Summary
Viene presentata una procedura per visualizzare le attività della chinasi proteica A nei topi con problemi alla testa e che si comportano. Un giornalista di attività A-kinase migliorato, tAKAR, è espresso in neuroni corticali e reso accessibile per l'imaging attraverso una finestra cranica. La microscopia di imaging a durata della fluorescenza a due fotoni viene utilizzata per visualizzare le attività PKA in vivo durante la locomozione applicata.
Abstract
Neuromodulazione esercita un potente controllo sulla funzione del cervello. La disfunzione dei sistemi neuromodulatori si traduce in disturbi neurologici e psichiatrici. Nonostante la loro importanza, le tecnologie per monitorare gli eventi neuromodulatori con risoluzione cellulare stanno appena cominciando ad emergere. I neuromodulatori, come dopamina, noradrenalina, acetilcolina e serotonina, innescano eventi di segnalazione intracellulare tramite i rispettivi recettori accoppiati alle proteine G per modulare l'eccitabilità neuronale, le comunicazioni sinaptiche e altri neuronali funzioni, regolando così l'elaborazione delle informazioni nella rete neuronale. I neuromodulatori di cui sopra convergono sul percorso cAMP/protein a chinasi A (PKA). Pertanto, l'imaging PKA in vivo con risoluzione a singola cellula è stato sviluppato come lettura per gli eventi neuromodulatori in modo analogo all'imaging del calcio per le attività elettriche neuronali. Qui, viene presentato un metodo per visualizzare l'attività PKA a livello di singoli neuroni nella corteccia di topi che si comportano alla testa.Here, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mic. A tale scopo, viene utilizzato un giornalista di attività A-kinasi (AKAR) migliorato, chiamato tAKAR, che si basa sul trasferimento di energia di risonanza del Fàrster (FRET). Questo sensore PKA geneticamente codificato viene introdotto nella corteccia motoria tramite elettroporazione in utero (IUE) di plasmidi di DNA, o iniezione stereotassica di virus adeno-associato (AAV). I cambiamenti freT sono immagini utilizzando la microscopia di imaging a vita a durata a due fotoni (2pFLIM), che offre vantaggi rispetto alle misurazioni geometriche FRET per quantificare il segnale FRET nel tessuto cerebrale che disperde la luce. Per studiare le attività della PKA durante la locomozione forzata, tAKAR è immagine attraverso una finestra cranica cronica sopra la corteccia di topi svegli, fissati per la testa, che corrono o poggiano su un tapis roulant motorizzato a velocità controllata. Questo approccio di imaging sarà applicabile a molte altre regioni del cervello per studiare le corrispondenti attività PKA indotte dal comportamento e ad altri sensori basati su FLIM per l'imaging in vivo.
Introduction
La neuromodulazione, nota anche come trasmissione sinaptica lenta, impone un forte controllo sulla funzione cerebrale durante i diversi stati comportamentali, come lo stress, l'eccitazione, l'attenzione e la locomozione1,2,3, 4. Nonostante la sua importanza, lo studio di quando e dove si svolgono eventi di neuromodulatori è ancora agli inizi. Neuromodulatori, tra cui acetilcolina, dopamina, noradrenalina, serotonina, e molti neuropeptidi, attivare G recettori accoppiati a proteina (GPCR), che a sua volta innescano percorsi di messaggeri intracellulari secondo con una vasta finestra di scale temporali che vanno da secondi a ore. Mentre ogni neuromodulatore innesca una serie distinta di eventi di segnalazione, il percorso cAMP/proteina kinase A (PKA) è un percorso a valle comune per molti neuromodulatori1,5. Il percorso cAMP/PKA regola l'eccitabilità neuronale, la trasmissione sinaptica e la plasticità6,7,8,9e quindi sintonizza le dinamiche della rete neuronale. Poiché neuroni o tipi neuronali diversi esprimono diversi tipi o livelli di recettori neuromodulatori10, gli effetti intracellulari dello stesso neuromodulatore extracellulare possono essere eterogenei tra neuroni diversi e, quindi, devono essere studiato con risoluzione cellulare. Ad oggi, rimane difficile monitorare gli eventi neuromodulatori nei singoli neuroni in vivo durante il comportamento.
Per studiare la dinamica spatiotemporale della neuromodulazione, è necessaria una modalità di registrazione adeguata. La microdialisi e la cimmimetria a scansione rapida sono spesso utilizzate per studiare il rilascio di neuromodulatori, ma mancano della risoluzione spaziale per monitorare gli eventi cellulari11,12. Analoga alla dinamica del calcio utilizzata come proxy per l'attività elettrica neuronale nell'imaging della popolazione13,l'imaging PKA può essere utilizzato per leggere eventi neuromodulatori in una popolazione neuronale a risoluzione cellulare. Il presente protocollo descrive l'uso di un activity reporter A-kinase (AKAR) migliorato per monitorare le attività PKA in vivo durante il comportamento animale. Il metodo qui descritto consente l'imaging simultaneo di popolazioni neuronali a risoluzione subcellulare con una risoluzione temporale che tiene traccia degli eventi neuromodulatori fisiologici.
Gli AKAR sono composti da un donatore e da proteine fluorescenti accettatore collegate da un peptide del substrato pkA phosphorylation e da un dominio associato alla forchetta (FHA) che si lega al serino fosforolato o alla treonina del substrato14,15. Al momento dell'attivazione della via PKA, il peptide substrato di AKAR viene fosforato. Di conseguenza, il dominio FHA si lega al peptide del substrato fosforilo, portando così i due fluorofori in stretta vicinanza, indicato come lo stato chiuso dell'AKAR. Lo stato chiuso di un AKAR fosforolato si traduce in un aumento del trasferimento di energia di risonanza del fàrster (FRET) tra il donatore e l'accettatore fluorofori. Poiché la percentuale di ACR al fosforo è correlata al livello di attività PKA16, la quantità di FRET in un campione biologico può essere utilizzata per quantificare il livello di attività PKA16,17,18, 19,20.
Le prime versioni degli AKAR sono state progettate principalmente per l'imaging ratiometrico a due colori14. Quando si immagina più in profondità nel tessuto cerebrale, il metodo ratiometrico soffre di distorsione del segnale a causa della dispersione della luce dipendente dalla lunghezza d'onda17,18,21. Come discusso di seguito, la microscopia per l'imaging a vita di fluorescenza (FLIM) elimina questo problema perché Il FLIM misura solo i fotoni emessi dal donatore fluoroforo18,21. Di conseguenza, la quantificazione FLIM di FRET non è influenzata dalla profondità tissutale17. Inoltre, può essere utilizzata una variante "scura" (cioè bassa resa quantistica [QY]) del fluoroforo dell'accettatore. Questo libera un canale di colore per facilitare la misurazione multiplexata delle proprietà neuronali ortogonali tramite l'imaging simultaneo di un secondo sensore o di un marcatore morfologico17,19,20.
