Summary
Этот протокол является руководством для реализации микроскопии отражения помех на стандартном флуоресцентном микроскопе для безэтикетки, высококонтрастной, высокоскоростной визуализации микротрубок с использованием анализов поверхностей in vitro.
Abstract
Существует несколько методов визуализации очищенных биомолекул вблизи поверхностей. Полностью внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) микроскопии является широко используемым методом, но имеет недостаток, что он требует флуоресцентной маркировки, которая может помешать деятельности молекул. Кроме того, фотоотбеление и фотоповреждения являются проблемами. В случае микротрубок, мы обнаружили, что изображения аналогичного качества TIRF могут быть получены с помощью микроскопии отражения помех (IRM). Это говорит о том, что IRM может быть общим методом визуализации динамики крупных биомолекул и олигомеров in vitro. В этой работе мы показываем, как флуоресцентный микроскоп может быть модифицирован просто для получения изображений IRM. IRM проще и значительно дешевле в реализации, чем другие методы контраста, такие как дифференциальная интерференция контрастной микроскопии или интерферометрической рассеяния микроскопии. Он также менее восприимчив к поверхностным дефектам и примесям раствора, чем микроскопия темного поля. Использование IRM, вместе с программным обеспечением для анализа изображений, описанным в настоящем документе, поле зрения и частота кадров ограничены только камерой; с помощью камеры sCMOS и широкоугольной длины микротрубока можно измерить с точностью до 20 нм с пропускной способностью 10 Гц.
Introduction
Без этикетки изображение микротрубок представляет интерес, поскольку она обходит необходимость флуоресцентной маркировки тубулина для создания контраста в изображениях. Флуоресцентная маркировка имеет несколько недостатков: это невозможно, если концентрация белка низкая 1, а фотоотбеление и фотоповреждение ограничивают время наблюдения. Несколько методов были использованы для изображения этикетки без микротрубок, в том числе видео-улучшенный дифференциальной интерференции контрастной микроскопии (DIC) и темного поля микроскопии2,3,4,5. В последнее время также использовались интерферометрическая микроскопия рассеяния (iSCAT)6,вращающаяся когеренно-рассеянная микроскопия (ROCS)7 и пространственная световая микроскопическая микроскопия (SLIM)8. Все эти методы способны к визуализации микротрубок и оказались полезными для изучения динамики микротруб. Тем не менее, каждый из них имеет свои собственные ограничения. В DIC контраст зависит от угла между микротрубоком и осью номарской призмы. В темном поле, сигнал микротрубока деградирует рассеянным светом от примесей или дефектов поверхностей. Хотя iSCAT проявляет чрезвычайную чувствительность (вплоть до отдельных белков) и ROCS может изображение микротрубочек глубже в образец, оба метода являются технически требовательными, требующие лазерных сканеров.
Этот протокол демонстрирует, как микроскопия отражения помех (IRM)9,10 может быть создана в качестве альтернативного метода для без этикетки изображения микротрубок. IRM легко реализовать, поскольку он требует только добавление недорогого зеркала 50/50 к стандартному флуоресцентному микроскопу. При использовании в сочетании с программным обеспечением, описанным здесь, IRM производит высококонтрастные микротрубчатые изображения, может изображения больших полей зрения на высокой скорости, требует однократного выравнивания, и может быть легко объединена с другими методами, такими как флуоресценция изображений.
Protocol
1. Модификация микроскопа и объективная линза
- Вставьте зеркало 50/50 в фильтрованное колесо флуоресцентного микроскопа с помощью соответствующего кубика фильтра(рисунок 1). Ручка 50/50 зеркало с осторожностью, как часто они имеют анти-отражения покрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали зеркало 50/50 в пустом кубе фильтра микроскопа. Зеркало 50/50 вставляется там, где находится дихроическое зеркало. - Используйте высокое увеличение / высокое NA нефти цели.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы использовали цель 100x/1.3 NA.
2. Камерная подготовка к присоединению микротрубочки к поверхности
- Чистые слайды микроскопа и 22 мм х 22 мм крышки (для вертикального микроскопа) или 22 мм х 22 мм и 18 мм х 18 мм крышки (для перевернутых микроскопов). Изменять поверхность по мере необходимости. Например, очистить крышки с помощью щелочным моющим средством (см. Таблица материалов), а затем 100% этанола с дистиллированной воды моет между и после11.
- Вырезать 3 мм широкие полосы пластиковой парафина пленки (см. Таблица материалов) с помощью лезвия бритвы и другой слайд микроскопа в качестве края.
- Поместите две пластиковые полоски парафина пленки 3 мм друг от друга на чистой 22 х 22 мм крышка скольжения. Затем поместите 18 мм х 18 мм coverslip сформировать канал. При использовании вертикального микроскопа, поместите полосы поверх чистого слайда микроскопа, а затем поместите coverslip на вершине.
- Поместите coverslip (или слайд) на теплоблок на 100 градусов по Цельсию для 10-30 с для парафина пленки, чтобы сформировать запечатанный канал.
- Поток в 50 мкг/мл антител (в Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) путем перфузии с помощью пипетки. Инкубировать в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем антитела против родамина, чтобы связать семена микротрубочек с маркировкой родамин на поверхность. Кроме того, авидин может быть использован для связывания семян микротрубочек с этикеткой на биотине или для биотинилатированных частиц золота. Чтобы просто посмотреть на микротрубочки при отсутствии тубулина в растворе (т.е. нединамическом анализе), можно использовать антитубулиновые антитела. - Вымойте пять раз с буфером BRB80. Рекомендуется фильтровать растворы с помощью фильтра 0,22 мкм.
- Поток в 1% полоксамер 407 (триблок кополимер) в BRB80, чтобы блокировать поверхность против неспецифических связывания. Инкубировать в течение 10 мин.
- Вымойте пять раз с буфером BRB80.
- Образец готов к размещению на микроскопе. Чтобы не допустить высыхания образца, добавьте две капли буфера BRB80 на концах канала и пополните при необходимости.
3. Выравнивание микроскопа
- Поместите образец на сцену микроскопа. Включите источник освещения эпиосвещения.
- Сосредоточьтесь на поверхности образца. Вы будете наблюдать несколько поверхностей, как цель перемещается вверх и вниз из-за обратного отражения света от оптики в оптическом пути. Хороший метод, чтобы найти поверхность образца, чтобы сосредоточиться на парафиновой пленки края. Как только поверхность найдена, установите поле зрения к центру камеры.
- Центр поля диафрагмы в поле зрения, закрыв его на полпути и с помощью регулировки винты. После выравнивания, вновь открыть диафрагму.
ПРИМЕЧАНИЕ: Винт корректировки только должно быть сделано спорадически, возможно, каждые 3-6 месяцев или при устранении неполадок. - Слайд в объектив Бертран для просмотра выхода ученика (задняя фокусная плоскость) цели.
- Закройте диафрагму диафрагмы (AD) за краями выхода зрачка цели.
- Используйте коррективные винты, чтобы центр AD с выходом ученика. Двойная проверка, открыв AD и сопоставляя его края с краями выхода ученика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта корректировка только должна быть сделана спорадически. - Установите диафрагму диафрагмы примерно до 2/3 от NA цели. Подробные процедуры оптимизации диафрагмы диафрагмы можно просмотреть в разделе 7.
4. Изображение стабилизированных микротрубушек или 40 нм частицы золота
ПРИМЕЧАНИЕ: Стабилизированные микротрубочки и золотые наночастицы служат хорошими контрольными образцами. Рекомендуется изображение поверхности прилагается микротрубочки или золотые наночастицы в качестве первого шага для оценки производительности IRM и помочь в установлении оптимального отверстия диафрагмы диафрагмы (раздел 7).
- Установите время экспозиции камеры до 10 мс и отрегулируйте освещение, чтобы почти насытить динамический диапазон камеры.
- Поток в 10 зл гуанилила-(альфа, бета)-метилен-дифосфонат (GMPCCP) или таксоло-стабилизированных микротрубоулах в BRB804,12,13 (или 40 нм частиц золота) при перфузии с помощью пипетки для свежего образца и мониторинга связывание путем визуализации поверхности. После того, как 10-20 микротрубок связаны в поле зрения, мыть образец 2x с BRB80.
ПРИМЕЧАНИЕ: С хорошо выровнены микроскоп, микротрубочки должны быть видны без фонового вычитания. - Приобретите 10 изображений, установив промежуток времени с 1 второй период задержки в течение 10 секунд (при 10 мс экспозиции).
