Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Visualisering af proteinkinase en aktivitet i hoved-fast opfører mus ved hjælp in vivo to-foton fluorescens levetid Imaging mikroskopi

doi: 10.3791/59526 Published: June 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

En procedure er præsenteret for at visualisere protein kinase A aktiviteter i hovedet-fast, opfører mus. En forbedret A-kinase-aktivitets reporter, tAKARα, udtrykkes i kortikale neuroner og gøres tilgængelig for billeddannelse gennem et kranie vindue. To-foton fluorescens Lifetime Imaging mikroskopi bruges til at visualisere PKA aktiviteter in vivo under tvungen bevægelse.

Abstract

Neuromodulation udøver kraftfuld kontrol over hjernens funktion. Dysfunktion af neuromodulatoriske systemer resulterer i neurologiske og psykiske lidelser. På trods af deres betydning, teknologier til sporing af neuromodulatory begivenheder med cellulære opløsning er lige begyndt at dukke op. Neuromodulatorer, såsom dopamin, noradrenalin, acetylcholin, og serotonin, udløser intracellulære signalering begivenheder via deres respektive G protein-koblede receptorer til at modutere neuronal ophidelse, synaptisk kommunikation, og andre neuronal og dermed regulere informationsbehandlingen i neuronal netværket. De ovennævnte neuromodulatorer konvergerer på lejren/protein kinase A (PKA) pathway. Derfor, in vivo PKA Imaging med enkelt celle opløsning blev udviklet som en udlæser for neuromodulatoriske begivenheder på en måde analogt med calcium Imaging for neuronal elektriske aktiviteter. Heri præsenteres en metode til at visualisere PKA aktivitet på niveauet af individuelle neuroner i cortex af hoved-fast opfører mus. For at gøre dette, en forbedret A-kinase Activity reporter (AKAR), kaldet tAKARα, anvendes, som er baseret på Förster resonans energioverførsel (FRET). Denne genetisk kodede PKA-sensor introduceres i motorisk cortex via in utero elektroporation (iue) af DNA-plasmider eller stereotaxisk injektion af adeno-associeret virus (AAV). FRET ændringer er afbildet ved hjælp af to-foton fluorescens Lifetime Imaging mikroskopi (2pFLIM), som giver fordele i forhold til ratiometriske FRET-målinger til kvantificering af FRET-signalet i et let spredt hjernevæv. For at studere PKA aktiviteter under tvungen bevægelse, takarα er afbildet gennem en kronisk kranie vindue over cortex af vågen, hoved-faste mus, der kører eller hvile på en hastigheds kontrolleret motoriseret løbebånd. Denne billeddannelses tilgang vil være gældende for mange andre hjerneregioner for at studere tilsvarende adfærds inducerede PKA-aktiviteter og for andre FLIM-baserede sensorer til in vivo-billeddannelse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Neuromodulation, også kendt som langsom synaptisk transmission, pålægger stærk kontrol over hjernens funktion under forskellige adfærdsmæssige tilstande, såsom stress, ophidselse, opmærksomhed og bevægelse1,2,3, 4. på trods af sin betydning, studiet af Hvornår og hvor neuromodulatory begivenheder finder sted, er stadig i sin vorden. Neuromodulatorer, herunder acetylcholin, dopamin, noradrenalin, serotonin, og mange neuropeptider, aktivere G protein-koblede receptorer (GPCRs), som igen udløser intracellulære anden Messenger veje med et bredt vindue af tidshorisonter spænder fra sekunder til timer. Mens hver neuromodulator udløser et særskilt sæt signalerings hændelser, er Camp/protein kinase a (PKA)-vejen en fælles downstream-vej for mange neuromodulatorer1,5. Lejren/PKA-vejen regulerer neuronal ophidelse, synaptisk transmission og plasticitet6,7,8,9, og derfor melodier neuronal netværks dynamik. Fordi forskellige neuroner eller neuronal typer udtrykker forskellige typer eller niveauer af neuromodulator receptorer10, de intracellulære virkninger af samme ekstracellulære neuromodulator kan være heterogene på tværs af forskellige neuroner, og dermed, nødt til at være undersøgt med cellulær opløsning. Til dato, det er fortsat udfordrende at overvåge neuromodulatory begivenheder i individuelle neuroner in vivo under opførsel.

For at studere neuromodulations rumlige dynamik kræves en passende optagelses modalitet. Mikrodialyse og hurtig scanning cyklisk voltammetri bruges ofte til at studere frigivelse af neuromodulatorer, men de mangler den rumlige opløsning til at overvåge cellulære begivenheder11,12. Analogt med calcium dynamik anvendes som en proxy for neuronal elektrisk aktivitet i befolkningen Imaging13, pKa Imaging kan bruges til at læse ud neuromodulatory begivenheder på tværs af en neuronal befolkning ved cellulær opløsning. Denne protokol beskriver brugen af en forbedret A-kinase Activity reporter (AKAR) til at overvåge PKA aktiviteter in vivo under dyrs adfærd. Den beskrevne metode giver mulighed for simultan billeddannelse af neuronal populationer ved subcellulær opløsning med en tidsmæssig opløsning, der sporer fysiologiske neuromodulatoriske hændelser.

Akars er sammensat af en donor og en acceptor fluorescerende proteiner forbundet med en PKA fosforylering substrat peptid og en forkhead-associeret (FHA) domæne, der binder sig til fosforyleret Serin eller Threonin af substrat14,15. Ved aktivering af PKA-vejen er det substrat peptid af AKAR fosforyleret. Som følge heraf binder FHA-domænet sig til det fosforylerede substrat peptid, hvorved de to fluorophorer bringes i umiddelbar nærhed, benævnt den lukkede tilstand AKAR. Den lukkede tilstand af en fosforyleret AKAR resulterer i øget Förster Resonance energioverførsel (FRET) mellem donor og acceptor fluorophores. Da andelen af phosphorylerede akarer er relateret til niveauet af PKA-aktivitet16, kan mængden af Fret i en biologisk prøve anvendes til at kvantificere niveauet af PKA-aktivitet16,17,18, 19,20.

Tidlige versioner af AKARs var primært designet til to-farve ratiometrisk billeddannelse14. Når Imaging dybere ind i hjernevæv, den ratiometriske metode lider af signalforvrængning på grund af bølgelængde-afhængige lys spredning17,18,21. Som beskrevet nedenfor eliminerer fluorescens livstids billedbehandlings mikroskopi (Flim) dette problem, fordi Flim kun måler fotoner udsendt af donor fluoroforet18,21. Som følge heraf påvirkes FLIM-kvantificering af FRET ikke af vævs dybden17. Desuden kan en "mørk" (dvs. lav Quantum Yield [QY]) variant af acceptor fluoroforet anvendes. Dette frigør en farvekanal til at lette multiplexed måling af ortogonale neuronal egenskaber via simultan billeddannelse af en anden sensor eller en morfologiske markør17,19,20.

