Summary
Ett förfarande presenteras för att visualisera proteinkinas en verksamhet i huvud-fast, beter möss. En förbättrad A-Kinas aktivitet reporter, tAKARα, uttrycks i kortikala neuroner och göras tillgängliga för avbildning genom en kranial fönster. Två-Photon fluorescens livstid Imaging mikroskopi används för att visualisera PKA aktiviteter in vivo under påtvingad förflyttning.
Abstract
Neuromodulation utövar kraftfull kontroll över hjärnans funktion. Dysfunktion av neuromodulatory system resulterar i neurologiska och psykiska störningar. Trots deras betydelse, teknik för att spåra neuromodulatory händelser med cellulära upplösning har precis börjat dyka upp. Neuromodulatorer, såsom dopamin, noradrenalin, acetylkolin, och serotonin, utlösa intracellulära signalering händelser via deras respektive G protein-kopplade receptorer att modulera neuronala retbarhet, synaptisk kommunikation, och andra neuronala och därmed reglera informations bearbetningen i neuronala nätverk. De ovan nämnda Neuromodulatorer konvergera på lägret/proteinkinas A (PKA) väg. Därför utvecklades in vivo PKA Imaging med encellig upplösning som en avläsning för neuromodulatory händelser på ett sätt som motsvarar kalcium avbildning för neuronala elektriska aktiviteter. Häri presenteras en metod för att visualisera PKA aktivitet på nivån för enskilda nervceller i cortex av huvud-fast beter möss. För att göra detta, en förbättrad A-Kinas Activity reporter (AKAR), kallas tAKARα, används, som är baserad på Förster resonans energiöverföring (FRET). Denna genetiskt kodade PKA-sensor introduceras i motoriska cortex via in utero elektroporation (Iue) av DNA-plasmider, eller stereotaxic injektion av Adeno-associerat virus (AAV). FRET förändringar avbildas med hjälp av två-Photon fluorescens livstid Imaging mikroskopi (2pflim), som erbjuder fördelar jämfört med ratiometriska fret mätningar för kvantifiera FRET signal i ljus-spridning hjärnvävnad. För att studera PKA verksamhet under påtvingad förflyttning, är tAKARα avbildas genom en kronisk kraniala fönster ovanför cortex av vaken, Head-fast möss, som kör eller vila på en hastighetskontrollerade motordrivna löpband. Denna avbildning tillvägagångssätt kommer att tillämpas på många andra hjärnregioner för att studera motsvarande beteende-inducerad PKA verksamhet och andra FLIM-baserade sensorer för in vivo Imaging.
Introduction
Neuromodulation, även känd som långsam synaptisk transmission, lägger stark kontroll över hjärnans funktion under olika beteendemässiga tillstånd, såsom stress, upphetsning, uppmärksamhet, och förflyttning1,2,3, 4. Trots sin betydelse, är studiet av när och var neuromodulatory händelser äger rum fortfarande i sin linda. Neuromodulatorer, inklusive acetylkolin, dopamin, noradrenalin, serotonin, och många neuropeptider, aktivera G protein-kopplade receptorer (GPCRs), som i sin tur utlösa intracellulära andra Messenger vägar med ett brett fönster av tidsskalor som sträcker sig från sekunder till timmar. Medan varje neuromodulator utlöser en distinkt uppsättning av signalering händelser, lägret/proteinkinas a (PKA) vägen är en vanlig nedströms väg för många Neuromodulatorer1,5. Lägret/PKA vägen reglerar neuronala retbarhet, synaptisk transmission, och plasticitet6,7,8,9, och därför, Tunes neuronala nätverkdynamiken. Eftersom olika nervceller eller neuronala typer uttrycker olika typer eller nivåer av neuromodulator receptorer10, de intracellulära effekterna av samma extracellulära neuromodulator kan vara heterogena mellan olika nervceller, och därmed, måste studerats med cellulär upplösning. Hittills är det fortfarande utmanande att övervaka neuromodulatory händelser i enskilda nervceller in vivo under beteende.
För att studera den spatiotemporal dynamiken i neuromodulering krävs en lämplig inspelnings modalitet. Mikrodialys och snabb-Scan cyklisk voltammetri används ofta för att studera frisättning av Neuromodulatorer, men de saknar den rumsliga upplösningen för att övervaka cellulära händelser11,12. Analogt med kalciumdynamik som används som en proxy för neuronala elektrisk aktivitet i population Imaging13, PKA Imaging kan användas för att läsa ut neuromodulatory händelser över en neuronala population vid cellulära upplösning. Det nuvarande protokollet beskriver användningen av en förbättrad A-Kinas Activity reporter (AKAR) för att övervaka PKA verksamhet in vivo under djurens beteende. Den metod som beskrivs här möjliggör samtidig avbildning av neuronala populationer vid subcellulära upplösning med en temporala upplösning som spårar fysiologiska neuromodulatory händelser.
Akars består av en donator och en acceptor fluorescerande proteiner kopplade av en PKA fosforylering substrat peptid och en forkhead-associerad (FHA) domän som binder till fosforylerade serin eller treonin av substratet14,15. Vid aktivering av PKA vägen, substrat peptid AKAR är fosforyleras. Som ett resultat, FHA domänen binder till fosforylerade substrat peptid, därmed föra de två fluorofotar i närheten, kallad stängda tillstånd AKAR. Det stängda påstår av fosforyleras Akar resulterar i ökande Förster resonans energiöverföring (FRET) mellan donatorn och acceptoren fluorophores. Eftersom andelen fosforylerade akars är relaterad till nivån för PKA-aktivitet16, kan mängden FRET i ett biologiskt prov användas för att kvantifiera nivån av PKA-aktivitet16,17,18, 19,20.
Tidiga versioner av AKARs var främst konstruerade för tvåfärgad ratiometrisk avbildning14. Vid avbildning djupare in i hjärnvävnaden, den ratiometriska metoden lider av signal förvrängning på grund av våglängd-beroende ljusspridning17,18,21. Som diskuteras nedan, fluorescens livstid Imaging mikroskopi (flim) eliminerar detta problem eftersom flim endast åtgärder fotoner som avges av givaren fluorophore18,21. Som ett resultat, FLIM kvantifiering av FRET påverkas inte av vävnaden djup17. Dessutom kan en "mörk" (dvs. låg Quantum Yield [QY]) variant av acceptorn fluorophore användas. Detta frigör en färgkanal för att underlätta multiplexade mätning av ortogonala neuronala egenskaper via samtidig avbildning av en andra sensor eller en morfologisk markör17,19,20.
FLIM Imaging kvantifierar den tid som en fluorophore tillbringar i upphetsad tillstånd, dvs fluorescensen livstid18. Returen av en fluorophore till det slipat påstår, således avslutar av det upphetsada statligt, ofta samråder med utsläppet av en Photon. Även om utsläppet av en Photon för en upphetsad individ molekyl är Stochastic, i en befolkning är den genomsnittliga fluorescenslivstiden ett kännetecken av det specifika fluorophore. När en ren population av fluoroforer är upphetsad samtidigt, kommer den resulterande fluorescensen följa en enda exponentiell sönderfall. Tidskonstant av detta exponentiellt förfall motsvarar den genomsnittliga fluorescenslivstiden, som vanligtvis sträcker sig från en till fyra nanosekunder för fluorescerande proteiner. Återlämnande av en upphetsad givare fluorophore till marken staten kan också inträffa genom FRET. I närvaro av FRET reduceras fluorescenslivstiden för donatorns fluorofore. Den unphosphorylated AKARs uppvisar en relativt längre givare fluorescens livstid. Vid fosforylering av PKA, uppvisar sensorn en kortare livstid eftersom givaren och acceptorn fluoroforer förs nära varandra och FRET ökas. Kvantifieringen av fluorescenslivstiden i en AKARs-population representerar därför nivån av PKA-aktivitet.
Tidiga versioner av AKARs har inte använts framgångsrikt för in vivo Imaging vid encells-upplösning. Detta är främst tack vare den låga signalamplituden av AKAR-sensorerna till fysiologiska aktiveringar17. Nyligen, genom att systematiskt jämföra tillgängliga Akar sensorer för två-Photon fluorescens livstid Imaging mikroskopi (2pflim), en sensor som kallas flim-Akar befanns överträffa alternativa sensorer. Dessutom, en serie av flim-Akar varianter kallas riktade akars (takars) utvecklades för att visualisera PKA aktivitet vid specifika subcellulära platser: mikrotubuli (takarα), Cytosol (takarβ), aktin (takarδ), trådformiga aktin (takarε), membran (takarγ), och postsynaptisk densitet (tAKARζ). Bland tAKARs, ökade tAKARα signalamplitud framkallas av noradrenalin av 2,7-faldigt. Detta är förenligt med den kunskap som majoriteten av PKA i nervceller är förankrade till mikrotubuli vid viloläge22,23. tAKARα var den bästa utföraren bland befintliga AKARs för 2pFLIM. Dessutom upptäckte tAKARα fysiologiskt relevant PKA-aktivitet som uppnåddes av multipla Neuromodulatorer, och uttrycket av tAKARα förändrade inte neuronala funktioner17.
Nyligen var tAKARα framgångsrikt används för att visualisera PKA aktiviteter i head-fast beter sig möss17. Det visades att påtvingad Locomotion utlöst PKA aktivitet i Soma av ytliga skikt nervceller (Layer 1 till 3, upp till ett djup av ~ 300 μm från Pia) i motorn, fat, och visuella cortices. Den motoriska utlöst PKA-aktiviteten var delvis beroende av signalering via β-adrenerga receptorer och D1 dopamin-receptorer, men påverkades inte av en dopamin receptor antagonist med D2. Detta arbete illustrerar förmågan hos takarer att spåra neuromodulering händelser in vivo med 2pflim.
I det aktuella protokollet beskrivs hela metoden för PKA-aktivitetsavbildning i head-fast vaken möss under ett påtvingat rörelse paradigm i sex steg. Först tillägg av 2pFLIM kapacitet till en konventionell två-Photon Mikroskop (figur 1). För det andra byggandet av ett motordrivet löpband (figur 2). För det tredje, uttrycket av takarα-sensorn i mus barken genom in utero elektroporation (Iue) av DNA-plasmider, eller stereotaxic injektion av Adeno-associerat virus (AAV). Utmärkta protokoll för operationer för Iue24,25 och stereotaxic injektion av virala partiklar26 har tidigare publicerats. De nyckelparametrar som vi använde beskrivs nedan. Fram, installationen av en kranial fönster. Utmärkta protokoll har tidigare publicerats för kranial fönster kirurgi27,28. Flera steg som har ändrats från standardprotokollen beskrivs. Femte, utför in vivo 2pFLIM. För det sjätte, analyserna av 2pFLIM-bilder (figur 3 och figur 4). Detta tillvägagångssätt bör vara lätt tillämplig på många andra Head-fast beteendemässiga paradigm och områden hjärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Oregon Health and Science University.
1.2pFLIM Mikroskop setup
- Installera en Photon timing Counting module (PTCM, tabell över material) och Anslut till datorn (figur 1) enligt tillverkarens manual.
Anmärkning: Den ptcm är vanligtvis en dator ombord som tar emot en "Sync" ingång för laserpuls timing och en Photon input från Fotomultiplikator röret (PMT). Den får också klock timing för pixlar, linjer och ramar, från två-Photon Imaging Control programvara. Den PTCM använder klock signalerna för att separera enskilda fotoner i olika pixlar och ramar. - Lägg till en fotodiod med > 200 MHz bandbredd för att mäta laser timing. Placera en standard glastäckslip i ljusbanan för att återspegla en liten del av laserljuset i photodioden placerad vinkelrätt mot ljusbanan (figur 1). Anslut fotodiod-utgången till "Sync"-ingången på ptcm.
Anmärkning: Många moderna lasrar också ut laser timing. För dessa lasrar är fotodioden inte nödvändigt, och man kan direkt ansluta lasertiming utgång till Sync input av PTCM. -
Utbyte av betalning, i händelse av tAKARα, den gröna kanalen PMT, med en låg-brus, snabb GaAsP PMT (figur 1). Anslut PMT-utgången till signal ingången på PTCM.
- Lägg till en valfri signal splitter (figur 1) om samtidig förvärv av intensitet genom den konventionella två-Photon Imaging Channel önskas. Anslut PMT-utgången till signaldelaren och Anslut splitter utgången till PTCM och den konventionella två-Photon Imaging module.
Anmärkning: GaAsP PMTs ger snabbare Single-Photon signaler än konventionella bialkali PMTs och möjliggör en mer exakt bestämning av fotonen timing. Vissa modeller av GaAsP PMTs kan kylas till 10 − 35 ° c under omgivningstemperatur, vilket gör att dämpning av mörka räkningar till en nivå under några hundra per sekund (typiskt ≤ 200 räknas/s). Denna låga ljudnivå är viktig för den exakta mätningen av fluorescenslivstider eftersom brus foton räknas inte lätt kan särskiljas eller subtrafieras från fluorescenslivslängdkurvan.
- Lägg till en valfri signal splitter (figur 1) om samtidig förvärv av intensitet genom den konventionella två-Photon Imaging Channel önskas. Anslut PMT-utgången till signaldelaren och Anslut splitter utgången till PTCM och den konventionella två-Photon Imaging module.
- Lägg till en band-pass fluorescens-utsläppsfilter som minimerar den spektrala föroreningen, om någon, från acceptorn fluorophore. Till exempel, för takarα, används ett 500 Nm ± 20 nm barriär filter för den gröna kanalen för att reducera föroreningen från acceptorsräckvidden, vilket är ett mörkt (Qy ~ 0,07) gult fluorescerande protein (yfp)29,30. Anslut timing signaler, till exempel klockorna för enskilda bildpixlar, linjer och ramar, som är lämpliga för kontrollprogram varan och beskrivs i PTCM bruksanvisning. Installera lämplig programvara för datakontroll och anskaffning.
Anmärkning: Vissa PTCM tillverkare (tabell över material) ger sin programvara för 2pFLIM Imaging. Här, anpassad programvara som kallas FLIMimage används, som utvecklades av Yasuda Lab (Max Planck Florida, via personlig kommunikation). Denna programvara fungerar som en Add-on användarfunktion till vissa två-Photon förvärv programvara (tabell över material). Den kontrollerar och kommunicerar med PTCM vid lämplig timing under två-Photon Imaging att förvärva 2pFLIM bilder.
2. byggande av ett motordrivet löpband
Anmärkning: Utformningen av det specialbyggda motordrivna löpbandet visas i figur 2.
- Skär en skum rulle (Ø = 200 mm) till 150 mm i längd med en fin hacksaw. Alternativt, limma de två halvorna av en skum boll tillsammans och placera tejp över sömmen. Alternativt, limma en gummimatta med profil på rullen för att öka dragkraften på rullen.
- Borra en 1/4 tum diameter hål genom mitten av rullen på den plana sidan av rullen eller borra en 1/4 tum diameter hål genom mitten av varje halva av bollen om skum bollen används.
-
Installera en 1/4 tums diameter stålaxel genom hålet. Limma skum rullen/bollen till axeln med hjälp av skum-kompatibelt lim. Alternativt, modifiera två flexibla axelkopplingar (1/4 tum innerdiameter) för att stärka kopplingen av axeln till skum rullen/bollen.
Anmärkning: Observera att många vanliga lim kan lösa upp skum.- För varje axel koppling, placera axelkopplingen på dess plana sida och i mitten av rektangelns metallplatta (0,7 mm x 15 mm x 76 mm). Svetsa plattan till axelkopplingen. Borra en 1/4 tum hål i mitten av plattan för att möjliggöra installation av den modifierade axelkopplingen på axeln och två skruvhål i metallplattan laterala från centrum.
- Montera axelkopplingen på axeln mot skum rullen/bollen. Om du använder den senare, något böja plattan för att passa krökning av bollen. Placera skruvarna i sido hålen för att fixera rullen/bollen på axeln.
- Borra och knacka på en 3/8-32-gänga i mitten av en bur plåt och installera Rotary encoder. Borra ett skruv hål i botten av den rätvinkliga motor fästet för att tillåta fastsättning av motorn på stolpen hållaren. Fäst både vridkodaren och motorn i änden på axeln med en flexibel axel koppling.
- Installera den monterade löpbandet på ett aluminium bröd ombord med hjälp av tjänster för motorn och roterande kodare (figur 2). Anslut motorns ingångar till hastighetsregulatorn och Rotary encoder output till en analog ingång på Computer Data Acquisition (DAQ)-kortet.
Anmärkning: Rotationsvinkel hastigheten kodas av Rotary encoder som spänning och digitaliseras med hjälp av anpassad programvara som kallas AnimalTracker skriven i MATLAB. - Montera den Headplate-kompatibla hållaren i ett högervinkelfäste. Installera en solid post på bröd plattan framför löpbandet och installera den monterade Headplate hållaren med den rätvinkliga fästet på stolpen (figur 2). Se till att huvud plattans hållarna är i linje med axeln så att musen kan inta en lämplig och bekväm gång position på löpbandet (figur 2C).
3. uttryck av tAKARα-sensor i musens cortex
-
I Utero elektroporation
- Bered en DNA-lösning för Iue genom att tillsätta 0,2% slutlig koncentration av snabbt grönt färgämne (för visualisering under injektion) till ett plasmid-DNA (3 − 4 μg/μl; sensorn konstruerar med en CAG promotor, sensorsekvens och en murmeldjur hepatitvirus post-transkriptionella responselement [WPRE] translationell förstärkare) upplöst/utspädd i vatten eller Tris-EDTA.
- Förbered en fördröjd gravid kvinnlig mus (t. ex. C57BL/6) för IUE vid E1624. Anesthetize musen med isofluran (4% för induktion och 1,5% för underhåll, på 95% O2 med 5% CO2) och tillämpa subkutan injektion av peri-operativa analgetika som innehåller 5 mg/kg meloxikam och 4 mg/kg Bupivacaine. Klipp öppna bukhålan med en skalpell och ett par sax och noggrant exponera livmoder hornen.
- Injicera 1 μL DNA-lösning per embryo i den laterala ventrikeln av ett halvklot, som tidigare beskrivits24.
- Utför regelbunden IUE24 för kortikala neuroner genom att placera den positiva elektrodens änd fot vid cortex och med hjälp av 5 100-MS fyrkantiga pulser (38 V) vid 1 Hz med en elektroporator.
Obs: olika kortikala regioner kan riktas för elektroporation genom att ändra placeringen av elektrodens änd fot i förhållande till den laterala ventrikeln.
-
Stereotaxic injektion
- Förbered en mus på postnatal dag 30 för stereotaxic kirurgi26. Anesthetize musen som beskrivs i steg 3.1.2, och tillämpa subkutan injektion av peri-operativa analgetika som innehåller 5 mg/kg karprofen.
- Späd AAV-serotyp 2/1 (AAV2/1) som uttrycker hSyn-tAKARα-WPRE till en empiriskt bestämd titer (~ 1 x 109− 1 x 1010 genom/μl) i spruta-filtrerat (0,2 μm cellulosaacetat membran) fosfatbuffrad saltlösning.
- Borra ett hål på ~ 500 μm diameter med hjälp av en handhållen borr under ett stereomikroskop på följande koordinater för motor barken: 0,5 mm Anterior till bregma, 1,2 mm lateralt till mittlinjen.
- Montera en injektor (t. ex. oljehydraulisk manipulator, med skräddarsydd kolv/glas pipett hållare) till en motoriserad manipulator. Placera injektionsnålen i 15 ° vinkel i förhållande till bregma-lambda-planet. Program mera en diagonal rörelse över x-och z-axlarna motsvarande en 700 μm och 200 μm progression längs främre-bakre och dorsala-ventrala axlar, respektive.
Anmärkning: För att undvika skador på vävnaden direkt ovanför det avsedda bildområdet injiceras AAV-partiklar i en vinkel i förhållande till bregma-lambda-planet. - Placera spetsen på injektionsnålen vid Pia i mitten av borrhålet och kör sakta den diagonala rörelsen (~ 25 μm/s) som beskrivs ovan. Detta förfarande kommer att placera centrum för injektion vid 1,2 mm anterior bregma, 1,2 mm lateral till mittlinjen, 0,2 mm under Pia.
- Injicera 20 nL utspädda viruspartiklar (~ 10 nL/min). Vänta minst 10 min och sakta tillbaka injektionsnålen (~ 12,5 μm/s).
- Avsluta stereotaxic injektionsproceduren och lim/sutur huden26.
4. installation av cranial fönster
- Utför placeringen av kranialfönstret på möss som uttrycker tAKARα via IUE (avsnitt 3,1) eller stereotaxic injektion av virala partiklar (avsnitt 3,2), mellan dag 30 och 60 i postnatal. För mus infekterade med virala partiklar, genomföra kraniala fönstret minst två veckor efter viruset injektion. Installera kraniala fönster som tidigare beskrivits27,28, med följande information. Anesthetize musen som beskrivs i steg 3.1.2, och tillämpa subkutan injektion av peri-operativa analgetika 0,075 mg/kg Buprenex och antiinflammatoriskt medel dexametason vid 4 mg/kg.
- Ta bort periostet och dra tillbaka nacken muskeln. Limma kanten av huden till skallen med vävnad lim för att undvika exponering av halsen muskulatur efter operationen.
- Torka och ta bort eventuella periostet från skallen genom att försiktigt skrapa med en skalpell. Placera bild huvud plattan (8 mm innerdiameter) för att omge det avsedda bildfältet. Limma huvud plattan på skallen med hjälp av cyanoakrylatbaserad lim, följt av Dental akryl cement. För optimal vidhäftning, se till att huvud plattan vilar på den exponerade och torkade skallen. Lim Accelerator kan användas för att påskynda härdning.
- Rita en cirkel med 5 mm i diameter över det avsedda bildfältet (koordinater enligt steg 3.2.3) med hjälp av en tand borr och exponera dura mater.
- Applicera ett tunt lager av transparent polymer, även kallad konstgjord Dura, till Dura-ytan för att täcka hela kraniala fönstret. Polymeren kommer att skydda och stabilisera dura mater. Placera en steril cirkulär täckslip (5 mm diameter) på dura mater. Säkra täckglas med cyanoakrylatlim appliceras runt kanterna av fönstret följt av Dental akryl cement.
5. in vivo Tvåfotonfluorescens livstid Imaging mikroskopi
- Påbörja 2pFLIM-avbildning vid eller efter 2 veckor efter installationen av kranialfönstret (avsnitt 4). Minimera experimentell störning på grund av stress genom frekvent hantering och skruffning av musen före starten av Imaging studien att vänja musen.
- Ställ in två-Photon excitation laser våglängd till 960 nm med hjälp av programvara som styr två-Photon laser.
- Anaesthetize musen med 4% isofluran. Bekräfta ordentlig anestetization av svans-nypa och observera andningsfrekvens. Det är, det bör inte finnas något svar på svansen-nypa och andningsfrekvensen bör reduceras till ~ 1 andetag per sekund. För att minimera onödig procedur tid och eftersom anestesi varar endast i två till tre minuter, ögon smörjmedel används inte.
- Överför den anestetiserade musen till det motoriserade löpbandet (figur 2C) och montera musens huvud platta på Headplate-hållaren på löp bands inställningen (se figur 2 för detaljer). Rengör ytan på kraniala fönster täckslip på musen med 70% etanol.
- Placera det motordrivna löpbandet med den monterade musen under 2pFLIM-målet. Applicera en droppe destillerat vatten mellan kraniala fönstertäckslip och målet.
- Låt den monterade musen vakna från anestesi och bli ackliated till löpbandet och Mikroskop miljön i minst 10 min. övervaka andningsfrekvens av musen medan den monterade musen vaknar upp från anestesi.
- Navigera till injektionsstället under EPI-belysning. Dokumentera relaterat funktioner (dvs. blodkärl) under brightfield för att underlätta avbildning av samma intresse region (ROI) under efterföljande bildsessioner.
- Eliminera alla inkommande ljus annat än det avgivna ljuset från hjärnvävnaden. Slå av EPI-belysningens ljuskälla och Stäng kapslingen på 2pFLIM-riggen. Aktivera 2pFLIM-PMT genom att slå på maskinvarans kommando spänningskontroll.
- Förvärva en z-stack 2pFLIM bild med hjälp av 2pFLIM förvärvet programvara FLIMimage med följande rekommenderade inställningar för avbildning tAKARα-positiv Somata i vakna möss. Ange bild Rute medelvärde till 3 bildrutor, skanningshastighet till 2 MS/linje, bildstorlek till 128 x 128 pixlar och synfält till 90 − 100 μm. Justera Bildinställningar baserat på förberedelse-och maskinvarukonfigurationen.
-
Inspektera den förvärvade bilden i FLIMview (egenutvecklad anpassad programvara; se avsnitt 6). Justera bildinställningarna enligt steg 5,9 för att optimera fotons räkning och minimera foto blekning.
Anmärkning: En fungerande integrerad Photon räkna i en ROI för livstid avbildning av en tAKARα-positiv Soma in vivo är ~ 1000 − 10000 fotoner beroende på signalamplitud som resulterar från en viss stimulans (se diskussion).- Vid behov, Använd ett minskat synfält, minskad skanningshastighet, ökad lasereffekt och ökat antal bildrutor som ska beräknas för att öka den integrerade fotonen räknas och minska livslängden uppskattning fel. På samma gång, se till att använda den minimala essentiella lasereffekt, ram medelvärdes-och skanningshastighet för att minimera photoblekning.
- Bild med ett regelbundet tidsintervall (t. ex. varje 30 − 60 s) genom att upprepa z-stack-anskaffningen med inställningar som bestäms i steg 5,10. Förvärva baseline 2pFLIM bilder för minst 15 min på noll löpband hastighet.
- Ställ in löp bands rotationshastigheten på ~ 15 cm/s i 15 minuter medan du förvärvar 2pFLIM-bilder. Fortsätt avbilda för ≥ 20 min efter avstängning av löpbandet rotation, för att bedöma varaktigheten av PKA aktivitet efter avslutad påtvingad förflyttning.
6. analys av 2pFLIM bilder
-
Öppna de förvärvade bilderna i FLIMview och ange följande parametrar i FLIMview.
Obs: parameter Detaljer beskrivs i diskussionen.- Klicka på den enda Photon Counting (SPC) minsta och största intervall fält i FLIMview. Ange lämpligt intervallvärde för minsta och högsta SPC, vanligtvis mellan 1,2 − 2 respektive 10 − 12 ns.
- Klick på det t0 värde fält i FLIMview och gå in den t0 värde (typiskt ~ 2 ns). Klicka på den livstids luminans minimum tröskel värde fält i FLIMview och ange det önskade tröskelvärdet till 5 − 30 fotoner.
- Klicka på knappen Ny grupp (N) och tilldela ett experiment gruppnamn. Detta kommer att generera en grupp som kombinerar data från varje tillagd FLIM-avbildning.
- Klicka på ROI -knappen i ROI Controls -modulen i flimview och rita en ROI runt en takarα-positiv Soma. Minska z-stack intervallet genom att flytta den nedre och övre z-gränsen i z-stacken kontroll reglagen i FLIMview, för att minimera signalen förorening från bakgrund fotoner i andra z djup.
- Klicka på knappen + för att lägga till flim-bilden i gruppen (steg 6,2). Klicka på Calc -knappen för att beräkna medelvärdet för livslängden (lt, även kallat Mean Photon emissions tid [mpet]), för ROI och livstids Skattnings fel (δτ).
- Öppna nästa fil i den chronical 2pFLIM Imaging-serien. Upprepa steg 6,4. Var noga med att justera positionen för ROI och z-stack intervall för att mäta samma tAKARα-positiv Soma över tiden, eftersom det kan finnas vävnad drift över tiden.
- Välj Deltampet/mpet0 i den nedrullningsbara menyn i modulen grupp kontroller . Klicka på fältet baseline # och ange index (er) (t. ex. 1 2 3 4 5 för de fem första bilderna i gruppen som skapades i steg 6,3). Detta kommer att definiera bilden/bilderna som används för att beräkna original livslängden (LT0).
- Klicka på Rita för att generera ett diagram som innehåller flim-svaret (δlt/lt0) av takarα under experimentet i den definierade Rois. Normaliserade livslängds förändringar (ΔLT) av enskilda ROIs med motsvarande baslinje livstid (LT0) möjliggör jämförelse av PKA-aktivitet vid förflyttning mellan olika Rois.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FRET-FLIM sensorer möjliggör visualisering av många olika signalering vägar, inklusive cAMP/PKA väg som deltar i neuromodulation. Det aktuella protokollet utnyttjar den nyligen utvecklade tAKARα-sensorn i kombination med 2pFLIM för att visualisera PKA-aktiviteter i huvud-fast beter möss. De flesta befintliga två-Photon Mikroskop kan uppgraderas med 2pFLIM kapacitet genom att lägga till tre till fyra komponenter, som illustreras i figur 1 (se även avsnitt 1). För att visualisera FRET i 2pFLIM-förvärvade bilder, kvantifiering av medelvärdet livstid utfördes på histogram tomter av Photon timing samlas per pixel (figur 3a, B). Mean livstid visualiserades med hjälp av en pseudo-färgad bild, där hög (kall färg) och låg (varm färg) betyder livstider representerar låg och hög PKA aktiviteter, respektive, eftersom PKA aktiveringen leder till en minskning av livstid. Försiktighet måste iakttas för att ställa in SPC-intervallet på rätt sätt. Detta intervall bör ställas in inom laserpuls intervallet (t. ex. 12,5 ns med en pulsfrekvens på 80 MHz) med minimerade hårdvaru kant artefakter (se även avsnitt 6 och diskussion). Beräkning av PKA aktivitet inom ROIs utfördes genom att kombinera LT av alla pixlar inom en given ROI (figur 3c, D). I head-fixad vaken möss basala livstider varierade mellan 1,3 och 1,8 NS (figurera 3E). Avbildning av tAKARα i motoriska cortex i head-fast vaken möss tillåtet för realtid kvantifiering av PKA aktivitet med cellulära upplösning under basal och påtvingad förflyttning (figur 4). Experimentet kan upprepas över dagar och månader. Påtvingad förflyttning utlöser PKA aktivitet i en population av nervceller i de ytliga lagren av mus motor cortex17. Denna PKA-aktivitet är beroende av neuromodulering via aktivering av β-adrenerga och D1-receptorer17.
Figur 1: schematiskt för ett 2pFLIM-system. 2pflim kan genomföras på en konventionell två-Photon Mikroskop genom tillsats av den gula markerade hårdvara komponenter: en Photon timing Counting module, en låg-brus snabb Fotomultiplikator röret (PMT), en fotodiod (endast behövs om lasern inte har en för lasertiming) och en signal splitter som tillval. Denna siffra har modifierats från MA et al.17. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: design av ett specialbyggt motordrivet löpband. (A) schematiskt av löp bands designen framifrån (överst till vänster), sida (överst till höger) och övre vyer (nederst till vänster). Löpbandet (Foam Ball) axeln är ansluten till en roterande kodare och en motor som är kollektivt monterade på två stolpar på en solid aluminium bröd plattan. Den Headplate-kompatibla hållaren på höger vinkels fäste är fast på en solid stolpe och placerad ovanför löpbandet. Schematiska ritningar är inte att skala. Front (B) och sida (C) Visa fotografier av löpbandet. Korrekt positionering av musen på löpbandet visas i panel C. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kvantifiering av 2pFLIM-data. (A) en flim bild med varje pixel pseudo-färgade för att representera medelvärdet livstid (lt), i förhållande till laser timing, av alla fotoner i denna pixel. (B) fotons ankomsttider inom en enda pixel (lila kvadrat i panel a) var ritade i ett histogram (vänster panel). Integrations gränser sattes för att bestämma det enda fotonräknande området (SPC, grått). Inom SPC intervallet, integralen av Photon timing divideras med det totala antalet fotoner och sedan dras av med t0 (1,65 ns, streckad linje), vilket resulterar i en genomsnittlig livstid (lt, avstånd mellan streckade och streckade linjer) av 1,74 ns. Kvantifiering av den genomsnittliga livslängden för hela synfältet (ljusblå fyrkant i panel A) involverade integrationen av fotons timing som samlats in i alla pixlar (höger panel), vilket resulterar i en genomsnittlig livstid på 1,7 NS. Insets visar samma data i semi-log skala. (C och D) Kvantifiering av genomsnittlig livstid per intresse region (ROI). (C) representativt exempel på en 2pFLIM-bild. Två ROIs drogs runt två Somata i lager 2/3 av motoriska cortex. (D) Photon timing distributioner integreras över alla pixlar inom varje ROI (vänster panel). Cellrois var färgkodade (som visas i panel C) röd, cell 1; blått, cell 2. Normaliserade Photon Counts möjliggör jämförelse av foton timing fördelningar mellan de två ROIs (höger panel, Mean livstid; cell 1, 1,33 ns; cell 2, 1,73 NS). Insets visar samma data i semi-log skala. (E) distribution Plot av genomsnittliga basala livstider från 254 avbildade celler i de ytliga lagren av motoriska cortex. L1-celler (n = 186 celler/11 djur, vänster panel), som är bosatta inom 100 μm under Pia, uttryckt som tAKARα efter en stereotaxic injektion av AAV2/1-hSyn-tAKARα-WPRE och L2/3 pyramidala celler (n = 68 celler/4 djur, höger panel), som är bosatta minst 150 μm under Pia, uttryckt tAKARα efter IUE av en CAG-tAKARα-WPRE DNA-konstruktion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: tAKARα spårar påtvingade rörelse-inducerad PKA aktiviteter i motoriska cortex. (A) representativ intensitet (vänster panel) och livstid (mellersta och högra paneler) bilder av tre L1-celler i motor barken. Cellrois var färgkodade: orange, cell 1; blått, cell 2; gul, cell 3. (B) Photon timing fördelningar mätt i cell 1 (övre panelen) under basal villkoret (orange spår, mätt i mellersta panelen Α) och påtvingad förflyttning (Loco., ljus orange spår, mätt i höger panel A). Normaliserade foton räknas som tillåtna för direkt jämförelse av fotontidfördelning (nedre panelen, genomsnittlig livstid: basal, 1,72 ns; förflyttning, 1,42 NS). Insets visar samma data i semi-log skala. (C) δlivstid/livstid0 (δlt/lt0) spår av motsvarande celler (övre panelen, se panel A) med påtvingad förflyttning hastighet (nedre panelen). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll visar användningen av FRET-FLIM sensor tAKARα att visualisera neuromodulation-utlöst PKA aktivitet i huvud-fast beter sig möss. Denna applikation är baserad på omfattande tester och karaktäriseringar av tAKARα in vitro och in vivo för att visa att den FLIM-signal som erhålls är relevant för fysiologiska neuromodulatoriska händelser17. Här, en in vivo ansökan, Locomotion-inducerad PKA aktivitet i motoriska cortex, används för att beskriva förfarandena för att leverera sensorn till hjärnan, djur kirurgi för avbildning, hårdvara och programvara krav för beteende och Imaging datainsamling och programvara och algoritmer för analys av bild data.
TAKARα-sensorn introduceras till cortex av IUE av DNA-plasmider eller stereotaxic injektion av AAV-partiklar. Beroende på elektroporation parametrar och DNA-koncentrationer, IUE resulterar i olika märkning densitet kortikala neuroner över ett relativt stort område i cortex25. Det kortikala skiktet märkt med IUE bestäms av embryonala stadiet när operationen utförs. Stereotaxic injektion av AAV-partiklar används när det önskas att avbilda många celler inom en definierad hjärna subregion. Det resulterar vanligtvis i tätt märkta nervceller vidinjektionsstället och alltmer glesa märkning längre från centrum. Viktigt är att infektionseffektiviteten hos cellerna i hjärnan är beroende av den AAV-serotyp som används. AAV2/1 erbjuder stor effektivitet i kortikala, thalamic, och striatala nervceller med relativt låg retrograd märkning aktiviteter. Det rekommenderas att empiriskt fastställa vilken AAV-serotyp som är effektivast för den riktade hjärnregionen och celltypen. Båda transfektionmetoderna har framgångsrikt uttryckt tAKARα. "Sweet Spot" för uttrycksnivån är empiriskt bestämd.
Påtvingad förflyttning resulterar i ökad PKA aktiviteter i lager 2/3 nervceller i motoriska cortex. För närvarande begränsar 2pFLIM utbudet av testbara beteenden på grund av huvud-fixering av musen. Men en ständigt växande lista över beteendemässiga paradigm har framgångsrikt genomförts inom denna begränsning, allt från att rapportera stimuli i go/no-go uppgifter till rumslig orientering i Virtual Reality31,32,33 . Dessutom kan förbättrade metoder möjliggöra avbildning i djupa hjärnregioner, såsom striatum, amygdala och Hippocampus, via ett nålliknande gradient index (GRIN) lins13 (opublicerade observationer). Därför bör det nuvarande protokollet som beskriver användningen av tAKARα och 2pFLIM för in vivo visualisering av neuromodulering händelser vara lätt tillämplig på många hjärnregioner i samband med huvud-fasta beteendemässiga paradigm.
Beräkning av livstid per pixel eller ROI med kurva passning är beräkningsmässigt tidskrävande, och den begränsade totala fotonen antal per pixel resulterar ofta i passande fel. Genomsnittlig livstid (lt) beräknas därför aritmetiskt som en approximation under livstiden (τ)17,34:
(Ekvation 1)
där SPCminoch SPCMax är mät fönstrets (SPC) gränser och F (t) är fluorescenslivstiden för förfall. Med andra ord, för varje Beräknad volym (pixel eller ROI, figur 3a) ritas fotontidfördelningen i ett histogram (figur 3b). Inom SPC-intervallet divideras den viktade integralen (med tiden som vikten) av denna fördelning med det totala antalet fotonen för att resultera i en genomsnittlig emissions tid. Den här tiden korrigeras sedan för t0. Så här skapar du en livstids bild (figur 3a) den här proceduren utförs för varje pixel, medan beräkning av livstid per ROI (figur 3c, D) integrerar alla fotoner från alla pixlar som ligger över tröskelvärdet inom ROI-volymen. Livslängds Skattnings felet (δτ) beräknas med hjälp av den integrerade intensiteten (Nfoton: totalt antal fotons kal):
(Ekvation 2)
För att minimera livslängds Skattnings fel, δτ, och ge ordentlig signaldetektering FRET-FLIM kräver förvärvet av tillräckligt fotoner per ROI. För att uppnå ett önskat signal-till-brus-förhållande (SNR) måste δτ också uppfylla följande ekvation:
(Ekvation 3)
Till exempel, typisk mätning under förflyttning i en neuronala Soma i motoriska cortex (LT = 1,57 ns, NPhoton = 9075, δlt = 0,15 ns; Figur 4, cell 1) ger ett livstids Skattnings fel på:
δτ 
0,016 NS (ekvation 4)
vilket resulterar i ett signal-brus-förhållande på:
SNR 
= 9,4 (ekvation 5)
Om en önskad SNR är endast 5, givet ΔLT = 0,15 ns är a δτ tillåten av:
som kräver en minsta total fotons räkning av:
Som beskrivits ovan kräver livstids kvantifiering korrekt inställning av flera parametrar, till exempel SPC-intervall, t0och livstids luminansminimitröskel. SPC-intervallet bestämmer mätnings fönstret för utsända fotoner inom maskin varu mätnings fönstret (ekvation 1; maskin varu mätnings fönstret är normalt 0 − 12,5 ns, eftersom lasern upprepas på 80 MHz). Detta är nödvändigt eftersom PTCM som används i det här protokollet har kant artefakter. SPC-intervallet är inställt på att införliva de flesta av givarens fotons livstids distribution utan att inkludera kant artefakterna. För att beräkna medellivstid subtraberas medelvärdet för fotonen från mätnings fönstret med t0, vilket motsvarar tidpunkten för laserpulsen i fönstret (ekvation 1, figur 3a, B)17,34. t0 kan justeras genom att ändra signalkabelns längder eller ptcm-inställningarna, och är normalt justerad för att vara ~ 2 ns från början av maskin varu mätnings fönstret. Efter initial karakterisering av systemet, vanligtvis utförs under nära idealiska avbildnings förhållanden (t. ex. När Imaging 5 μM fluorescein lösning), både SPC området och t0 är inställda som fasta parametrar för en viss maskinvarukonfiguration. Minimitröskeln för livstids luminans är inställd så att endast pixlar med ett totalt fotons antal som är lika med eller högre än tröskelvärdet inkluderas i visningen och analysen. Detta minskar effektivt bullret på grund av bakgrund foton räknas, inklusive autofluorescence, omgivande ljus, och spontana PMT mörka räknas. Denna tröskel är empiriskt bestämd.
Lyckade FRET-FLIM-sensorer för in vivo 2pFLIM-avbildning har minst tre gemensamma funktioner. För det första, när det gäller valet av fluoroforer, är den Photon insamling effektivitet vanligtvis låg under den utmanande in vivo Imaging miljön delvis på grund av svår ljusspridning i hjärnvävnad. Samtidigt krävs ett stort antal upptäckta fotoner för att uppnå en önskvärd SNR (≥ 1 000 fotoner skulle krävas för att uppnå ett SNR på 1 för en ΔLT/LT0 av 0,03; se ekvationer 2 och 3). Därför är en givare fluorophore med en hög Photon budget (dvs., det maximala antalet detekterbara fotoner innan en fluorophore blekt) gynnas. För närvarande finns det ingen systematisk jämförelse av olika givare fluorophores i termer av deras Photon budget under två-Photon excitation. Empiriskt är eGFP relativt ljus samtidigt som den är mer foto stabil jämfört med många andra fluoroforer i den gröna/gula spektrumet, vilket gör det till en stor givare fluorophore för in vivo användning av FRET-FLIM sensorer. Dessutom, för optimal kvantifiering av FRET, givare fluoroforer med en enda exponentiell fluorescens livstid förfall gynnas. Många vanligt förekommande givare fluorescerande proteiner för ratiometriska avbildning, såsom eCFP, har multiexponentiell fluorescens livstid sönderfaller, vilket tyder på att de består av blandade populationer av fluoroforer. Dessa fluorescerande proteiner är därför inte idealiska för FRET-FLIM21. Tvärtemot donatorn fluorophore, kan en låg Quantum avkastning av acceptorn fluorophore vara fördelaktigt för FRET-FLIM sensorer. Den "mörka" låg-irradiant fluorofores sREACh används för tAKARs. Låg Quantum Yield av acceptorn fluorophore minimerar fotonen förorening i givaren fluorophore emission spektrum och frigör en fluorescensdetektor kanal för samtidig avbildning av en andra fluorescerande sensor eller morfologi markör i det röda spektrumet När det gäller tAKARα.
För det andra, för att få tillräckligt SNR över bindnings fraktion intervall, en optimal FRET-effektivitet ~ 0.5 − 0.7 gynnas21. Signalen, dvs den genomsnittliga livslängden förändras under en given givare-acceptor bindande förhållande förändring, är beroende av effektiviteten i FRET. Detta förhållande mellan FRET effektivitet och betyder livstid förändring är dock icke-linjär. Om bandet effektivitet närmar sig en, givaren fluoroforer i Bound-State är effektivt avger nästan inga fotoner. Därför, om inte bindnings förhållandet är 100% (detta är aldrig fallet eftersom ingen acceptor fluorophore mognar till 100%29) den genomsnittliga livstiden närmar sig livslängden för givaren fluorophore i öppen stat, och förmågan att upptäcka Bound-State sensorer Minskar. BANDET-effektivitet för tAKARα uppskattas vara ~ 0,7, inom det gynnsamma intervallet.
Tredje, FRET-FLIM sensorer bör rapportera signaler med en känslighet och kinetik som är relevanta för djurens fysiologi. Sensorns känslighet och kinetik bör testas i stor utsträckning in vitro före användning in vivo, och, om nödvändigt, kan stämmas med hjälp av en mängd olika metoder, såsom att justera substrat-bindande domän tillhörighet och kinetik, länkare-optimering, och subcellulära sensorns inriktning. I tidigare arbete, det fastställdes att tAKARα kan detektera PKA aktivitet framkallas av utsläpp av endogena dopamin, och att kinetik och känslighet av sensorn överensstämmer med en känd PKA-beroende biologisk process, som är noradrenalin-inducerad inaktivering av den långsamma efter-hyperpolarization strömmen17. Dessutom verkar uttrycket av tAKARα inte förändra neuronala funktioner, som analyseras med elektrofysiologi17 och mätning av strukturell plasticitet av enskilda Taggar (opublicerade observationer).
Aktuella tekniska begränsningar för 2pFLIM Imaging är relaterade till datahantering och foton räkna throughputs. Först kräver FLIM lagring av fotons ankomsttider för varje pixel. Minnesstorleken på PTCM begränsar den erhållas Pixel upplösning. För den PCTM beskrivs här, upp till 256 x 256 pixlar per bild ram med en 64-punkt tidsupplösning kan uppnås. Dessutom är överföringshastigheten för FLIM bilddata från Board till dator lagring relativt långsam, igen, sätta praktiska gränser för upplösning och samplingsfrekvens. Kontinuerlig teknisk förbättring av minneskapacitet och datahantering kan lösa dessa begränsningar i framtiden. Andra, vanligen använda PTCMs är analoga till digitala system och begränsas av deras Photon upptäckt återställa gånger (dvs., "dödtid"). Detta innebär att efter upptäckten av en Photon den ptcm inte kommer att registrera ankomsten av någon efterföljande Photon (s) för nästa 100 − 125 ns18,21. Dessutom är livstids mätningen partisk mot den första anlände fotonen efter en laserpuls (så kallade "Pile-up"). Dessa begränsar fotonräknande klassar till < 107 fotoner per s. Även om det i de flesta typiska två-Photon Imaging regimer detta inte är ett stort problem, bör försiktighet iakttas att inte överstiga fotons räkna hastighet gränser. Nyare PTCMs som har kortare dödtid eller en gigahertz kontinuerlig datainsamlingssystem kan lindra denna begränsning (för den senare se Yellen och Mongeon18).
Fluorescerande sensorer för signalering vägar, såsom Camp/PKA, akt/PKB, PKC, och erk, ständigt genereras och optimeras16,35. För de flesta av de aktuella sensorerna behövs ytterligare karakterisering och optimering för att utmärka sig i den utmanande in vivo-avbildningsmiljön. I synnerhet, ökad signalamplitud är viktigt, eftersom någon ökning av signalamplituden minskar efterfrågan på Photon budgetar med en fyrkantig relation. För tAKARα, dess responsamplitud till endogena Neuromodulatorer, såsom noradrenalin, förbättrades med 2,7-faldigt jämfört med den tidigare bästa sensorn. Detta översatt till en ~ 7-faldig minskning av erforderliga fotoner. I praktiken minskade detta kraftigt antalet falska negativa (dvs. icke-responders) hos djur under beteende17. Den maximala tAKARα-signalen som observeras är ~ 30% (ΔLT/LT0). Hittills är detta den största FLIM signal rapporteras för liknande klasser av FRET sensorer. Ytterligare förbättring kan också vara möjligt genom att optimera acceptorn fluorophore och affiniteten av FHA till fosforylerade Threonine. Dessutom kan användningen av sensorer som övervakar olika aspekter av samma signalväg ge en kraftfull metod för att mekanistiskt undersöka regleringen av signalering vägar in vivo. I framtiden, den framgångsrika tillämpningen av flim sensorer för att visualisera neuromodulatory signalering vägar in vivo kommer att ge viktiga insikter om var och när neuromodulering sker i intakt neuronala nätverk av beter möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar MS Tess J. Lameyer, MS Ruth Frank, och Dr Michael A. Muniak för redigeringar och kommentarer, och Dr Ryohei Yasuda på Max Planck Florida för 2pFLIM förvärv programvara. Detta arbete stöddes av två BRAIN Initiative Awards U01NS094247 (H.Z. och T.M.) och R01NS104944 (H.Z. och T.M.), en R01 Grant R01NS081071 (T.M.), och en R21 Grant R21NS097856 (H.Z.). Alla utmärkelser är från det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
| 3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
| Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
| AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
| Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
| Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Circular coverslip (5 mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
| Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
| Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
| Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
| Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
| Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
| Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
| FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
| Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
| Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
| Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
| Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
| Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
| Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
| Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
| Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
| Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
| Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
| Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
| Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
| Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
| Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
| Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
| Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
| Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
| Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
| Rotation encoder | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
| Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
| Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
| Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
| Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
| Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
| Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
| Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
| White PE foam roller (8 inch x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
| White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |
References
- Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).
- Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).
- Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety. Neuron. 87 (3), 468-470 (2015).
- Berke, J. D. What does dopamine mean? Nature Neuroscience. 21 (6), 787-793 (2018).
- Chen, Y., et al. Endogenous Gαq-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A. Neuron. 96 (5), 1070-1083 (2017).
- Madison, D. V., Nicoll, R. A. Cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 372 (1), 245-259 (1986).
- Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction. Nature Neuroscience. 6 (1), 15-16 (2003).
- Pedarzani, P., Storm, J. F. PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons. Neuron. 11 (6), 1023-1035 (1993).
- Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection. Current Opinion in Neurobiology. 7 (3), 397-403 (1997).
- Radnikow, G., Feldmeyer, D. Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex. Frontiers in Neuroanatomy. 12 (January), (2018).
- Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
- Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. Hitchhiker’s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach. Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochemical and Biophysical Research Communications. 348 (2), 716-721 (2006).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging. Frontiers in Pharmacology. 5 (April), 1-12 (2014).
- Ma, L., et al. A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice. Neuron. 99 (4), 665-679 (2018).
- Yellen, G., Mongeon, R. Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).
- Tang, S., Yasuda, R. Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity. Neuron. 93 (6), 1315-1324 (2017).
- Tillo, S. E., et al. Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates. Cell Reports. 19 (3), 617-629 (2017).
- Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16 (5), 551-561 (2006).
- Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2. Journal of Biological Chemistry. 257 (6), 3284-3290 (1982).
- Zhong, H., et al. Subcellular dynamics of type II PKA in neurons. Neuron. 62 (3), 363-374 (2009).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP. Brain Cell Biology. 36 (1-4), 31-42 (2008).
- Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of Förster resonance energy transfer. Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
- Yu, K., et al. The central amygdala controls learning in the lateral amygdala. Nature Neuroscience. 20 (12), 1680-1685 (2017).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Yasuda, R. Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1121-1128 (2012).
- Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nature Cell Biology. 20 (10), 1215-1225 (2018).