- Приобретите фоновое изображение. Для этого переместите сцену с помощью контроллера сцены или компьютерного программного обеспечения вдоль длинной оси канала, приобретая 100 изображений без задержек (т.е. потоковая передача около 100 кадров в секунду и 10 мс экспозиции).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фон является медианой 100 изображений. Принимая медианы, профиль освещения и другие стационарные функции, такие как грязь на оптике сохраняются в то время как все остальное отфильтровывается. На образце не должно быть наклона, так как это приведет к изменению осевого положения по мере перемещения сцены и, в конечном счете, к деградации фонового изображения. Если наклона не избежать, то альтернативный метод заключается в приобретении усредненных фоновых изображений перед потоком семян. - Для обработки и анализа изображений перейдите на 6-й шаг.
5. Динамика микротрубок
- Для микротрубочной динамики с помощью тубулина головного мозга установите температуру нагревателя образца до 37 градусов по Цельсию.
- Поток в 10 Л гмPCCP стабилизированных семян микротрубочек в BRB8011 путем перфузии с помощью пипетки в свежий образец и контролировать их связывание с поверхностью путем визуализации поверхности жить (т.е., во время потоковой передачи). После того, как 10-20 семян связаны с полем зрения, мыть образец с помощью 2x объем канала с BRB80 (BRB80 должны быть предварительно разогреты до 37 градусов по Цельсию или по крайней мере при комнатной температуре).
ПРИМЕЧАНИЕ: С хорошо выровнены микроскоп, семена должны быть видны без фонового вычитания. - Поток в полимеризации смеси (7,5 мМ немаркированных тубулина 1 мм гуанозин трифосфат (GTP) 1 мМ дитиотрийтол (DTT) в буфере BRB80). Для измерения роста микротрубок установите промежуток времени с помощью программного обеспечения для приобретения изображения каждые 5 секунд (0,2 кадра в секунду (fps)) в течение 15 минут.
- Для усиления контраста, приобрести 10 изображений (вместо одного) в каждой точке времени и усреднеть их. Для микротрубочек усадки, приобрести изображения на 100 кадров в секунду, установив задержку времени до 0 и время экспозиции 10ms (более высокие fps возможно с меньшими регионами интереса в зависимости от используемой камеры).
- Приобретите фоновое изображение в шаге 4.4.
6. Обработка и анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа, этот протокол использует Фиджи14, но читатель может свободно использовать любое программное обеспечение, она / он считает целесообразным.
- Откройте сохраненные фоновые изображения.
- Рассчитайте медианное изображение (т.е. фон) с помощью изображения
- Открыть микротрубочную динамику фильма в виде стека (то же самое для нединамических микротрубок) с помощью файла (Rugt; Open.
- Вычтите фоновое изображение из стека с помощью процесса (ru) и калькуляторизображения. Убедитесь в том, чтобы проверить "32bit (плавающий) результат" вариант.
- Для динамических микротруб, используя линейный инструмент провести линию вдоль микротрубки интерес и добавить его в регион интересов менеджера, нажав "т". Повторите для всех микротрубок интереса.
- Для динамических микротрубочек запустите макрос Multi-Kymo(Дополнительный файл 1). Макрос будет генерировать видео и kymograph для каждого микротрубока в рентабельности менеджера. Каждый микротрубубл получит уникальный идентификатор.
- Для динамических микротрубочек запустите макрос Kymo-Analysis (Дополнительныйфайл2) и выполните его шаги по измерению темпов роста и усадки микротрубочек.
7. Размер диафрагмы диафрагмы апертуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Важным фактором для приобретения высококонтрастных изображений микротрубок с помощью IRM является установка освещения численной диафрагмы (INA) правильно10,15. INA может быть измененпутем путем изменения размера входящего луча освещения на выходе ученика цели, который контролируется размером АД (AD находится на конъюгированном самолете с выходом зрачка (задний фокусный самолет) цели , Рисунок 1):
где DAD является диаметр диафрагмы диафрагмы, Fцель фокусного длины цели и Dep является целью выхода ученика диаметра. Как правило, AD остается полностью открытым для флуоресценции изображения, так что INA равна NAцели . В флуоресцентном микроскопе шкала АД не указывает его диаметр, поэтому INA не может быть рассчитана. Можно откалибровать размер AD с помощью цели. Тем не менее, это не является необходимым, так как размер AD будет привязан к размеру, который производит самый высокий контраст.
