Summary

Inducerande apikal parodontit hos möss

Published: August 06, 2019
doi:

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att lokalt inducera apikal parodontit hos möss. Vi visar hur man borrar ett hål i musens tand och exponerar sin massa, för att orsaka lokal inflammation. Analysmetoder för att undersöka arten av denna inflammation, såsom mikro-CT och histologi, visas också.

Abstract

De mekanismer som är involverade i lokal inducerad inflammation kan studeras med hjälp av flera tillgängliga djurmodeller. En av dessa är induktion av apikal parodontit (AP). Apikala parodontit är en vanlig patologi av en inflammatorisk karaktär i parodontala vävnader som omger tandroten. För att bättre förstå arten och mekanismen hos denna patologi är det fördelaktigt att utföra ingreppet hos möss. Induktionen av denna odontogena inflammation uppnås genom att borra i musens tand tills tand massan exponeras. Därefter är tand massan fortfarande utsatt för att vara förorenad av den naturliga orala floran över tid, vilket orsakar apikala parodontit. Efter denna tidsperiod, djuret offras, och tanden och käkbenet kan analyseras på olika sätt. Typiska analyser är mikro-CT-avbildning (för att utvärdera benresorption), histologisk färgning, immunohistokemi och RNA-uttryck. Detta protokoll är användbart för forskning inom området för oral biologi för att bättre förstå denna inflammatoriska process i en in vivo experimentell miljö med enhetliga villkor. Förfarandet kräver en noggrann hantering av möss och den isolerade käken, och en visuell demonstration av tekniken är användbar. Alla tekniska aspekter av de förfaranden som leder till inducerad apikal parodontit och dess karakterisering i en musmodell demonstreras.

Introduction

Målet med denna metod är att inducera apikal parodontit i en mus genom att förora spetsen med den naturliga mikrofloran, och att sedan studera olika egenskaper hos denna patologiska process.

Apikala parodontit (AP) är en vanlig patologi av en inflammatorisk karaktär i parodontala vävnader som omger tandroten. Denna tandsjukdom kan orsaka svår smärta och måste behandlas av en tandläkare. Behandlingsalternativen inkluderar rotfyllning behandling (primär eller sekundär), ENDODONTISK kirurgi, tandutdragning, eller uppföljning beroende på de kliniska och radiologiska fynd, och yttrandet från klinikern. Mekanismen för denna inflammatoriska process, även studerat i flera decennier1,2,3, är fortfarande inte heltäckande förstås. Med tanke på svårighetsgraden av denna patologi, det finns alltså ett tydligt behov av forskning som behandlar dess grundläggande natur. System där studiet av AP är möjligt är således av stort vetenskapligt intresse.

Eftersom AP är en komplicerad patologisk process som involverar de lokala vävnaderna och immunförsvaret, är in vitro-studier otillräckliga för en fullständig förståelse av processerna. Studier av kliniska prover av denna sjukdom är också problematiska på grund av etiska begränsningar och betydande variation mellan olika människor och olika kliniska stadier4,5, ochdärmed nödvändigheten av in vivo-modeller. Dessa modeller är baserade på begreppet utsätta tand massan till kontaminering och observera den inflammatoriska reaktionen av kroppen till denna stimulans i de periapikala vävnaderna6,7. Vanliga in vivo-modeller är gnagare eller större djur såsom hundar. Trots den kliniska utmaningen vid behandling av möss, som är mycket små djur med miniatyr tänder, är fördelarna med musmodellen betydande: praktiskt taget arbetar med möss är tekniskt enkel när det gäller anläggningar och är mest kostnadseffektiv, och vetenskapligt är musen en väl studerat djurmodell med lätt tillgängliga genetiska och molekylära verktyg och en väl studerat genom. Faktum är att tidigare studier använt en musmodell för att studera inflammatoriska och benresorption signaler och celler inblandade i apikala parodontit8,9,10,11. Därför behövs ett tydligt protokoll om hur man använder en musmodell för att studera AP. Här beskriver vi ett sådant protokoll.

Det protokoll som beskrivs här är har den stora fördelen av att vara lämpligt att studera knock-out (Ko) möss och lära sig hur avsaknaden av en specifik gen påverkar tand inflammation7,12. Andra användbara tillämpningar av detta protokoll inkluderar studiet av effekterna av mediciner och systemiska tillstånd på utvecklingen av apikala parodontit13, effekten av apikala parodontit på utvecklingen av osteonekros i käkarna14 , 15 och stamcellsterapi för ben förnyelse16.

Detta protokoll kan också generaliseras som en modell för att studera lokal inflammation. För att studera den inflammatoriska processen, flera musmodeller har utvecklats, som inkluderar till exempel inducerad kolit eller artrit17,18. Dessa modeller har systemiska effekter och har ingen inbyggd kontroll i samma djur. Modeller för inducerad apikal parodontit, som inkluderar en kontralaterala kontroll utan inflammation, har fördelen av att övervinna dessa begränsningar14,19.

Det protokoll som beskrivs nedan är därför användbart för forskare som är intresserade av lokala inflammatoriska processer. Den kontrollerade karaktären av denna inflammation, dess inneslutning till en viss plats, och den kontralaterala kontroll tand, alla gör detta protokoll värdefullt för att studera de mekanismer som är inblandade i denna process. Dessutom är protokollet användbart för forskare som är intresserade av de kliniska aspekterna av Periapikal inflammation. Musmodellen är idealisk för att studera olika variabler av sjukdomen, förutom fördelen av att kunna enkelt utföra genetiska manipulationer i musmodellen, för att undersöka aktiviteten hos specifika gener i Periapikal inflammation.

Tekniskt, det kliniska förfarandet är utmanande att utföra på grund av de små dimensionerna av möss tänderna. Det kommer att vara fördelaktigt att visualisera denna procedur för att lära sig om positionering, utrustning som behövs och prestanda.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av hebreiska universitetet (Ethics No. MD-17-15093-5). 1. djur anestesi och positionering Förbered sterila lösningar enligt beskrivningen nedan. Bered 5 mL av 7 mg/mL ketamin och 0,09 mg/mL Medetomidin utspädd i fosfatbuffertlösning (PBS)/Saline. Bered en steril lösning av atipamezol (0,4 mg/mL) utspädd i PBS/saltlösning (rekommenderas att bereda…

Representative Results

Ett flödesschema av experimentella steg presenteras i figur 1. Som nämnts i protokollet, möss är sövda, och deras första mandibular molar på ena sidan borras tills massa exponering, medan kontralaterala tanden lämnas som en kontroll. Därefter är tänderna kvar att vara förorenade av den orala floran för 42 dagar, under vilken de övervakas och få smärtstillande medicin. Efter 42 dagar, möss är euthanized, och tänderna och angränsande käken …

Discussion

Här introduceras en metod för induktion av apikal parodontit hos möss. Målet med metoden är att utnyttja det apikala parodontit villkoret för att studera mekanismer och konsekvenser av denna inflammatoriska process. Apikal parodontit inducerades i 6-8 veckor gamla möss, en ålder där rötterna är fullt utvecklad24. För att orsaka apikala parodontit i denna modell, är tandköttet av mus mandibular molarer exponeras med hjälp av en tand skorra. Bakterier från den orala flor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi skulle vilja erkänna Dr Oded Heyman för hans hjälp med djur positionering, Raphael Lieber för hjälp med mikro-CT-analys, och prof. andiara de Rossi daldegan för råd om formning experimentet. Vi skulle också vilja erkänna Dr Sidney Cohen för kritisk läsning och redigering.

Detta arbete stöddes av ett bidrag från Dr Izador I. Cabakoff Research donationsfond till MK och IA, och en Yitzhak Navon gemenskap från Israel ministeriet för vetenskap och teknik till exempel.

Materials

Atipamezole hydrochloride Eurovet Animal Health CAS 104075-48-1
ATR dentsply tecnika
blocking machine Leica EG1150H
buprenorphine vetmarket 163451
clinical microscope/binocular Olympus Sz61
dental bur Komet dental ZR8801L 315 008
dental spatula Premier 1003737
EDTA J.T Baker 8993
entelan mercury 1.07961
Eosin Y solution, alcoholic SIGMA HT110116
hematoxylin solution, Mayer's SIGMA MHS 16
Ketamine hydrochloride Vetoquinol CAS 1867-669
Medetomidine hydrochloride (cepetor) CP-pharma GmbH CAS 86347-15-1
Mepivacaine HCl 3% Teva CAS 96-88-8
microbrushes- adjustable precision applicators PARKELL S379
micro-ct scanner scanco uCT 40
parafin Leica 39602004
PBS SIGMA D8537
PFA EMS 15710
Chloramphenicol eye ointment (5%) Rekah pharmaceutical CAS 56-75-7
tweezers WAM Ref-CT
xylazine Eurovet Animal Health CAS 7361-61-7
xylene Gadot CAS 1330-20-7

References

  1. Azuma, M. M., Samuel, R. O., Gomes-Filho, J. E., Dezan-Junior, E., Cintra, L. T. The role of IL-6 on apical periodontitis: a systematic review. International Endodontics Journal. 47 (7), 615-621 (2014).
  2. Marton, I. J., Kiss, C. Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (2), 155-163 (2014).
  3. Graunaite, I., Lodiene, G., Maciulskiene, V. Pathogenesis of apical periodontitis: a literature review. Journal of Oral and Maxillofacial Research. 2 (4), e1 (2012).
  4. Hussein, F. E., Liew, A. K., Ramlee, R. A., Abdullah, D., Chong, B. S. Factors Associated with Apical Periodontitis: A Multilevel Analysis. Journal of Endodontics. 42 (10), 1441-1445 (2016).
  5. Takahashi, K., MacDonald, D. G., Kinane, D. F. Analysis of immunoglobulin-synthesizing cells in human dental periapical lesions by in situ hybridization and immunohistochemistry. Journal of Oral Pathology Medicine. 25 (6), 331-335 (1996).
  6. Lin, D., et al. Enterococcus faecalis lipoteichoic acid regulates macrophages autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochemical and Biophysical Research Community. 498 (4), 1028-1036 (2018).
  7. Wu, Y., Sun, H., Yang, B., Liu, X., Wang, J. 5-Lipoxygenase Knockout Aggravated Apical Periodontitis in a Murine Model. Journal of Dental Research. 97 (4), 442-450 (2018).
  8. Barreiros, D., et al. Immunohistochemical and mRNA expression of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during apical periodontitis progression in mice. Journal of Applied Oral Science. 26, e20170512 (2018).
  9. Barreiros, D., et al. MMP2 and MMP9 are Associated with Apical Periodontitis Progression and Might be Modulated by TLR2 and MyD88. Brazillian Dentistry Journal. 29 (1), 43-47 (2018).
  10. Virtej, A., Papadakou, P., Sasaki, H., Bletsa, A., Berggreen, E. VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis. Journal of Oral Microbiology. 8, 32433 (2016).
  11. De Rossi, A., et al. Cementocytes Express Receptor Activator of the Nuclear Factor Kappa-B Ligand in Response to Endodontic Infection in Mice. Journal of Endodontics. 42 (8), 1251-1257 (2016).
  12. Rider, D., et al. Elevated CD14 (Cluster of Differentiation 14) and Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling Deteriorate Periapical Inflammation in TLR2 Deficient Mice. Anatomy Records (Hoboken). 299 (9), 1281-1292 (2016).
  13. Martins, C. M., Sasaki, H., Hirai, K., Andrada, A. C., Gomes-Filho, J. E. Relationship between hypertension and periapical lesion: an in vitro and in vivo study. Brazillian Oral Research. 30 (1), e78 (2016).
  14. Rao, N. J., Wang, J. Y., Yu, R. Q., Leung, Y. Y., Zheng, L. W. Role of Periapical Diseases in Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws. Biomedical Research International. 2017, 1560175 (2017).
  15. Song, M., et al. Preexisting Periapical Inflammatory Condition Exacerbates Tooth Extraction-induced Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Jaw Lesions in Mice. Journal of Endodontics. 42 (11), 1641-1646 (2016).
  16. Wu, Y., et al. Hypoxic Preconditioning Enhances Dental Pulp Stem Cell Therapy for Infection-Caused Bone Destruction. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1191-1203 (2016).
  17. Eichele, D. D., Kharbanda, K. K. Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 23 (33), 6016-6029 (2017).
  18. Choudhary, N., Bhatt, L. K., Prabhavalkar, K. S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 40 (3), 193-200 (2018).
  19. Shah, A., et al. Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice. Oral Disease. 24 (1-2), 57-62 (2018).
  20. Wan, C., et al. MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (5), 658-664 (2014).
  21. Bezerra da Silva, R. A., et al. MyD88 knockout mice develop initial enlarged periapical lesions with increased numbers of neutrophils. International Endod Journal. 47 (7), 675-686 (2014).
  22. Mehrazarin, S., Alshaikh, A., Kang, M. K. Molecular Mechanisms of Apical Periodontitis: Emerging Role of Epigenetic Regulators. Dental Clinics of North America. 61 (1), 17-35 (2017).
  23. Metzger, Z. Macrophages in periapical lesions. Endodontics Dentisrty and Traumatology. 16 (1), 1-8 (2000).
  24. Lungova, V., et al. Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development. Journal of Anatomy. 218 (6), 699-716 (2011).
  25. Zilberstein, L. F., Moens, Y. P., Leterrier, E. The effect of local anaesthesia on anaesthetic requirements for feline ovariectomy. Veterinary Journal. 178 (2), 214-218 (2008).
  26. Kaufman, E., Epstein, J. B., Gorsky, M., Jackson, D. L., Kadari, A. Preemptive analgesia and local anesthesia as a supplement to general anesthesia: a review. Anesthesia Progress. 52 (1), 29-38 (2005).
  27. Song, M., et al. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. Journal of Visual Experimentalization. (119), (2017).
  28. Yoneda, N., et al. Development of a root canal treatment model in the rat. Scientific Reports. 7 (1), 3315 (2017).
  29. AlShwaimi, E., et al. Regulatory T cells in mouse periapical lesions. Journal of Endodontics. 35 (9), 1229-1233 (2009).

Play Video

Cite This Article
Goldman, E., Reich, E., Abramovitz, I., Klutstein, M. Inducing Apical Periodontitis in Mice. J. Vis. Exp. (150), e59521, doi:10.3791/59521 (2019).

View Video