Flim Imaging kvantificerer den tid, en fluoroforet tilbringer i den ophidsede tilstand, dvs fluorescens levetid18. Tilbagelevering af en fluoroforet til jorden tilstand, således enden af den ophidsede tilstand, ofte samtidens med emission af en foton. Selv om emissionen af en foton for en individuel spændt molekyle er stokastisk, i en population den gennemsnitlige fluorescens levetid er en karakteristisk for denne særlige fluorophore. Når en ren population af fluorophorer er spændt samtidig, vil den resulterende fluorescens følge en enkelt eksponentiel forfald. Tids konstanten for dette eksponentielle forfald svarer til den gennemsnitlige fluorescens levetid, som typisk spænder fra et til fire nanosekunder for fluorescerende proteiner. Tilbagevenden af en ophidset donor fluoroforet til jorden tilstand kan også forekomme ved fret. Ved tilstedeværelse af Fret reduceres fluorescens levetid for donor fluoroforet. De unfosforylerede Akarer udviser en relativ længere donor fluorescens levetid. Ved fosforylering af PKA udviser sensoren en kortere levetid, fordi donoren og acceptoren fluorophores bringes i nærheden af hinanden, og FRET øges. Kvantificeringen af fluorescens levetid i en population af AKARs repræsenterer derfor niveauet for PKA-aktiviteten.

Tidlige versioner af AKARs er ikke blevet anvendt med succes til in vivo-billeddannelse ved en enkelt celle opløsning. Dette skyldes primært den lave signal amplitude af AKAR-sensorerne til fysiologiske aktiveringer17. For nylig, ved systematisk at sammenligne tilgængelige AKAR sensorer for to-photon fluorescens levetid Imaging mikroskopi (2pFLIM), en sensor kaldet FLIM-AKAR blev fundet at overgå alternative sensorer. Desuden blev der udviklet en række Flim-Akar varianter kaldet målrettede akars (takars) for at visualisere PKA aktivitet på specifikke subcellulære steder: microtubuler (takarα), cytosol (takarβ), actin (takarδ), filamentøse actin (takarε), membran (takarγ), og postsynaptisk tæthed (tAKARζ). Blandt Takarer øgede tAKARα signal amplitude fremkaldt af noradrenalin med 2,7 gange. Dette er i overensstemmelse med den viden, at størstedelen af PKA i neuroner er forankret til microtubuler i hviletilstand22,23. tAKARα var den bedste performer blandt eksisterende AKARs for 2pFLIM. Desuden opdagede tAKARα fysiologisk relevant PKA-aktivitet, som blev fremkaldt af flere neuromodulatorer, og ekspression af tAKARα ændrede ikke neuronal funktion17.

For nylig blev tAKARα anvendt med succes til at visualisere PKA-aktiviteter i hoved-Fixed opfører mus17. Det blev påvist, at tvungen bevægelse udløste PKA aktivitet i Soma af overfladiske lag neuroner (lag 1 til 3, op til en dybde på ~ 300 μm fra Pia) i motoren, tønde, og visuelle cortices. Den bevægelses udløste PKA-aktivitet var delvis afhængig af signalering via β-adrenerge receptorer og D1 dopamin receptorer, men blev ikke påvirket af en D2 dopamin receptor antagonist. Dette arbejde illustrerer evnen af takars til at spore Neuro hændelser in vivo ved hjælp af 2pflim.

I den nuværende protokol er hele metoden til PKA-aktivitetsbilleddannelse i hoved rettede vågne mus under et tvungen bevægelses paradigme beskrevet i seks trin. For det første tilføjelsen af 2pFLIM kapaciteter til en konventionel to-foton mikroskop (figur 1). For det andet opførelsen af et motoriseret løbebånd (figur 2). For det tredje ekspression af tAKARα-sensoren i muse barken ved in utero elektroporation (IUE) af DNA-plasmider eller stereotaxisk injektion af adeno-associeret virus (AAV). Fremragende protokoller for kirurgi for iue24,25 og stereotaxisk injektion af virale partikler26 er tidligere blevet offentliggjort. De vigtigste parametre, vi brugte, er beskrevet nedenfor. Frem, installation af et kranie vindue. Fremragende protokoller er tidligere blevet offentliggjort for kranie Window kirurgi27,28. Flere trin, der er blevet ændret fra standardprotokollerne, er beskrevet. Femte, udfører in vivo 2pFLIM. For det sjette analyserne af 2pFLIM billeder (figur 3 og figur 4). Denne tilgang bør være let anvendelig på mange andre hoved-faste adfærdsmæssige paradigmer og hjerneområder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC) i Oregon Health and Science University.

1.2pFLIM mikroskop opsætning

  1. Installer et foton timing tælle modul (PTCM, tabel over materialer) og Tilslut til computeren (figur 1) i henhold til producentens manual.
    Bemærk: PTCM er typisk en computer bord, der modtager en "Sync" input til laser puls timing og en foton input fra Photomultiplier Tube (PMT). Det modtager også Clock timing for pixels, linjer og rammer, fra to-photon Imaging Control software. PTCM bruger uret signaler til at adskille individuelle fotoner i forskellige pixels og rammer.
  2. Tilføj en fotodiode med > 200 MHz båndbredde for at måle laser timingen. Anbring en standard glas dækseddel i lysbanen for at afspejle en lille brøkdel af laserlys i den fotodiode, der er placeret vinkelret på lysbanen (figur 1). Tilslut Photo diode-udgangen til "Sync"-indgangen på PTCM.
    Bemærk: Mange moderne lasere også output laser timing. For disse lasere er foto dioden ikke nødvendig, og man kan direkte forbinde laser timing output til Sync indgang af PTCM.
  3. Ombyt PMT, i tilfælde af tAKARα, den grønne kanal PMT, med en lav-støj, hurtig GaAsP PMT (figur 1). Tilslut PMT-outputtet til PTCM'S signalindgang.
    1. Tilføj en valgfri signal splitter (figur 1), hvis der ønskes samtidig erhvervelse af intensitet gennem den konventionelle to-foton Imaging Channel. PMT-udgangen til signalfordeleren, og forbind Opdelings udgangen med PTCM og det konventionelle to-foton-billedbehandlings modul.
      Bemærk: GaAsP PMTs giver hurtigere enkelt-foton signaler end konventionelle bialkali PMTs og giver mulighed for en mere præcis bestemmelse af foton timing. Visse modeller af GaAsP PMTs kan afkøles til 10 − 35 °C under omgivende temperatur, hvilket gør det muligt at undertrykke mørke tællinger til et niveau under et par hundrede pr. sekund (typisk ≤ 200 tæller/s). Dette lave støjniveau er vigtigt for den præcise måling af fluorescens levetid, fordi støj foton tællinger ikke let kan skelnes fra eller trækkes fra fluorescens levetids kurve.
  4. Tilsæt et bånd-pass fluorescens emissions filter, der minimerer den spektral kontaminering, hvis nogen, fra acceptoren fluorophore. For eksempel anvendes et 500 Nm ± 20 Nm-barriere filter til den grønne kanal for takarα til at reducere forureningen fra acceptoren Sreach, som er et mørkt (QY ~ 0,07) gult fluorescerende protein (yfp)29,30. Forbind timing signaler, såsom ure for individuelle billedpixels, linjer og rammer, som er relevante for kontrol softwaren og beskrevet i PTCM brugermanual. Installer den relevante data kontrol-og indsamlings software.
    Bemærk: Nogle PTCM-producenter (tabel over materialer) leverer deres software til 2pFLIM Imaging. Her bruges brugerdefineret software kaldet FLIMimage, som blev udviklet af Yasuda Lab (Max Planck Florida, via personlig kommunikation). Denne software fungerer som en add-on brugerfunktion til visse to-photon erhvervelse software (tabel over materialer). Det styrer og kommunikerer med PTCM ved passende timing under to-photon Imaging til at erhverve 2pFLIM billeder.