- Подготовьте образец флуоресцентно маркированных стабилизированных микротрубушек, прилипшие к поверхности (шаги 4.1-4.2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали тетраметилходамин помечены микротрубочки16 (Ex: 550 нм, Em: 580 нм). - Принесите микротрубочки в фокусе с помощью микроскопа фокусировки ручку в то время как флуоресцентноих изображения (если микротрубочки не помечены, изображение их с IRM15 или DIC 5).
- Установите экспозицию камеры на 10 мс с помощью программного обеспечения камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта экспозиция является произвольной и воздействия 100 мс также будет работать. - Закройте АД до самого маленького отверстия. Отрегулируйте освещение, чтобы почти насытить динамический диапазон камеры или максимально возможно.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве руководства используйте таблицу поиска, обычно предоставляемую программным обеспечением для приобретения. - Приобретите 10 изображений (путем потоковой передачи или принятия изображения каждую секунду) поля зрения, содержащего микротрубочки на 10 евро.
- Приобретите фоновое изображение в шаге 4.4.
- Изменение размера АД и повторите шаги 7.5-7.6 для всего диапазона открытия AD (от закрытого до размера ученика выхода, рисунок2). Каждый раз, когда размер АД изменяется, отрегулируйте интенсивность освещения, чтобы соответствовать интенсивности шага 7.4.
- Для каждого поля зрения приобрели, вычесть соответствующий фон с помощью процесса ,gt; калькулятор изображений и выбора "вычитание" из выпадающих меню. Убедитесь, что параметр "32bit (float) результат" проверен. Затем в среднем в результате изображения с помощью изображения , стеки стек
- Измерьте соотношение шума от сигнала к фону (SBR) микротрубок, определяемого как средняя интенсивность сигнала микротрубочки (интенсивность микротрубочки минус интенсивность фона), разделенного на стандартное отклонение фона ( Рисунок 3).
- Определите оптимальный размер АД (т.е. оптимальный INA) путем расчета среднего SBR микротрубочки для каждого размера открытия и установить размер АД на один производить самый высокий SBR (Рисунок 2). Вполне возможно, что существует ряд размеров АД, которые производят сопоставимыеконтраст15.
Representative Results
Как уже упоминалось выше, с хорошо выровнены микроскоп, микротрубочки должны быть видны без фонового вычитания(Рисунок 4A). Вычитание фона(рисунок 4B) усиливает контраст микротрубока (рисунок4C). Для дальнейшего повышения контраста, усреднения или Fourier фильтрации или сочетание обоих могут быть использованы(Рисунок 4D, F, E). Сканирование линии на рисунке 4G показывает постепенное улучшение качества изображения. Обратите внимание на снижение фонового шума с каждым этапом обработки.
Примеры kymographs динамики микротрубочек, генерируемых из фильмов замедленного времени, показаны на рисунке 5. Видео были приобретены с двумя частотами кадров: 0,2 fps (медленный) и 100 кадров в секунду (быстрый). Первый подходит для измерения темпов роста, в то время как второй больше подходит для измерения темпов сокращения, что на порядок быстрее, чем темпы роста.
В случае, когда золотые наночастицы используются для настройки микроскопа, пример изображения отображается на рисунке 6. Золотые наночастицы пассивно прикреплялись к поверхности. Хотя 40 нм частиц рекомендуется, это также возможно изображение 20 нм частиц, но на более низком контрасте.
