Summary
本协议是使用体外表面测定在标准荧光显微镜上实施干扰反射显微镜的指南,用于使用体外表面测定对微管进行无标签、高对比度、高速成像。
Abstract
有几种方法可以可视化表面附近的纯化生物分子。全内部反射荧光 (TIRF) 显微镜是一种常用的方法,但有其缺点是需要荧光标记,这可能会干扰分子的活动。此外,光漂白和光损伤也是问题。对于微管,我们发现使用干扰反射显微镜(IRM)可以获得与TIRF质量相似的图像。这表明IRM可能是一种在体外可视化大型生物分子和寡聚物动力学的通用技术。本文介绍了荧光显微镜如何进行改进,以获得IRM图像。与其他对比技术(如差分干涉对比度显微镜或干涉散射显微镜)相比,IRM 更容易实现,而且成本更低。与暗场显微镜相比,它也不易受到表面缺陷和溶液杂质的影响。使用IRM,结合本文描述的图像分析软件,视野和帧速率仅受摄像机限制;使用 sCMOS 摄像机和宽场照明微管长度可精确测量至 20 nm,带宽为 10 Hz。
Introduction
微管的无标签成像是值得关注的,因为它绕过了对图布林的荧光标记以在图像中产生对比度的需要。荧光贴标有几个缺点:如果蛋白质浓度低1,光漂白和光损伤限制了观察时间,则不可行。已经使用几种技术来成像无标签的微管,包括视频增强差分干扰对比度显微镜(DIC)和暗场显微镜2,3,4,5。最近,干涉散射显微镜(iSCAT)6、旋转相干散射显微镜(ROCS)7和空间光干涉显微镜(SLIM)8也被使用。 所有这些技术都能够成像微管,并已证明对研究微管动力学有价值的。但是,每个都有各自的限制。在 DIC 中,对比度取决于微管和诺马斯基棱镜轴之间的角度。 在暗场中,微管信号因杂质或表面缺陷的散射光而退化。尽管 iSCAT 具有非凡的灵敏度(下至单个蛋白质),ROCS 可以深入样品中成像微管,但两种方法在技术上都要求很高,需要激光扫描仪。
该协议演示了如何设置干扰反射显微镜(IRM)9,10作为无标签成像微管的替代技术。IRM 易于实施,因为它只需要在标准荧光显微镜中添加一个廉价的 50/50 镜子。当与此处描述的软件结合使用时,IRM 可生成高对比度微管图像,能够高速拍摄大视场,需要一次性对齐,并可轻松与其他技术(如荧光成像)结合使用。
Protocol
1. 显微镜修改和物镜
- 使用适当的滤镜立方体将 50/50 镜插入荧光显微镜的过滤轮(图 1)。小心处理 50/50 镜子,因为它们经常有防反射涂层。
注:我们在显微镜的空滤镜立方体中使用50/50镜子。50/50 镜像插入二色镜所在的位置。 - 使用高放大倍率/高 NA 油目标。
注:在此协议中,我们使用 100x/1.3 NA 目标。
2. 室准备,将微管粘附到表面
- 清洁显微镜玻片和 22 mm x 22 mm 盖玻片(用于立式显微镜)或 22 mm x 22 mm 和 18 mm x 18 mm 盖玻片(用于倒置显微镜)。根据需要修改曲面。例如,使用碱性洗涤剂(参见材料表)清洁盖玻片,然后用蒸馏水在11之间和之后清洗100%乙醇。
- 使用剃刀刀片和另一张显微镜幻灯片作为边缘切割 3 毫米宽的塑料石蜡薄膜条(参见材料表)。
- 将两条塑料石蜡薄膜条分开 3 毫米放在干净的 22 x 22mm 盖玻片上。然后放置一个 18 mm x 18 mm 盖玻片以形成通道。如果使用直立显微镜,请将条带放在干净的显微镜幻灯片顶部,然后将盖玻片放在顶部。
- 将盖玻片(或滑动)放在 100°C 的热块上,为石蜡薄膜 10-30 s,形成密封通道。
- 使用移液器灌注50μg/mL抗体(在Brinkley缓冲液1980(BRB80)中流动。孵育10分钟。
注:我们使用抗红胺抗体将罗达胺标记的微管种子结合到表面。或者,avidin 可用于结合生物锡标记的微管种子或生物缩量金颗粒。简单地说,在溶液中没有结节(即非动态测定)的情况下,可以简单地观察微管,可以使用抗图布林抗体。 - 使用 BRB80 缓冲液洗涤五次。建议使用 0.22 μm 过滤器过滤溶液。
- 在BRB80中流动1%的球菌407(三块共聚物),以阻挡表面对非特异性结合。孵育10分钟。
- 使用 BRB80 缓冲液洗涤五次。
- 样品已准备好放在显微镜上。为防止样品干燥,在通道末端添加两滴 BRB80 缓冲液,并在需要时补充。
3. 显微镜对准
- 将样品放在显微镜台上。打开外光光源。
- 聚焦在样品表面。当目标因光学路径内光学器件的反射而上下移动时,您将观察多个表面。找到样品表面的一个好方法是聚焦石蜡薄膜边缘。找到曲面后,将视场设置为造型室的中心。
- 将现场隔膜在视野中居中,方法是将其关闭一半并使用调整螺钉。对齐后,重新打开隔膜。
注:螺钉调整只需偶尔进行,可能每 3-6 个月或故障排除时进行。 - 在 Bertrand 镜头中滑动以查看目标的退出孔(后焦平面)。