L'imaging FLIM quantifica il tempo che un fluoroforo trascorre nello stato eccitato, cioè la durata della fluorescenza18. Il ritorno di un fluoroforo allo stato di terra, così la fine dello stato eccitato, spesso si contempla con l'emissione di un fotone. Anche se l'emissione di un fotone per una singola molecola eccitata è stocastica, in una popolazione la durata media della fluorescenza è una caratteristica di quel particolare fluoroforo. Quando una popolazione pura di fluorofori è eccitata contemporaneamente, la fluorescenza risultante seguirà un singolo decadimento esponenziale. La costante temporale di questo decadimento esponenziale corrisponde alla durata media della fluorescenza, che in genere varia da uno a quattro nanosecondi per le proteine fluorescenti. Il ritorno di un fluoroforo donatore eccitato allo stato di terra può avvenire anche da PARTE di FRET. In presenza di FRET, la durata della fluorescenza del fluoroforo del donatore è ridotta. Gli AKAsphorylated unphosphorylated mostrano una durata di fluorescenza del donatore relativamente più lunga. Al fosforo della PKA, il sensore presenta una vita più breve perché i fluorofori donatore e accettatore sono portati l'uno vicino all'altro e FRET è aumentato. La quantificazione della durata della fluorescenza in una popolazione di AKAR rappresenta quindi il livello di attività PKA.
Le prime versioni degli AKA non sono state utilizzate con successo per l'imaging in vivo a risoluzione a cella singola. Ciò è dovuto principalmente alla bassa ampiezza del segnale dei sensori AKAR alle attivazioni fisiologiche17. Recentemente, confrontando sistematicamente i sensori AKAR disponibili per la microscopia di imaging a durata della fluorescenza a due fotoni (2pFLIM), è stato scoperto che un sensore chiamato FLIM-AKAR ha sovraperformato i sensori alternativi. Inoltre, una serie di varianti FLIM-AKAR chiamate AKAR mirati (tAKAR) sono state sviluppate per visualizzare l'attività PKA in posizioni subcellulari specifiche: microtubuli (tAKAR), citosol (tAKAR), actina (tAKAR) , actina mentoluta (tAKAR) , membrana (tAKAR) densità postsinaptica (tAKAR). Tra i tAKARR, tAKAR ha aumentato l'ampiezza del segnale suscitata dalla noradrenalina di 2,7 volte. Questo è coerente con la conoscenza che la maggior parte della PKA nei neuroni sono ancorati ai microtubuli allo stato di riposo22,23. il tAKAR è stato il migliore tra gli AKAR esistenti per 2pFLIM. Inoltre, tAKAR ha rilevato un'attività PKA fisiologicamente rilevante suscitata da più neuromodulatori, e l'espressione di tAKAR non ha alterato le funzioni neuronali17.
Di recente, tAKAR è stato utilizzato con successo per visualizzare le attività PKA nei mouse che si comportano alla testa17. È stato dimostrato che la locomozione forzata ha innescato l'attività PKA nel soma dei neuroni a strati superficiali (strato da 1 a 3, fino a una profondità di 300 m da pia) nel motore, nella canna e nelle cortici visive. L'attività PKA innescata dalla locomozione dipendeva in parte dalla segnalazione tramite recettori adrenergici e recettori della dopamina D1, ma non era influenzata da un antagonista del recettore della dopamina D2. Questo lavoro illustra la capacità dei tAKAR di tenere traccia degli eventi di neuromodulazione in vivo utilizzando 2pFLIM.
Nel protocollo corrente, l'intero metodo per l'imaging dell'attività PKA nei topi svegli fissati alla testa durante un paradigma di locomozione forzata è descritto in sei passaggi. In primo luogo, l'aggiunta di funzionalità 2pFLIM a un microscopio convenzionale a due fotoni (Figura 1). In secondo luogo, la costruzione di un tapis roulant motorizzato (Figura 2). In terzo luogo, l'espressione del sensore tAKAR nella corteccia del topo per elettroporazione inutero (IUE) di plasmidi di DNA, o iniezione stereotassica di virus adeno-associato (AAV). Protocolli eccellenti per interventi chirurgici per IUE24,25 e iniezione stereotassica di particelle virali26 sono stati precedentemente pubblicati. I parametri chiave che abbiamo usato sono descritti di seguito. Forth, l'installazione di una finestra cranica. Protocolli eccellenti sono stati precedentemente pubblicati per la chirurgia della finestra cranica27,28. Vengono descritti diversi passaggi che sono stati modificati dai protocolli standard. Quinto, esecuzione in vivo 2pFLIM. Sesto, le analisi delle immagini 2pFLIM (Figura 3 e Figura 4). Questo approccio dovrebbe essere facilmente applicabile a molti altri paradigmi comportamentali fissati alla testa e aree cerebrali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Oregon Health and Science University.
1. Configurazione del microscopio 2pFLIM
- Installare un modulo di conteggio dei tempi di fotoni (PTCM, tabella deimateriali) e connettersi al computer (Figura 1) in base al manuale del produttore.
NOT: Il PTCM è in genere una scheda di computer che riceve un ingresso di "sincronizzazione" per la temporizzazione dell'impulso laser e un ingresso fotone dal tubo fotomoltiplicatore (PMT). Riceve anche la temporizzazione dell'orologio per pixel, linee e cornici, dal software di controllo dell'imaging a due fotoni. Il PTCM utilizza i segnali di clock per separare i singoli fotoni in diversi pixel e fotogrammi. - Aggiungere un fotodiode con larghezza di banda >200 MHz per misurare la temporizzazione del laser. Posizionare un coperchio di vetro standard nel percorso della luce per riflettere una piccola frazione della luce laser nel fotodiode posizionato perpendicolare al percorso della luce (Figura 1). Collegare l'uscita fotodiode all'ingresso "sync" di PTCM.
NOT: Molti laser moderni emetteno anche la temporizzazione laser. Per questi laser, il fotodiodo non è necessario e si può collegare direttamente l'uscita di temporizzazione laser all'ingresso di sincronizzazione del PTCM. -
Scambiare il PMT, nel caso del tAKAR, il canale verde PMT, con un basso rumore, veloce GaAsP PMT (Figura 1). Collegare l'uscita PMT all'ingresso del segnale di PTCM.
- Aggiungere uno splitter di segnale opzionale (Figura 1) se si desidera un'acquisizione simultanea di intensità attraverso il canale di imaging convenzionale a due fotoni. Collegare l'uscita PMT allo splitter del segnale e collegare l'uscita dello splitter al PTCM e al modulo di imaging a due fotoni convenzionale.
NOT: I PMT GaAsP offrono segnali a singolo fotone più veloci rispetto ai PMT bialkali convenzionali e consentono una determinazione più precisa della temporizzazione dei fotoni. Alcuni modelli di PMT GaAsP possono essere raffreddati a 10-35 gradi al di sotto della temperatura ambiente, permettendo la soppressione dei conteggi scuri ad un livello inferiore a poche centinaia al secondo (tipicamente 200 dollari/ s). Questo basso livello di rumore è importante per la misurazione precisa delle durate della fluorescenza perché il numero di fotoni di rumore non può essere facilmente distinto o sottratto dalla curva di durata della fluorescenza.
- Aggiungere uno splitter di segnale opzionale (Figura 1) se si desidera un'acquisizione simultanea di intensità attraverso il canale di imaging convenzionale a due fotoni. Collegare l'uscita PMT allo splitter del segnale e collegare l'uscita dello splitter al PTCM e al modulo di imaging a due fotoni convenzionale.
- Aggiungere un filtro di emissione di fluorescenza passa-banda che riduca al minimo la contaminazione spettrale, se presente, dal fluoroforo dell'accettatore. Ad esempio, per tAKAR, per ridurre la contaminazione dall'accettatore sREACh, che è una proteina fluorescente gialla (YFP)29,30scura (QY 0,07). Collegare i segnali di temporizzazione, ad esempio gli orologi per singoli pixel dell'immagine, linee e fotogrammi, a seconda del software di controllo e descritto nel manuale utente di PTCM. Installare il software di acquisizione e controllo dati appropriato.
NOT: Alcuni produttori di PTCM (Tabella dei materiali) forniscono il loro software per l'imaging 2pFLIM. Qui, viene utilizzato un software personalizzato chiamato FLIMimage, che è stato sviluppato dallo Yasuda Lab (Max Planck Florida, tramite comunicazione personale). Questo software funziona come una funzione utente add-on per alcuni software di acquisizione a due fotoni (Tabella dei materiali). Controlla e comunica con il PTCM al momento opportuno durante l'imaging a due fotoni per acquisire immagini 2pFLIM.
2. Costruzione di un tapis roulant motorizzato
NOT: La progettazione del tapis roulant motorizzato su misura è illustrata nella Figura2.
- Tagliare un rullo di schiuma (200 mm) a 150 mm di lunghezza con un seghetto fine. In alternativa, incollare le due metà di una palla di schiuma insieme e posizionare il nastro sopra la cucitura. Facoltativamente, incollare un tappetino di gomma con profilo sul rullo per aumentare la trazione sul rullo.
- Forare un foro di diametro di 1/4 di pollice attraverso il centro del rullo sul lato piatto del rullo o praticare un foro di diametro di 1/4 di pollice attraverso il centro di ogni metà della palla se viene utilizzata la palla di schiuma.
-
Installare un asse d'acciaio di 1/4 di pollice attraverso il foro. Incollare il rullo/palla di schiuma all'asse utilizzando colla compatibile con la schiuma. Facoltativamente, modificare due accoppiamenti flessibili dell'albero (diametro interno da 1/4 di pollice) per rafforzare l'accoppiamento dell'asse al rullo/palla di schiuma.
NOT: Si prega di notare che molte colle comuni possono dissolvere schiuma.- Per ogni accoppiamento dell'albero, posizionare l'accoppiamento dell'albero sul lato piatto e al centro della piastra metallica rettangolare (0,7 mm x 15 mm x 76 mm). Saldare la piastra all'accoppiamento dell'albero. Forare un foro di un pollice al centro della piastra per consentire l'installazione dell'accoppiamento dell'albero modificato sull'asse e due fori a vite nella piastra metallica laterale dal centro.
- Installare l'accoppiamento dell'albero sull'asse contro il rullo/palla di schiuma. Se si utilizza quest'ultimo, piegare leggermente la piastra per adattarsi alla curvatura della palla. Posizionare le viti nei fori laterali per fissare il rullo/palla sull'asse.
- Forare e toccare un filo 3/8-32 al centro di una piastra gabbia e installare l'encoder rotante. Forare un foro a vite nella base della staffa motorica ad angolo retto per consentire l'attaccamento del motore sul supporto del palo. Attaccare sia l'encoder rotante che il motore all'estremità dell'asse utilizzando un accoppiamento flessibile dell'albero.
- Installare il tapis roulant assemblato su una scheda di pane in alluminio utilizzando i pali per il motore e l'encoder rotante (Figura 2). Collegare gli ingressi del motore al controller di velocità e l'uscita dell'encoder rotante a un ingresso analogico della scheda di acquisizione dati del computer (DAQ).
NOT: La velocità angolare di rotazione è codificata dall'encoder rotante come tensione e viene digitalizzata utilizzando un software personalizzato chiamato AnimalTracker scritto in MATLAB. - Installare il supporto compatibile con la testata in una staffa ad angolo retto. Installare un palo solido sulla piastra di pane di fronte al tapis roulant e installare il supporto assemblato con la staffa di angolo retto sul palo (Figura 2). Assicurarsi che le barre del portaportadella testata siano allineate con l'asse in modo che il mouse possa adottare una posizione di marcia adeguata e confortevole sul tapis roulant (Figura 2C).
3. Espressione del sensore tAKAR nella corteccia del mouse
-
Elettroporazione in utero
- Preparare una soluzione di DNA per l'IUE aggiungendo lo 0,2% di concentrazione finale di colorante verde veloce (per la visualizzazione durante l'iniezione) a un DNA plasmide (3,4 g/l; i costrutti del sensore che contengono un promotore CAG, una sequenza di sensori e un virus dell'epatite di legno elemento di risposta post-trascrizione [WPRE] esaltante traslazionale) disciolto/diluito in acqua o Tris-EDTA.
- Preparare un topo femmina incinta a tempo (ad esempio, C57BL/6) per IUE all'E1624. Anestesizzare il topo con isoflurane (4% per l'induzione e 1,5% per lamanutenzione, su 95% O2 con 5% CO 2) e applicare l'iniezione sottocutanea di analgesici peri-operatorie contenenti 5 mg/kg Meloxicam e 4 mg/kg Bupivacaine. Tagliare aprire la cavità addominale con un bisturi e un paio di forbici ed esporre con attenzione le corna uterine.
- Iniettare 1 L di soluzione di DNA per embrione nel ventricolo laterale di un emisfero, come descritto in precedenza24.
- Eseguire iUE24 regolari per i neuroni corticali posizionando il piede finale dell'elettrodo positivo nella corteccia e utilizzando cinque impulsi quadrati da 100 ms (38 V) a 1 Hz con un elettroporatore.
NOTA: Diverse regioni corticali possono essere mirate per l'elettroporazione cambiando il posizionamento del piede finale dell'elettrodo rispetto al ventricolo laterale.
-
Iniezione stereotassica
- Preparare un topo al giorno postnatale 30 per la chirurgia stereotaxic26. Anestesizzare il topo come descritto al passo 3.1.2., e applicare l'iniezione sottocutanea di analgesici peri-operatori contenenti 5 mg/kg di Carprofen.
- Diluire il sierotipo AAV 2/1 (AAV2/1) esprimendo hSyn-tAKAR-WPRE a un titro empiricamente determinato (1 x 10x10 x 1010 genomi/LL) in siringa filtrata (0,2 s. a cetami di cellulosa a membrana di acetosa) di salina con buffer di fosfatio.