Рисунок 1. Схематическое представление IRM. (A) Эпи-освещение от источника света проходит через диафрагму диафрагмы до достижения 50/50 зеркало. Диафрагма диафрагмы диафрагмы устанавливает ширину луча таким образом освещение NA. Зеркало 50/50 частично отражает свет до цели, чтобы осветить образец. Свет, отраженный в образце, собирается, а затем проецируется на чип камеры (по объективу трубки), где он мешает генерировать изображение. Контраст изображения является результатом взаимодействия между светом, отраженным от стеклянного/водного интерфейса (I1) и светом, отраженным от интерфейса воды/микротрубочки (I2). В зависимости от микротрубочки/расстояния поверхности (h), оптическая разница пути между I1 и I2 приведет к конструктивному (яркий сигнал) или разрушительному (темный сигнал) или что-нибудь между ними. Например, если свет с длиной волны 600 нм используется для визуализации, контраст будет переключаться между темным и ярким, когда высота микротрубока изменяется примерно на 100 нм. Звездочка указывает на конъюгированные плоскости (измененные из15). (B) Пример установки зеркала 50/50. Подходящий кубик фильтра был открыт и зеркало было вставлено где дикроаическое зеркало обычно сидит. Зеркало было ориентировано в рамках инструкций производителя. Затем куб был вставлен в фильтрколесо, которое было вставлено обратно в микроскоп (не показано). Во время установки использовались перчатки, а зеркало держалось только по краям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Оптимальная диафрагма диафрагмы. (A) То же поле зрения было изображено на различных отверстиях диафрагмы диафрагмы без фонового вычитания. Визуально контраст увеличивался по мере увеличения размера диафрагмы диафрагмы, пока она не достигла плато и не начала ухудшаться впоследствии. Это было подтверждено (B) SBR измерения фоновых вычитаемых изображений. Бары ошибок являются стандартным отклонением. Шкала баров 500 мкм (н.э.) и 3 мкм (микротрубочки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Измерение соотношения шума от сигнала к фону. Микротрубочки были изолированы в интересуемых регионах. Каждый регион, представляющий интерес, был заранее отделен от фона микротрубока. Средний сигнал микротрубока был получен из сканирования линии по микротрубе. Ширина линии сканирования была установлена в соответствии с длиной микротрубок. Таким образом, каждая точка сканирования представляет собой среднее значение сигналов всех пикселей вдоль оси микротрубок, параллельных этой точке. Фоновый шум является стандартным отклонением всех пикселей ниже отсеченного порога. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Обработка изображений. После получения необработанных изображений (A)фон (B) был вычтен (C) для повышения контраста микротрубок. Для дальнейшего улучшения контраста изображения были либо усреднены (D) или Фурье фильтруется (E) или оба (F). Сканирование линии (G),местоположение которой указывается на пунктирной красной линии в (A) являются цветом, соответствующим различным изображениям в (A) к (F). Цифры в нижнем углу являются средними SBRs, измеренными для всего поля зрения. Шкала бар 5 мкм (изменено от15) . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5. Примеры кимографов. (A) Kymograph примеры динамики микротрубочек, генерируемых из замедленного фильмов, приобретенных на 0,2 fps. (B) Kymograph с изображением примера события усадки, порожденных из фильма, приобретенного на 100 кадров в секунду. Dashed линии отмечают семена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6. Пример золотых наночастиц, изображенных irM. Золотые наночастицы размеров 20 и 40 нм были пассивно прикреплены к поверхности. Было получено 10 изображений. После фонового вычитания изображения усреднели для повышения контраста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7. Точность отслеживания длины микротрубок в изображениях IRM. Стабилизированные микротрубочки (т.е. фиксированная длина) были изображены 200x на 100 кадров в секунду, а затем в среднем до 10 кадров в секунду для повышения контрастности. Далее, длина микротрубочки были измерены с помощью программного обеспечения отслеживания Fiesta17. Для каждого микротрубока средняя длина и стандартное отклонение были рассчитаны, как показано на рисунке (пунктирная линия представляет собой среднее и сплошные красные линии, представляющие стандартное отклонение, длина 3971 и 20 нм. Общая точность отслеживания была в среднем по стандартному отклонению всех гусеничных микротрубок (n no 6 микротрубчатых х 20 точек данных и 120 точек данных). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Этот протокол продемонстрировал успешное использование IRM для визуализации и измерения динамики микротруб. Следует позаботиться о правильном настройке просветительной численной диафрагмы, так как она оказывает самое сильное влияние на контраст изображения. Кроме того, использование высоких численных целей диафрагмы (NA) имеет важное значение для получения высокого разрешения / высокой контрастности изображения, как более высокая цель NA имеют более высокую мощность сбора света по сравнению с низкими целями NA. Чище поверхности и растворов используется ниже шума, как грязь заканчивается крепления к поверхности и добавления (в течение эксперимента) пятнышко, как шум на изображения. Приобретение фонового изображения имеет важное значение, а также удаляет неоднородности освещения, статического шума и поверхностных неровностей.