- 关闭目标出口孔边缘的孔径膜片 (AD)。
- 使用调整螺钉将 AD 与出口孔居中。通过打开 AD 并将其边缘与出口孔的边缘匹配来仔细检查。
注:此调整只需偶尔执行。 - 将孔径膜片设置为目标 NA 的大约 2/3。有关优化孔径膜片的详细步骤,请参阅第 7 节。
4. 成像稳定微管或40纳米金颗粒
注:稳定的微管和金纳米颗粒是很好的控制样品。建议将图像表面附着的微管或金纳米颗粒作为评估 IRM 性能的第一步,并帮助设置最佳孔径膜片开口(第 7 节)。
- 将相机的曝光时间设置为 10 毫秒,并调整照明以几乎使摄像机动态范围饱和。
- 在 BRB804、12、13(或 40 nm 金颗粒)中,使用移液器向新鲜样品和监测器灌注,在 10 μL 的甘尼利-(α、β)-亚甲基-二磷酸酯 (GMPCCP)或类醇稳定微管中流动通过成像表面进行结合。一旦10-20微管在视场内结合,用BRB80清洗样品2倍。
注:使用对齐良好的显微镜,微管应可见,无需背景减法。 - 通过设置 1 秒延迟 10 秒(曝光 10 毫秒)的时间间隔,获取 10 张图像。
- 获取背景图像。为此,请沿通道长轴使用舞台控制器或计算机软件移动舞台,同时获取 100 张图像,没有延迟(即流式传输接近 100 fps = 10 ms 曝光)。
注: 背景是 100 张图像的中位数。通过取中值,照明轮廓和其他固定功能(如光学元件上的污垢)将保留,同时过滤掉其他所有功能。样品上不应有倾斜,因为当舞台移动时,这将导致轴向位置发生变化,并最终降低背景图像。如果倾斜无法避免,则另一种方法是在流撒种子之前获取平均背景图像。 - 要处理和分析图像,转到步骤 6。
5. 成像微管动力学
- 对于使用脑挫图林的微管动力学,将样品加热器温度设置为 37°C。
- 在 BRB8011中,使用移液器向新鲜样品灌注,在 10 μL 的 GMPCCP 稳定微管种子中流动,并通过对表面进行实时成像(即,在流时)来监测其与表面结合。一旦 10-20 种子与视场绑定,使用 BRB80(BRB80 应预热至 37 °C 或至少在室温下)使用 2x 通道体积清洗样品。
注:使用对齐良好的显微镜,种子应可见,无需背景减法。 - 在聚合混合物中流动(7.5 μM 无标记的图布林 = 1 mM 三磷酸基苯甲酸酯 (GTP) = BRB80 缓冲液中的 1 mM 二硫磷醇 (DTT)。为了测量微管生长,使用采集软件设置延时,每 5 秒(0.2 帧/秒 (fps))采集一个图像,持续 15 分钟。
- 要增强对比度,在每个时间点获取 10 个图像(而不是一个图像),并对其进行平均处理。对于微管收缩,通过将时间延迟设置为 0 和曝光时间为 10ms 来获取 100 fps 的图像(根据所使用的相机,感兴趣的区域较小,可以获取较高的 fps)。
- 获取背景图像,如步骤 4.4 所示。
6. 图像处理和分析
注:为了分析,此协议使用斐济14,但读者可以自由使用她/他认为合适的任何软件。
- 打开保存的背景图像。
- 使用图像 > 堆栈 > Z 项目 > 中位数 计算中值图像(即背景)
- 使用文件 > 打开将微管动态影片作为堆栈(对于非动态微管相同)
- 使用"处理 > 图像"计算器从堆栈中减去背景图像。请务必选中"32 位(浮动)结果"选项。
- 对于动态微管,使用线工具沿感兴趣的微管绘制一条线,并通过按"t"将其添加到兴趣管理器区域。对所有感兴趣的微管重复上述步骤。
- 对于动态微管,运行多 Kymo 宏 (补充文件 1)。该宏将为 ROI 管理器中的每个微管生成视频和 kymograph。每个微管都将获得一个唯一的标识符。
- 对于动态微管,运行 Kymo 分析宏 (补充文件 2), 并按照其步骤测量微管的生长速率和收缩率。
7. 孔径膜片尺寸
注:使用IRM获取微管高对比度图像的一个重要因素是正确设置照明数字光圈(INA)10、15 。INA可以通过更改目标出口孔处的进入照明光束的大小来更改,该光束由 AD 的大小控制(AD 位于与目标的退出孔(后焦平面)的偶联平面上,图1):
其中DAD是孔径膜片的直径,f物是目标的焦距,D ep是目标的出孔直径。通常,AD 完全开放用于荧光成像,因此INA等于目标的NA。在荧光显微镜中,AD刻度不指示其直径,因此无法计算INA。 借助目标,可以校准 AD 大小。但是,由于 AD 大小将固定到产生最高对比度的大小,因此没有必要这样做。
- 准备粘在表面的荧光标记稳定微管样本(步骤 4.1-4.2)。
注:我们使用四甲基二甲胺标记微管16(如:550纳米,Em:580 nm)。 - 使用显微镜聚焦旋钮对焦,同时对微管进行荧光成像(如果未标记微管,请使用 IRM15或 DIC5进行成像)。
