Summary
इस प्रोटोकॉल लेबल मुक्त, उच्च विपरीत, microtubules के उच्च गति इमेजिंग इन विट्रो सतहों पर परख का उपयोग करने के लिए एक मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपको लागू करने के लिए एक गाइड है.
Abstract
सतहों के निकट शुद्ध जैव अणुओं को विज़ुअलाइज़ करने के लिए कई तरीके हैं। कुल-आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरोसेंट (TIRF) माइक्रोस्कोपी एक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया विधि है, लेकिन दोष है कि यह फ्लोरोसेंट लेबलिंग की आवश्यकता है, जो अणुओं की गतिविधि के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. इसके अलावा, photobleaching और photodamage चिंता कर रहे हैं. माइक्रोट्युबल्स के मामले में, हमने पाया है कि टीआईआरएफ के समान गुणवत्ता की छवियों को हस्तक्षेप परावर्तन माइक्रोस्कोपी (आईआरएम) का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। यह पता चलता है कि IRM इन विट्रो में बड़े जैव अणुओं और oligomers की गतिशीलता visualizing के लिए एक सामान्य तकनीक हो सकती है. इस पत्र में, हम बताते हैं कि कैसे एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप बस IRM छवियों को प्राप्त करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. IRM आसान है और काफी सस्ता है इस तरह के अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोकॉपी या interferometric प्रकीर्णन माइक्रोस्कोपी के रूप में अन्य विपरीत तकनीकों की तुलना में लागू करने के लिए. यह डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी की तुलना में सतह दोष और समाधान दोष के लिए भी कम संवेदनशील है। IRM का उपयोग करना, इस पेपर में वर्णित छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ, दृश्य का क्षेत्र और फ़्रेम दर केवल कैमरे द्वारा सीमित है; एक sCMOS कैमरा और व्यापक क्षेत्र रोशनी microtubule लंबाई के साथ अप करने के लिए परिशुद्धता के साथ मापा जा सकता है 20 एनएम की एक बैंडविड्थ के साथ 10 हर्ट्ज.
Introduction
माइक्रोट्युबकेस के लेबल-मुक्त इमेजिंग ब्याज की है क्योंकि यह छवियों में इसके विपरीत उत्पन्न करने के लिए ट्यूबुलिन के फ्लोरोसेंट लेबलिंग की आवश्यकता को दरकिनार करता है। फ्लोरोसेंट लेबलिंग में कई कमियां हैं: यह संभव नहीं है अगर प्रोटीन एकाग्रता कमहै 1 और photobleaching और photodamage अवलोकन समय सीमा। कई तकनीकों का इस्तेमाल लेबल-मुक्त माइक्रोट्यूब्यूल्स की छवि बनाने के लिए किया गया है, जिसमें वीडियो-एन्हांस्ड डिफरेंट इंटरप्रेसी डवरमाइक्रोस्कोपी (डीआईसी) और डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी 2,3,4,5शामिल हैं। हाल ही में, इंटरफेरोमेट्रिक प्रकीर्णन माइक्रोस्कोपी (iSCAT)6,घूर्णन-समन्वय माइक्रोस्कोपी (ROCS)7 और स्थानिक प्रकाश हस्तक्षेप माइक्रोस्कोपी (एसईपी)8का भी उपयोग किया गया है। इन सभी तकनीकों microtubules इमेजिंग करने में सक्षम हैं और microtubule गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान साबित कर दिया है. हालांकि, प्रत्येक की अपनी सीमाएं हैं। DIC में इसके विपरीत microtubule और Nomarski प्रिज्म अक्ष के बीच कोण पर निर्भर करता है. डार्कफील्ड में, माइक्रोट्युबल संकेत अशुद्धियों या सतहों दोषों से बिखरे हुए प्रकाश द्वारा निम्नीकृत होता है। हालांकि iSCAT असाधारण संवेदनशीलता दर्शाती है (एक प्रोटीन के नीचे) और ROCS नमूना में गहरी microtubules छवि कर सकते हैं, दोनों तरीकों तकनीकी रूप से मांग कर रहे हैं, लेजर स्कैनर की आवश्यकता होती है.
इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (IRM)9,10 microtubules के लेबल मुक्त इमेजिंग के लिए एक वैकल्पिक तकनीक के रूप में स्थापित किया जा सकता है. IRM को लागू करने के रूप में यह केवल एक मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के लिए एक सस्ती 50/ जब यहाँ वर्णित सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया, IRM उच्च विपरीत microtubule छवियों का उत्पादन, उच्च गति पर देखने के बड़े क्षेत्रों छवि कर सकते हैं, एक onetime संरेखण की आवश्यकता है, और आसानी से इस तरह के फ्लोरोसेंट इमेजिंग के रूप में अन्य तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है.
Protocol
1. संशोधन माइक्रोस्कोप और उद्देश्य लेंस
- एक उपयुक्त फिल्टर घन का उपयोग कर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के फिल्टर पहिया में एक 50/50 दर्पण डालें (चित्र1). देखभाल के साथ 50/50 दर्पण संभाल के रूप में अक्सर वे विरोधी प्रतिबिंब कोटिंग है.
नोट: हम माइक्रोस्कोप के एक खाली फिल्टर घन में एक 50/50 दर्पण का इस्तेमाल किया. 50/50 दर्पण डाला जाता है जहां dichroic दर्पण स्थित है. - एक उच्च आवर्धन / उच्च एनए तेल उद्देश्य का प्रयोग करें।
नोट: इस प्रोटोकॉल में, हम एक 100x/1.3 NA उद्देश्य का इस्तेमाल किया.
2. सतह के लिए microtubules का पालन करने के लिए चैंबर की तैयारी
- स्वच्छ माइक्रोस्कोप स्लाइड और 22 मिमी x 22 मिमी coverslips (सीधे माइक्रोस्कोप के लिए) या 22 मिमी x 22 मिमी और 18 मिमी x 18 मिमी coverslips (उल्टा माइक्रोस्कोप के लिए). आवश्यकतानुसार सतह को संशोधित करें. उदाहरण के लिए, क्षारीय डिटर्जेंट का उपयोग करके कवरलिपों को साफ करें (सामग्री की तालिकादेखें ) इसके बाद 11 के बीच औरबादमें आसुत जल के साथ 100% एथेनॉल का उपयोग किया जाता है।
- प्लास्टिक पैराफिन फिल्म के 3 मिमी चौड़ी स्ट्रिप्स कट (सामग्री की मेजदेखें) एक उस्तरा ब्लेड और एक किनारे के रूप में एक और माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग कर.
- प्लेस दो प्लास्टिक पैराफिन फिल्म स्ट्रिप्स 3 मिमी के अलावा एक साफ 22 x 22mm कवर पर्ची पर. फिर एक चैनल बनाने के लिए एक 18 मिमी x 18 मिमी कवरस्लिप रखें। यदि एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, एक साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड के शीर्ष पर स्ट्रिप्स जगह है और फिर शीर्ष पर एक coverslip जगह है.
- पैराफिन फिल्म के लिए 10-30 एस के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर एक हीट ब्लॉक पर कवरस्लिप (या स्लाइड) रखें एक सील चैनल बनाने के लिए।
- एंटीबॉडी के 50 डिग्री ग्राम/एमएल में प्रवाह (Brinkley बफर 1980 (BRB80) में एक pipette का उपयोग कर के भ्रम द्वारा. 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
नोट: हम सतह के लिए रोडामाइन लेबल microtubule बीज बाँध करने के लिए विरोधी rhodamine एंटीबॉडी का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, avidin biotin लेबल microtubule बीज बाध्य करने के लिए या biotinylated सोने के कणों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बस समाधान में ट्यूबुलिन की अनुपस्थिति में microtubules को देखने के लिए (यानी, एक गैर गतिशील परख), एक विरोधी tubulin एंटीबॉडी इस्तेमाल किया जा सकता है. - BRB80 बफर के साथ पांच बार धो लें. यह एक 0.22 डिग्री फ़िल्टर का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर करने के लिए अनुशंसा की जाती है।
- गैर-विशिष्ट बाइंडिंग के खिलाफ सतह को ब्लॉक करने के लिए BRB80 में 1% poloxamer 407 (एक triblock copolymer) में प्रवाह। 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- BRB80 बफर के साथ पांच बार धो लें.
- नमूना माइक्रोस्कोप पर रखा जा करने के लिए तैयार है। बाहर सुखाने से नमूना को रोकने के लिए, चैनल के सिरों पर BRB80 बफर की दो बूंदों को जोड़ने और जब जरूरत की भरपाई।
3. माइक्रोस्कोप संरेखण
- माइक्रोस्कोप अवस्था पर नमूना रखें। एपि-इल्युमिनेशन प्रकाश स्रोत को चालू करें।
- नमूना सतह पर ध्यान दें। आप कई सतहों का निरीक्षण करेंगे क्योंकि ऑप्टिकल पथ के भीतर प्रकाशिकी से प्रकाश के पीछे प्रतिबिंब के कारण उद्देश्य ऊपर और नीचे चला जाता है। नमूना सतह खोजने के लिए एक अच्छा तरीका पैराफिन फिल्म बढ़त पर ध्यान केंद्रित करने के लिए है। एक बार सतह पाया जाता है, कक्ष के केंद्र के लिए देखने के क्षेत्र सेट.
- इसे आधे रास्ते बंद करके और समायोजन शिकंजा का उपयोग करके दृश्य के क्षेत्र में फ़ील्ड डायाफ्राम को केंद्र में रखना. एक बार गठबंधन, डायाफ्राम फिर से खोलना.
नोट: पेंच समायोजन केवल छिटपुट रूप से किया जाना चाहिए, शायद हर 3-6 महीने या जब समस्या निवारण. - उद्देश्य के बाहर निकलने के छात्र (बैक फोकल विमान) को देखने के लिए बर्ट्रेंड लेंस में स्लाइड करें।
- उद्देश्य के निकास पुतली के किनारों से परे एपर्चर डायाफ्राम (एडी) को बंद करें।
- बाहर निकलने के छात्र के साथ विज्ञापन केंद्र के लिए समायोजन शिकंजा का प्रयोग करें. विज्ञापन खोलने और बाहर निकलने के छात्र के उन लोगों के साथ अपने किनारों मिलान द्वारा डबल जांच.
नोट: यह समायोजन केवल छिटपुट रूप से किया जाना चाहिए। - एपर्चर डायाफ्राम उद्देश्य के एनए के बारे में 2/3 के लिए सेट करें। एपर्चर डायाफ्राम के अनुकूलन के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं के लिए अनुभाग 7 देखें।
4. इमेजिंग स्थिर microtubules या 40 एनएम सोने के कण
नोट: स्थिर microtubules और सोने नैनोकणों अच्छा नियंत्रण नमूने के रूप में सेवा करते हैं। यह IRM प्रदर्शन का आकलन करने और इष्टतम एपर्चर डायाफ्राम खोलने (अनुभाग 7) स्थापित करने में मदद करने के लिए एक पहला कदम के रूप में सतह संलग्न microtubules या सोने नैनोकणों छवि करने के लिए सिफारिश की है।
- 10 एमएस करने के लिए कैमरे के जोखिम समय सेट और लगभग कैमरे गतिशील रेंज तर करने के लिए रोशनी को समायोजित.
- 10 डिग्री में guanylyl-(अल्फा, बीटा)-मेथिलीन-डाइफॉस्फोनेट (GMPCCP) - या BRB804,12,13 (या 40 एनएम सोने के कणों) में taxol-स्थिर microtubules एक ताजा नमूना और निगरानी के लिए एक पाइपेट का उपयोग करके प्रवाह सतह इमेजिंग द्वारा बाइंडिंग. एक बार 10-20 microtubules देखने के क्षेत्र के भीतर बाध्य कर रहे हैं, BRB80 के साथ नमूना 2x धो लें.
नोट: एक अच्छी तरह से गठबंधन माइक्रोस्कोप के साथ, microtubules पृष्ठभूमि घटाव के बिना दिखाई देना चाहिए. - 10 सेकंड के लिए 1 सेकंड (10 एमएस जोखिम पर) के लिए 1 दूसरी देरी अवधि के साथ एक समय चूक की स्थापना करके 10 छवियों का अधिग्रहण।
- पृष्ठभूमि छवि प्राप्त करें. ऐसा करने के लिए, मंच नियंत्रक या चैनल लंबे अक्ष के साथ कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मंच ले जाएँ, जबकि कोई देरी के साथ 100 छवियों को प्राप्त (यानी 100 एफपीएस के करीब स्ट्रीमिंग - 10 एमएस जोखिम).
नोट: पृष्ठभूमि 100 छवियों की माध्य है। औसत लेने से, रोशनी प्रोफ़ाइल और प्रकाशिकी पर गंदगी की तरह अन्य स्थिर सुविधाओं को संरक्षित कर रहे हैं, जबकि बाकी सब बाहर फ़िल्टर किया जाता है. नमूने पर कोई झुकाव नहीं होना चाहिए क्योंकि यह चरण ले जाया जाता है और अंततः पृष्ठभूमि छवि को नीचा करने के रूप में अक्षीय स्थिति में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व करेंगे। यदि झुकाव से बचा नहीं जा सकता है, तो एक वैकल्पिक तरीका बीज बहने से पहले औसत पृष्ठभूमि छवियों को प्राप्त करने के लिए है। - संसाधन और छवियों का विश्लेषण करने के लिए, चरण 6 पर जाएँ.
5. इमेजिंग माइक्रोट्युब गतिशीलता
- मस्तिष्क ट्यूबुलिन का उपयोग microtubule गतिशीलता के लिए, नमूना हीटर तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट करें।
- BRB8011 में GMPCCP-स्थिर microtubule बीज के 10 डिग्री एल में प्रवाह एक ताजा नमूना करने के लिए एक पिपेट का उपयोग कर perfusion द्वारा और उन्हें सतह लाइव इमेजिंग द्वारा सतह के लिए बाध्यकारी की निगरानी (यानी, जबकि स्ट्रीमिंग). एक बार 10-20 बीज देखने के क्षेत्र के साथ बाध्य कर रहे हैं, BRB80 के साथ 2x चैनल मात्रा का उपयोग कर नमूना धोने (BRB80 37 डिग्री सेल्सियस या कम से कम कमरे के तापमान पर prewarmed किया जाना चाहिए).
नोट: एक अच्छी तरह से गठबंधन माइक्रोस्कोप के साथ, बीज पृष्ठभूमि घटाव के बिना दिखाई देना चाहिए। - बीआरबी80 बफर में बहुलकीकरण मिश्रण (7.5 डिग्री सेल्सियस अनलेबल ट्यूबुलिन + 1 एमएम ग्वानोसिन ट्राइफॉस्फेट (जीटीपी) + 1 एम डीथियोथ्रेटोल (डीटी) में प्रवाह। microtubule विकास को मापने के लिए, एक समय चूक अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक छवि हर 5 सेकंड (0.2 फ्रेम प्रति सेकंड (fps) 15 मिनट के लिए प्राप्त करने के लिए निर्धारित किया है.
- इसके विपरीत बढ़ाने के लिए, प्रत्येक समय बिंदु पर 10 छवियों (एक के बजाय) प्राप्त करें और उन्हें औसत. microtubule संकुचन के लिए, 0 करने के लिए समय देरी और 10ms के एक जोखिम समय की स्थापना करके 100 एफपीएस पर छवियों को प्राप्त (उच्च एफपीएस कैमरे का इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है ब्याज के छोटे क्षेत्रों के साथ संभव है).
- चरण 4.4 में के रूप में एक पृष्ठभूमि छवि प्राप्त करें.
6. छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण
नोट: विश्लेषण के लिए, इस प्रोटोकॉल फिजी14 का उपयोग करता है, लेकिन पाठक किसी भी सॉफ्टवेयर वह उपयुक्त लगता है का उपयोग करने के लिए स्वतंत्र है।
- सहेजी गई पृष्ठभूमि छवियों को खोलें.
- छविका उपयोग करते हुए माध्यिका छवि (अर्थात पृष्ठभूमि) की गणना करें ]
- एक ढेर के रूप में खुला microtubule गतिशीलता फिल्म (गैर-गतिशील microtubules के लिए एक ही) फ़ाइलका उपयोग कर
- प्रक्रिया का उपयोग कर ढेर से पृष्ठभूमि छवि घटाना gt; छविकैलकुलेटर। "32bit (फ्लोट) परिणाम" विकल्प की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें।
- गतिशील microtubules के लिए, लाइन उपकरण का उपयोग कर ब्याज की microtubule के साथ एक लाइन आकर्षित और "टी" दबाकर ब्याज प्रबंधक के क्षेत्र में जोड़ें. ब्याज के सभी microtubules के लिए दोहराएँ.
- गतिशील microtubules के लिए, मल्टी-कीमो मैक्रो (पूरकफ़ाइल1) चलाएँ। मैक्रो ROI प्रबंधक में हर microtubule के लिए एक वीडियो और एक kymograph उत्पन्न करेगा. हर microtubule एक अद्वितीय पहचानकर्ता मिल जाएगा.
- गतिशील माइक्रोट्युबल्स के लिए, किमो-विश्लेषण मैक्रो (पूरकफाइल2) चलाएं और माइक्रोट्युब की वृद्धि दर और संकुचन दरों को मापने के लिए इसके चरणों का पालन करें।
7. एपर्चर डायाफ्राम आकार
नोट: IRM का उपयोग कर microtubules के उच्च विपरीत छवियों को प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक रोशनी संख्यात्मक एपर्चर (आईएनए) सही ढंग से10,15स्थापित कर रहा है . आई.एन.ए. को उद्देश्य के निकास शिष्य पर आने वाली रोशनी बीम के आकार को बदलकर बदला जा सकता है जो ई. के आकार द्वारा नियंत्रित होता है (ई. उद्देश्य के निकास पुतली (बैक फोकल तल) के साथ एक संयुग्मी तल पर स्थित होता है , चित्र 1:
जहां डीई एपर्चर डायाफ्राम का व्यास है, चउद्देश्य उद्देश्य की फोकल लंबाई है और डीपी उद्देश्य के बाहर निकलने के छात्र व्यास है. आमतौर पर, विज्ञापन पूरी तरह से फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए खुला छोड़ दिया है, तो आईएनए उद्देश्य के एनएके बराबर होती है। एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप में, विज्ञापन पैमाने अपने व्यास का संकेत नहीं है, इस प्रकार आईएएनकी गणना नहीं की जा सकती। यह एक उद्देश्य की मदद से विज्ञापन आकार जांचना संभव है. फिर भी, यह आवश्यक नहीं है क्योंकि विज्ञापन आकार आकार है कि उच्चतम विपरीत उत्पादन करने के लिए तय किया जाएगा.
- फ्लोरोसेंटरूप से सतह पर अटके हुए स्थिर माइक्रोट्युबल्स का एक नमूना तैयार करें (चरण 4-1-4.2)।
नोट: हम tetramethylrhodamine लेबल microtubules16 (पूर्व: 550 एनएम, एम: 580 एनएम) का इस्तेमाल किया। - माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ध्यान केंद्रित करने में microtubules लाओ घुंडी ध्यान केंद्रित करते हुए फ्लोरोसेंटली उन्हें इमेजिंग (यदि microtubules लेबल नहीं कर रहे हैं, उन्हें IRM15 या डीआईसी5के साथ छवि).
- कैमरा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 10 एमएस के लिए कैमरा जोखिम सेट करें।
नोट: यह जोखिम मनमाने ढंग से है और 100 एमएस के एक जोखिम भी काम करेगा. - अपनी छोटी खोलने के लिए विज्ञापन बंद करो. लगभग कैमरे के गतिशील रेंज तर करने के लिए या अधिकतम संभव करने के लिए रोशनी समायोजित करें।
नोट: एक मार्गदर्शिका के रूप में, आमतौर पर प्राप्ति सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रदान की गई लुक अप तालिका का उपयोग करें. - 10 + microtubules युक्त देखने के एक क्षेत्र के 10 छवियों (स्ट्रीमिंग या एक छवि हर दूसरे लेने के द्वारा) प्राप्त करें।
- चरण 4.4 में के रूप में एक पृष्ठभूमि छवि प्राप्त करें.
- विज्ञापन का आकार बदलें और पूरे AD खोलने की सीमा के लिए चरण 7.5-7.6 दोहराएँ (बंद से बाहर निकलने वाले पुतली आकार, चित्र 2)। हर बार विज्ञापन आकार बदल जाता है, रोशनी तीव्रता को समायोजित करने के लिए कदम 7.4 की है कि मैच.
- प्राप्त देखने के हर क्षेत्र के लिए, प्रक्रिया का उपयोग कर इसी पृष्ठभूमि घटाना और छवि कैलकुलेटर और ड्रॉप-डाउन मेनू से "सबड्राट" का चयन। सुनिश्चित करें कि "32bit (फ्लोट) परिणाम" विकल्प चेक किया गया है। फिर छवि का उपयोग करते हुए परिणामी छवियों का औसत [ ]
- माइक्रोट्युब्यूल सिग्नल की औसत तीव्रता (पृष्ठभूमि की तीव्रता को घटाकर सूक्ष्म नलिका की तीव्रता) पृष्ठभूमि के मानक विचलन से विभाजित माइक्रोट्युब के रूप में परिभाषित माइक्रोट्युब के सिग्नल-टू-बैकग्राउंड शोर अनुपात (एसबीआर) को मापें ( चित्र 3) .
- इष्टतम AD आकार (अर्थात इष्टतम आईएए) हर खोलने के आकार के लिए microtubules के औसत SBR की गणना करके निर्धारित करें और सबसे अधिक SBR (चित्र 2) का उत्पादन एक करने के लिए विज्ञापन आकार सेट. यह संभव है कि ई . आकार ों की एक श्रृंखला है जो तुलनीय विपरीत15का उत्पादन करती है .
Representative Results
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, एक अच्छी तरह से संरेखित सूक्ष्मदर्शी के साथ, माइक्रोट्यूल पृष्ठभूमि घटाव के बिना दिखाई देना चाहिए (चित्र 4क)। पृष्ठभूमि को घटाना (चित्र 4ख) सूक्ष्म नलिका के विपरीत को बढ़ाता है (चित्र 4ब्) इसके विपरीत को और अधिक बढ़ाने के लिए, औसत या फूरिये फ़िल्टरिंग या दोनों का संयोजन उपयोग किया जा सकता है (चित्र 4D,F,E)। चित्रा 4जी में लाइन स्कैन छवि गुणवत्ता के वृद्धिशील सुधार को दर्शाता है। प्रत्येक प्रसंस्करण कदम के साथ पृष्ठभूमि शोर की कमी पर ध्यान दें.
समय-चूक फिल्मों से उत्पन्न माइक्रोट्युब गतिशीलता के किमोग्राफ ों के उदाहरण चित्र 5में दिखाए गए हैं। वीडियो दो फ्रेम दरों पर अधिग्रहण किया गया: 0.2 एफपीएस (धीमी) और 100 एफपीएस (तेजी से). पूर्व विकास दर को मापने के लिए उपयुक्त है, जबकि बाद संकुचन दर है कि विकास दर की तुलना में तेजी से परिमाण का एक आदेश है को मापने के लिए अधिक उपयुक्त है.
उस मामले के लिए जहाँ सूक्ष्मदर्शी स्थापित करने के लिए सोने के नैनोकणों का उपयोग किया जाता है, एक उदाहरण प्रतिबिंब चित्र 6में दर्शाया गया है। सोने के नैनोकणों निष्क्रिय सतह से जुड़े थे। जबकि 40 एनएम कणों की सिफारिश कर रहे हैं, यह भी 20 एनएम कणों छवि के लिए संभव है, अभी तक एक कम विपरीत पर.
चित्र 1. IRM के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व| (क) प्रकाश स्रोत से एपि-प्रदीपन 50/50 दर्पण तक पहुंचने से पहले एपर्चर डायाफ्राम से गुजरता है। एपर्चर डायाफ्राम बीम चौड़ाई इस प्रकार रोशनी एनए सेट करता है। 50/50 दर्पण आंशिक रूप से नमूना रोशन करने के उद्देश्य के लिए प्रकाश को दर्शाता है. प्रकाश नमूना से परिलक्षित एकत्र की है और फिर कैमरा चिप पर पेश (ट्यूब लेंस द्वारा) जहां यह छवि उत्पन्न करने के लिए हस्तक्षेप. छवि कंट्रास्ट कांच/जल अंतराफलक (I1) से परावर्तित प्रकाश के बीच हस्तक्षेप का परिणाम है और जल/माइक्रोट्युबल इंटरफ़ेस (I2) से परावर्तित प्रकाश है। microtubule/सतह दूरी (ज) पर निर्भर करता है, I1 और I2 के बीच ऑप्टिकल पथ अंतर एक रचनात्मक (ब्राइट संकेत) या विनाशकारी (अंधेरे संकेत) या बीच में कुछ भी में परिणाम होगा. उदाहरण के लिए, यदि 600 एनएम की तरंगदैर्ध्य वाले प्रकाश का उपयोग इमेजिंग के लिए किया जाता है, तो इसके विपरीत अंधेरे और उज्ज्वल के बीच स्विच हो जाएगा जब माइक्रोट्युबल ऊंचाई लगभग 100 एनएम से बदलती है। तारांकन संयुग्मी विमानों को इंगित करता है(15से संशोधित )। (बी) 50/50 दर्पण स्थापना का उदाहरण. एक उपयुक्त फिल्टर घन खोला गया था और दर्पण डाला गया था, जहां एक dichroic दर्पण आमतौर पर बैठता है. निर्माता के निर्देशों के अनुसार दर्पण उन्मुख था। फिर घन फिल्टर पहिया जो माइक्रोस्कोप को वापस डाला गया था में डाला गया था (नहीं दिखाया). स्थापना के दौरान, दस्ताने इस्तेमाल किया गया, और दर्पण केवल किनारों द्वारा आयोजित किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2. इष्टतम एपर्चर डायाफ्राम सेटिंग. (क) देखने का एक ही क्षेत्र पृष्ठभूमि घटाव के बिना अलग एपर्चर डायाफ्राम उद्घाटन पर छवि थी. नेत्रहीन, इसके विपरीत वृद्धि हुई के रूप में एपर्चर डायाफ्राम के आकार में वृद्धि हुई जब तक यह एक पठार तक पहुँच गया और बाद में नीचा शुरू कर दिया. यह (बी) SBR माप पृष्ठभूमि घटाया छवियों द्वारा पुष्टि की गई थी. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन हैं. स्केल बार 500 डिग्री (एडी) और 3 डिग्री (माइक्रोट्युबल्स) हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3. सिग्नल-टू-बैकग्राउंड शोर अनुपात को मापने। माइक्रोट्यूल ब्याज के क्षेत्रों में अलग-अलग थे। ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र पृष्ठभूमि से microtubule अलग करने के लिए सीमा निर्धारित किया गया था. माइक्रोट्युबल के पार एक लाइन स्कैन से औसत माइक्रोट्युबल संकेत प्राप्त किया गया था। स्कैन लाइन चौड़ाई microtubule लंबाई के बराबर करने के लिए सेट किया गया था। इस तरह, स्कैन पर हर बिंदु microtubule अक्ष है कि उस बिंदु के समानांतर हैं साथ सभी पिक्सल के संकेतों का एक औसत है. पृष्ठभूमि शोर सीमा से नीचे सभी पिक्सल के मानक विचलन काट रहा है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4. छवि प्रसंस्करण. कच्चे चित्र प्राप्त करने के बाद (A), पृष्ठभूमि (B) को माइक्रोट्युबल कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए घटाया गया था (C) इसके विपरीत को और बेहतर बनाने के लिए छवियों को या तो औसत (डी) या फूरिये फ़िल्टर किए गए (ई) या दोनों (एफ)थे। लाइन स्कैन (G), जिसका स्थान डैश्ड लाल रेखा द्वारा इंगित किया गया है (A) रंग में विभिन्न छवियों से मिलान कर रहे हैं (A) करने के लिए (F). निचले कोने पर संख्या औसत SBRs देखने के पूरे क्षेत्र के लिए मापा जाता है. स्केल बार 5 डिग्री (15से संशोधित ) है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5. kymographs के उदाहरण. (क) 0.2 एफपीएस पर अधिग्रहीत समय-चूक फिल्मों से उत्पन्न माइक्रोट्युबल गतिशीलता के किमोग्राफ उदाहरण। (ख) किमोग्राफ में 100 एफपीएस पर प्राप्त फिल्म से उत्पन्न संकुचन घटना का एक उदाहरण दर्शाया गया है। डैश्ड रेखाएँ बीजों को चिह्नित करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6. IRM के साथ छवि सोने नैनोकणों का उदाहरण। आकार 20 और 40 एनएम के सोने के नैनोकणों निष्क्रिय सतह से जुड़े थे। 10 छवियों का अधिग्रहण किया गया. पृष्ठभूमि घटाव के बाद, छवियों के विपरीत बढ़ाने के लिए औसत थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 7. IRM छवियों में Microtubule लंबाई ट्रैकिंग परिशुद्धता. स्थिर microtubules (यानी, निश्चित लंबाई) 100 एफपीएस पर 200x छवि थी तो इसके विपरीत बढ़ाने के लिए 10 एफपीएस के लिए औसत. इसके बाद, माइक्रोट्युब्यूल्स की लंबाई को फिएस्टा17 ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मापा गया। प्रत्येक माइक्रोट्युबल के लिए माध्य लंबाई और मानक विचलन की गणना की गई थी जैसा कि चित्र में दर्शाया गया है (डैश्ड रेखा माध्य का प्रतिनिधित्व करती है और ठोस लाल रेखाएँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं, लंबाई ] 3971 ] 20 दउ। समग्र ट्रैकिंग परिशुद्धता सभी ट्रैक किए गए microtubules के मानक विचलन का औसत था (द ] 6 microtubules x 20 डेटा अंक ] 120 डेटा अंक). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अनुपूरक फाइल 1. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
अनुपूरक फाइल 2. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
Discussion
इस प्रोटोकॉल इमेजिंग और microtubule गतिशीलता की माप के लिए IRM के सफल उपयोग का प्रदर्शन किया. ध्यान सही ढंग से रोशनी संख्यात्मक एपर्चर सेट के रूप में यह छवि विपरीत पर सबसे मजबूत प्रभाव पड़ता है दिया जाना चाहिए. इसके अलावा, उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) उद्देश्यों का उपयोग कर उच्च संकल्प / उच्च विपरीत छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में उच्च एनए उद्देश्य कम एनए उद्देश्यों की तुलना में उच्च प्रकाश संग्रह शक्ति है. क्लीनर सतह और समाधान कम शोर का इस्तेमाल किया के रूप में गंदगी समाप्त होता है सतह के लिए संलग्न और जोड़ने (प्रयोग के दौरान) छवियों के लिए शोर की तरह धब्बे. एक पृष्ठभूमि छवि का अधिग्रहण महत्वपूर्ण है और साथ ही यह रोशनी inhomogeneities, स्थिर शोर और सतह अनियमितताओं को हटा.
एक सिफारिश संशोधन रोशनी पथ में एक लंबे पास फिल्टर (gt; 600 एनएम) शुरू करने के लिए है। सफेद प्रकाश स्रोतों के स्पेक्ट्रम आम तौर पर यूवी जो microtubules नुकसान कर सकते हैं में तरंगदैर्ध्य शामिल हैं. इसके अलावा, IRM के लिए लंबी लहर लंबाई का उपयोग कर काम में आता है जब फ्लोरोसेंट के साथ IRM संयोजन (उदाहरण के लिए, जब microtubule गतिशीलता पर microtubule जुड़े प्रोटीन (MAPs) के प्रभाव का अध्ययन). ध्यान रखें कि जब समय की व्यय अवधि के लिए इमेजिंग, नमूना बहाव (विशेष रूप से ऑप्टिकल अक्ष के साथ) पृष्ठभूमि विमान से छवि विमान के विचलन के कारण छवि इसके विपरीत कम हो जाती है. आधुनिक माइक्रोस्कोप अक्सर स्थिरीकरण तंत्र (उदाहरण के लिए, सही ध्यान (Nikon), निश्चित फोकस.2 (ज़िस), IX3-जेडडीसी 2 (ओलम्पस) के साथ सुसज्जित हैं। एक वैकल्पिक समाधान है कि सेटअप को निष्क्रिय रूप से या सक्रिय रूप से18 को स्थिर किया जाए या बहाव19,20,21के लिए सही किया जाए . अंत में, microtubule इसके विपरीत क्षेत्र डायाफ्राम के आकार को कम करने से बढ़ाया जा सकता है (एक 70% खोलने अच्छा विकल्प है के रूप में यह बढ़ती इसके विपरीत और देखने के आकार के क्षेत्र के बीच एक संतुलन है)15.
जबकि IRM इमेजिंग microtubules के लिए उपयुक्त है यह पर्याप्त संवेदनशील नहीं है एकल प्रोटीन का पता लगाने के लिए. इस तरह के आवेदन के लिए, iSCAT एक अधिक उपयुक्त तकनीक है. इसी तरह, फ्लोरोसेंट और iSCAT बेहतर अनुकूल हैं अगर कम से कम 10 एनएम की सटीक ट्रैकिंग की जरूरत है. IRM के लिए, मापित लंबाई ट्रैकिंग परिशुद्धता $20 दउ है जैसा कि चित्र 7में दर्शाया गया है।
सतह पराख में IRM का उपयोग microtubules से परे जा सकते हैं; उदाहरण के लिए, आणविक मोटर्स सोने नैनोकणों के साथ लेबल और ट्रैक के रूप में वे microtubules के साथ बातचीत कर सकते हैं. इसके अलावा चिंतनशील हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (आरआईसीएम)22 के रूप में जाना जाता IRM का एक और अधिक उन्नत रूप, सिद्धांत रूप में, आगे microtubules इसके विपरीत बढ़ाने के लिए और उच्च ट्रैकिंग परिशुद्धता प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Disclosures
लेखकों के हित का कोई संघर्ष नहीं है खुलासा करने के लिए.
Acknowledgments
लेखक अन्ना Luchniak और यिन-वी कुओ महत्वपूर्ण पढ़ने और प्रोटोकॉल पर टिप्पणी के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
| 50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
| NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
| Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
| plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
| Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
| 40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
| 20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
| Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048x2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
| Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
| Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |
References
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