- Forare un foro di 500 m di diametro utilizzando un trapano portatile sotto uno stereomicroscopio alle seguenti coordinate per la corteccia motoria: 0,5 mm anteriore a bregma, 1,2 mm laterale a linea mediana.
- Montare un iniettore (ad esempio, manipolatore idraulico ad olio, con supporto per tubi a stantuffo/vetro su misura) su un manipolatore motorizzato. Posizionare l'ago di iniezione ad un angolo di 15 gradi rispetto al piano bregma-lambda. Programmare un movimento diagonale attraverso gli assi x e z, equivalente rispettivamente a una progressione di 700 e 200 m lungo gli assi anteriore-posteriore e dorsale-ventrale.
NOT: Per evitare danni al tessuto direttamente sopra il campo di imaging previsto, le particelle AAV vengono iniettate ad angolo rispetto al piano bregma-lambda. - Posizionare la punta dell'ago di iniezione al centro del foro di perforazione ed eseguire lentamente il movimento diagonale (25 m/s) descritto in precedenza. Questa procedura posizionerà il centro di iniezione a 1,2 mm anteriore a bregma, 1,2 mm laterale a linea mediana, 0,2 mm sotto il pia.
- Iniettare 20 nL di particelle virali diluite (10 nL/min). Attendere almeno 10 min e ritrarre lentamente l'ago di iniezione (12,5 m/s).
- Terminare la procedura di iniezione stereotassica e incollare/suturare la pelle26.
4. Installazione della finestra Cranial
- Eseguire il posizionamento della finestra cranica sui topi che esprimono tAKAR tramite iUE (sezione 3.1) o l'iniezione stereotassica di particelle virali (sezione 3.2), tra i giorni postnatali 30 e 60. Per i topi infettati da particelle virali, implementare la finestra cranica almeno due settimane dopo l'iniezione di virus. Installare la finestra cranica come descritto in precedenza27,28, con i seguenti dettagli. Anestesizzare il topo come descritto nel passaggio 3.1.2., e applicare l'iniezione sottocutanea di analgesici peri-operatorii 0.075 mg/kg Buprenex e agente antinfiammatorio Dexamethasone a 4 mg/kg.
- Rimuovere il periosteo e ritrarre il muscolo del collo. Incollare il bordo della pelle al cranio con adesivo per evitare l'esposizione della muscolatura del collo dopo l'intervento chirurgico.
- Asciugare e rimuovere qualsiasi periosteo dal cranio raschiando delicatamente con un bisturi. Posizionare la piastra di testa di imaging (8 mm di diametro interno) per circondare il campo di imaging previsto. Incollare la testata al cranio utilizzando colla a base di cianoacrilato, seguita da cemento acrilico dentale. Per un'adesione ottimale, assicurarsi che la testata poggia sul cranio esposto ed essiccato. L'acceleratore di colla può essere utilizzato per accelerare l'indurimento.
- Disegnare un cerchio di 5 mm di diametro sopra il campo di imaging previsto (coordinate come specificato al punto 3.2.3) utilizzando un trapano dentale ed esporre la dura mater.
- Applicare un sottile strato di polimero trasparente, chiamato anche dura artificiale, sulla superficie dura per coprire l'intera finestra cranica. Il polimero proteggerà e stabilizzerà la dura mater. Posizionare un coperchio circolare sterile (5 mm di diametro) sulla dura mater. Fissare la coverslip con colla cianoacrilata applicata intorno ai bordi della finestra seguita da cemento acrilico dentale.
5. Microscopia Fluorescenza a 2 fotoni in vivo in vivo
- Iniziare 2pFLIM imaging a o oltre 2 settimane dopo l'installazione della finestra cranica (sezione 4). Ridurre al minimo le interferenze sperimentali dovute allo stress mediante la movimentazione frequente e la traspuntatura del mouse prima dell'inizio dello studio di imaging per abituare il mouse.
- Impostare la lunghezza d'onda laser di eccitazione a due fotoni a 960 nm utilizzando il software che controlla il laser a due fotoni.
- Anestesizzare il topo utilizzando 4% isoflurane. Confermare la corretta anestesizzazione con la coda-pizzico e osservando i tassi di respirazione. Cioè, non ci dovrebbe essere risposta al pizzico di coda e la frequenza respiratoria dovrebbe essere ridotta a 1 respiro al secondo. Per ridurre al minimo il tempo procedurale non necessario e poiché l'anestesia dura solo per due o tre minuti, i lubrificanti per gli occhi non vengono utilizzati.
- Trasferire il mouse aestizzato al tapis roulant motorizzato (Figura 2C) e montare la tela del mouse sul supporto della testata della configurazione del tapis roulant (vedere Figura 2 per i dettagli). Pulire la superficie della finestra cranica coverslip sul mouse con 70% di etanolo.
- Posizionare il tapis roulant motorizzato con il mouse montato sotto l'obiettivo 2pFLIM. Applicare una goccia di acqua distillata tra la vetrina della finestra cranica e l'obiettivo.
- Lasciate che il topo montato svegliarsi dall'anestesia e acclimatarsi all'ambiente del tapis roulant e del microscopio per almeno 10 min. Monitor frequenza respiratoria del mouse mentre il mouse montato si sveglia dall'anestesia.
- Navigare verso la posizione di iniezione sotto epi-illuminazione. Documentare le caratteristiche fiduciarie (cioè i vasi sanguigni) sotto il campo luminoso per facilitare l'imaging della stessa regione di interesse (ROI) durante le successive sessioni di imaging.
- Eliminare qualsiasi luce in entrata diversa dalla luce emessa dal tessuto cerebrale. Spegnere la sorgente luminosa dell'epiilluminazione e chiudere il recinto del rig 2pFLIM. Attivare il PMT 2pFLIM attivando il controllo della tensione del comando hardware.
- Acquisire un'immagine z-stack 2pFLIM utilizzando il software di acquisizione 2pFLIM FLIMimage con le seguenti impostazioni consigliate per l'imaging di somata tAKAR-positivo in topo sveglio. Impostare la media dei fotogrammi su 3 fotogrammi, la velocità di scansione su 2 ms/linea, le dimensioni dell'immagine su 128 x 128 pixel e il campo visivo su 90 e 100 m. Regolare le impostazioni di imaging in base alla preparazione e alla configurazione hardware.
-
Ispezionare l'immagine acquisita in FLIMview (software personalizzato sviluppato internamente; vedere sezione 6). Regola le impostazioni di imaging seguendo il passaggio 5.9 per ottimizzare il numero di fotoni e ridurre al minimo il fotobleaching.
NOT: Un numero di fotoni integrato utilizzabile in un ROI per l'imaging a vita di un soma tAKAR-positivo in vivo è di 1.000-10.000 di fotoni a seconda dell'ampiezza del segnale che deriva da un particolare stimolo (vedi Discussione).- Se necessario, utilizzare un campo visivo ridotto, la riduzione della velocità di scansione, una maggiore potenza laser e un aumento del numero di fotogrammi da mediare per aumentare il numero di fotoni integrati e ridurre l'errore di stima della durata. Allo stesso tempo, assicurati di utilizzare la potenza laser essenziale minima, la media dei fotogrammi e la velocità di scansione per ridurre al minimo il fotosbiancamento.
- Immagine a intervalli di tempo regolari (ad es. ogni 30-60 s) ripetendo l'acquisizione dello stack z utilizzando le impostazioni determinate nel passaggio 5.10. Acquisire immagini di base 2pFLIM per almeno 15 min alla velocità del tapis roulant zero.
- Impostare la velocità di rotazione del tapis roulant su 15 cm/s per 15 min durante l'acquisizione di immagini 2pFLIM. Continuare l'imaging per 20 minuti dopo aver spento la rotazione del tapis roulant, per valutare la durata dell'attività PKA dopo la cessazione della locomozione forzata.
6. Analisi delle immagini 2pFLIM
-
Aprite le immagini acquisite in FLIMview e impostate i seguenti parametri in FLIMview.
NOTA: i dettagli dei parametri sono descritti in DISCUSSIONE.- Fare clic sui campi di conteggio dei singoli fotoni (SPC) di intervallo minimo e massimo in FLIMview. Immettere il valore dell'intervallo SPC minimo e massimo appropriato, in genere compreso tra 1,2 e 10-12 ns rispettivamente.
- Fare clic sul campo valore t0 in FLIMview e immettere il valore t0 (in genere 2 ns). Fate clic sul campo del valore soglia minimo di luminanza a vita in FLIMview e immettete il valore di soglia desiderato a 5-30 fotoni.
- Fare clic sul pulsante del nuovo gruppo (N)e assegnare il nome di un gruppo di esperimenti. Verrà generato un gruppo che combina i dati di ogni immagine FLIM aggiunta.
- Fare clic sul pulsante ROI nel modulo Controlli Roi di FLIMview e disegnare un ROI intorno a un soma tAKAR-positivo. Ridurre l'intervallo z-stack, spostando il limite z inferiore e superiore nei cursori di controllo dello stack z in FLIMview, per ridurre al minimo la contaminazione del segnale proveniente dai fotoni di sfondo in altre profondità z.
- Fare clic sul pulsante s per aggiungere l'immagine FLIM al gruppo (passaggio 6.2). Fare clic sul pulsante Calc per calcolare la durata media (LT, denominato anche tempo medio di emissione di fotoni [MPET]), per il ROI e l'errore di stima a vita (z) .
- Aprire il file successivo nella serie di immagini 2pFLIM cronica. Ripetere il passaggio 6.4. Assicurarsi di regolare la posizione del ROI e dell'intervallo z-stack per misurare lo stesso soma positivo al tAKAR nel corso del tempo, perché ci può essere deriva del tessuto nel tempo.
- Selezionare deltaMPET/MPET0 nel menu a discesa del modulo Controlli gruppo. Fare clic sul campo baseline e immettere gli indici (ad esempio, 1 2 3 4 5 per le prime cinque immagini del gruppo creato nel passaggio 6.3). In questo modo verranno definite le immagini utilizzate per calcolare la durata prevista (LT0).
- Fare clic su Stampa per generare un grafico contenente la risposta FLIM (LT/LT0) di tAKAR durante l'esperimento nei ROI definiti. I cambiamenti normalizzati nella durata (SezioneLT) dei singoli ROI in base alla durata di base corrispondente (LT0) consentono di confrontare l'attività PKA durante la locomozione tra diversi ROI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I sensori FRET-FLIM consentono la visualizzazione di molti percorsi di segnalazione diversi, tra cui il percorso cAMP/PKA coinvolto nella neuromodulazione. L'attuale protocollo utilizza il sensore tAKAR, sviluppato di recente, in combinazione con 2pFLIM per visualizzare le attività PKA nei mouse che si comportano con la testa fissa. La maggior parte dei microscopi a due fotoni esistenti può essere aggiornata con capacità 2pFLIM aggiungendo da tre a quattro componenti, come illustrato nella Figura 1 (vedere anche la sezione 1). Per visualizzare FRET in immagini acquisite da 2pFLIM, la quantificazione della durata media è stata eseguita su grafici istogrammi di intervalli di fotoni raccolti per pixel (Figura3A, B). La durata media è stata visualizzata utilizzando un'immagine pseudocolorata, in cui le durate medie alte (colore freddo) e bassa (colore caldo) rappresentano rispettivamente attività PKA basse e alte, poiché l'attivazione PKA porta alla diminuzione della vita. È necessario prestare attenzione a impostare correttamente la gamma SPC; questo intervallo deve essere impostato entro l'intervallo dell'impulso laser (ad esempio, 12,5 ns di una frequenza di impulso di 80 MHz) con artefatti bordo hardware ridotti al minimo (vedere anche sezione 6 e DISCUSSION). Il calcolo dell'attività PKA all'interno dei ROI è stato eseguito combinando il LT di tutti i pixel all'interno di un determinato ROI (Figura 3C, D). Nelle durate dei topi svegli fissate alla testa variavano tra 1,3 e 1,8 ns (Figura 3E). L'imaging di tAKARa nella corteccia motoria in topi svegli fissati alla testa ha permesso la quantificazione in tempo reale dell'attività PKA con risoluzione cellulare durante la locomozione basale e forzata (Figura 4). L'esperimento può essere ripetuto per giorni e mesi. La locomozione forzata attiva l'attività PKA in una popolazione di neuroni all'interno degli strati superficiali della corteccia motoria del topo17. Questa attività PKA dipende dalla neuromodulazione tramite l'attivazione dei recettori di z-adrenergico e D117.
Figura 1: Schema di un sistema 2pFLIM. 2pFLIM può essere implementato su un microscopio convenzionale a due fotoni mediante l'aggiunta dei componenti hardware evidenziati in giallo: un modulo di conteggio dei tempi dei fotoni, un tubo fotomoltiplicatore veloce a basso rumore (PMT), un fotodiode (necessario solo se il laser non segnale di uscita per la temporizzazione laser) e una barra di divisione del segnale opzionale. Questa cifra è stata modificatada Ma et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Progettazione di un tapis roulant motorizzato su misura. (A) Schematica del disegno del tapis roulant dalla parte anteriore (in alto a sinistra), laterale (in alto a destra) e viste superiore (in basso a sinistra). L'asse del tapis roulant (palla di schiuma) è collegato a un encoder rotante e a un motore che sono montati collettivamente su due pali su una piastra di pane in alluminio solido. Il supporto compatibile con la testata su parentesi angolare destra è fissato a un palo solido e posizionato sopra il tapis roulant. I disegni schematici non sono in scala. Anteriore (B) e lato (C) visualizzano le fotografie del tapis roulant. Il posizionamento corretto del mouse sul tapis roulant è mostrato nel pannello C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La quantificazione dei dati 2pFLIM. (A) Un'immagine FLIM con ogni pixel pseudo-colorato per rappresentare la durata media (LT), relativa alla temporizzazione laser, di tutti i fotoni in quel pixel. (B) Gli orari di arrivo dei fotoni all'interno di un singolo pixel (quadrato viola nel pannello A) sono stati stampati in un istogramma (pannello sinistro). I limiti di integrazione sono stati impostati per determinare l'intervallo di conteggio dei singoli fotoni (SPC, grigio). All'interno della gamma SPC, l'integrale della temporizzazione dei fotoni è stato diviso per il numero totale di fotoni e quindi sottratto da t0 (1,65 ns, linea tratteggiata), con conseguente durata media (LT, distanza tra linee tratteggiate e linee tratteggiate) di 1,74 ns. La quantificazione della durata media dell'intero campo visivo (quadrato azzurro nel pannello A)ha comportato l'integrazione dei tempi di fotoni raccolti in tutti i pixel (pannello destro), con una durata media di 1,7 ns. Gli inset mostrano gli stessi dati in scala semi-log. (C e D) Quantificazione della durata media per regione di interesse (ROI). (C) Esempio rappresentativo di un'immagine 2pFLIM. Due ROI sono stati disegnati intorno a due somata nello strato 2/3 della corteccia motoria. (D) Distribuzioni di temporizzazione foton integrate in tutti i pixel all'interno di ogni ROI (pannello sinistro). I ROI di cella erano codificati a colori (come mostrato nel pannello C) rosso, cella 1; blu, cella 2. I conteggi di fotoni normalizzati consentono il confronto delle distribuzioni di temporizzazione dei fotoni tra le due ROI (pannello destro, durata media; cella 1, 1,33 ns; cella 2, 1,73 ns). Gli inset mostrano gli stessi dati in scala semi-log. (E) Grafico di distribuzione della durata basale media da 254 celle imagete negli strati superficiali della corteccia motoria. L1 cellule (n : 186 cellule/11 animali, pannello sinistro), che risiedono entro 100 m sotto pia, espresse tAKAR dopo un'iniezione stereotassica di AAV2/1-hSyn-tAKAR-WPRE, e l2/3 cellule piramidali (n - 68 cellule/4 animali, pannello destro), che risiedono almeno 150 m sotto pia, dopo l'IUE di un costrutto di DNA CAG-tAKAR-WPRE. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: tAKAR traccia le attività PKA indotta dalla locomozione nella corteccia motoria. (A) Immagini di intensità rappresentativa (pannello sinistro) e durata (pannelli centrali e destro) di tre celle L1 nella corteccia motoria. I ROI di cella erano contraddistinti da colori: arancione, cella 1; blu, cella 2; giallo, cella 3. (B) Distribuzioni di temporizzazione fotone misurate nella cella 1 (pannello superiore) durante la condizione basale (traccia arancione, misurata nel pannello centrale )e locomozione applicata (loco., traccia arancione chiaro, come misurata nel pannello destro A). I conteggi di fotoni normalizzati consentivano il confronto diretto della distribuzione dei tempi fotoni (pannello inferiore, durata media: basale, 1,72 ns; locomozione, 1,42 ns). Gli inset mostrano gli stessi dati in scala semi-log. (C) Tracce a vita/durata0 (LT/LT0) delle celle corrispondenti (pannello superiore, vedi pannello A) con velocità di locomozione applicata (pannello inferiore). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo dimostra l'uso del sensore FRET-FLIM tAKAR per visualizzare l'attività PKA innescata dalla neuromodulazione nei topi che si comportano con la testa fissa. Questa applicazione si basa su test approfonditi e caratterizzazioni di tAKAR , in vitro e in vivo per dimostrare che il segnale FLIM ottenuto è rilevante per gli eventi neuromodulatori fisiologici17. Qui, un'applicazione in vivo, l'attività PKA indotta dalla locomozione nella corteccia motoria, viene utilizzata per descrivere le procedure per la consegna del sensore al cervello, la chirurgia animale per l'imaging, i requisiti hardware e software per il comportamento e l'acquisizione dei dati di imaging , software e algoritmi per l'analisi dei dati di imaging.
Il sensore tAKAR viene introdotto nella corteccia da IUE di plasmidi di DNA o iniezione stereotassica di particelle AAV. A seconda dei parametri di elettroporazione e delle concentrazioni di DNA, IUE si traduce in varie densità di etichettatura dei neuroni corticali su un'area relativamente grande nella corteccia25. Lo strato corticale etichettato con IUE è determinato dallo stadio embrionale quando viene eseguito l'intervento chirurgico. L'iniezione stereotassica di particelle AAV viene utilizzata quando si desidera immaginare molte cellule all'interno di una sottoregione cerebrale definita. In genere si traduce in neuroni densamente etichettati al centro di iniezione e sempre più scarsa etichettatura ulteriormente dal centro. È importante sottolineare che l'efficienza dell'infezione delle cellule all'interno del cervello dipende dal sierotipo AAV utilizzato. AAV2/1 offre una grande efficienza nei neuroni corticali, talamici e striatali con attività di etichettatura retrograda relativamente basse. Si consiglia di stabilire empiricamente quale serotipo AAV è più efficiente per la regione cerebrale mirata e il tipo di cellula. Entrambi i metodi di trasfezione hanno espresso con successo tAKAR. Il "punto dolce" per il livello di espressione è determinato empiricamente.
La locomozione forzata comporta un aumento delle attività PKA nei neuroni di strato 2/3 della corteccia motoria. Attualmente, 2pFLIM limita la gamma di comportamenti tesi a causa della fissazione della testa del mouse. Tuttavia, un elenco sempre crescente di paradigmi comportamentali è stato implementato con successo all'interno di questo vincolo, che vanno dalla segnalazione di stimoli in attività go/no-go all'orientamento spaziale nella realtà virtuale31,32,33 . Inoltre, metodi migliorati possono consentire l'imaging in regioni del cervello profondo, come lo striato, l'amigdala e l'ippocampo, tramite una lente GRIN (aghi come indice di sfumatura)13 (osservazioni inedite). Pertanto, l'attuale protocollo che descrive in dettaglio l'uso di tAKAR e 2pFLIM per la visualizzazione in vivo degli eventi di neuromodulazione dovrebbe essere facilmente applicabile a molte regioni del cervello nel contesto dei paradigmi comportamentali fissati dalla testa.
Il calcolo della durata per pixel o ROI utilizzando il raccordo della curva richiede tempo dal punto di vista computazionale e il numero totale limitato di fotoni per pixel spesso genera errori di adattamento. Quindi, la durata media (LT) è calcolata aritmeticamente come un'approssimazione per la durata (z)17,34:
(Equazione 1)
dove SPCmin, e SPCmax sono i bordi della finestra di misurazione (SPC) e F(t) è la curva di decadimento a vita della fluorescenza. In altre parole, per ogni volume calcolato (pixel o ROI, figura 3A) la distribuzione della temporizzazione dei fotoni viene tracciata in un istogramma (Figura 3B). All'interno della gamma SPC l'integrale ponderato (con il tempo è il peso) di questa distribuzione è diviso per il numero totale di fotoni per ottenere un tempo medio di emissione. Questo tempo viene quindi corretto per t0. Per generare un'immagine a vita (Figura 3A) questa procedura viene eseguita per ogni pixel, mentre il calcolo della durata per ROI (Figura 3C, D) integra tutti i fotoni di tutti i pixel che sono al di sopra della soglia all'interno della soglia all'interno del volume del ROI. L'errore di stima della durata (z) viene calcolato utilizzando l'intensità integrata (Nfotoni: numero totale di fotoni):
(Equazione 2)
Per ridurre al minimo l'errore di stima della durata, la funzione di valutazione e la resa del corretto rilevamento del segnale FRET-FLIM richiede l'acquisizione di un numero sufficiente di fotoni per ROI. Al fine di ottenere un rapporto segnale-rumore desiderato (SNR), s deve anche soddisfare la seguente equazione:
(Equazione 3)
Ad esempio, la misurazione tipica durante la locomozione in un soma neuronale nella corteccia motoria (LT - 1,57 ns, Nfotone - 9075, s.l.m. Figura 4, cella 1) restituisce un errore di stima della vita di:
z 
z 0,016 ns (Equazione 4)
che si traduce in un rapporto segnale-rumore di:
SNR 
- 9,4 (Equazione 5)
Se un SNR desiderato è solo 5, dato LT s 0,15 ns è consentito il numero di zer di:
che richiede un numero totale minimo di fotoni di:
Come descritto in precedenza, la quantificazione a vita richiede l'impostazione appropriata di diversi parametri, ad esempio l'intervallo SPC, t0e la soglia minima di luminanza a vita. L'intervallo SPC determina la finestra di misurazione dei fotoni emessi all'interno della finestra di misurazione hardware (Equazione 1; la finestra di misurazione hardware è in genere di 0,12,5 ns, poiché il laser si ripete a 80 MHz). Ciò è necessario perché il PTCM utilizzato in questo protocollo dispone di artefatti perimetrali. La gamma SPC è impostata per incorporare la maggior parte della distribuzione a vita dei fotoni del donatore senza includere gli artefatti del bordo. Per calcolare la durata media, il tempo medio di fotone dalla finestra di misurazione viene sottratto da t0, che corrisponde alla temporizzazione dell'impulso laser all'interno della finestra (Equazione 1, Figura 3A,B)17,34. t0 può essere regolato modificando la lunghezza del cavo del segnale o le impostazioni PTCM, ed è in genere regolato per essere s 2 ns dall'inizio della finestra di misurazione hardware. Dopo la caratterizzazione iniziale del sistema, tipicamente effettuata in condizioni di imaging quasi ideali (ad esempio, quando si immagina la soluzione a 5 fluoresceina M), sia la gamma SPC che lo t0 vengono impostati come parametri fissi di una determinata configurazione hardware. La soglia minima di luminanza a vita è impostata in modo che solo i pixel con un numero totale di fotoni uguale o superiore alla soglia vengano inclusi nella visualizzazione e nell'analisi. Questo riduce efficacemente il rumore dovuto al numero di fotoni di sfondo, tra cui autofluorescenza, luce ambientale e conteggi scuri PMT spontanei. Questa soglia è determinata empiricamente.
I sensori FRET-FLIM di successo per l'imaging in vivo 2pFLIM hanno almeno tre caratteristiche comuni. In primo luogo, per quanto riguarda la selezione dei fluorofori, l'efficienza della raccolta dei fotoni è solitamente bassa nell'ambiente di imaging in vivo, in parte a causa della grave dispersione della luce nel tessuto cerebrale. Allo stesso tempo, è necessario un numero elevato di fotoni rilevati per ottenere un SNR desiderabile (1.000 fotoni di 1.000 dollari per ottenere un SNR di 1 per uno 0 LT/LT0 di 0,03; vedi Equazioni 2 e 3). Pertanto, un donatore di fluoroforo con un budget elevato per i fotoni (cioè il numero massimo di fotoni rilevabili prima di un fluoroforo viene sbiancato) è favorito. Attualmente, non esiste un confronto sistematico di diversi fluorofori donatori in termini di budget per i fotoni sotto l'eccitazione a due fotoni. Empiricamente, eGFP è relativamente luminoso pur essendo più fototable rispetto a molti altri fluorofori nello spettro verde /giallo, rendendolo un grande donatore fluoroforo per l'uso in vivo di sensori FRET-FLIM. Inoltre, per una quantificazione ottimale di FRET, i fluorofori del donatore con un decadimento a vita a fluorescenza monoesponenziale sono favoriti. Molte proteine fluorescenti del donatore comunemente usate per l'imaging ratiometrico, come eCFP, hanno decadimenti a vita della fluorescenza multi-esponenziale, suggerendo che sono costituite da popolazioni miste di fluorofori. Queste proteine fluorescenti non sono quindi ideali per FRET-FLIM21. Contrariamente al fluoroforo donatore, una bassa resa quantistica del fluoroforo dell'acceleratore può essere utile per i sensori FRET-FLIM. Il fluoroforo sREACh "scuro" a basso irradiante viene utilizzato per i tAKAR. La bassa resa quantistica del fluoroforo dell'accettatore riduce al minimo la contaminazione da fotoni nello spettro di emissione del fluoroforo del donatore e libera un canale di rilevamento della fluorescenza per l'imaging simultaneo di un secondo sensore fluorescente o marcatore morfologia nello spettro rosso nel caso di tAKAR.
In secondo luogo, per ottenere un numero sufficiente di SNR nell'intervallo di frazioni di rilegatura, un'efficienza FRET ottimale di 0,5,7 USD è preferitadi 21. Il segnale, cioè il cambiamento di durata medio in base a un determinato cambiamento del rapporto donatore-accettazione, dipende dall'efficienza del FRET. Questa relazione tra efficienza FRET e cambiamento medio di durata non è tuttavia lineare. Se l'efficienza del FRET si avvicina a una, i fluorofori del donatore in stato delimitato emettono efficacemente quasi nessun fotone. Pertanto, a meno che il rapporto di legame non sia 100% (questo non è mai il caso perché nessun fluoroforo accettatore matura al 100%29) la durata media si avvicina alla durata del fluoroforo del donatore in stato aperto e alla capacità di rilevare sensori di stato delimitato Diminuisce. L'efficienza FRET per tAKAR è stimata a 0,7 dollari, entro l'intervallo favorevole.
In terzo luogo, i sensori FRET-FLIM dovrebbero segnalare i segnali con una sensibilità e una cinetica rilevanti per la fisiologia animale. La sensibilità e la cinetica del sensore devono essere ampiamente testate in vitro prima del suo utilizzo in vivo e, se necessario, possono essere regolate utilizzando una varietà di approcci, come la regolazione dell'affinità di dominio e della cinetica che lega il substrato, l'ottimizzazione del linker e la subcellulare mirata del sensore. Nel lavoro precedente, è stato stabilito che tAKAR è in grado di rilevare l'attività PKA suscitata dai rilasci di dopamina endogena e che la cinetica e la sensibilità del sensore si allineano con un processo biologico noto dipendente dalla PKA, che è indotta da noradrenalina inattivazione della corrente lenta dopo l'iperpolarizzazione17. Inoltre, l'espressione di tAKAR non sembra alterare le funzioni neuronali, come pure per l'elettrofisiologia17 e la misurazione della plasticità strutturale delle singole spine (osservazioni inedite).
Le attuali limitazioni tecniche dell'imaging 2pFLIM sono correlate alla gestione dei dati e alla velocità effettiva del conteggio dei fotoni. In primo luogo, FLIM richiede lo stoccaggio degli orari di arrivo dei fotoni per ogni pixel. La dimensione della memoria di PTCM limita la risoluzione dei pixel ottenibile. Per il PCTM descritto qui, è possibile ottenere fino a 256 x 256 pixel per fotogramma dell'immagine con una risoluzione temporale di 64 punti. Inoltre, la velocità di trasferimento dei dati immagine FLIM dalla scheda all'archiviazione del computer è relativamente lenta, ancora una volta, ponendo limiti pratici alla risoluzione e alla frequenza di campionamento. Il continuo miglioramento tecnologico della capacità di memoria e la gestione dei dati possono risolvere queste limitazioni in futuro. In secondo luogo, i PTCOM di uso comune sono sistemi analogici-digitali e sono limitati dai tempi di ripristino del rilevamento dei fotoni (cioè, "tempo morto"). Ciò significa che dopo il rilevamento di un fotone il PTCM non registrerà l'arrivo di alcun fotone successivo per i successivi 10-125 ns18,21. Inoltre, la misurazione della durata è inclinata verso il primo fotone arrivato dopo un impulso laser (chiamato "pile-up"). Questi limitano le frequenze di conteggio dei fotoni a <107 fotoni per s. Anche se nella maggior parte dei tipici regimi di imaging a due fotoni questo non è un problema importante, occorre prestare attenzione a non superare i limiti di frequenza di conteggio dei fotoni. I PTCC più recenti che hanno un tempo morto più breve o un sistema di acquisizione continua di dati gigahertz possono alleviare questa limitazione (per quest'ultimo vedi Yellen e Mongeon18).
I sensori fluorescenti per le vie di segnalazione, come cAMP/PKA, Akt/PKB, PKC ed ERK, vengono continuamente generati e ottimizzati16,35. Per la maggior parte dei sensori attuali, sono necessari ulteriori caratterizzazione e ottimizzazione per eccellere nell'impegnativo ambiente di imaging in vivo. In particolare, una maggiore ampiezza del segnale è importante, in quanto qualsiasi aumento dell'ampiezza del segnale riduce la domanda sui budget dei fotoni con una relazione quadrata. Per tAKAR, la sua ampiezza di risposta ai neuromodulatori endogeni, come la noradrenalina, è stata migliorata di 2,7 volte rispetto al sensore migliore precedente. Questo si tradusse in una diminuzione di 7 volte dei fotoni richiesti. In pratica, ciò ha ridotto notevolmente il numero di falsi negativi (cioè non soccorritori) negli animali durante il comportamento17. Il segnale massimo di tAKAR osservato è del 30% (LT/LT0). Ad oggi, questo è il più grande segnale FLIM segnalato per classi simili di sensori FRET. Un ulteriore miglioramento può essere possibile anche ottimizzando il fluoroforo dell'acceleratore e l'affinità della FHA con la trenola fosforifilata. Inoltre, l'uso di sensori che monitorano diversi aspetti dello stesso percorso di segnalazione può fornire un potente approccio per studiare meccanicamente la regolazione dei percorsi di segnalazione in vivo. In futuro, la riuscita applicazione dei sensori FLIM per visualizzare i percorsi di segnalazione neuromodulatori in vivo fornirà importanti informazioni su dove e quando la neuromodulazione avviene in reti neuronali intatte di topi che si comportano.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo la signora Tess J. Lameyer, la signora Ruth Frank, e il dr. Michael A. Muniak per le modifiche e i commenti, e il dottor Ryohei Yasuda a Max Planck Florida per il software di acquisizione 2pFLIM. Questo lavoro è stato sostenuto da due premi BRAIN Initiative U01NS094247 (H.e T.M.) e R01NS104944 (H. e T.M.), una sovvenzione R01 R01 R01NS081071 (T.M.) e una concessione R21 R21 R21NS097856 (H. ) . Tutti i premi sono dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Stati Uniti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
| 3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
| Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
| AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
| Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
| Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Circular coverslip (5 mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
| Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
| Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
| Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
| Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
| Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
| Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
| FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
| Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
| Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
| Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
| Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
| Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
| Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
| Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
| Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
| Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
| Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
| Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
| Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
| Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
| Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
| Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
| Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
| Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
| Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
| Rotation encoder | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
| Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
| Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
| Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
| Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
| Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
| Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
| Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
| White PE foam roller (8 inch x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
| White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |
References
- Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).
- Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).
- Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety. Neuron. 87 (3), 468-470 (2015).
- Berke, J. D. What does dopamine mean? Nature Neuroscience. 21 (6), 787-793 (2018).
- Chen, Y., et al. Endogenous Gαq-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A. Neuron. 96 (5), 1070-1083 (2017).
- Madison, D. V., Nicoll, R. A. Cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 372 (1), 245-259 (1986).
- Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction. Nature Neuroscience. 6 (1), 15-16 (2003).
- Pedarzani, P., Storm, J. F. PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons. Neuron. 11 (6), 1023-1035 (1993).
- Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection. Current Opinion in Neurobiology. 7 (3), 397-403 (1997).
- Radnikow, G., Feldmeyer, D. Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex. Frontiers in Neuroanatomy. 12 (January), (2018).
- Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
- Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. Hitchhiker’s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach. Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochemical and Biophysical Research Communications. 348 (2), 716-721 (2006).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging. Frontiers in Pharmacology. 5 (April), 1-12 (2014).
- Ma, L., et al. A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice. Neuron. 99 (4), 665-679 (2018).
- Yellen, G., Mongeon, R. Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).
- Tang, S., Yasuda, R. Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity. Neuron. 93 (6), 1315-1324 (2017).
- Tillo, S. E., et al. Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates. Cell Reports. 19 (3), 617-629 (2017).
- Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16 (5), 551-561 (2006).
- Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2. Journal of Biological Chemistry. 257 (6), 3284-3290 (1982).
- Zhong, H., et al. Subcellular dynamics of type II PKA in neurons. Neuron. 62 (3), 363-374 (2009).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP. Brain Cell Biology. 36 (1-4), 31-42 (2008).
- Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of Förster resonance energy transfer. Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
- Yu, K., et al. The central amygdala controls learning in the lateral amygdala. Nature Neuroscience. 20 (12), 1680-1685 (2017).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Yasuda, R. Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1121-1128 (2012).
- Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nature Cell Biology. 20 (10), 1215-1225 (2018).