- 使用相机软件将相机曝光设置为 10 毫秒。
注意:这种曝光是任意的,曝光 100 毫秒也起作用。 - 将 AD 关闭到其最小的开口。调整照明以几乎使摄像机的动态范围饱和或达到最大可能。
注: 作为指南,请使用通常由采集软件提供的查找表。 - 获取包含 10+ 微管的视场的 10 个图像(每秒流式传输或拍摄图像)。
- 获取背景图像,如步骤 4.4 所示。
- 更改 AD 的大小并对整个 AD 开放范围(从关闭到退出学生大小,图 2) 重复步骤 7.5-7.6。每次更改 AD 大小时,调整照明强度以匹配步骤 7.4。
- 对于获取的每个视场,使用过程 > 图像计算器减去相应的背景,并从下拉菜单中选择"减法"。确保选中"32 位(浮动)结果"选项。然后使用图像 > 堆栈 > Z 项目 > 平均计算生成的图像。
- 测量定义为微管信号的平均强度(微管强度减去背景强度)的信号与背景噪声比 (SBR) 除以背景的标准偏差(图 3.
- 通过计算每个开口尺寸的微管的平均 SBR,并将 AD 大小设置为产生最高 SBR 的 AD 大小(图 2 ),确定最佳 AD 大小(即最佳INA)。可能有一系列的AD尺寸,产生可比的对比度15。
Representative Results
如上所述,使用对齐良好的显微镜,微管应可见,无需背景减法(图4A)。减去背景(图4B)可增强微管的对比度(图4C)。为了进一步增强对比度,可以使用平均或傅立叶滤波或两者的组合(图4D、F、E)。图 4G中的线扫描显示了图像质量的增量改进。请注意,每个处理步骤都会降低背景噪音。
图5显示了从延时电影生成的微管动力学的图形学实例。这些视频以两帧速率采集:0.2 fps(慢速)和 100 fps(快速)。前者适用于测量增长率,而后者更适合测量比增长率快一个数量级的收缩率。
对于使用金纳米粒子设置显微镜的情况,图 6显示了一个示例图像。金纳米粒子被动地附着在表面。虽然建议使用 40 nm 颗粒,但也可以以较低的对比度对 20 nm 粒子进行成像。
图 1.IRM 的原理表示。(A)光源的微光照明在到达 50/50 镜子之前穿过孔径膜片。孔径膜片设置光束宽度,从而设置照明 NA。50/50 镜像部分反射到照亮样品目标的光线。从样品反射的光被收集,然后投射到相机芯片(通过管透镜),在那里它干扰生成图像。图像对比度是玻璃/水界面 (I1) 反射的光与水/微管界面 (I2) 反射的光之间的干扰的结果。根据微管/表面距离 (h),I1 和 I2 之间的光路径差将导致建设性(亮信号)或破坏性(暗信号)或介于两者之间的任何内容。例如,如果波长为 600 nm 的光用于成像,则当微管高度变化约 100 nm 时,对比度将在暗色和明亮之间切换。星号表示偶联平面(从15修改)。(B) 50/50 镜像安装的示例。打开了一个合适的滤镜立方体,并将镜插入了通常位于二色镜的位置。该镜像按照制造商的说明定向。然后 , 将立方体插入过滤轮中 , 该滤盘入显微镜 ( 未显示 ) 。在安装过程中,使用了手套,镜子只被边缘保持。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.最佳孔径膜片设置。(A)同一视场在不同孔径隔膜开口处成像,没有背景减法。从视觉上看,对比度随着孔径膜片尺寸的增加而增加,直到达到一个高原,然后开始退化。这一点由(B)SBR测量背景减缩图像得到证实。误差条是标准偏差。 刻度条为 500 μm (AD) 和 3 μm(微管)。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.测量信背景噪声比。微管被隔离在感兴趣的地区。每个感兴趣的区域都设限于将微管与背景分开。平均微管信号是从微管的线路扫描中获得的。扫描线宽度设置为等于微管长度。这样,扫描中的每个点都是沿微管轴与该点平行的所有像素的信号的平均值。背景噪声是所有阈值以下像素的标准偏差切断。 请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.图像处理。获得原始图像(A)后,减去背景(B)以增强微管对比度。为了进一步改善对比度,图像被平均(D)或傅立叶过滤(E)或两者(F)。线扫描(G),其位置由(A)中的虚线红线指示,其颜色与(A)到(F)中的各种图像匹配。下角的数字是整个视场测量的平均 SBR。刻度条为 5 μm(从15起修改)。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5.kymograph 的例子。(A) 以0.2 fps获得从延时电影生成的微管动力学的Kymograph示例。(B) Kymograph 描述从以 100 fps 获得的电影产生的收缩事件的示例。虚线标记种子。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6.使用 IRM 成像的金纳米粒子示例。尺寸为20和40纳米的金纳米颗粒被动地附着在表面。获得了10张图像。背景减法后,对图像进行平均,以增强对比度。请点击此处查看此图的较大版本。
图 7.IRM 图像中的微管长度跟踪精度。稳定微管(即固定长度)在100fps下成像200倍,然后平均到10fps,以增强对比度。接下来,使用嘉年华17跟踪软件测量微管的长度。对于每个微管,均长和标准差计算如图所示(虚线表示均值,实线表示标准差,长度 = 3971 = 20 nm)。总体跟踪精度是所有跟踪微管的标准偏差的平均值(n = 6 微管x 20 个数据点 = 120 个数据点)。请点击此处查看此图的较大版本。
补充文件1。 请点击此处下载此文件。
补充文件2。 请点击此处下载此文件。
Discussion
该协议演示了 IRM 在微管动力学成像和测量中的成功应用。应注意正确设置照明数值光圈,因为它对图像对比度的影响最大。此外,使用高数值光圈 (NA) 目标对于获得高分辨率/高对比度图像非常重要,因为与低 NA 目标相比,较高的 NA 目标具有更高的光收集能力。表面和溶液的清洁程度越低,因为污垢最终附着在表面,并在实验过程中向图像添加类似噪声的斑点。背景图像的采集非常重要,因为它可以消除均匀性、静态噪声和表面不规则性的照明。
建议的修改是在照明路径中引入长通滤波器(>600 nm)。白色光源的光谱通常含有紫外线中的波长,这些波长会损害微管。此外,在将 IRM 与荧光相结合(例如,在研究微管相关蛋白 (MAPs) 对微管动力学的影响时,使用长波长度对于 IRM 会很有用。请注意,当对花费的时间段进行成像时,由于图像平面偏离背景平面,样品漂移(尤其是沿光轴)会降低图像对比度。现代显微镜通常配备稳定机制(例如,完美聚焦(尼康),明确对焦2(蔡司),IX3-ZDC2(奥林巴斯)。另一种解决方案是被动或主动地稳定设置,或者纠正漂移19,20,21。最后,微管对比度可以通过减小场膜片的大小来增加(70%的开口是很好的选择,因为它是增加对比度和视场尺寸之间的平衡)15。
虽然 IRM 适合成像微管,但它不够灵敏,无法检测单个蛋白质。对于此类应用,iSCAT 是一种更合适的技术。同样,如果需要小于 10 nm 的跟踪精度,荧光和 iSCAT 更适合。对于 IRM,测量的长度跟踪精度为 ±20 nm,如图7所示。
在表面测定中使用IRM可以超越微管;例如,分子马达可以贴上金纳米粒子的标签,并在它们与微管相互作用时进行跟踪。此外,一种更先进的IRM形式称为反射干涉对比度显微镜(RICM)22,原则上可用于进一步增强微管对比度,并获得更高的跟踪精度。
Disclosures
提交人没有利益冲突可披露。
Acknowledgments
作者感谢安娜·卢奇尼亚克和郭银伟对协议的批评性阅读和评论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
| 50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
| NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
| Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
| plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
| Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
| 40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
| 20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
| Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048x2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
| Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
| Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |
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