Рекомендуемая модификация заключается в том, чтобы ввести фильтр длинного прохода (Зgt;600 нм) в траектории освещения. Спектр белых источников света обычно содержит длины волн в УФ-излучения, которые могут повредить микротрубочки. Кроме того, использование длинной длины волны для IRM пригодится при сочетании IRM с флуоресценцией (например, при изучении влияния микротрубок связанных белков (МЭП) на динамику микротрубок). Имейте в виду, что при визуализации за расходуемый период времени, дрейф образца (особенно вдоль оптической оси) уменьшает контраст изображения из-за отклонения плоскости изображения от фонового самолета. Современные микроскопы часто оснащены стабилизационными механизмами (например, идеальным фокусом (Nikon), Определенным фокусом.2 (Зейсс), IX3-ЗДК2 (Олимп)). Альтернативным решением является термически стабилизировать установку либо пассивно или активно18 или путем коррекции для дрейфа19,20,21. Наконец, контраст микротрубок может быть увеличен за счет уменьшения размера поля диафрагмы (70% открытие является хорошим выбором, как это баланс между увеличением контрастности и поля зрения размера)15.
В то время как IRM подходит для визуализации микротрубочек, он не достаточно чувствителен для обнаружения одиночных белков. Для такого применения iSCAT является более подходящей техникой. Аналогичным образом, флуоресценция и iSCAT лучше подходят, если требуется точность отслеживания менее 10 нм. Для IRM измеренная точность отслеживания длины составляет 20 нм, как показано на рисунке 7.
Использование IRM в поверхностных анализах может выйти за рамки микротрубок; например, молекулярные двигатели могут быть помечены золотыми наночастицами и отслеживаться при взаимодействии с микротрубами. Кроме того, более продвинутая форма IRM, известная как светоотражающая микроскопия интерференции (RICM)22, в принципе может быть использована для дальнейшего повышения контраста микротрубок и получения более высокой точности отслеживания.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Авторы благодарят Анну Лучняк и Инь-вэй Куо за критическое чтение и комментарии к протоколу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
| 50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
| NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
| Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
| plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
| Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
| 40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
| 20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
| Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048x2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
| Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
| Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |
References
- Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Hotani, H., Horio, T. Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability. Cell Motility and the Cytoskeleton. 10 (1-2), 229-236 (1988).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).
- Bormuth, V., Howard, J., Schäffer, E. LED illumination for video-enhanced DIC imaging of single microtubules. J Microsc. 226 (Pt 1), 1-5 (2007).
- Andrecka, J., Ortega Arroyo, J., Lewis, K., Cross, R. A., Kukura, P. Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy. Biophysical Journal. 110 (1), 214-217 (2016).
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-Free Imaging of Single Microtubule Dynamics Using Spatial Light Interference Microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Curtis, A. S. G. The Mechanism of Adhesion of Cells to Glass. The Journal of Cell Biology. 20 (2), 199-215 (1964).
- Weber, I. [2] Reflection interference contrast microscopy. Methods in Enzymology. 361, 34-47 (2003).
- Gell, C., et al. Chapter 13 - Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Nitzsche, B., et al. Chapter 14 - Studying Kinesin Motors by Optical 3D-Nanometry in Gliding Motility Assays. Methods in Cell Biology. 95, 247-271 (2010).
- Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Hyman, A., et al. [39] Preparation of modified tubulins. Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Ruhnow, F., Zwicker, D., Diez, S. Tracking Single Particles and Elongated Filaments with Nanometer Precision. Biophysical Journal. 100 (11), 2820-2828 (2011).
- Mahamdeh, M., Schäffer, E. Optical tweezers with millikelvin precision of temperature-controlled objectives and base-pair resolution. Optics Express. 17 (19), 17190-17199 (2009).
- Kim, K., Saleh, O. A. Stabilizing method for reflection interference contrast microscopy. Applied Optics. 47 (12), 2070-2075 (2008).
- Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
- Carter, A. R., King, G. M., Ulrich, T. A., Halsey, W., Alchenberger, D., Perkins, T. T. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).
- Limozin, L., Sengupta, K. Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion. ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).