2. opførelse af et motoriseret løbebånd

Bemærk: Designet af det specialbyggede motoriserede løbebånd er vist i figur 2.

  1. Skær en skum rulle (Ø = 200 mm) til 150 mm i længden med en fin nedstryger. Alternativt lim de to halvdele af en skum kugle sammen og læg tape over sømmen. Eventuelt lim en gummimåtte med profil på rullen for at øge trækkraft på rullen.
  2. Bore en 1/4 tommer diameter hul gennem midten af rullen på den flade side af rullen eller bore en 1/4 tommer diameter hul gennem midten af hver halvdel af bolden, hvis skum bolden anvendes.
  3. Installer en 1/4 tommer diameter stål aksel gennem hullet. Lim skum rullen/bolden til akslen ved hjælp af skum-kompatibel lim. Alternativt skal du ændre to fleksible Akselkoblinger (1/4 tommer indvendig diameter) for at styrke koblingen af akslen til skum rullen/bolden.
    Bemærk: Bemærk venligst, at mange almindeligt lim kan opløse skum.
    1. For hver akselkobling, Placer aksel koblingen på dens flade side og i midten af rektanglets metalplade (0,7 mm x 15 mm x 76 mm). Svejse pladen til aksel koblingen. Bore et 1/4 tommer hul i midten af pladen for at tillade installation af den modificerede akselkobling på akslen og to skruehuller i metalpladen lateral fra midten.
    2. Installer aksel koblingen på akslen mod skum rullen/kuglen. Hvis du bruger sidstnævnte, let bøje pladen til at passe krumningen af bolden. Placer skruerne i de laterale huller for at fastgøre rullen/kuglen på akslen.
  4. Bor og Tap på en 3/8-32 tråd i midten af en burplade, og Installer den roterende Encoder. Bor et skrue hul i bunden af højre vinkel motor beslaget for at tillade fastgørelse af motoren på indlægs holderen. Fastgør både dreje koderen og motoren til enden af akslen ved hjælp af en fleksibel akselkobling.
  5. Installer det samlede løbebånd på et aluminiums brød bræt ved hjælp af stillinger til motoren og den roterende encoder (figur 2). Tilslut motorens indgange til hastighedsregulatoren, og den roterende encoder udgang til en analog indgang af computer data Acquisition (DAQ) bestyrelsen.
    Bemærk: Rotationsvinkel hastigheden er kodet af rotations koderen som spænding og digitaliseres ved hjælp af brugerdefineret software kaldet AnimalTracker skrevet i MATLAB.
  6. Installer headplate-kompatibel holder til en højre vinkelbeslag. Installer et solidt indlæg på brød pladen foran løbebåndet, og Installer den monterede hovedplade holder med højre vinkelbeslag på stillingen (figur 2). Sørg for, at hoved pladens holdere er justeret med akslen, så musen kan indtage en passende og behagelig gang position på løbebåndet (figur 2c).

3. ekspression af tAKARα sensor i muse cortex

  1. I utero elektroporation
    1. Forbered en DNA-opløsning til IUE ved at tilføje 0,2% endelig koncentration af hurtigt grønt farvestof (til visualisering under injektion) til et plasmid-DNA (3 − 4 μg/μL; sensor konstrukterne indeholder en CAG-promotor, sensor sekvens og en Woodchuck hepatitis-virus post-transkriptivt respons element [WPRE] translationel Enhancer) opløst/fortyndet i vand eller Tris-EDTA.
    2. Forbered en tidsindstillet gravid kvindelig mus (f. eks. C57BL/6) for IUE på E1624. Bedøvelses musen med isofluran (4% for induktion og 1,5% for vedligeholdelse, 95% O2 med 5% CO2) og anvende subkutan injektion af perioperative analgetika indeholdende 5 mg/kg meloxicam og 4 mg/kg Bupivacain. Skær Åbn bughulen med en skalpel og et par saks og Udsæt forsigtigt livmoder hornene.
    3. Der indsprøjtes 1 μL DNA-opløsning pr. embryon i den laterale ventrikel på en halvkugle, som tidligere beskrevet24.
    4. Udfør regelmæssigt IUE24 for kortikale neuroner ved at placere den positive elektrode ved foden af cortex og ved hjælp af 5 100-MS-kvadratiske impulser (38 V) ved 1 Hz med en elektroporator.
      Bemærk: forskellige kortikale regioner kan målrettes mod elektroporation ved at ændre placeringen af elektrode enden i forhold til den laterale ventrikel.
  2. Stereotaxisk injektion
    1. Forbered en mus på postnatale dag 30 for stereotaxisk kirurgi26. Anæstetize musen som beskrevet i trin 3.1.2., og anvende subkutan injektion af perioperative analgetika indeholdende 5 mg/kg carprofen.
    2. Fortyndet AAV serotype 2/1 (AAV2/1), som udtrykker hSyn-tAKARα-WPRE til en empirisk bestemt titer (~ 1 x 109− 1 x 1010 genomer/μl) i sprøjte filtreret (0,2 μm celluloseacetat membran) fosfat-bufferet saltvand.
    3. Bore en ~ 500 μm diameter hul ved hjælp af en håndholdt boremaskine under et stereomicroskop på følgende koordinater for motoren cortex: 0,5 mm forreste til bregma, 1,2 mm lateral til midterlinjen.
    4. Monter en injektor (f. eks. olie hydraulisk manipulator, med specialfremstillet stempel/glas pipette holder) til en motoriseret manipulator. Placer injektions nålen i en vinkel på 15 ° i forhold til bregma-lambda-flyet. Programmer en diagonal bevægelse på tværs af x-og z-aksen svarende til en 700 μm og 200 μm progression langs de forreste-posterior og dorsale-ventral akser, hhv.
      Bemærk: For at undgå beskadigelse af vævet direkte over det tilsigtede billedbehandlings felt injiceres AAV-partikler i en vinkel i forhold til bregma-lambda-flyet.
    5. Placer spidsen af kanylen på Pia i midten af borehullet, og Udfør langsomt den diagonale bevægelse (~ 25 μm/s), der er beskrevet ovenfor. Denne procedure vil placere midten af injektionen ved 1,2 mm forreste til bregma, 1,2 mm lateral til Midline, 0,2 mm under Pia.
    6. Injicer 20 nL af fortyndede virale partikler (~ 10 nL/min). Vent mindst 10 minutter, og træk kanylen langsomt (~ 12,5 μm/s) tilbage.
    7. Afslut den stereotaxiske injektion procedure og lim/suture huden26.

4. montering af kranie vinduet

  1. Udfør placeringen af kranie vinduet på mus, som udtrykker tAKARα via IUE (afsnit 3,1) eller stereotaxisk injektion af virale partikler (punkt 3,2) mellem postnatale dage 30 og 60. For mus inficeret med virale partikler, implementere kraniet vindue mindst to uger efter virus injektion. Installer kranie vinduet som tidligere beskrevet27,28, med følgende detaljer. Anæstetize musen som beskrevet i trin 3.1.2., og anvende subkutan injektion af perioperative analgetika 0,075 mg/kg Buprenex og anti-inflammatorisk middel dexamethason ved 4 mg/kg.
  2. Fjern periosteum og træk nakkemusklen tilbage. Lim kanten af huden til kraniet med vævs klæbemiddel for at undgå udsættelse af nakke muskulatur efter operationen.
  3. Tør og fjern alle periosteum fra kraniet ved forsigtigt at skrabere med en skalpel. Placer billedbehandlings hovedpladen (8 mm indvendig diameter) for at omgive det tilsigtede billedfelt. Lim hovedpladen til kraniet ved hjælp af cyanoacrylat-baseret lim, efterfulgt af dental akryl cement. For optimal vedhæftning, Sørg for, at hovedpladen hviler på det eksponerede og tørrede kraniet. Lim Accelerator kan bruges til at fremskynde hærdning.
  4. Tegn en cirkel med en diameter på 5 mm over det tilsigtede billedbehandlings felt (koordinater som angivet i trin 3.2.3) ved hjælp af en tand øvelse og eksponere dura mater.
  5. Påfør et tyndt lag af transparent polymer, også kaldet kunstig Dura, til Dura-overfladen for at dække hele kranie vinduet. Polymeren vil beskytte og stabilisere dura mater. Anbring en steril rund dækseddel (5 mm diameter) på dura mater. Fastgør dæksedlen med cyanoacrylat lim, der påføres omkring kanterne af vinduet efterfulgt af dental akryl cement.

5. in vivo to-foton fluorescens levetid Imaging mikroskopi

  1. Begynd 2pFLIM Imaging på eller ud over 2 uger efter installation af kranie vinduet (afsnit 4). Minimer eksperimentel interferens på grund af stress ved hyppig håndtering og skruffning af musen før påbegyndelsen af billeddannelses studiet for at habituere musen.
  2. Indstil to-foton excitation laser bølgelængde til 960 nm ved hjælp af den software, der styrer to-photon laser.
  3. Bedøvelse ved hjælp af 4% isofluran. Bekræft korrekt bedøvelse ved hale-knivspids og observere vejrtrækning satser. Det er, bør der ikke være nogen reaktion på halen-knivspids og vejrtrækningen bør reduceres til ~ 1 åndedræt per sekund. For at minimere unødvendig procestid, og fordi anæstesi kun varer i to til tre minutter, anvendes øjen smøremidler ikke.
  4. Overføre den anæstetiserede mus til Det motoriserede løbebånd (figur 2c) og montere hovedpladen på hovedpladen til holderen på løbebåndet (Se figur 2 for detaljer). Rengør overfladen af kranie vinduet dækglas på musen med 70% ethanol.
  5. Placer Det motoriserede løbebånd med den monterede mus under 2pFLIM-målsætningen. Påfør en dråbe destilleret vand mellem kranie vindues dæksedlen og målet.
  6. Lad den monterede mus vågne op fra anæstesi og blive akkliliseret til løbebåndet og mikroskopet miljø i mindst 10 min. Overvåg respirationshastigheden af musen, mens den monterede mus vågner op fra anæstesi.
  7. Naviger til injektionsstedet under EPI-belysning. Document fiducial funktioner (dvs., blodkar) under lysfelt at støtte billeddannelse af den samme region af interesse (ROI) under efterfølgende Imaging sessioner.
  8. Fjerne enhver indkommende lys andre end det udsendte lys fra hjernevæv. Sluk for EPI-belysnings lyskilden, og luk kabinettet på 2pFLIM riggen. Aktivér 2pFLIM PMT ved at tænde for hardware-kommando spændings styringen.
  9. Erhverve en z-stack 2pFLIM billede ved hjælp af 2pFLIM erhvervelse software FLIMimage med følgende anbefalede indstillinger for Imaging tAKARα-positive somata i vågen mus. Indstil ramme gennemsnit til 3 rammer, scanningshastighed til 2 MS/line, billedstørrelse til 128 x 128 pixels, og synsfelt til 90 − 100 μm. Juster billedbehandlings indstillinger baseret på klargøring og hardwarekonfiguration.
  10. Undersøg det erhvervede billede i FLIMview (in-House udviklet brugerdefineret software; Se afsnit 6). Juster billedbehandlings indstillingerne efter trin 5,9 for at optimere photon Count og minimere foto blegning.
    Bemærk: En brugbar integreret foton tæller i et ROI for livstids afbildning af en tAKARα-positiv Soma in vivo er ~ 1000 − 10000 fotoner afhængigt af signal amplitude, der skyldes en bestemt stimulus (Se diskussion).
    1. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge et nedsat synsfelt, nedsat scanningshastighed, øget laser effekt og et øget antal rammer, der skal gennemsnit for at øge de integrerede foton-optællinger og reducere levetids estimerings fejlen. Samtidig skal du sørge for at bruge den minimale essentielle laser effekt, ramme gennemsnit og scanningshastighed for at minimere fotoblegning.
  11. Billede med et almindeligt tidsinterval (f. eks. hver 30 − 60 s) ved at gentage z-stack-anskaffelsen ved hjælp af indstillinger, der er fastlagt i trin 5,10. Køb baseline 2pflim-billeder i mindst 15 minutter ved Zero løbebånd-hastighed.
  12. Indstil løbe bånds rotationshastigheden til ~ 15 cm/s i 15 minutter, mens du erhverver 2pFLIM-billeder. Fortsæt billeddannelse i ≥ 20 minutter efter afbrydelse af løbebåndet rotation, for at vurdere varigheden af PKA aktivitet efter ophør af tvangs bevægelse.

6. analyse af 2pFLIM-billeder

  1. Åbn de erhvervede billeder i FLIMview og sæt følgende parametre i FLIMview.
    Bemærk:
    parameter detaljer er beskrevet i diskussionen.
    1. Klik på felterne enkelt foton optælling (SPC) minimum og maksimumområde i FLIMview. Angiv den relevante minimums-og maksimumsværdi for SPC-området, typisk mellem 1,2 − 2 og 10 − 12 ns.
    2. Klik på værdi feltet t0 i flimview, og Indtast værdien t0 (typisk ~ 2 NS). Klik på feltet livstids minimumstærskel værdi for lysstyrke i FLIMview, og Indtast den ønskede tærskelværdi til 5 − 30 fotoner.
  2. Klik på knappen ny gruppe (N), og Tildel et eksperiment gruppenavn. Dette vil generere en gruppe, der kombinerer data fra hver tilføjet FLIM billede.
  3. Klik på knappen ROI i modulet ROI Controls i flimview, og tegn et investeringsafkast omkring en takarα-positiv Soma. Reducer z-stack Range, ved at flytte den nedre og øvre z-grænse i z-stak kontrol skydere i flimview, for at minimere signal kontaminering stammer fra baggrunds fotoner i andre z dyber.
  4. Klik på knappen + for at føje Flim-billedet til gruppen (trin 6,2). Klik på knappen Calc for at beregne den gennemsnitlige levetid (lt, også kaldet Mean foton emission time [MPET]), for ROI og livstids estimerings fejl (δτ).
  5. Åbn den næste fil i den kroniske 2pFLIM Imaging Series. Gentag trin 6,4. Sørg for at justere positionen af ROI og z-stack Range for at måle den samme tAKARα-positive Soma over tid, fordi der kan være væv drift over tid.
  6. Vælg Deltampet/MPET0 i rullemenuen i modulet gruppestyring . Klik på feltet Oprindelig plan , og Angiv indekset (ES) (f. eks. 1 2 3 4 5 for de første fem billeder i gruppen, der blev oprettet i trin 6,3). Dette definerer de (t) billede (r), der bruges til at beregne den oprindelige levetid (LT0).
  7. Klik på plot for at generere en graf, der indeholder Flim respons (δlt/lt0) af takarα under eksperimentet i de definerede Rois. Normaliserede ændringer i levetid (ΔLT) af individuelle ROIs med den tilsvarende baseline levetid (LT0) giver mulighed for sammenligning af PKA aktivitet under bevægelse på tværs af forskellige Rois.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

FRET-FLIM sensorer giver mulighed for visualisering af mange forskellige signalering veje, herunder cAMP/PKA pathway involveret i Neuromodulation. Den nuværende protokol udnytter den nyudviklede tAKARα-sensor i kombination med 2pFLIM til at visualisere PKA-aktiviteter i hoved-fikseret opfører mus. De fleste eksisterende to-foton mikroskoper kan opgraderes med 2pFLIM kapaciteter ved at tilføje tre til fire komponenter, som illustreret i figur 1 (Se også punkt 1). At visualisere FRET i 2pFLIM-erhvervede billeder, kvantificering af gennemsnitlig levetid blev udført på Histogram plots af foton timing indsamlet per pixel (figur 3a, B). Gennemsnitlig levetid blev visualiseret ved hjælp af et pseudo farvet billede, hvor høj (kold farve) og lav (varm farve) betyder, at livs tiderne repræsenterer henholdsvis lave og høje PKA-aktiviteter, da PKA-aktivering fører til et fald i levetiden. Der skal udvises forsigtighed for at sætte SPC-intervallet korrekt; dette interval skal indstilles inden for laser puls intervallet (f. eks. 12,5 NS med en puls hastighed på 80 MHz) med minimerede hardware kant artefakter (Se også afsnit 6 og diskussion). Beregning af PKA aktivitet i ROIs blev udført ved at kombinere LT af alle pixels inden for en given ROI (figur 3c, D). I hoved faste vågne mus varierede basale livstider mellem 1,3 og 1,8 NS (figur 3E). Billeddannelse af tAKARα i motorisk cortex i hoved-fast vågne mus tilladt for real-time kvantificering af PKA aktivitet med cellulære opløsning under basal og tvungen bevægelse (figur 4). Eksperimentet kan gentages over dage og måneder. Tvungen Locomotion udløser PKA aktivitet i en population af neuroner inden for de overfladiske lag af musen motor cortex17. Denne PKA-aktivitet er afhængig af Neuro via aktivering af β-adrenerge og D1-receptorer17.

Figure 1
Figur 1: skematisk af et 2pFLIM-system. 2pFLIM kan implementeres på en konventionel to-foton mikroskop ved tilsætning af de gule Fremhævede hardwarekomponenter: en photon timing tælle modul, en lav-støj hurtig Photomultiplier Tube (PMT), en fotodiode (kun nødvendig, hvis laseren ikke har en udgang signalering for laser timing), og en valgfri signal splitter. Dette tal er blevet ændret fra Ma et al.17. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: design af en specialbygget motoriseret løbebånd. (A) skematisk af løbebåndet design fra forsiden (øverst til venstre), side (øverst til højre), og top visninger (nederst til venstre). Løbebåndet (skum kugle) aksel er forbundet til en roterende encoder og en motor, der er samlet monteret på to stillinger på en solid aluminium brød plade. Den headplate-kompatible holder på højre vinkelbeslag er fastgjort til en fast stilling og placeret overløbe båndet. Skematiske tegninger er ikke til at skalere. Front (B) og side (C) Se fotografier af løbebåndet. Korrekt placering af musen på løbebåndet vises i panel C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kvantificering af 2pFLIM data. (A) et Flim billede med hver pixel pseudo-farvet for at repræsentere den gennemsnitlige levetid (lt), i forhold til laser timing, af alle fotoner i denne pixel. (B) foton-ankomsttiderne inden for en enkelt pixel (lilla firkant i panel a) blev afbildet i et histogram (venstre panel). Integrations grænser blev indstillet til at bestemme det enkelte foton-optællings område (SPC, Gray). Inden for SPC-området blev integralet af foton timingen divideret med det samlede antal fotoner og derefter trukket af t0 (1,65 ns, stiplede linje), hvilket resulterede i en gennemsnitlig levetid (lt, afstanden mellem stiplede og punkterede linjer) på 1,74 ns. Kvantificering af den gennemsnitlige levetid for hele synsfeltet (lyseblå firkant i panel A) involverede integrationen af foton timing indsamlet i alle pixels (højre panel), hvilket resulterer i en gennemsnitlig levetid på 1,7 ns. Insets viser de samme data i semi-log skala. (C og D) Kvantificering af gennemsnitlig levetid pr. interesseområde (ROI). C) repræsentativt eksempel på et 2pFLIM-billede. To ROIs blev trukket omkring to somata i lag 2/3 af motor cortex. (D) foton timing fordelinger integreret på tværs af alle pixels inden for hver ROI (venstre panel). Celle ROIs blev farvekodet (som vist i panel C) rød, celle 1; blå, celle 2. Normaliserede foton-optællinger giver mulighed for sammenligning af foton timing fordelinger mellem de to ROIs (højre panel, gennemsnitlig levetid; celle 1, 1,33 NS; celle 2, 1,73 NS). Insets viser de samme data i semi-log skala. (E) fordelings plot af gennemsnitlige basale livstider fra 254 afbildet celler i de overfladiske lag af motorisk cortex. L1-celler (n = 186 celler/11 dyr, venstre panel), der opholder sig inden for 100 μm under Pia, udtrykte tAKARα efter en stereotaxisk injektion af AAV2/1-hSyn-tAKARα-WPRE og L2/3 pyramidale celler (n = 68 celler/4 dyr, højre panel), der bor mindst 150 μm under Pia, udtrykte tAKARα efter IUE af en CAG-tAKARα-WPRE DNA-konstruktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: tAKARα sporer tvungne bevægelses-inducerede PKA-aktiviteter i motorisk cortex. (A) repræsentativ intensitet (venstre panel) og levetid (midterste og højre paneler) billeder af tre L1 celler i motorisk cortex. Celle ROIs var farvekodede: orange, celle 1; blå, celle 2; gul, celle 3. B) foton timing fordelinger målt i celle 1 (øvre panel) under basal tilstand (orange spor, målt i Midterpanel Α) og tvungen bevægelse (Loco., lys orange spor, som målt i højre panel A). Normaliseret foton tæller tilladt for direkte sammenligning af foton timing distribution (lavere panel, gennemsnitlig levetid: basal, 1,72 NS; bevægelse, 1,42 NS). Insets viser de samme data i semi-log skala. (C) δ/levetids levetid0 (δlt/lt0) spor af de tilsvarende celler (øverste panel, se panel A) med tvungen bevægelseshastighed (lavere panel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokol demonstrerer brugen af FRET-FLIM sensor tAKARα til at visualisere Neuromodulation-udløst PKA aktivitet i hoved-fast opfører mus. Denne applikation er baseret på omfattende tests og karakteriseringer af tAKARα in vitro og in vivo for at påvise, at det opnåede FLIM-signal er relevant for fysiologiske neuromodulatoriske hændelser17. Her bruges en in vivo-applikation, bevægelses induceret PKA-aktivitet i motorisk cortex, til at beskrive procedurerne for levering af sensoren til hjernen, dyre kirurgi til billeddannelse, hardware-og softwarekrav til adfærd og indsamling af billeddata , software og algoritmer til analyse af billeddata.

TAKARα sensoren introduceres til cortex ved IUE af DNA-plasmider eller stereotaxisk injektion af AAV-partikler. Afhængigt af elektroporations parametrene og DNA-koncentrationerne resulterer IUE i forskellige mærknings tæthed af kortikale neuroner over et relativt stort område i cortex25. Det kortikale lag mærket ved hjælp af IUE bestemmes af fosterstadiet, når operationen udføres. Stereotaxisk injektion af AAV-partikler anvendes, når det ønskes at afbilde mange celler i en defineret hjerne subregion. Det resulterer typisk i tæt mærkede neuroner i Indsprøjtnings centeret og mere og mere sparsom mærkning længere fra midten. Det er vigtigt, at infektions effektiviteten af cellerne i hjernen afhænger af den anvendte AAV-serotype. AAV2/1 tilbyder stor effektivitet i kortikale, thalamiske og striatal neuroner med relativt lave tilbage mærkningsaktiviteter. Det tilrådes at empirisk fastslå, hvilken AAV serotype er mest effektiv for den målrettede hjerneregion og celletype. Begge transfektering metoder har med succes udtrykt takarα. "Sweet spot" for udtryks niveauet er empirisk bestemt.

Tvungen bevægelse resulterer i øgede PKA aktiviteter i Layer 2/3 neuroner i motorisk cortex. I øjeblikket, 2pFLIM begrænser rækken af testabile adfærd på grund af hoved-fiksering af musen. Men, en stadigt voksende liste over adfærdsmæssige paradigmer er blevet implementeret med succes inden for denne begrænsning, lige fra rapportering stimuli i Go/No-Go opgaver til rumlig orientering i Virtual Reality31,32,33 . Desuden kan forbedrede metoder muliggøre billeddannelse i dybe hjerneområder, såsom striatum, amygdala og hippocampus, via et nålelignende gradient Index (GRIN) linse13 (ikke offentliggjorte observationer). Derfor bør denne protokol, der beskriver brugen af takarα og 2pflim for in vivo visualisering af Neuro begivenheder være let anvendelig for mange hjerneregioner i forbindelse med hoved-Fixed adfærdsmæssige paradigmer.

Beregning af levetid pr. pixel eller ROI ved hjælp af kurve montering er beregningsmæssigt tidskrævende, og det begrænsede samlede antal foton pr. pixel resulterer ofte i tilpasnings fejl. Derfor beregnes den gennemsnitlige levetid (lt) aritmetisk som en tilnærmelse for levetiden (τ)17,34:


Equation 1(Ligning 1)


hvor SPCmin, og SPCMax er måle vinduet (SPC) grænser og F (t) er fluorescens levetid forfald kurve. Med andre ord, for hver beregnet volumen (pixel eller ROI, figur 3a) er foton timing fordeling afbildet i et histogram (figur 3b). Inden for SPC-intervallet divideres den vægtede Integral (med tiden vægten) af denne fordeling med det samlede antal foton for at resultere i en gennemsnitlig emissionstid. Denne tid korrigeres derefter for t0. Sådan genereres et livstids billede (figur 3a) denne procedure udføres for hver pixel, hvorimod beregning af levetid pr. ROI (figur 3c, D) integrerer alle fotoner fra alle pixels, der ligger over tærsklen inden for ROI-lydstyrken. Livstids estimerings fejlen (δτ) beregnes ved hjælp af den integrerede intensitet (Nphoton: Total foton Count):


Equation 2(Ligning 2)

For at minimere levetids estimerings fejl, δτ, og give korrekt signaldetektering, kræver FRET-FLIM erhvervelse af nok fotoner pr. ROI. For at opnå det ønskede signal-støj-forhold (SNR) skal δτ også opfylde følgende ligning:


Equation 3(Ligning 3)


For eksempel typisk måling under bevægelse i en neuronal Soma i motorisk cortex (LT = 1,57 ns, Nphoton = 9075, δlt = 0,15 NS; Figur 4, celle 1) giver en levetid estimerings fejl på:

δτ Equation 4 Equation 5 Equation 4 0,016 NS (ligning 4)

hvilket resulterer i et signal-til-støj-forhold på:

SNR Equation 4 Equation 6 Equation 7 = Equation 4 9,4 (ligning 5)

Hvis et ønsket SNR kun er 5, givet ΔLT = 0,15 NS a δτ er tilladt af:

Equation 8

som kræver et mindste antal foton af:

Equation 9

Som beskrevet ovenfor kræver levetiden kvantificering en passende indstilling af flere parametre, såsom SPC Range, t0, og Lifetime luminans minimum tærskel. SPC-intervallet bestemmer måle vinduet for udsendte fotoner i vinduet hardware måling (ligning 1; vinduet hardware måling er typisk 0 − 12,5 ns, da laseren gentages ved 80 MHz). Dette er nødvendigt, fordi PTCM bruges i denne protokol har kant artefakter. SPC-serien er indstillet til at indarbejde det meste af donor foton levetid distribution uden at inkludere kant artefakter. For at beregne gennemsnitlig levetid, trækkes den gennemsnitlige foton timing fra måle vinduet med t0, hvilket svarer til timingen af laser pulsen i vinduet (ligning 1, figur 3a, B)17,34. t0 kan justeres ved at ændre signalkabel længder eller ptcm indstillinger, og er typisk justeret til at være ~ 2 NS fra starten af vinduet hardware måling. Efter den indledende karakterisering af systemet, der typisk udføres under nær ideelle billeddannelses forhold (f. eks. ved billeddannelse 5 μM fluorescein-opløsning), indstilles både SPC-intervallet og t0 som faste parametre for en given hardwarekonfiguration. Levetid luminans minimum tærskel er indstillet således, at kun pixels med en samlet foton tælle lig med eller højere end tærsklen vil blive inkluderet i displayet og analyse. Dette reducerer effektivt støjen på grund af baggrundsfoton-tællinger, herunder autofluorescens, omgivende lys og spontane, PMT-mørke tal. Denne tærskel er empirisk fastlagt.

Vellykkede FRET-FLIM sensorer til in vivo 2pFLIM Imaging har mindst tre fælles træk. For det første, hvad angår udvælgelsen af fluorophorer, er foton-indsamlings effektiviteten normalt lav under det udfordrende in vivo-billedbehandlings miljø til dels på grund af svær lysspredning i hjernevæv. Samtidig kræves et stort antal fundne fotoner for at opnå en ønskelig SNR (≥ 1.000 fotoner ville være påkrævet for at opnå et SNR på 1 for en ΔLT/LT0 af 0,03; Se ligninger 2 og 3). Derfor er en donor fluoroforet med en høj foton budget (dvs. det maksimale antal detekterbare fotoner før en fluoroforet bleget) er begunstiget. I øjeblikket er der ingen systematisk sammenligning af forskellige donor fluorophorer i form af deres photon budget under to-foton excitation. Empirisk er egfp forholdsvis lys, samtidig med at den er mere foto stabil sammenlignet med mange andre fluorophorer i det grønne/gule spektrum, hvilket gør det til en stor donor fluoroforet til in vivo brug af Fret-Flim sensorer. Hertil kommer, at for optimal kvantificering af FRET, donor fluorophores med en enkelt-eksponentiel fluorescens levetid forfald er begunstiget. Mange almindeligt anvendte donor fluorescerende proteiner til ratiometrisk billeddannelse, såsom eCFP, har multi eksponentiel fluorescens levetid henfalder, hvilket tyder på, at de består af blandede populationer af fluorophorer. Disse fluorescerende proteiner er derfor ikke ideelle til FRET-FLIM21. I modsætning til donor fluoroforet, en lav Quantum udbytte af acceptor fluoroforet kan være gavnlig for fret-Flim sensorer. Den "mørke" lav-irradiant fluoroforet Sreach bruges til takars. Lavt kvanteudbytte af acceptors fluoroforet minimerer foton-kontaminering i donor fluoroforet-emissionsspektret og frigør én fluorescens detektionskanal til simultan billeddannelse af en anden fluorescerende sensor eller morfologi markør i det røde spektrum i tilfælde af tAKARα.

For det andet, at opnå tilstrækkelig SNR på tværs af bindende brøk området, en optimal FRET-effektivitet på ~ 0.5 − 0,7 er begunstiget21. Signalet, dvs, den gennemsnitlige levetid ændring under en given donor-acceptor bindende ratio ændring, er afhængig af effektiviteten af FRET. Dette forhold mellem FRET effektivitet og gennemsnitlig levetid ændring er dog ikke-lineær. Hvis FRET-effektiviteten nærmer sig, udsender donor fluorophorerne i bundet tilstand faktisk næsten ingen fotoner. Derfor, medmindre den bindende ratio er 100% (dette er aldrig tilfældet, fordi ingen acceptor fluoroforet modnes til 100%29) den gennemsnitlige levetid nærmer sig donorernes fluoroforet levetid i åben tilstand, og evnen til at detektere bundne-tilstands sensorer Falder. FRET-effektivitet for tAKARα skønnes at være ~ 0,7, inden for det gunstige område.

For det tredje bør FRET-FLIM sensorer rapportere signaler med en følsomhed og kinetik, der er relevante for dyrs fysiologi. Sensor følsomhed og kinetik bør testes grundigt in vitro før brug in vivo, og om nødvendigt kan indstilles ved hjælp af en række forskellige tilgange, såsom justering substrat-binding domæne affinitet og kinetik, linker-optimering, og subcellulære målretning af sensoren. I tidligere arbejde blev det fastslået, at tAKARα kan påvise PKA-aktivitet, der er fremkaldt af udgivelserne af endogene dopamin, og at sensorens kinetik og følsomhed justeres med en kendt PKA-afhængig biologisk proces, som er noradrenalin-induceret inaktivering af den langsomme efter-hyperpolarisering nuværende17. Desuden synes tAKARα ikke at ændre neuronal funktion som analyseret af Elektrofysiologi17 og måling af den strukturelle plasticitet af individuelle Spiner (ikke offentliggjorte observationer).

De nuværende tekniske begrænsninger for 2pFLIM Imaging er relateret til datahåndtering og foton optælling. For det første kræver FLIM opbevaring af foton ankomsttider for hver pixel. Hukommelsesstørrelsen på PTCM begrænser den opnåelige pixel opløsning. For det her beskrevne PCTM kan der opnås op til 256 x 256 pixels pr. billedramme med en 64-punkts tidsopløsning. Desuden er overførselshastigheden af FLIM-billeddata fra bord til computerlager relativt langsom, igen, hvilket sætter praktiske grænser for opløsningen og prøvetagnings frekvensen. Kontinuerlig teknologisk forbedring af hukommelseskapacitet og datahåndtering kan løse disse begrænsninger i fremtiden. Anden, almindeligt anvendte PTCMs er analog-til-digitale systemer og er begrænset af deres foton afsløring reset gange (dvs., "Dead time"). Det betyder, at efter påvisning af en photon vil ptcm ikke registrere ankomsten af eventuelle efterfølgende photon (s) for de næste 100 − 125 ns18,21. Desuden er livstids målingen forudindtaget i forhold til den første ankomne photon efter en laser puls (såkaldt "bunke-up"). Disse begrænser foton tælle raterne til < 107 fotoner per s. Selv i de fleste typiske to-foton Imaging regimer dette er ikke et stort problem, bør man passe på ikke at overskride foton optælling sats grænser. Nyere PTCMs, der har kortere Dead time eller en gigahertz kontinuerlig data erhvervelse system kan lindre denne begrænsning (for sidstnævnte Se Yellen og Mongeon18).

Fluorescerende sensorer til signalveje, såsom Camp/pKa, akt/PKB, PKC og Erk, genereres kontinuerligt og optimeres16,35. For de fleste af de nuværende sensorer, yderligere karakterisering og optimering er nødvendige for at udmærke sig i den udfordrende in vivo Imaging miljø. Især, øget signal amplitude er vigtigt, som enhver stigning i signalet amplitude reducerer efterspørgslen på photon budgetter med en firkantet forhold. For tAKARα, dens respons amplitude til endogene neuromodulatorer, såsom noradrenalin, blev forbedret med 2,7-fold i forhold til den tidligere bedste sensor. Dette oversat til en ~ 7-fold fald i krævede fotoner. I praksis, dette stærkt reduceret antallet af falske negativer (dvs., non-responders) i dyr under opførsel17. Det maksimalt observerede tAKARα-signal er ~ 30% (ΔLT/LT0). Til dato er dette det største FLIM-signal, der rapporteres for lignende klasser af FRET-sensorer. Yderligere forbedring kan også være muligt ved at optimere acceptoren fluoroforet og affiniteten af FHA til fosforyleret threonine. Desuden kan brugen af sensorer, der overvåger forskellige aspekter af den samme signal pathway, give en effektiv tilgang til mekanisk at undersøge reguleringen af signal vejene in vivo. I fremtiden vil den vellykkede anvendelse af Flim sensorer til at visualisere neuromodulatory signalering Pathways in vivo give vigtig indsigt om, hvor og Hvornår Neuro finder sted i intakt neuronal netværk af opfører mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker fru Tess J. Lameyer, MS. Ruth Frank, og Dr. Michael A. Muniak for redigeringer og kommentarer, og Dr. Ryohei Yasuda på Max Planck Florida for 2pFLIM erhvervelse software. Dette arbejde blev støttet af to BRAIN Initiative Awards U01NS094247 (H.Z. og T.M.) og R01NS104944 (H.Z. og T.M.), en R01 Grant R01NS081071 (T.M.), og en R21 Grant R21NS097856 (H.Z.). Alle priser er fra National Institute of neurologiske lidelser og slagtilfælde, USA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm cellulose acetate syringe filter Nalgene 190-2520 Step 3.2.2.
16x 0.8 NA water-immersion objective Nikon MRP07220 Step 5.5.
3-pin cable US digital CA-MIC3-SH-NC Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope
Aluminum bread board Thorlabs MB1012 Step 2.5.
AnimalTracker MATLAB software N/A N/A Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author
Band-pass barrier filter Chroma ET500-40m Step 1.4.
Cage plate Thorlabs CP01 Step 2.4. Used as mount for rotation sensor
Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter FST 19007-05 Steps 3.2.3. and 4.4.
Circular coverslip (5 mm diameter) VWR 101413-528 Step 4.5.
Custom-made injection needle holder N/A N/A Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author
Dental acrylic Yates Motloid 44114 Steps 4.3. and 4.5.
Dental drill; Microtorque ii Ram products 66699 Steps 3.2.3. and 4.4.
Dowsil transparent polymer The Dow Chemical Company 3-4680 Step 4.5. Artificial dura
Electroporation electrode Bex LF650P5 Step 3.1.4.
Electroporator Bex CUY21 Step 3.1.4.
Fast green FCF Sigma-aldrich F7258-25G Step 3.1.1.
FLIMimage MATLAB software N/A N/A Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida
FLIMview MATLAB software N/A N/A Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author
Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) Gorilla 5201204 Step 2.3.
Headplate N/A N/A Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author
Headplate holder N/A N/A Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket
Hydraulic micromanipulator Narishige MO-10 Step 3.2.4.
Krazy glue Krazy glue KG82648R Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue
Low-noise fast photomultiplier tube Hamamatsu H7422PA-40 or H10769PA-40 Step 1.3.
MATLAB 2012b Mathworks N/A Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software
Motor Zhengke ZGA37RG Step 2.4.
Motor speed controller Elenker EK-G00015A1-1 Step 2.5.
Motorized micromanipulator Sutter MP-285 Step 3.2.4.
Mounting base Thorlabs BA1S Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2
Mounting post Thorlabs P14 Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2
Mounting post base Thorlabs PB2 Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14
Mounting post bracket Thorlabs C1515 Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder
Optical post Thorlabs TR2 Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4
Phosphate-buffered saline Ν/Α Ν/Α Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247
Photodiode Thorlabs FDS010 Step 1.2.
Photon timing counting module Becker and Hickl SPC-150 Step 1.1.
Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) Addgene 119913 Step 3.1.3.
Post holder Thorlabs PH4 Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2
Right-angle bracket Thorlabs AB90 Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder
Rotation encoder US digital MA3-A10-250-N Step 2.4.
Rubber mat Rubber-Cal B01DCR5LUG Step 2.1.
Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) McMaster 6208K433 Steps 2.3. and 2.4.
ScanImage 3.6 Svoboda Lab/Vidrio Technology N/A Steps 5.9. and 6.1.
Signal splitter Becker and Hickl HPM-CON-02 Step 1.3.1.
Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) McMaster 1327K66 Step 2.3.
Stereotaxic alignment systsem David kopf 1900 Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator
Two-photon microscope N/A N/A Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)
Vetbond tissue adhesive 3M 14006 Step 3.2.6.
Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) Addgene 119921 Step 3.2.2.
White PE foam roller (8 inch x 12 inch) Fabrication enterprises INC. 30-2261 Step 2.1.1.
White polystyrene fom ball halves GrahamSweet 200mm diameter 2 hollow halves Step 2.1.1.
Zipkicker PACER PT29 Step 4.3. Hardening accelerator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294, (5544), 1024-1030 (2001).
  2. Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35, (2), 73-89 (2012).
  3. Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety. Neuron. 87, (3), 468-470 (2015).
  4. Berke, J. D. What does dopamine mean? Nature Neuroscience. 21, (6), 787-793 (2018).
  5. Chen, Y., et al. Endogenous Gαq-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A. Neuron. 96, (5), 1070-1083 (2017).
  6. Madison, D. V., Nicoll, R. A. Cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 372, (1), 245-259 (1986).
  7. Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction. Nature Neuroscience. 6, (1), 15-16 (2003).
  8. Pedarzani, P., Storm, J. F. PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons. Neuron. 11, (6), 1023-1035 (1993).
  9. Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection. Current Opinion in Neurobiology. 7, (3), 397-403 (1997).
  10. Radnikow, G., Feldmeyer, D. Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex. Frontiers in Neuroanatomy. 12, (January), (2018).
  11. Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17, (5), 860-867 (2013).
  12. Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. Hitchhiker’s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8, (2), 221-234 (2017).
  13. Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach. Neuron. 86, (1), 140-159 (2015).
  14. Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochemical and Biophysical Research Communications. 348, (2), 716-721 (2006).
  15. Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (26), 14997-15002 (2001).
  16. Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging. Frontiers in Pharmacology. 5, (April), 1-12 (2014).
  17. Ma, L., et al. A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice. Neuron. 99, (4), 665-679 (2018).
  18. Yellen, G., Mongeon, R. Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).
  19. Tang, S., Yasuda, R. Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity. Neuron. 93, (6), 1315-1324 (2017).
  20. Tillo, S. E., et al. Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates. Cell Reports. 19, (3), 617-629 (2017).
  21. Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16, (5), 551-561 (2006).
  22. Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2. Journal of Biological Chemistry. 257, (6), 3284-3290 (1982).
  23. Zhong, H., et al. Subcellular dynamics of type II PKA in neurons. Neuron. 62, (3), 363-374 (2009).
  24. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, (2), 151-158 (2005).
  25. Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).
  26. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).
  27. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).
  28. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4, (8), 1128-1144 (2009).
  29. Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP. Brain Cell Biology. 36, (1-4), 31-42 (2008).
  30. Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of Förster resonance energy transfer. Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).
  31. Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS ONE. 9, (2), (2014).
  32. Yu, K., et al. The central amygdala controls learning in the lateral amygdala. Nature Neuroscience. 20, (12), 1680-1685 (2017).
  33. Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461, (7266), 941-946 (2009).
  34. Yasuda, R. Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, (11), 1121-1128 (2012).
  35. Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nature Cell Biology. 20, (10), 1215-1225 (2018).
Visualisering af proteinkinase en aktivitet i hoved-fast opfører mus ved hjælp in vivo to-foton fluorescens levetid Imaging mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jongbloets, B. C., Ma, L., Mao, T., Zhong, H. Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59526, doi:10.3791/59526 (2019).More

Jongbloets, B. C., Ma, L., Mao, T., Zhong, H. Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59526, doi:10.3791/59526 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter