Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Visualisere protein kinase en aktivitet i hodet-fast oppfører mus bruke in vivo to-Foton fluorescens Lifetime Imaging mikroskopi

Published: June 7, 2019 doi: 10.3791/59526
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Vollum Institute, Oregon Health & Science University
* These authors contributed equally

Summary

En prosedyre er presentert for å visualisere protein kinase en virksomhet i hodet fast, oppfører mus. En forbedret A-kinase aktivitet reporter, tAKARα, uttrykkes i kortikale neurons og gjort tilgjengelig for Imaging gjennom et skallen vindu. To-Foton fluorescens levetid Imaging mikroskopi brukes til å visualisere PKA aktiviteter in vivo under tvungen bevegelse.

Abstract

NeuroModulation utøver kraftig kontroll over hjernens funksjon. Dysfunksjon av neuromodulatoriske systemer resulterer i nevrologiske og psykiatriske lidelser. Til tross for deres betydning, teknologier for sporing neuromodulatoriske hendelser med mobilnettet oppløsning er bare begynnelsen å dukke opp. Neuromodulatorer, som Dopamin, noradrenalin, acetylkolin, og serotonin, utløse intracellulære signalering hendelser via sine respektive G protein-koplet reseptorer til modulere neuronal excitability, Synaptic kommunikasjon og andre neuronal funksjoner, og dermed regulere informasjonsbehandling i det neuronal nettverket. De nevnte neuromodulatorer møtes på cAMP/protein kinase A (PKA). Derfor, in vivo PKA Imaging med single-celle oppløsning ble utviklet som en avlesning for neuromodulatoriske hendelser på en måte som tilsvarer kalsium Imaging for neuronal elektriske aktiviteter. Her presenteres en metode for å visualisere PKA aktivitet på nivået av individuelle neurons i cortex på hodet faste oppfører mus. For å gjøre dette, en forbedret A-kinase aktivitet reporter (AKAR), kalt tAKARα, brukes, som er basert på Förster resonans energi overføring (bånd). Denne genetisk-kodede PKA-sensoren introduseres i motor barken via Utero electroporation (IUE) av DNA-plasmider, eller stereotaxic injeksjon av adeno-assosiert virus (AAV). BÅND endringer er avbildet ved hjelp av to-Foton fluorescens levetid Imaging mikroskopi (2pFLIM), som tilbyr fordeler fremfor ratiometrisk bånd målinger for kvantifisere bånd signal i lys-spredning hjernevev. For å studere PKA aktiviteter under tvungen bevegelse, er tAKARα avbildet gjennom en kronisk skallen vindu over cortex av våken, Head-fast mus, som løper eller hviler på en Speed-kontrollerte motorisert tredemølle. Denne avbildnings tilnærmingen vil være gjeldende for mange andre hjerneregioner for å studere tilsvarende atferds-indusert PKA aktiviteter og til andre FLIM-baserte sensorer for in vivo Imaging.

Introduction

NeuroModulation, også kjent som langsom Synaptic girkasse, pålegger sterk kontroll over hjernens funksjon under ulike atferds-tilstander, som stress, opphisselse, oppmerksomhet, og bevegelse1,2,3, 4. til tross for sin betydning, studiet av når og hvor neuromodulatoriske hendelser finner sted er fortsatt i sin spede begynnelse. Neuromodulatorer, inkludert acetylkolin, dopamin, noradrenalin, serotonin, og mange nevropeptider, aktivere G protein-sammenkoblede reseptorer (GPCRs), som igjen utløser intracellulære andre Messenger trasé med et bredt vindu av tidsrammer alt fra sekunder til timer. Selv om hver neuromodulator utløser et distinkt sett med signal hendelser, er leiren/proteinet kinase a (pKa) en vanlig nedstrøms vei for mange neuromodulatorer1,5. Leiren/pKa Pathway regulerer neuronal excitability, Synaptic transmisjon, og plastisitet6,7,8,9, og derfor Tunes den neuronal Network Dynamics. Fordi ulike neurons eller neuronal typer uttrykke ulike typer eller nivåer av neuromodulator reseptorer10, den intracellulære effektene av samme ekstracellulære neuromodulator kan være heterogen på tvers av ulike neurons, og dermed må studert med mobilnettet oppløsning. Hittil er det fortsatt utfordrende å overvåke neuromodulatoriske hendelser i individuelle neurons in vivo under atferden.

Å studere spatiotemporal dynamikk av NeuroModulation, en passende innspilling modalitet er nødvendig. Microdialysis og rask skanning syklisk voltammetri er ofte brukt til å studere utgivelsen av neuromodulatorer, men de mangler romlig oppløsning for å overvåke cellulære hendelser11,12. Analoge til kalsium dynamikk blir brukt som en proxy for neuronal elektrisk aktivitet i befolkningen Imaging13, pKa Imaging kan brukes til å lese ut neuromodulatoriske hendelser over en neuronal befolkning på mobilnettet oppløsning. Den foreliggende protokollen beskriver bruken av en forbedret A-kinase aktivitet reporter (AKAR) til å overvåke PKA aktiviteter in vivo under dyr atferd. Metoden som er beskrevet her gir mulighet for samtidig bildebehandling av neuronal populasjoner ved subcellulære oppløsning med en temporal oppløsning som sporer fysiologiske neuromodulatoriske hendelser.

AKARs består av en donor og en Acceptor fluorescerende proteiner forbundet med en pKa fosforylering substrat peptid og en stallgreip-assosiert (FHA) domene som binder seg til fosforylert Serine eller threonin av underlaget14,15. Ved aktivering av PKA veien, underlaget peptid av AKAR er fosforylert. Som følge av FHA domenet binder seg til fosforylert substrat peptid, og dermed bringe de to fluorophores i umiddelbar nærhet, referert til som den lukkede tilstand av AKAR. Den lukkede tilstand av en fosforylert AKAR resulterer i økt Förster resonans energi overføring (bånd) mellom donor og Acceptor fluorophores. Siden andelen fosforylert AKARs er relatert til nivået av pKa aktivitet16, kan mengden av bånd i en biologisk prøve brukes til å kvantifisere nivået av pKa aktivitet16,17,18, 19,20.

Tidlige versjoner av AKARs ble primært utviklet for to-fargers ratiometrisk Imaging14. Når Imaging dypere inn i hjernevevet, lider ratiometrisk metoden fra signal forvrengning på grunn av bølgelengde-avhengig lysspredning17,18,21. Som beskrevet nedenfor, eliminerer fluorescens Lifetime Imaging mikroskopi (FLIM) dette problemet fordi FLIM bare måler fotoner slippes ut av donor fluoroforen18,21. Som et resultat, FLIM kvantifisering av bånd er ikke påvirket av vev-dybde17. I tillegg kan en "mørk" (dvs. lav Quantum yield [QY]) variant av Acceptor fluoroforen brukes. Dette frigjør en fargekanal for å lette multiplekset måling av ortogonale neuronal egenskaper via simultan avbildning av en andre sensor eller en morfologiske markør17,19,20.

FLIM Imaging kvantifiserer tiden som en fluoroforen tilbringer i opphisset tilstand, dvs. den fluorescens levetid18. Avkastningen av en fluoroforen til bakken staten, og dermed slutten av opphisset tilstand, ofte concomitates med utslipp av et foton. Selv om utslipp av et foton for en individuell spent molekyl er Stokastisk, i en befolkning den gjennomsnittlige fluorescens levetid er karakteristisk for den aktuelle fluoroforen. Når en ren befolkning av fluorophores er opphisset samtidig, det resulterer fluorescens ville følge etter etter en enkelt eksponentiell forråtnelse. Tiden konstant av dette eksponentiell forfall tilsvarer gjennomsnittlig fluorescens levetid, som vanligvis spenner fra ett til fire nanosekunder for fluorescerende proteiner. Avkastningen av en spent donor fluoroforen til bakken staten kan også oppstå ved bånd. I nærvær av bånd, fluorescens levetid av donor fluoroforen er redusert. Den unphosphorylated AKARs utstillingen en relativt lengre donor fluorescens levetid. Ved fosforylering av PKA, viser sensoren en kortere levetid fordi donor og Acceptor fluorophores bringes nær hverandre og bånd økes. Kvantifisering av fluorescens levetid i en populasjon av AKARs representerer derfor nivået av PKA aktivitet.

Tidlige versjoner av AKARs har ikke blitt brukt for in vivo Imaging på en enkelt celle oppløsning. Dette skyldes i hovedsak den lave signal amplituden til AKAR-sensorene til fysiologiske aktiveringer17. I den seneste tid, av systematisk sammenlignende anvendelig AKAR sensor for to-Foton fluorescens levetid tenkelig mikroskopi (2pFLIM), en sensor alarmert FLIM-AKAR var grunnlegge å overgå alternativ sensor. Videre ble en rekke FLIM-AKAR-varianter kalt målrettet AKARs (tAKARs) utviklet for å visualisere PKA aktivitet på bestemte subcellulære steder: mikrotubuli (tAKARα), stoffer (tAKARβ), utgangen (tAKARδ), trådformede utgangen (tAKARε), membran (tAKARγ), og postsynaptic tetthet (tAKARζ). Blant tAKARs, tAKARα økt signal amplitude elicited av noradrenalin av 2,7-fold. Dette er i overensstemmelse med kunnskapen om at flertallet av pKa i neurons er forankret til mikrotubuli ved hvile staten22,23. tAKARα var den beste utøver blant eksisterende AKARs for 2pFLIM. Videre oppdaget tAKARα fysiologisk-relevant PKA aktivitet elicited av flere neuromodulatorer, og uttrykk for tAKARα ikke endre neuronal funksjoner17.

Nylig ble tAKARα vellykket brukt til å visualisere PKA aktiviteter i hodet faste oppfører mus17. Det ble vist at tvungen bevegelse utløste PKA aktivitet i Soma av overfladisk lag neurons (lag 1 til 3, opp til en dybde på ~ 300 μm fra Pia) i motoren, fat, og visuelle barken. Den bevegelse-utløste PKA aktiviteten var delvis avhengig signalering via β-adrenerge reseptorer og D1 dopamin-reseptorer, men ble ikke påvirket av en D2 dopamin reseptor motstander. Dette arbeidet illustrerer evnen til tAKARs å spore NeuroModulation hendelser in vivo bruker 2pFLIM.

I den gjeldende protokollen er hele metoden for PKA aktivitet Imaging i hode-fast våken mus under et tvungen bevegelse paradigme beskrevet i seks trinn. Først tillegg av 2pFLIM evner til en konvensjonell to-Foton mikroskop (figur 1). For det andre, byggingen av en motorisert tredemølle (figur 2). For det tredje, uttrykket av tAKARα sensoren i musen cortex av i Utero electroporation (IUE) av DNA plasmider, eller stereotaxic injeksjon av adeno-assosiert virus (AAV). Excellent protokoller for operasjoner for IUE24,25 og stereotaxic injeksjon av viral partikler26 har blitt publisert tidligere. De viktigste parametrene vi brukte er beskrevet nedenfor. Videre installasjon av et skallen vindu. Excellent protokoller har tidligere blitt utgitt for skallen vinduet kirurgi27,28. Flere trinn som er endret fra standardprotokollene, er beskrevet. Femte, opptre i vivo 2pFLIM. Sjette, analysene av 2pFLIM bilder (Figur 3 og Figur 4). Denne tilnærmingen bør være lett tilgjengelig for mange andre hode-faste atferdsmessige paradigmer og hjerneområder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her over ha blitt anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) av Oregon sunnhet og vitenskap universitet.

1. oppsett av mikroskop 2pFLIM

  1. Installer en Foton timing telling modul (PTCM, tabell av materialer) og koble til datamaskinen (figur 1) i henhold til produsentens manual.
    Merk: PTCM er vanligvis en datamaskin tavle som mottar en "Sync" input for laser puls timing og en Foton inngang fra photomultiplier røret (PMT). Den mottar også klokke timing for piksler, linjer og rammer, fra to-Foton tenkelig kontrollprogramvare. PTCM bruker klokke signalene til å skille individuelle fotoner inn i forskjellige piksler og rammer.
  2. Legg til en PHOTODIODE med > 200 MHz båndbredde for å måle laser timingen. Plasser en standard glass dekkglass i lys banen for å reflektere en liten brøkdel av laser lyset inn i PHOTODIODE plassert vinkelrett på lys banen (figur 1). Koble PHOTODIODE utgang til "Sync" input av PTCM.
    Merk: Mange moderne lasere også utgang laseren timing. For disse lasere er PHOTODIODE ikke nødvendig, og man kan direkte koble laser timing utgang til Sync input av PTCM.
  3. Utveksle avdrag, i tilfelle tAKARα, den grønne kanalen PMT, med lav støy, rask GaAsP PMT (figur 1). Koble PMT-utgangen til signalinngangen på PTCM.
    1. Legg til en valgfri signal splitter (figur 1) hvis samtidig anskaffelse av intensitet gjennom konvensjonelle to-Foton bilde kanal er ønsket. Koble PMT-utgangen til signal splitteren, og koble dele utgangen til PTCM og den konvensjonelle to-Foton bilde modulen.
      Merk: GaAsP eksportert pmts gir hurtigere enkelt-Foton signaler enn tradisjonell bialkali eksportert pmts og tillate for en flere akkurat bestemmelse av det Foton beregner. Enkelte modeller av GaAsP eksportert pmts kan kjøles ned til 10 − 35 ° c under omgivelsestemperatur, slik at undertrykkelse av mørke teller til et nivå under et par hundre per sekund (vanligvis ≤ 200 teller/s). Denne lav bråk plan flate er betydelig for det akkurat måler av fluorescens levetid fordi bråk Foton teller kan ikke være lett skille ut eller trekkes fra det fluorescens levetid kurven.
  4. Legg til et bånd-pass fluorescens utslipps filter som minimerer Spectral forurensning, hvis noen, fra Acceptor fluoroforen. For eksempel, for tAKARα, en 500 NM ± 20 NM barriere filter for den grønne kanalen brukes til å redusere forurensning fra Acceptor sREACh, som er en mørk (QY ~ 0,07) gult fluorescerende protein (YFP)29,30. Koble tidssignaler, for eksempel klokkene for individuelle bildepunkter, linjer og rammer, avhengig av Kontrollprogramvaren og beskrevet i PTCM Brukerhåndbok. Installer riktig datakontroll og programvare for oppkjøp.
    Merk: Noen PTCM-produsenter (tabell over materialer) leverer programvare for 2pFLIM-avbildning. Her brukes tilpasset programvare kalt FLIMimage, som ble utviklet av Yasuda Lab (Max Planck Florida, via personlig kommunikasjon). Denne programvaren fungerer som en add-on bruker funksjon til visse to-Foton oppkjøpet programvare (tabell av materialer). Den kontroller og kommuniserer med det PTCM for det passende beregner under to-Foton tenkelig å erverve 2pFLIM profilen.

2. bygging av en motorisert tredemølle

Merk: Utformingen av den spesialbygde motoriserte tredemølle er vist i figur 2.

  1. Skjær en skum valsen (Ø = 200 mm) til 150 mm i lengde med en fin baufil. Alternativt, lim de to halvdelene av en skum ball sammen og plassere tape over sømmen. Alternativt kan du lime en gummimatte med profil på valsen for å øke grepet på rullen.
  2. Bor en 1/4 tommers diameter hull gjennom midten av valsen på den flate siden av valsen eller bore en 1/4 tommers diameter hull gjennom midten av hver halvdel av ballen hvis skummet ballen brukes.
  3. Installer en 1/4 tommer diameter stål aksel gjennom hullet. Lim skummet valsen/ballen til akselen ved hjelp av skum-kompatible lim. Alternativt, endre to fleksible akselkoblinger (1/4 tommer indre diameter) for å styrke koplingen av akselen til skummet roller/ball.
    Merk: Vær oppmerksom på at mange vanlige lim kan oppløse skum.
    1. For hver aksel kopling, plasser aksel koplingen på den flate siden og i midten av rektangel metallplaten (0,7 mm x 15 mm x 76 mm). Sveis platen til aksel koplingen. Bor en 1/4 tommers hull i midten av platen for å muliggjøre installasjon av modifisert aksel kopling på akselen og to skruen hull i metallplaten lateral fra sentrum.
    2. Monter aksel koplingen på akselen mot skum valsen/ballen. Hvis du bruker sistnevnte, litt bøy platen for å passe krumning av ballen. Plasser skruene i de laterale hullene for å feste rullen/ballen på akselen.
  4. Drill og trykk på en 3/8-32 tråd i midten av en bur plate og Monter den roterende koderen. Bor en skrue hull i bunnen av høyre vinkel motor braketten for å tillate feste av motoren på innlegget holderen. Fest både den roterende koderen og motoren til enden av akselen ved hjelp av en fleksibel aksel kopling.
  5. Installer montert tredemølle på en aluminium brød bord ved hjelp av innlegg for motoren og roterende Encoder (figur 2). Koble motor innganger til hastighets kontrolleren, og den roterende koderen utgang til en analog inngang på datamaskinen datainnsamling (DAQ) bord.
    Merk: Rotasjonen vinkel hastighet er kodet av roterende Encoder som spenning og er digitalisert ved hjelp av tilpasset programvare kalt AnimalTracker skrevet i MATLAB.
  6. Monter den headplate holderen til en høyre vinkel brakett. Installer et solid innlegg på brød platen foran tredemøllen og Installer den monterte headplate holderen med høyre vinkel brakett på innlegget (figur 2). Sørg for at headplate holder stolpene er på linje med akselen slik at musen kan vedta en tilstrekkelig og behagelig gang posisjon på tredemøllen (figur 2C).

3. uttrykk for tAKARα sensor i mus cortex

  1. I Utero electroporation
    1. Klargjør en DNA-løsning for IUE ved å legge til 0,2% endelig konsentrasjon av raskt grønt fargestoff (for visualisering under injeksjon) til et plasmider DNA (3 − 4 μg/μL; sensor konstruksjoner som inneholder et CAG-Promotor, sensor sekvens og et woodchuck hepatitt-virus post-transcriptional respons element [WPRE] translational Enhancer) oppløst/fortynnet i vann eller Tris-EDTA.
    2. Forbered en tidsinnstilt gravid kvinnelig mus (f. eks C57BL/6) for IUE på E1624. Bedøve musen med isoflurane (4% for induksjon og 1,5% for vedlikehold, på 95% O2 med 5% CO2) og påfør subkutan injeksjon av Peri-operative smertestillende inneholdende 5 mg/kg meloksikam og 4 mg/kg bupivakain. Skjær åpne bukhulen med en skalpell og en saks og nøye utsette livmor hornene.
    3. Injiser 1 μL av DNA-oppløsning per embryo i den laterale ventrikkel av en halvkule, som tidligere beskrevet24.
    4. Utfør regelmessige IUE24 for kortikale neurons ved å plassere den positive elektrode enden foten ved cortex og bruke 5 100-MS kvadrat pulser (38 V) ved 1 Hz med en electroporator.
      Merk: ulike kortikale regioner kan rettes for electroporation ved å endre plasseringen av elektrode enden foten i forhold til lateral ventrikkel.
  2. Stereotaxic injeksjon
    1. Forbered en mus på postnatal dag 30 for stereotaxic kirurgi26. Bedøve musen som beskrevet i trinn 3.1.2., og påfør subkutan injeksjon av Peri-operative smertestillende inneholdende 5 mg/kg Karprofen.
    2. Fortynne AAV serotype 2/1 (AAV2/1) uttrykker hSyn-tAKARα-WPRE til en empirisk bestemt titer (~ 1 x 109− 1 x 1010 genomer/μL) i sprøyte-filtrert (0,2 μm cellulose acetate membran) fosfat-bufret saltvann.
    3. Bor en ~ 500 μm diameter hull ved hjelp av en håndholdt Drill under en stereomikroskopet på følgende koordinater for motor cortex: 0,5 mm fremre til bregma, 1,2 mm lateral til midtlinjen.
    4. Monter en injeksjons (f.eks. oljehydraulisk manipulator, med skreddersydd stempel/glass pipette holder) til en motorisert manipulator. Plasser injeksjonsnålen i en 15 ° vinkel i forhold til bregma-lambda-flyet. Programmere en diagonal bevegelse på tvers av x-og z-aksene tilsvarende en 700 μm og 200 μm progresjon langs fremre bakre og rygg-ventrale akser, henholdsvis.
      Merk: For å unngå skader på vevet rett over det tiltenkte bildefeltet, injiseres AAV-partikler i en vinkel i forhold til bregma-lambda-planet.
    5. Plasser tuppen av injeksjonsnålen på Pia i midten av borehullet og utfør sakte den diagonale bevegelsen (~ 25 μm/s) beskrevet ovenfor. Denne prosedyren vil posisjonere sentrum av injeksjon ved 1,2 mm fremre til bregma, 1,2 mm lateral til midtlinjen, 0,2 mm under Pia.
    6. Injiser 20 nL av fortynnede virale partikler (~ 10 nL/min). Vent minst 10 minutter og trekk langsomt ut injeksjonsnålen (~ 12,5 μm/s).
    7. Fullfør den stereotaxic injeksjonsprosedyren og lim/Sutur huden26.

4. installasjon av skallen Window

  1. Utfør plassering av skallen vinduet på mus uttrykker tAKARα via IUE (§ 3,1) eller stereotaxic injeksjon av virale partikler (§ 3,2), mellom postnatal dager 30 og 60. For mus infisert med viral partikler, implementere skallen vinduet minst to uker etter at viruset injeksjon. Installer skallen vinduet som tidligere beskrevet27,28, med følgende detaljer. Bedøve musen som beskrevet i trinn 3.1.2., og påfør subkutan injeksjon av Peri-operative smertestillende 0,075 mg/kg Buprenex og anti-inflammatorisk middel deksametason ved 4 mg/kg.
  2. Fjern periosteum og trekk ut nakke muskelen. Lim kanten av huden til skallen med vev lim for å unngå eksponering av nakkemuskulaturen etter operasjonen.
  3. Tørk og fjern eventuelle periosteum fra skallen ved forsiktig skraping ved hjelp av en skalpell. Plasser bilde headplate (innvendig diameter på 8 mm) for å omgi det tiltenkte bildefeltet. Lim headplate til skallen ved hjelp av Cyanoacrylate-basert lim, etterfulgt av Dental akryl sement. For optimal vedheft, sørg for at headplate hviler på eksponert og tørket skallen. Lim akselerator kan brukes til å akselerere herding.
  4. Tegn en sirkel på 5 mm i diameter over den tiltenkte Imaging feltet (koordinater som angitt i trinn 3.2.3) ved hjelp av en tannlege bore og utsette Dura mater.
  5. Påfør et tynt lag med transparent polymer, også kalt kunstig Dura, til Dura overflaten for å dekke hele skallen vinduet. Den polymer vil beskytte og stabilisere Dura mater. Plasser en steril sirkulær dekkglass (5 mm diameter) på Dura mater. Fest dekkglass med Cyanoacrylate lim påføres rundt kantene av vinduet etterfulgt av Dental akryl sement.

5. inne vivo to-Foton fluorescens levetid tenkelig mikroskopi

  1. Start 2pFLIM Imaging på eller utover 2 uker etter installasjon av skallen vinduet (del 4). Minimer eksperimentell interferens på grunn av stress ved hyppig håndtering og Scruffing av musen før starten av bildebehandlings studien for å venne musen.
  2. Sett to-Foton eksitasjon laser bølgelengde til 960 NM ved hjelp av programvare som styrer to-Foton laser.
  3. Dop musa med 4% isoflurane. Bekreft riktig bedøvelsen ved hale-klype og observere puste rater. Det er, bør det ikke være noen respons på halen-klype og puste hastigheten bør reduseres til ~ 1 pust per sekund. For å minimere unødvendig prosessuelle tid og fordi anestesi varer bare for to til tre minutter, er øye smøremidler ikke brukes.
  4. Overfør den anesteserte musen til den motoriserte tredemøllen (figur 2C), og Monter headplate til den headplate holderen til tredemølle-oppsettet (se figur 2 for detaljer). Rengjør overflaten av skallen vinduet dekkglass på musen med 70% etanol.
  5. Plasser den motoriserte tredemøllen med den monterte musen under 2pFLIM-målet. Påfør en dråpe destillert vann mellom skallen vinduet dekkglass og målet.
  6. La montert musen våkner opp fra anestesi og bli acclimated til tredemølle og mikroskop miljø i minst 10 min. Monitor åndedrett hastighet av musen mens montert musen våkner opp fra anestesi.
  7. Naviger til injeksjonsstedet under Epi-belysning. Dokument fiducial funksjoner (dvs. blodkar) under brightfield for å hjelpebilde behandling av samme interesseområde (ROI) under påfølgende bildebehandlings økter.
  8. Eliminer eventuelle innkommende lys annet enn det som avgis lys fra hjernevevet. Slå av Epi-belysning lyskilde og lukke kabinettet til 2pFLIM riggen. Aktiver 2pFLIM PMT ved å slå på kommando spennings kontrollen for maskinvare.
  9. Skaff en z-stack 2pFLIM bilde ved hjelp av 2pFLIM oppkjøpet programvare FLIMimage med følgende anbefalte innstillinger for Imaging tAKARα-positive somata i våken mus. Sett ramme gjennomsnitt til 3 rammer, skanning hastighet til 2 MS/line, bildestørrelse til 128 x 128 piksler, og synsfelt til 90 − 100 μm. Juster bildeinnstillingene basert på klargjøringen og maskinvarekonfigurasjonen.
  10. Inspiser ervervet bildet i FLIMview (egenutviklet tilpasset programvare; se avsnitt 6). Juster bildeinnstillingene etter trinn 5,9 for å optimalisere Foton-telling og Minimer photobleaching.
    Merk: En gjennomførbar integrert Foton telle i en avkastning for levetid Imaging av en tAKARα-positive Soma in vivo er ~ 1000-10000 fotoner avhengig av signal amplitude som resultater fra en bestemt stimulans (se diskusjon).
    1. Der det er nødvendig, bruk et redusert synsfelt, redusert skannehastighet, økt laser kraft, og økt antall rammer som skal gjennomsnitt for å øke den integrerte Foton teller og redusere levetiden estimering feilen. På samme tid, sørg for å bruke minimal viktig laser effekt, ramme snitt, og skanning hastighet for å minimere photobleaching.
  11. Bilde med et vanlig tidsintervall (for eksempel hver 30 − 60 s) ved å gjenta kjøp av z-stakken ved å bruke innstillinger fastsatt i trinn 5,10. Skaff Baseline 2pFLIM bilder i minst 15 min ved null tredemølle hastighet.
  12. Sett tredemølle rotasjonshastighet til ~ 15 cm/s for 15 min mens anskaffe 2pFLIM bilder. Fortsett Imaging for ≥ 20 min etter å ha slått av tredemøllen rotasjon, for å vurdere varigheten av PKA aktivitet etter opphør av tvungen bevegelse.

6. analyse av 2pFLIM bilder

  1. Åpne de kjøpte bildene i FLIMview, og angi følgende parametere i FLIMview.
    Merk:     parameter detaljer er beskrevet i diskusjon.
    1. Falle i staver på enkelt Foton opptellingen (SPC) minst mulig og maksimum omfang felter inne FLIMview. Angi riktig minimums-og maksimumsverdi for SPC-området, som vanligvis varierer mellom 1,2 − 2 og 10 − 12 NS.
    2. Falle i staver på t0 salgsverdi åker inne FLIMview og gå inn det t0 salgsverdi (karakteristisk ~ 2 NS). Klikk på det minste terskelverdi feltet for levetid i FLIMview, og angi ønsket terskelverdi til 5 − 30 fotoner.
  2. Klikk på den nye gruppe knappen (N) og Tildel et eksperiment gruppenavn. Dette vil generere en gruppe som kombinerer data fra hvert tillagte FLIM-bilde.
  3. Klikk på avkastningen Button i avkastningen styrer modulen av FLIMVIEW og trekke en avkastning rundt en tAKARα-positive Soma. Reduser z-stakken området, ved å flytte den nedre og øvre z-grensen i z-stabelen kontroll glidere i FLIMview, for å minimere signal forurensning som stammer fra bakgrunnen fotoner i andre z dybder.
  4. Klikk på + -knappen for å legge til FLIM-bildet i gruppen (trinn 6,2). Klikk på calc -knappen for å beregne gjennomsnittlig levetid (lt, også kalt Mean Foton utslipps tid [MPET]), for avkastning og levetid estimering feilen (δτ).
  5. Åpne neste fil i kroniske 2pFLIM Imaging-serien. Gjenta trinn 6,4. Sørg for å justere plasseringen av AVKASTNINGEN og z-stack rekkevidde for å måle de samme tAKARα-positive Soma over tid, fordi det kan være vev drift over tid.
  6. Velg deltaMPET/MPET0 i rullegardinmenyen for gruppen kontroller modul. Klikk på feltet Baseline # og skriv inn indeksen (e) (for eksempel 1 2 3 4 5 for de første fem bildene i gruppen som ble opprettet i trinn 6,3). Dette vil definere bildet (ene) som brukes til å beregne opprinnelig levetid (LT0).
  7. Klikk på plott for å generere en graf som inneholder FLIM-RESPONSEN (ΔLT/lt0) av tAKARα under eksperimentet i den definerte ROIs. Normalisert endringer i levetid (ΔLT) av individuelle ROIs av tilsvarende Baseline levetid (LT0) tillater for sammenligning av pKa aktivitet under bevegelse på tvers av ulike ROIs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BÅND-FLIM sensorer tillater visualisering av mange forskjellige signalering veier, inkludert cAMP/PKA veien involvert i NeuroModulation. Den nåværende protokollen benytter den nylig utviklede tAKARα-sensoren i kombinasjon med 2pFLIM for å visualisere PKA-aktiviteter i hode faste oppfører mus. De fleste eksisterende to-Foton-mikroskop kan oppgraderes med 2pFLIM-funksjoner ved å legge til tre til fire komponenter, som illustrert i figur 1 (se også avsnitt 1). Å visualisere bånd i 2pFLIM-ervervet bilder, kvantifisering av bety levetid ble utført på histogram plott av Foton timing samlet per piksel (figur 3a, B). Gjennomsnittlig levetid ble avbildet ved hjelp av en pseudo-farget bilde, der høy (kald farge) og lav (varm farge) betyr levetiden representerer lav og høy PKA aktiviteter, henholdsvis siden PKA aktivering fører til reduksjon av levetid. Det må utvises forsiktighet for å stille inn SPC-området korrekt; Dette området bør settes innenfor laser puls intervallet (for eksempel 12,5 NS av en puls på 80 MHz) med minimerte maskinvare kant artefakter (se også avsnitt 6 og diskusjon). Beregning av PKA aktivitet innenfor ROIs ble utført ved å kombinere LT av alle piksler innenfor en gitt ROI (figur 3c, D). I hodet-fast våken mus basal levetid varierte mellom 1,3 og 1,8 NS (figur 3e). Imaging av tAKARα i motor cortex i hode-fast våken mus tillatt for sanntids kvantifisering av PKA aktivitet med mobilnettet oppløsning under basal og tvungen bevegelse (Figur 4). Eksperimentet kan gjentas over dager og måneder. Tvungen bevegelse utløser PKA aktivitet i en populasjon av neurons innenfor overfladiske lag av musen motor cortex17. Dette PKA aktivitet er avhengig av NeuroModulation via aktivering av β-adrenerge og D1 reseptorer17.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av et 2pFLIM-system. 2pFLIM kan implementeres på en konvensjonell to-Foton mikroskop ved tilsetning av de gule markerte maskinvarekomponenter: et foton timing telling modul, en lav-støy rask photomultiplier Tube (PMT), en PHOTODIODE (bare nødvendig hvis laseren ikke har en utgangssignaler for laser timing), og en valgfri signal splitter. Dette tallet er endret fra ma et al.17. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: design av en spesialbygd motorisert tredemølle. (A) skjematisk av tredemølle design fra front (øverst til venstre), side (øverst til høyre), og topp visninger (nederst til venstre). Tredemøllen (skum ball) akselen er koblet til en roterende Encoder og en motor som er kollektivt montert på to innlegg på en solid aluminiums brød plate. Den headplate holderen på høyre vinkel brakett er festet til et solid innlegg og plassert over tredemøllen. Skjematisk tegninger er ikke å skalere. Front (B) og side (C) Vis fotografier av tredemøllen. Riktig posisjonering av musen på tredemøllen er vist i panel C. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kvantifisering av 2pFLIM data. (A) en FLIM bilde med hver piksel pseudo-farget for å representere gjennomsnittlig levetid (lt), i forhold til laser timing, av alle fotoner i den pixel. (B) Foton ankomst ganger innenfor en enkelt piksel (lilla firkant i panel a) ble plottet i et histogram (venstre panel). Integrasjon grenser ble satt til å bestemme enkelt Foton telling Range (SPC, grå). Innenfor SPC-området, var Integral av Foton timing delt på det totale antall fotoner og deretter trekkes fra t0 (1,65 NS, stiplet linje), noe som resulterer i en gjennomsnittlig levetid (lt, avstand mellom stiplede og stiplede linjer) av 1,74 NS. Kvantifisering av gjennomsnittlig levetid for hele synsfeltet (lys blå firkant i panel A) involvert integreringen av Foton timing samlet i alle piksler (høyre panel), noe som resulterer i en gjennomsnittlig levetid på 1,7 NS. Inn-inn data viser de samme dataene i en skala med halv logg. (C og D) Kvantifisering av gjennomsnittlig levetid per region av interesse (ROI). (C) representativt eksempel på et 2pFLIM bilde. To ROIs ble trukket rundt to somata i lag 2/3 i motor barken. (D) Foton timing distribusjoner integrert på tvers av alle piksler innen hver ROI (venstre panel). Celle ROIs ble fargekodet (som vist i panel C) rød, celle 1; blå, celle 2. Normalisert Foton teller tillate sammenligning av Foton timing distribusjoner mellom de to ROIs (høyre panel, betyr levetid; celle 1, 1,33 NS; celle 2, 1,73 NS). Inn-inn data viser de samme dataene i en skala med halv logg. (E) distribusjon tomten av Mean basal levetid fra 254 avbildet celler i overfladiske lag av motoren cortex. L1-celler (n = 186 celler/11 dyr, venstre panel), bosatt innenfor 100 μm under Pia, uttrykt tAKARα etter en stereotaxic injeksjon av AAV2/1-hSyn-tAKARα-WPRE, og L2/3 pyramideformet celler (n = 68 celler/4 dyr, høyre panel), bosatt minst 150 μm under Pia, uttrykt tAKARα etter IUE av en CAG-tAKARα-WPRE DNA-konstruksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: tAKARα sporer håndheves av aktiviteter som har indusert pKa i motor barken. (A) representative intensitet (venstre panel) og levetid (midtre og høyre paneler) bilder av tre L1-celler i motor barken. Celle ROIs ble fargekodet: oransje, celle 1; blå, celle 2; gul, celle 3. (B) Foton timing distribusjoner målt i celle 1 (øvre panel) under basal tilstand (oransje spor, målt i midten panel Α) og tvungen bevegelse (Loco., lys oransje spor, målt i høyre panel A). Normalisert Foton teller tillatt for direkte sammenligning av Foton timing distribusjon (nedre panel, betyr levetid: basal, 1,72 NS; bevegelse, 1,42 NS). Inn-inn data viser de samme dataene i en skala med halv logg. (C) Δlifetime/levetid0 (ΔLT/lt0) spor av de tilsvarende cellene (øvre panel, se panel A) med tvungen bevegelse hastighet (nedre panel). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen demonstrerer bruken av bånd-FLIM sensor tAKARα å visualisere NeuroModulation-utløste PKA aktivitet i hode-fast oppfører mus. Dette programmet er basert på omfattende testing og characterizations av tAKARα in vitro og in vivo for å demonstrere at FLIM signalet innhentet er relevant for fysiologiske neuromodulatoriske hendelser17. Her brukes en in vivo-applikasjon, bevegelse-indusert PKA-aktivitet i motor barken, til å beskrive prosedyrene for å levere sensoren til hjernen, dyre kirurgi for avbildning, maskinvare-og programvarekrav for atferd og bildedata innhenting og programvare og algoritmer for dataanalyser for bildebehandling.

Den tAKARα sensoren er introdusert til cortex av IUE av DNA plasmider eller stereotaxic injeksjon av AAV partikler. Avhengig av electroporation parametre og DNA konsentrasjoner, IUE resulterer i ulike merking tettheten av kortikale neurons over et relativt stort område i cortex25. Kortikale laget merket med IUE bestemmes av den embryonale scenen når operasjonen er utført. Stereotaxic injeksjon av AAV-partikler brukes når det er ønskelig å avbilde mange celler innenfor en definert hjerne under region. Det vanligvis resulterer i tett merket neurons på injeksjonsstedet og stadig mer sparsom merking lenger fra sentrum. Viktigere er infeksjon effektiviteten av celler i hjernen avhengig av AAV serotype brukes. AAV2/1 gir stor effektivitet i kortikale, thalamic, og stria tale neurons med relativt lav retrograd merking aktiviteter. Det anbefales å empirisk etablere hvilke AAV serotype er mest effektiv for den målrettede hjernen regionen og celle type. Begge transfeksjoner metoder har lykkes uttrykt tAKARα. "Sweet spot" for uttrykket nivå er empirisk bestemmes.

Tvungen bevegelse resulterer i økt PKA-aktivitet i lag 2/3 neurons av motor barken. Foreløpig begrenser 2pFLIM omfanget av testbare atferd på grunn av hode-fiksering av musen. Imidlertid, en noen gang-voksing liste over opptreden paradigmer ha blitt med hell gjennomført innen denne tvang, oppstiller fra meddeler stimuli inne gå/nei-gå verv å romlig orienteringen inne virkelig realitet31,32,33 . I tillegg kan forbedrede metoder muliggjøre bildebehandling i dype hjerneområder, slik som striatum, amygdala og hippocampus, via en nål-lignende graderings indeks (GRIN) linse13 (upubliserte observasjoner). Derfor bør den nåværende protokollen detaljering bruk av tAKARα og 2pFLIM for in vivo visualisering av NeuroModulation hendelser være lett tilgjengelig for mange hjerneregioner i sammenheng med hode-fast atferdsdata paradigmer.

Beregning av levetid per piksel eller avkastning ved hjelp av kurve montering er beregningsmessig tidkrevende, og den begrensede totale Foton teller per piksel ofte resulterer i montering feil. Derfor er gjennomsnittlig levetid (lt) aritmetisk beregnet som en tilnærming for levetiden (τ)17,34:


Equation 1(Formel 1)


hvor SPCmin, og SPCMax er måle vinduet (SPC) grenser og F (t) er fluorescens livstids forfall kurve. Med andre ord, for hvert beregnede volum (Pixel eller ROI, figur 3a) er Foton timing distribusjonen plottet i et histogram (figur 3b). Innenfor SPC-området er vektet Integral (med tiden vekten) av denne fordelingen delt på det totale antallet Foton for å resultere i en gjennomsnittlig utslipps tid. Denne gangen er så korrigert for t0. For å generere en livstids avbildning (figur 3a) utføres denne fremgangsmåten for hver piksel, mens beregning av levetid per ROI (figur 3c, D) integrerer alle fotoner fra alle piksler som er over terskelen i ROI-volumet. Livstids beregnings feilen (δτ) beregnes ved hjelp av den integrerte intensiteten (NFoton: totalt Foton-antall):


Equation 2(Ligning 2)

For å minimere livstids estimering feil, δτ, og gi riktig signal deteksjon bånd-FLIM krever oppkjøpet av nok fotoner per avkastning. For å oppnå et ønsket signal-til-støy-forhold (SNR), må δτ også oppfylle følgende ligning:


Equation 3(Ligning 3)


For eksempel, typisk måling under bevegelse i en neuronal Soma i motoren cortex (LT = 1,57 NS, NFoton = 9075, ΔLT = 0,15 NS; Figur 4, celle 1) gir en levetid estimering feil av:

Equation 4 Equation 5 δτ Equation 4 0,016 NS (ligning 4)

som resulterer i et signal-til-støy-forhold på:

SNR Equation 4 Equation 6 Equation 7 = Equation 4 9,4 (formel 5)

Hvis en ønsket SNR er bare 5, gitt ΔLT = 0,15 NS en δτ er tillatt av:

Equation 8

som krever et minimum totalt Foton teller:

Equation 9

Som beskrevet ovenfor, krever livstids kvantifisering riktig innstilling av flere parametre, for eksempel SPC-området, t0og minimums terskelen for levetid med lysstyrke. SPC-området fastsetter måle vinduet til utsendt fotoner i vinduet for maskinvare måling (formel 1; maskinvare målings vinduet er vanligvis 0 − 12,5 NS, da laseren gjentas ved 80 MHz). Dette er nødvendig fordi PTCM som brukes i denne protokollen, har kant artefakter. SPC-området er satt til å innlemme det meste av donor Foton levetid distribusjon uten å inkludere kanten artefakter. For å beregne gjennomsnittlig levetid trekkes den gjennomsnittlige Foton-timingen fra måle vinduet med t0, som tilsvarer tidspunktet for laser pulsen i vinduet (ligning 1, figur 3a, B)17,34. t0 kan justeres ved å endre signalkabel LENGDER eller PTCM-innstillingene, og er vanligvis justert til å være ~ 2 NS fra starten av maskinvare målings vinduet. Etter første karakterisering av systemet, vanligvis utført under nesten ideelle tenkelig forhold (f. eks, når Imaging 5 μM fluorescein løsning), både SPC-området og t0 er satt som faste parametre for en gitt maskinvarekonfigurasjon. Levetid glød minimums terskelen er satt slik at bare piksler med et totalt Foton telle lik eller høyere enn terskelen vil bli inkludert i skjerm og analyse. Denne effektivt reduserer støyen på grunn av miljøet Foton teller, inkluderer autofluorescence, omgivende lyset, og spontan avdrag mørk teller. Denne terskelen er empirisk bestemmes.

Vellykket bånd-FLIM sensorer for in vivo 2pFLIM Imaging har minst tre vanlige funksjoner. For det første, angående valget av fluorophores, det Foton innsamling av effektivitet er vanligvis lav under det utfordrende inne vivo tenkelig omgivelsene inne del på grunn av kraftig lyset spredningen inne hjerne tissue. Samtidig er det nødvendig med et høyt antall oppdagede fotoner for å oppnå en ønskelig SNR (≥ 1 000 fotoner ville være nødvendig for å oppnå en SNR på 1 for en ΔLT/LT0 av 0,03; se ligninger 2 og 3). Derfor en donor fluoroforen med et høyt Foton budsjett (dvs. maksimalt antall synlig fotoner før en fluoroforen er bleket) er favorisert. Foreløpig er det ingen systematisk sammenligning av ulike donor fluorophores i form av deres Foton budsjett under to-Foton eksitasjon. Empirisk, eGFP er relativt lyse samtidig som mer bred sammenlignet med mange andre fluorophores i grønt/gult spektrum, noe som gjør det til en stor donor fluoroforen for in vivo bruk av bånd-FLIM sensorer. I tillegg, for optimal kvantifisering av bånd, donor fluorophores med en enkelt-eksponentiell fluorescens levetid forfall foretrekkes. Mange vanlig brukte donor fluorescerende proteiner for ratiometrisk avbildning, slik som eCFP, har multi-eksponentiell fluorescens levetid henfall, noe som tyder på at de består av blandede populasjoner av fluorophores. Disse fluorescerende proteinene er derfor ikke ideelle for bånd-FLIM21. I motsetning til donor fluoroforen, en lav Quantum yield av Acceptor fluoroforen kan være fordelaktig for bånd-FLIM sensorer. Den "mørke" Low-irradiant fluoroforen sREACh brukes for tAKARs. Lav kvantum utbytte av det Acceptor fluoroforen minimere Foton forurensning inne det donor fluoroforen utstråling gjenferd og befrir ettall fluorescens oppdagelsen kanalen for samtidig tenkelig av en andre fluorescerende sensor eller morfologi Farm land inne det rød gjenferd i tilfelle av tAKARα.

For det andre, for å oppnå tilstrekkelig SNR på tvers av bindings brøk området, foretrekkes en optimal bånd effektivitet på ~ 0,5 − 0.721. Signalet, det vil si, gjennomsnittlig levetid endring under en gitt donor-Acceptor bindende forhold endring, er avhengig av effektiviteten av bånd. Dette forholdet mellom bånd effektivitet og gjennomsnittlig levetid endringen er imidlertid ikke-lineær. Hvis bånd effektivitet tilnærminger ett, donor fluorophores i Bound-stat er effektivt emitting nesten ingen fotoner. Derfor, med mindre bindings forholdet er 100% (dette er aldri tilfelle fordi ingen Acceptor fluoroforen modnes til 100%29) betyr levetid tilnærminger levetiden til donor fluoroforen i åpen tilstand, og evne til å oppdage bundne statlige sensorer Reduserer. Den bånd-effektivitet for tAKARα er anslått til ~ 0,7, innenfor gunstige området.

Tredje, bånd-FLIM sensorer skal rapportere signaler med en følsomhet og Kinetics som er relevante for dyre fysiologi. Sensor følsomhet og Kinetics bør testes grundig in vitro før bruk i Vivo, og, om nødvendig, kan stilles inn ved hjelp av en rekke tilnærminger, for eksempel justering av substrat bindende domene affinitet og Kinetics, linker-optimalisering, og subcellulære målretting av sensoren. I tidligere arbeid, ble det fastslått at tAKARα kan oppdage PKA aktivitet elicited av utgivelser av endogene dopamin, og at Kinetics og følsomhet for sensoren align med en kjent PKA-avhengig biologisk prosess, som er noradrenalin-indusert Deaktivering av langsom etter-hyperpolarization nåværende17. Videre, uttrykket av tAKARα ser ikke ut til å endre neuronal funksjoner, som analyseres av elektrofysiologi17 og måling av strukturelle plastisitet av individuelle pigger (upubliserte observasjoner).

Aktuelle teknisk begrensninger av 2pFLIM tenkelig er i slekt å data handling og Foton opptellingen produksjon. Først, FLIM krever lagring av Foton ankomst ganger for hver piksel. Minnestørrelsen på PTCM begrenser den oppnåelig piksel oppløsningen. For PCTM beskrevet her, opptil 256 x 256 piksler per bilderamme med en 64-punkts tid oppløsning kan oppnås. Dessuten, det forflytning fart av FLIM image data fra råd å computer lagringen er relativt langsom, atter, setter praktisk rammer på resolution og prøving hyppigheten. Kontinuerlig teknologisk forbedring av minnekapasitet og datahåndtering kan løse disse begrensningene i fremtiden. For det andre, vanlig-anvendt PTCMs er analog-å-Digital systemer og er begrenset av deres Foton oppdagelsen restarte timene (i.e., "død tid"). Dette betyr at etter oppdagelsen av ett Foton vil PTCM ikke registrere ankomsten av etterfølgende Foton (er) for de neste 100 − 125 NS18,21. Videre er livstids målingen forutinntatt mot den første ankom Foton etter en laser puls (såkalt "hoper opp"). Disse grense det Foton opptellingen ratene å < 107 fotoner per s. Til tross for inne høyst typisk to-Foton tenkelig regimer denne er ikke en større problem, bekymre burde være tatt ikke for å overgå det Foton opptellingen rate rammer. Nyere PTCMs som har kortere død tid eller en gigahertz kontinuerlig datainnsamlingssystem kan lindre denne begrensningen (for sistnevnte se Yellen og Mongeon18).

Fluorescerende sensorer for signal veier, for eksempel leir/pKa, akt/PKB, PKC og erk, blir kontinuerlig generert og optimert16,35. For de fleste av de nåværende sensorene er det behov for ytterligere karakterisering og optimering for å utmerke deg i det utfordrende i vivo bilde miljø. Spesielt er økt signal amplitude viktig, ettersom enhver økning i signal amplitude reduserer etterspørselen på Foton budsjetter med et firkantet forhold. For tAKARα, dens respons amplitude til endogene neuromodulatorer, som noradrenalin, ble forbedret med 2,7-fold i forhold til forrige beste sensor. Dette oversettes til en ~ 7-fold nedgang i nødvendige fotoner. I praksis er dette sterkt redusert antall falske negativer (dvs. ikke-respondere) i dyr under atferd17. Maksimalt tAKARα-signal observert er ~ 30% (ΔLT/LT0). Hittil er dette den største FLIM signal rapportert for lignende klasser av bånd sensorer. Ytterligere forbedring kan også være mulig ved å optimalisere Acceptor fluoroforen og affinitet av FHA til fosforylert threonin. I tillegg kan bruk av sensorer som overvåker ulike aspekter av samme signal vei gi en kraftig tilnærming til mechanistically undersøke regulering av signalering trasé in vivo. I fremtiden vil den vellykkede anvendelsen av FLIM sensorer for å visualisere neuromodulatoriske signalering trasé in vivo gi viktig innsikt om hvor og når NeuroModulation finner sted i intakt neuronal nettverk av oppfører mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker MS Tess J. Lameyer, MS Ruth Frank, og Dr. Michael A. Muniak for redigeringer og kommentarer, og Dr. Woojung Yasuda på Max Planck Florida for 2pFLIM oppkjøpet programvare. Dette arbeidet ble støttet av to BRAIN Initiative Awards U01NS094247 (H.Z. og T.M.) og R01NS104944 (H.Z. og T.M.), en R01 Grant R01NS081071 (T.M.), og en R21 Grant R21NS097856 (H.Z.). Alle priser er fra National Institute of nevrologiske lidelser og Stroke, USA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm cellulose acetate syringe filter Nalgene 190-2520 Step 3.2.2.
16x 0.8 NA water-immersion objective Nikon MRP07220 Step 5.5.
3-pin cable US digital CA-MIC3-SH-NC Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope
Aluminum bread board Thorlabs MB1012 Step 2.5.
AnimalTracker MATLAB software N/A N/A Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author
Band-pass barrier filter Chroma ET500-40m Step 1.4.
Cage plate Thorlabs CP01 Step 2.4. Used as mount for rotation sensor
Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter FST 19007-05 Steps 3.2.3. and 4.4.
Circular coverslip (5 mm diameter) VWR 101413-528 Step 4.5.
Custom-made injection needle holder N/A N/A Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author
Dental acrylic Yates Motloid 44114 Steps 4.3. and 4.5.
Dental drill; Microtorque ii Ram products 66699 Steps 3.2.3. and 4.4.
Dowsil transparent polymer The Dow Chemical Company 3-4680 Step 4.5. Artificial dura
Electroporation electrode Bex LF650P5 Step 3.1.4.
Electroporator Bex CUY21 Step 3.1.4.
Fast green FCF Sigma-aldrich F7258-25G Step 3.1.1.
FLIMimage MATLAB software N/A N/A Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida
FLIMview MATLAB software N/A N/A Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author
Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) Gorilla 5201204 Step 2.3.
Headplate N/A N/A Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author
Headplate holder N/A N/A Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket
Hydraulic micromanipulator Narishige MO-10 Step 3.2.4.
Krazy glue Krazy glue KG82648R Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue
Low-noise fast photomultiplier tube Hamamatsu H7422PA-40 or H10769PA-40 Step 1.3.
MATLAB 2012b Mathworks N/A Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software
Motor Zhengke ZGA37RG Step 2.4.
Motor speed controller Elenker EK-G00015A1-1 Step 2.5.
Motorized micromanipulator Sutter MP-285 Step 3.2.4.
Mounting base Thorlabs BA1S Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2
Mounting post Thorlabs P14 Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2
Mounting post base Thorlabs PB2 Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14
Mounting post bracket Thorlabs C1515 Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder
Optical post Thorlabs TR2 Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4
Phosphate-buffered saline Ν/Α Ν/Α Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247
Photodiode Thorlabs FDS010 Step 1.2.
Photon timing counting module Becker and Hickl SPC-150 Step 1.1.
Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) Addgene 119913 Step 3.1.3.
Post holder Thorlabs PH4 Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2
Right-angle bracket Thorlabs AB90 Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder
Rotation encoder US digital MA3-A10-250-N Step 2.4.
Rubber mat Rubber-Cal B01DCR5LUG Step 2.1.
Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) McMaster 6208K433 Steps 2.3. and 2.4.
ScanImage 3.6 Svoboda Lab/Vidrio Technology N/A Steps 5.9. and 6.1.
Signal splitter Becker and Hickl HPM-CON-02 Step 1.3.1.
Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) McMaster 1327K66 Step 2.3.
Stereotaxic alignment systsem David kopf 1900 Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator
Two-photon microscope N/A N/A Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)
Vetbond tissue adhesive 3M 14006 Step 3.2.6.
Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) Addgene 119921 Step 3.2.2.
White PE foam roller (8 inch x 12 inch) Fabrication enterprises INC. 30-2261 Step 2.1.1.
White polystyrene fom ball halves GrahamSweet 200mm diameter 2 hollow halves Step 2.1.1.
Zipkicker PACER PT29 Step 4.3. Hardening accelerator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).
  2. Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).
  3. Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety. Neuron. 87 (3), 468-470 (2015).
  4. Berke, J. D. What does dopamine mean? Nature Neuroscience. 21 (6), 787-793 (2018).
  5. Chen, Y., et al. Endogenous Gαq-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A. Neuron. 96 (5), 1070-1083 (2017).
  6. Madison, D. V., Nicoll, R. A. Cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 372 (1), 245-259 (1986).
  7. Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction. Nature Neuroscience. 6 (1), 15-16 (2003).
  8. Pedarzani, P., Storm, J. F. PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons. Neuron. 11 (6), 1023-1035 (1993).
  9. Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection. Current Opinion in Neurobiology. 7 (3), 397-403 (1997).
  10. Radnikow, G., Feldmeyer, D. Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex. Frontiers in Neuroanatomy. 12 (January), (2018).
  11. Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
  12. Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. Hitchhiker’s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
  13. Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach. Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).
  14. Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochemical and Biophysical Research Communications. 348 (2), 716-721 (2006).
  15. Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14997-15002 (2001).
  16. Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging. Frontiers in Pharmacology. 5 (April), 1-12 (2014).
  17. Ma, L., et al. A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice. Neuron. 99 (4), 665-679 (2018).
  18. Yellen, G., Mongeon, R. Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).
  19. Tang, S., Yasuda, R. Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity. Neuron. 93 (6), 1315-1324 (2017).
  20. Tillo, S. E., et al. Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates. Cell Reports. 19 (3), 617-629 (2017).
  21. Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16 (5), 551-561 (2006).
  22. Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2. Journal of Biological Chemistry. 257 (6), 3284-3290 (1982).
  23. Zhong, H., et al. Subcellular dynamics of type II PKA in neurons. Neuron. 62 (3), 363-374 (2009).
  24. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
  25. Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).
  26. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).
  27. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).
  28. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  29. Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP. Brain Cell Biology. 36 (1-4), 31-42 (2008).
  30. Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of Förster resonance energy transfer. Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).
  31. Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  32. Yu, K., et al. The central amygdala controls learning in the lateral amygdala. Nature Neuroscience. 20 (12), 1680-1685 (2017).
  33. Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
  34. Yasuda, R. Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1121-1128 (2012).
  35. Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nature Cell Biology. 20 (10), 1215-1225 (2018).

Tags

Nevrovitenskap NeuroModulation cAMP-avhengige protein kinase/protein kinase A (PKA) A-kinase aktivitet reporter (AKAR) Förster resonans energi overføring (bånd) tAKARα in vivo to-Foton fluorescens levetid Imaging mikroskopi (2pFLIM) kraniotomi bevegelse
Visualisere protein kinase en aktivitet i hodet-fast oppfører mus bruke in vivo to-Foton fluorescens Lifetime Imaging mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jongbloets, B. C., Ma, L., Mao, T.,… More

Jongbloets, B. C., Ma, L., Mao, T., Zhong, H. Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59526, doi:10.3791/59526 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter