Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Gjennomføring av interferens refleksjon mikroskopi for Label-fri, High-Speed Imaging av Mikrotubuli

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/59520

Summary

Denne protokollen er en guide for å implementere interferens refleksjon mikroskopi på et standard fluorescens mikroskop for etikett-fri, høy kontrast, høyhastighets avbildning av mikrotubuli bruker in vitro overflater analyser.

Abstract

Det finnes flere metoder for å visualisere renset biomolekyler nær overflater. Total-intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi er en vanlig metode, men har den ulempen at det krever fluorescerende merking, noe som kan forstyrre aktiviteten av molekylene. Også, photobleaching og photoskade er bekymringer. I tilfelle av mikrotubuli, har vi funnet at bilder av lignende kvalitet til TIRF kan fås ved hjelp av interferens refleksjon mikroskopi (IRM). Dette tyder på at IRM kan være en generell teknikk for å visualisere dynamikken i store biomolekyler og oligomers in vitro. I dette dokumentet viser vi hvordan et fluorescens mikroskop kan endres bare for å få IRM-bilder. IRM er enklere og betydelig billigere å implementere enn andre kontrast teknikker som differensial forstyrrelser kontrast microcopy eller henvise spredning mikroskopi. Det er også mindre utsatt for overflate defekter og løsnings urenheter enn darkfield mikroskopi. Ved hjelp av IRM, sammen med bildeanalyse programvaren som er beskrevet i dette dokumentet, er synsfeltet og bildefrekvensen bare begrenset av kameraet. med et sCMOS-kamera og bred felts belysning mikrotubulinettverket lengde kan måles med presisjon opp til 20 NM med en båndbredde på 10 Hz.

Introduction

Label-fri avbildning av mikrotubuli er av interesse som det omgår behovet for fluorescerende merking av tubulin å generere kontrast i bildene. Fluorescerende merking har flere ulemper: det er ikke gjennomførbart hvis protein konsentrasjonen er lav1 og photobleaching og photoskade begrense observasjons tiden. Flere teknikker har blitt brukt til bilde Label-fri mikrotubuli, inkludert video-forbedret differensial forstyrrelser kontrast mikroskopi (dic) og darkfield mikroskopi2,3,4,5. Nylig, henvise spredning mikroskopi (iSCAT)6, roterende-sammenhengende-spredning MIKROSKOPI (ROCS)7 og romlig lys interferens mikroskopi (Slim)8, har også blitt brukt. Alle disse teknikkene er i stand til Imaging mikrotubuli og har vist seg å være verdifullt for å studere mikrotubulinettverket dynamikk. Men hver har sine egne begrensninger. I DIC kontrasten avhenger av vinkelen mellom mikrotubulinettverket og Nomarski prisme aksen.  I darkfield er det mikrotubulinettverket signalet degradert av spredt lys fra urenheter eller overflater defekter. Selv iSCAT utstillinger ekstraordinære følsomhet (ned til enkelt proteiner) og ROCS kan bildet mikrotubuli dypere inn i prøven, begge metodene er teknisk krevende, krever laser skannere.

Denne protokollen demonstrerer hvordan interferens refleksjon mikroskopi (IRM)9,10 kan settes opp som en alternativ teknikk for Label-fri avbildning av mikrotubuli. IRM er enkelt å implementere ettersom det bare krever et billig 50/50 speil til et standard fluorescerende mikroskop. Når den brukes sammen med programvaren som er beskrevet her, produserer IRM høy kontrast mikrotubulinettverket bilder, kan bildet store visningsfelt ved høy hastighet, krever en en gangs justering, og kan enkelt kombineres med andre teknikker som fluorescens Imaging.

Protocol

1. endring av mikroskop og objektiv objektiv

  1. Sett inn et 50/50 speil i filter hjulet på det fluorescerende mikroskopet ved hjelp av en passende filter kube (figur 1). Håndter 50/50 speilet med forsiktighet så ofte de har anti-refleksjon belegg.
    Merk: vi brukte et 50/50 speil i en tom filter kube av mikroskopet. Det 50/50 speil er satt inn der dichroic speilet er plassert.
  2. Bruk en høy forstørrelse/høy NA olje mål.
    Merk: i denne protokollen brukte vi et mål på 100 a/1.3 NA.

2. kammer forberedelse til å overholde mikrotubuli til overflaten

  1. Rengjør mikroskop glass og 22 mm x 22 mm coverslips (for stående mikroskop) eller 22 mm x 22 mm og 18 mm x 18 mm coverslips (for invertert mikroskop). Endre overflaten etter behov. For eksempel, rengjør coverslips ved hjelp av et alkalisk vaskemiddel (se tabell over materialer) etterfulgt av 100% etanol med destillert vann vasker i mellom og etter11.
  2. Skjær 3 mm brede strimler av plast para fin film (se tabell over materialer) ved hjelp av et barberblad og et annet mikroskop lysbilde som en kant.
  3. Plasser to plastikk parafin film strimler 3 mm fra hverandre på en ren 22 x 22mm deksel slip. Deretter plasseres en 18 mm x 18 mm dekkglass for å danne en kanal. Hvis du bruker et stående mikroskop, plasserer du stripene oppå et rent mikroskop og plasserer en dekkglass oppå.
  4. Plasser dekkglass (eller skyve) på en varme blokk ved 100 ° c for 10-30 s for para fin filmen for å danne en forseglet kanal.
  5. Strømning i 50 μg/mL av antistoff (i Brinkley buffer 1980 (BRB80)) ved å bruke en pipette. Ruge i 10 min.
    Merk: vi bruker anti-rhodamine antistoffer for å binde rhodamine-merket mikrotubulinettverket frø til overflaten. Alternativt kan avidin brukes til å binde biotin-merkede mikrotubulinettverket frø eller til biotinylated gull partikler. For å bare se på mikrotubuli i fravær av tubulin i løsningen (dvs. en ikke-dynamisk analysen), kan et anti-tubulin antistoff brukes.
  6. Vask fem ganger med BRB80 buffer. Det anbefales å filtrere løsningene ved hjelp av et filter på 0,22 μm.
  7. Flow i 1% poloksamer 407 (en triblock kopolymer) i BRB80 å blokkere overflaten mot ikke-spesifikk binding. Ruge i 10 min.
  8. Vask fem ganger med BRB80 buffer.
  9. Prøven er klar til å plasseres på mikroskopet. For å hindre at prøven tørker ut, Legg to dråper BRB80 buffer på endene av kanalen og etterfylle ved behov.

3. justering av mikroskop

  1. Plasser prøven på scenen på mikroskopet. Slå på Epi-belysning lyskilde.
  2. Fokuser på prøveoverflaten. Du vil observere flere overflater som målet er flyttet opp og ned på grunn av tilbake refleksjon av lys fra optikk innenfor den optiske banen. En god metode for å finne prøven overflaten er å fokusere på parafin film kanten. Når overflaten er funnet, setter synsfeltet til sentrum av kammeret.
  3. Midtstill felt membranen i synsfeltet ved å lukke den halvveis og bruke justeringsskruene. Når den er justert, åpner du membranen på nytt.
    Merk: skrue justeringen må bare gjøres sporadisk, kanskje hver 3-6 måneder eller når feilsøking.
  4. Skyv inn Bertrand-objektivet for å vise utgangs eleven (det bakre fokalplanet) for målet.
  5. Lukk blenderåpning membranen (AD) utover kantene på exit elev av målet.
  6. Bruk justeringsskruene til å sentrere ANNONSEN med avslutnings Eleven. Dobbeltsjekk ved å åpne AD og matche kantene med de av exit elev.
    Merk: denne justeringen må bare gjøres sporadisk.
  7. Sett blenderåpningen membranen til ca 2/3 av NA av målet. Se avsnitt 7 for detaljerte fremgangsmåter for å optimalisere blenderåpningen.

4. Imaging stabilisert mikrotubuli eller 40 nm gull partikkel

Merk: stabilisert mikrotubuli og gull nanopartikler fungerer som gode kontroll prøver. Det anbefales å bilde overflaten festet mikrotubuli eller gull nanopartikler som et første skritt for å vurdere IRM ytelse og hjelp til å sette den optimale blenderåpning membran åpning (§ 7).

  1. Still eksponeringstid på kameraet til 10 MS og justere belysningen til nesten mette kameraets dynamiske rekkevidde.
  2. Flow i 10 μL av guanylyl-(Alpha, beta)-metylen-diphosphonate (GMPCCP)-eller taxol-stabilisert mikrotubuli i BRB804,12,13 (eller 40 nm gull partikler) ved å bruke en pipette til en frisk prøve og overvåke bindende ved å avbilde overflaten. Når 10-20 mikrotubuli er bundet innen synsfeltet, vask prøven 2x med BRB80.
    Merk: med et godt justert mikroskop bør mikrotubuli være synlig uten bakgrunns subtraksjon.
  3. Erverve 10 profilen av innfatning en tid lapse med 1 andre forsinkelsen periode for 10 sekunder (for 10 MULTIPLE SCLEROSIS avsøring).
  4. Skaff deg et bakgrunnsbilde. For å gjøre dette, flytte scenen ved hjelp av scenen kontrolleren eller dataprogrammer langs kanalen lange aksen mens anskaffe 100 bilder uten forsinkelse (dvs. streaming nær 100 fps @ 10 MS eksponering).
    Merk: bakgrunnen er medianen i 100-bildene. Ved å ta medianen bevares belysnings profilen og andre stasjonære funksjoner som smuss på optikk, mens alt annet filtreres ut. Det bør ikke være noen vippe på prøven da dette vil føre til endring i aksial posisjon som scenen er flyttet og til slutt forringe bakgrunnsbildet. Hvis Tilt ikke kan unngås, så en alternativ metode er å erverve gjennomsnitt bakgrunnsbilder før flyter frøene.
  5. Gå til trinn 6 for å behandle og analysere bildene.

5. Imaging mikrotubulinettverket dynamikk

  1. For mikrotubulinettverket dynamikk ved hjelp av hjerne tubulin, Still prøve varme temperaturen til 37 ° c.
  2. Flow i 10 μL av GMPCCP-stabilisert mikrotubulinettverket frø i BRB8011 ved å bruke en pipette til en frisk prøve og overvåke dem binding til overflaten ved å avbilde overflaten Live (dvs. mens streaming). Når 10-20 frø er bundet med synsfelt, vask prøven med 2x kanal volum med BRB80 (BRB80 skal prewarmed til 37 ° c eller i det minste ved romtemperatur).
    Merk: med et godt justert mikroskop bør frøene være synlige uten bakgrunns subtraksjon.
  3. Flow i polymerisering mix (7,5 μM umerkede tubulin + 1 mM guanosin trifosfat (GTP) + 1 mM Dithiotreitol (DTT) i BRB80 buffer). For å måle mikrotubulinettverket vekst, angi en tidsforløp ved hjelp av oppkjøpet programvare for å få et bilde hvert 5 sekunder (0,2 bilder per sekund (FPS)) i 15 minutter.
  4. Å forsterke kontrasten, erverve 10 profilen (istedet for ettall) for hver tid punkt og middel seg. For mikrotubulinettverket krymping, få bilder på 100 fps ved å sette tidsforsinkelsen til 0 og en eksponeringstid på 10ms (høyere FPS er mulig med mindre områder av interesse avhengig av kameraet som brukes).
  5. Skaff deg et bakgrunnsbilde som i trinn 4,4.

6. bildebehandling og analyse

Merk: for analyse, bruker denne protokollen Fiji14 , men leseren er gratis å bruke programvare hun/han finner egnet.

  1. Åpne lagrede bakgrunnsbilder.
  2. Beregn median bildet (dvs. bakgrunn) ved hjelp av bilde ≫ stable ≫ Z-prosjekt ≫ median.
  3. Åpne mikrotubulinettverket Dynamics-film som en stabel (samme for ikke-dynamisk mikrotubuli) ved hjelp av fil ≫ åpne.
  4. Trekk bakgrunnsbildet fra stabelen ved hjelp av prosess ≫ bilde kalkulator. Sørg for å sjekke "32Bit (float) resultat" alternativet.
  5. For dynamiske mikrotubuli kan du bruke linjeverktøyet til å tegne en linje langs mikrotubulinettverket og legge den til i regionen av interesse lederen ved å trykke på "t". Gjenta for alle mikrotubuli av interesse.
  6. For dynamiske mikrotubuli kan du kjøre multi-Kymo-makroen (tilleggsfil 1). Makroen vil generere en video og en kymograph for hver mikrotubulinettverket i ROI Manager. Hver mikrotubulinettverket vil få en unik identifikator.
  7. For dynamiske mikrotubuli kan du kjøre Kymo-analyse-makroen (tilleggsfil 2) og følge fremgangsmåten for å måle vekstrater og svinn rater for mikrotubuli.

7. blender membran størrelse

Merk: en viktig faktor for å oppnå høy kontrast bilder av mikrotubuli ved hjelp av IRM er å sette belysning numerisk blenderåpning (Ina) riktig10,15. Den Ina kan endres ved å endre størrelsen på innkommende lysstrålen på målet er exit elev som styres av størrelsen på AD (ad er plassert på et bøy plan med exit elev (tilbake fokalplanet) av målet , Figur 1):
Equation
der DAd er diameteren på blenderåpning membranen, fmålet er brennvidde på målet og DEP er målet er exit elev diameter. Vanligvis er AD venstre helt åpen for fluorescens Imaging, så Ina lik målet ' s na. I et fluorescens mikroskop, indikerer AD skalaen ikke sin diameter, dermed Ina kan ikke beregnes. Det er mulig å kalibrere AD størrelse ved hjelp av en objektiv. Likevel, det er ikke nødvendig siden annonsestørrelsen ville være fast til den størrelsen som gir den høyeste kontrasten.

  1. Forbered en prøve av fluorescensmerkete merket stabilisert mikrotubuli fast til overflaten (trinn 4.1-4.2).
    Merk: vi brukte tetramethylrhodamine merket mikrotubuli16 (Ex: 550 NM, Em: 580 NM).
  2. Bring mikrotubuli i fokus ved hjelp av mikroskopet med fokuserings knotten mens fluorescensmerkete Imaging dem (hvis mikrotubuli ikke er merket, bilde dem med IRM15 eller dic5).
  3. Angi kamera eksponering til 10 MS ved hjelp av kameraprogramvaren.
    Merk: denne eksponeringen er vilkårlig og en eksponering av 100 MS vil også fungere.
  4. Lukk AD til minste åpning. Juster belysningen til å nesten mette kameraets dynamiske område eller til det maksimale mulige.
    Merk: som en guide, bruker du slå opp tabellen vanligvis gitt av oppkjøpet programvare.
  5. Skaff deg 10 bilder (ved å strømme eller ta et bilde hvert sekund) av et synsfelt som inneholder 10 + mikrotubuli.
  6. Skaff deg et bakgrunnsbilde som i trinn 4,4.
  7. Endre størrelsen på AD og gjenta trinn 7.5-7.6 for hele annonse åpnings området (fra lukket til exit eleven størrelse, figur 2). Hver gang annonsestørrelsen endres, justerer du lysstyrken slik at den samsvarer med trinn 7,4.
  8. For hvert felt av visningen ervervet, subtrahere den tilsvarende bakgrunn ved hjelp av prosess > bilde kalkulator og velge "subtrahere" fra rullegardinmenyen. Kontroller at "32Bit (float) resultat" alternativet er sjekket. Deretter gjennomsnittlig de resulterende bildene ved hjelp av bilde > stable ≫ Z prosjekt > gjennomsnitt.
  9. Mål signal-til-bakgrunn støy ratio (SBR) av mikrotubuli definert som den gjennomsnittlige intensiteten av mikrotubulinettverket signal (intensiteten av mikrotubulinettverket minus intensiteten av bakgrunnen) dividert med standardavviket i bakgrunnen ( Figur 3).
  10. Bestem den optimale AD størrelse (dvs. optimal Ina) ved å beregne gjennomsnittlig SBR av mikrotubuli for hver åpning størrelse og sett ad størrelse til den som produserer den høyeste SBR (figur 2). Det er mulig at det er en rekke AD størrelser som produserer sammenlignbare kontrast15.

Representative Results

Som nevnt ovenfor, med et godt justert mikroskop, bør mikrotubuli være synlig uten bakgrunn subtraksjon (figur 4a). Hvis du trekker fra bakgrunnen (figur 4b), forbedres kontrasten i Mikrotubulinettverket (figur 4c). For ytterligere å forbedre kontrasten, snitt eller Fourier-filtrering eller en kombinasjon av begge kan brukes (figur 4d, F, E). Linjen skanner i figur 4G viser trinnvis forbedring av bildekvalitet. Legg merke til reduksjonen av bakgrunnsstøy med hvert behandlingstrinn.

Eksempler på kymographs av mikrotubulinettverket dynamikk generert fra tidsforløp filmer vises i figur 5. Videoene ble kjøpt på to bildefrekvenser: 0,2 fps (sakte) og 100 fps (rask). Den førstnevnte er egnet for å måle vekstrater, mens sistnevnte er mer egnet for å måle krymping hastighet som er en størrelsesorden raskere enn vekstraten.

For tilfeller der gull nanopartikler brukes til å sette opp mikroskopet, vises et eksempel bilde i figur 6. Gull nanopartikler ble passivt festet til overflaten. Mens 40 nm partikler anbefales, er det også mulig å avbilde 20 NM partikler, men på en lavere kontrast.

Figure 1
Figur 1. Skjematisk representasjon av IRM. (A) Epi-belysning fra lyskilden passerer gjennom blenderåpningen membranen før den når 50/50 speilet. Blenderåpningen membran setter strålen bredde dermed belysning NA. 50/50 speilet reflekterer delvis lyset opp til målsettingen for å belyse prøven. Lys reflekteres fra prøven er samlet og deretter projisert på kamera brikken (av røret linsen) der det forstyrrer å generere bildet. Bilde kontrast er et resultat av forstyrrelsen mellom lyset som reflekteres fra glass/vann-grensesnittet (i1) og lyset som reflekteres fra vann/mikrotubulinettverket-grensesnittet (I2). Avhengig av mikrotubulinettverket/overflate avstanden (h), vil den optiske bane forskjellen mellom i1 og i2 resultere i et konstruktivt (skarpt signal) eller ødeleggende (mørkt signal) eller noe i mellom. For eksempel, hvis lys med en bølgelengde på 600 NM brukes til bildebehandling, vil kontrasten veksle mellom mørke og lyse når mikrotubulinettverket høyde endres med ca 100 NM. Stjernen angir bøy plan (endret fra15). (B) eksempel på installasjon av 50/50-speilet. En passende filter kube ble åpnet og speilet ble satt inn der et dichroic speil vanligvis sitter. Speilet var orientert som per produsent instruksjoner. Deretter ble kuben satt inn i filter hjulet som ble satt tilbake til mikroskopet (ikke vist). Under installasjonen ble hansker brukt, og speilet ble bare holdt av kantene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Optimal blenderåpning. (A) samme synsfelt ble avbildet ved forskjellige blenderåpninger uten bakgrunn subtraksjon. Visuelt, kontrasten økt som størrelsen på blenderåpningen membranen økt til den nådde et platå og begynte å brytes ned etterpå. Dette ble bekreftet av (B) SBR målinger av bakgrunnen trekkes bilder. Feilfelt er standardavvik.  Vektstenger er 500 μm (AD) og 3 μm (mikrotubuli). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Måle signal-til-bakgrunn støyforhold. Mikrotubuli ble isolert i områder av interesse. Hver region av interesse var thresholded å skille mikrotubulinettverket fra bakgrunnen. Den gjennomsnittlige mikrotubulinettverket signalet ble innhentet fra en linjeskanning over mikrotubulinettverket. Bredden på skanne linjen ble satt til lik mikrotubulinettverket lengde. På denne måten er hvert punkt på skanningen et gjennomsnitt av signalene fra alle bildepunkter langs mikrotubulinettverket akse som er parallelt med dette punktet. Bakgrunnsstøyen er standardavviket for alle pikslene under terskelen avskåret.  Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Bildebehandling. Etter å ha innhentet RAW-bilder (A), ble bakgrunnen (B) trukket (C) for å forsterke mikrotubulinettverket kontrast. For ytterligere å forbedre kontrasten bildene var enten gjennomsnitt (D) eller Fourier-filtrert (E) eller begge (F). Linjen skanner (G), hvis plassering er angitt med den stiplede røde linjen i (a) er farge matchet til de ulike bildene i (a) til (F). Tallene i det nedre hjørnet er gjennomsnittlig SBRs målt for hele synsfeltet. Skalaen stang er 5 μm (modifisert fra15). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Eksempler på kymographs. (A) Kymograph eksempler på mikrotubulinettverket dynamikk generert fra tid-lapse filmer ervervet på 0,2 fps. (B) Kymograph skildrer et eksempel på en krymping hendelse generert fra en film ervervet på 100 fps. Stiplede linjer markerer frøene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Eksempel på gull nanopartikler avbildet med IRM. Gull nanopartikler av størrelser 20 og 40 nm ble passivt festet til overflaten. 10 bilder ble anskaffet. Etter at bakgrunnen ble subtraksjon, var bildene i gjennomsnitt å forbedre kontrasten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7. Mikrotubulinettverket lengde sporings presisjon i IRM-bilder. Stabilisert mikrotubuli (dvs. faste lengder) ble avbildet 200x på 100 fps deretter gjennomsnitt til 10 fps for å forbedre kontrasten. Neste, mikrotubuli ' lengder ble målt ved hjelp av Fiesta17 sporing programvare. For hver mikrotubulinettverket gjennomsnittlig lengde og standardavvik ble beregnet som vist i figuren (stiplet linje representerer gjennomsnittet og faste røde linjer representerer standardavviket, lengde = 3971 ± 20 NM. Den totale sporings presisjonen var gjennomsnittet av standardavviket for alle sporede mikrotubuli (n = 6 mikrotubuli x 20 datapunkter = 120 datapunkter). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilleggsfil 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen. 

Tilleggsfil 2. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen. 

Discussion

Denne protokollen viste vellykket bruk av IRM for avbildning og måling av mikrotubulinettverket dynamikk. Forsiktighet bør gis til riktig sette belysning numerisk blenderåpning som den har den sterkeste innvirkning på bildet kontrast. Også ved hjelp av høy numerisk blenderåpning (NA) mål er viktig for å få høy oppløsning/høy kontrast bilder, som høyere NA objektiv har høyere lys samle makt i forhold til lav NA mål. Renere overflaten og løsninger som brukes lavere støy som smuss ender opp feste til overflaten og legge til (i løpet av eksperimentet) speckle som støy til bildene. Oppkjøp av et bakgrunnsbilde er viktig, så vel som det fjerner belysning inhomogeneities, statisk støy og overflate uregelmessigheter.

En anbefalt modifikasjon er å innføre et langt pass filter (> 600 NM) i belysnings banen. Spekteret av hvite lyskilder inneholder vanligvis bølgelengder i UV som kan skade mikrotubuli. I tillegg er bruk av Langbølge lengde for IRM nyttig når du kombinerer IRM med fluorescens (f.eks. Når du studerer effekten av mikrotubulinettverket tilknyttede proteiner (kart) på mikrotubulinettverket dynamikk). Vær oppmerksom på at når Imaging for brukt tid, sample drift (spesielt langs den optiske aksen) reduserer bildekontrasten på grunn av avviket i bildet planet fra bakgrunnen planet. Moderne mikroskop er ofte utstyrt med stabiliserings mekanismer (f.eks. perfekt fokus (Nikon), bestemt fokus. 2 (Zeiss), IX3-ZDC2 (Olympus)). En alternativ løsning er å termisk stabilisere oppsettet enten passivt eller aktivt18 eller ved å korrigere for drift19,20,21. Til slutt kan mikrotubulinettverket kontrast økes ved å redusere størrelsen på feltet membran (en 70% åpning er godt valg som det er en balanse mellom økende kontrast og synsfelt størrelse)15.

Selv om IRM er egnet for bilde mikrotubuli, er det ikke følsomt nok til å oppdage enkelt proteiner. For slik anvendelse, er iSCAT en mer egnet teknikk. På samme måte er fluorescens og iSCAT bedre egnet hvis det er behov for å spore presisjon på mindre enn 10 NM. For IRM er den målte lengden på sporings presisjonen ~ 20 NM som vist i figur 7.

Bruk av IRM i overflate analyser kan gå utover mikrotubuli; for eksempel kan molekylære motorer merkes med gull nanopartikler og spores når de samhandler med mikrotubuli. I tillegg en mer avansert form for IRM kjent som reflekterende interferens kontrast mikroskopi (RICM)22 kan i prinsippet brukes til å ytterligere forsterke mikrotubuli kontrast og oppnå høyere sporing presisjon.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Anna Luchniak og Yin-Wei Kuo for kritisk lesing og kommentarer på protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Nikon Ti-Eclipse An inverted microscope used for perfoming the expriments
50/50 beam splitter Chroma 21000 When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective Nikon MRH02902 Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3
Mucasol universal detergent Sigma-aAldrich Z637181-2L Used for cleaning coverslips and slides
plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) Sigma-aAldrich P7793 Used for constructing flow channels
Anti-TAMRA antibody Invitrogen A-6397 Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196)
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) Sigma-aAldrich Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding
40 nm gold nanoparticles Sigma-aAldrich 753637 Used as a control sample
20 nm gold nanoparticles Sigma-aAldrich 753610 Used as a control sample
Zyla 4.2 Camera Andor Zyla 4.2 2048x2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range
Feista tracking software https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA
Stabilized microtubles prepared in house (see references in text)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  2. Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  3. Hotani, H., Horio, T. Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability. Cell Motility and the Cytoskeleton. 10 (1-2), 229-236 (1988).
  4. Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).
  5. Bormuth, V., Howard, J., Schäffer, E. LED illumination for video-enhanced DIC imaging of single microtubules. J Microsc. 226 (Pt 1), 1-5 (2007).
  6. Andrecka, J., Ortega Arroyo, J., Lewis, K., Cross, R. A., Kukura, P. Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy. Biophysical Journal. 110 (1), 214-217 (2016).
  7. Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
  8. Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-Free Imaging of Single Microtubule Dynamics Using Spatial Light Interference Microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
  9. Curtis, A. S. G. The Mechanism of Adhesion of Cells to Glass. The Journal of Cell Biology. 20 (2), 199-215 (1964).
  10. Weber, I. [2] Reflection interference contrast microscopy. Methods in Enzymology. 361, 34-47 (2003).
  11. Gell, C., et al. Chapter 13 - Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
  12. Nitzsche, B., et al. Chapter 14 - Studying Kinesin Motors by Optical 3D-Nanometry in Gliding Motility Assays. Methods in Cell Biology. 95, 247-271 (2010).
  13. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
  16. Hyman, A., et al. [39] Preparation of modified tubulins. Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1991).
  17. Ruhnow, F., Zwicker, D., Diez, S. Tracking Single Particles and Elongated Filaments with Nanometer Precision. Biophysical Journal. 100 (11), 2820-2828 (2011).
  18. Mahamdeh, M., Schäffer, E. Optical tweezers with millikelvin precision of temperature-controlled objectives and base-pair resolution. Optics Express. 17 (19), 17190-17199 (2009).
  19. Kim, K., Saleh, O. A. Stabilizing method for reflection interference contrast microscopy. Applied Optics. 47 (12), 2070-2075 (2008).
  20. Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
  21. Carter, A. R., King, G. M., Ulrich, T. A., Halsey, W., Alchenberger, D., Perkins, T. T. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).
  22. Limozin, L., Sengupta, K. Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion. ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).

Tags

Tilbaketrekking interferens refleksjon mikroskopi Label-fri avbildning av store biomolekyler in vitro overflate analyser mikrotubulinettverket dynamikk høyhastighets Imaging bildeanalyse
Gjennomføring av interferens refleksjon mikroskopi for Label-fri, High-Speed Imaging av Mikrotubuli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahamdeh, M., Howard, J.More

Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules. J. Vis. Exp. (150), e59520, doi:10.3791/59520 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter