Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

تصور البروتين كيناز نشاط في الفئران يتصرف الرأس ثابتة باستخدام في فيفو اثنين من الفوتون الفلورة التصوير مدى الحياة المجهرية

doi: 10.3791/59526 Published: June 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

يتم تقديم إجراء لتصور أنشطة البروتين كيناز A في الفئران الثابتة الرأس، وتتصرف. يتم التعبير عن مراسل نشاط A-kinase محسنة، tAKARα، في الخلايا العصبية القشرية وجعلها في متناول للتصوير من خلال نافذة الجمجمة. يتم استخدام اثنين من الفوتون الفلورة التصوير مدى الحياة المجهرية لتصور أنشطة PKA في الجسم الحي أثناء الحركة القسرية.

Abstract

التشكيل العصبي يمارس سيطرة قوية على وظيفة الدماغ. يؤدي خلل في النظم العصبية إلى اضطرابات عصبية ونفسياً. على الرغم من أهميتها، بدأت تقنيات تتبع الأحداث العصبية مع القرار الخلوي في الظهور. Neuromodulators, مثل الدوبامين, إفراز, أستيل, والسيروتونين, تؤدي الأحداث الإشارات داخل الخلايا عن طريق مستقبلات البروتين G الخاصة بهم إلى تحوير الإثارة العصبية, الاتصالات متشابك, وغيرها من الخلايا العصبية وظائف، وبالتالي تنظيم معالجة المعلومات في شبكة الخلايا العصبية. تتلاقى المعوّقات العصبية المذكورة أعلاه على مسار كيناز/بروتين cAMP/protein (PKA). لذلك، في التصوير PKA في الجسم الحي مع قرار خلية واحدة وضعت كقراءة للأحداث neuromodulatory بطريقة مماثلة لتصوير الكالسيوم للأنشطة الكهربائية العصبية. هنا، يتم تقديم طريقة لتصور نشاط PKA على مستوى الخلايا العصبية الفردية في قشرة الفئران التي تتصرف في الرأس ثابتة. للقيام بذلك، يتم استخدام مراسل نشاط A-kinase محسنة (AKAR)، ودعا tAKARα، الذي يقوم على Förster نقل الطاقة الرنين (FRET). يتم إدخال هذا الاستشعار PKA ترميز وراثيا في القشرة الحركية عن طريق في الكهربائي الرحم (IUE) من بلازميدات الحمض النووي، أو حقن مجسمة من الفيروس المرتبط بأدينو (AAV). يتم تصوير التغييرات FRET باستخدام اثنين من الفوتون الفلورة التصوير المجهري مدى الحياة (2pFLIM)، والذي يقدم مزايا على قياسات FRET ratiometric لتحديد كمية إشارة افري في أنسجة الدماغ مبعثرة الضوء. لدراسة أنشطة PKA أثناء الحركة القسرية، يتم تصوير tAKARα من خلال نافذة الجمجمة المزمنة فوق قشرة الفئران اليقظة، وثابتة الرأس، والتي تعمل أو تقع على جهاز المشي الآلية التي تسيطر عليها السرعة. وسوف ينطبق هذا النهج التصويري على العديد من مناطق الدماغ الأخرى لدراسة أنشطة PKA المقابلة الناجمة عن السلوك وعلى أجهزة الاستشعار الأخرى القائمة على FLIM في التصوير الحي.

Introduction

التشكيل العصبي، والمعروف أيضا باسم انتقال متشابك بطيء، يفرض سيطرة قوية على وظيفة الدماغ خلال الحالات السلوكية المختلفة، مثل الإجهاد، والإثارة، والاهتمام، والحركة1،2،3، 4.على الرغم من أهميتها، ودراسة متى وأين تجري الأحداث neuromodulatory لا تزال في مهدها. Neuromodulators, بما في ذلك أستيل, الدوبامين, نورادرينالين, السيروتونين, والعديد من الببتيدات العصبية, تنشيط مستقبلات G البروتين المقترنة (GPCRs), التي بدورها تؤدي داخل الخلايا مسارات رسول الثاني مع نافذة واسعة من الجداول الزمنية تتراوح من ثانية إلى ساعات. في حين أن كل neuromodulator مشغلات مجموعة متميزة من الأحداث إشارة، وcAMP / البروتين كيناز A (PKA) المسار هو مسار المصب المشتركة لكثير من neuromodulators1،5. مسار CAMP / PKA ينظم الإثارة العصبية، انتقال متشابك،واللدونة 6،وبالتالي، الإيقاعات ديناميات شبكة الخلايا العصبية. لأن الخلايا العصبية المختلفة أو أنواع الخلايا العصبية التعبير عن أنواع مختلفة أو مستويات مستقبلات neuromodulator10، قد تكون الآثار داخل الخلايا من نفس neuromodulator خارج الخلية غير متجانسة عبر الخلايا العصبية المختلفة ، وبالتالي ، يجب أن يكون درس مع القرار الخلوية. حتى الآن, لا يزال من الصعب رصد الأحداث neuromodulatory في الخلايا العصبية الفردية في الجسم الحي أثناء السلوك.

لدراسة الديناميات الصدغية للتشكيل العصبي، يلزم إجراء تسجيل مناسب. يتم استخدام غسيل الكلى الدقيق والقياس الفولتامتري الدوري يُفحص بسرعة لدراسة إطلاق النيونوموتورات، ولكنها تفتقر إلى الدقة المكانية لرصد الأحداث الخلوية11،12. مماثلة لديناميات الكالسيوم المستخدمة كوكيل للنشاط الكهربائي العصبي في التصوير السكاني13، يمكن استخدام التصوير PKA لقراءة الأحداث neuromodulatory عبر السكان الخلايا في القرار الخلوي. يصف هذا البروتوكول استخدام مراسل نشاط A-kinase محسن (AKAR) لرصد أنشطة PKA في الجسم الحي أثناء السلوك الحيواني. الطريقة الموصوفة هنا يسمح للتصوير المتزامن للسكان الخلايا العصبية في القرار دون الخلوي مع قرار زمني الذي يتتبع الأحداث العصبية الفسيولوجية.

وتتكون AKARs من متبرع وبروتينات فلورية مقبولة مرتبطة ببتيد الركيزة الفسفور PKA والمجال المرتبط بشوكة الرأس (FHA) الذي يربط serine الفوسفوري أو ثروينين الركيزة14،15. عند تفعيل مسار PKA، يتم الفوسفورية الببتيد الركيزة من AKAR. ونتيجة لذلك، يرتبط مجال FHA بببتيد الركيزة الفوسفوري، وبالتالي جلب الفلوروفورين اثنين على مقربة من بعضها البعض، ويشار إليها باسم حالة AKAR المغلقة. ينتج ال ينفضّ دولة من [سكر] [فوسفوريلت] في يزاد [فرستر] رنة طاقة إنتقال ([فريت]) بين المانحة ومقبولة [فلوروفورس]. وبما أن نسبة الأكور الفوسفورية ترتبط بمستوى نشاط PKA16،يمكن استخدام كمية قوات الاتحاد الثوري في عينة بيولوجية لتحديد مستوى نشاط PKA16،17،18، 19،20.

تم تصميم الإصدارات المبكرة من AKARs في المقام الأول للتصوير قياس اللونين14. عند التصوير أعمق في أنسجة الدماغ، وطريقة قياس النسب يعاني من تشويه الإشارة بسبب تشتت الضوء تعتمد على الطول الموجي17،18،21. كما هو موضح أدناه، الفلورة التصوير المجهري مدى الحياة (FLIM) يزيل هذه المشكلة لأن FLIM يقيس فقط الفوتونات المنبعثة من الفلوروفور المانح18،21. ونتيجة لذلك، لا يتأثر التحديد الكمي للFLIM من FRET بعمق الأنسجة17. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام متغير "داكن" (أي انخفاض غلة الكم [QY]) من الفلوروفور المقبول. هذا يحرر قناة ملونة لتسهيل القياس المتعدد من خصائص الخلايا العصبية المتعامدة عن طريق التصوير المتزامن للمستشعر الثاني أو علامة مورفولوجية17،19،20.

التصوير FLIM يحدد الوقت الذي يقضيه الفلوروفور في حالة متحمس، أي عمر الفلورة18. عودة فلوروفور إلى حالة الأرض، وبالتالي نهاية الدولة متحمس، وغالبا ما تصاحب انبعاث فوتون. على الرغم من أن انبعاث الفوتون لجزيء متحمس الفردية هو الاستوكاستك، في السكان متوسط عمر الفلورة هو سمة من سمات ذلك الفلوروفور خاصة. عندما يكون السكان النقيمن الفلوروفور متحمسون في وقت واحد، فإن الفلورة الناتجة سوف تتبع تسوس أسي واحد. ثابت الوقت من هذا الاضمحلال الأسي يتوافق مع متوسط عمر الفلورة، والتي تتراوح عادة من واحد إلى أربعة نانو ثانية للبروتينات الفلورية. كما يمكن أن تحدث عودة الفلوروفور المتحمس للمانحين إلى الحالة الأرضية من قبل الاتحاد من أجل إعادة التأثر. في وجود فريت، يتم تقليل عمر الفلوروفور المانح. وAAKARs غير الفوسفورية تظهر عمر الفلورة المانحة أطول نسبيا. وعند الفسفور من قبل PKA، يعرض جهاز الاستشعار عمراً أقصر لأن المتبرع والمانح الفلوروفوريس يقتربان من بعضهما البعض وتزداد الـ FRET. وبالتالي فإن التحديد الكمي لعمر الفلورة في عدد السكان من الـ AKARs يمثل مستوى نشاط مرافق الحماية من الكلمنها.

لم يتم استخدام الإصدارات المبكرة من AKARs بنجاح في التصوير في الجسم الحي بدقة خلية واحدة. ويرجع ذلك أساسا إلى انخفاض سعة إشارة أجهزة الاستشعار عكار إلى التنشيط الفسيولوجي17. في الآونة الأخيرة، من خلال المقارنة المنهجية أجهزة الاستشعار AKAR المتاحة لاثنين من الفوتون الفلورة التصوير المجهري مدى الحياة (2PFLIM)، تم العثور على جهاز استشعار يسمى FLIM-AKAR لتفوق أجهزة الاستشعار البديلة. وعلاوة على ذلك، تم تطوير سلسلة من المتغيرات FLIM-AKAR تسمى AKARs المستهدفة (tAKARs) لتصور نشاط PKA في مواقع محددة دون الخلوية: microtubules (tAKARα)، سيتوسول (tAKARβ)، أكتين (tAKARδ)، الأكتين خيوطي (tAKARי)، غشاء (tAKARγ)، والكثافة الرصاقة (tAKARי). ومن بين التاكارس، زاد التاكارا من سعة الإشارة التي أثارها إفراز بمقدار 2.7 أضعاف. وهذا يتفق مع المعرفة بأن غالبية PKA في الخلايا العصبية راسية على microtubules في حالة يستريح22،23. وكان tAKARα أفضل أداء بين AKARs القائمة ل2pFLIM. وعلاوة على ذلك، اكتشف tAKARα نشاط PKA ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي أثارها المغيرات العصبية متعددة، والتعبير عن tAKARα لم يغير وظائف الخلايا العصبية17.

في الآونة الأخيرة، تم استخدام tAKARα بنجاح لتصور أنشطة PKA في الفئران يتصرف الرأس ثابتة17. وقد تبين أن الحركة القسرية أدت إلى نشاط PKA في سوما من الخلايا العصبية الطبقة السطحية (الطبقة 1 إلى 3، تصل إلى عمق ~ 300 ميكرومتر من بيا) في المحرك، برميل، والقشرية البصرية. وكان نشاط PKA التي تسببها الحركة تعتمد جزئيا على الإشارة عن طريق مستقبلات β-adrenergic ومستقبلات الدوبامين D1, ولكن لم يتأثر بخصم مستقبلات الدوبامين D2. يوضح هذا العمل قدرة tAKARs على تتبع أحداث التشكيل العصبي في الجسم الحي باستخدام 2pFLIM.

في البروتوكول الحالي، يتم وصف الطريقة الكاملة لتصوير نشاط PKA في الفئران مستيقظا ثابتالرأس أثناء نموذج الحركة القسري في ست خطوات. أولا، إضافة قدرات 2pFLIM إلى المجهر التقليدية اثنينفوتون (الشكل 1). ثانيا، بناء جهاز المشيالآلية (الشكل 2). ثالثا، التعبير عن جهاز استشعار tAKARα في قشرة الماوس عن طريق في الكهربائي الرحم (IUE) من بلازميدات الحمض النووي، أو حقن مجسمة من الفيروس المرتبط بأدينو (AAV). وقد نشرت سابقا بروتوكولات ممتازة للعمليات الجراحية لIUE24،25 وحقن stereotaxic من الجسيمات الفيروسية26. ويرد أدناه وصف للبارامترات الرئيسية التي استخدمناها. وإلى الأمام، تركيب نافذة الجمجمة. وقد نشرت بروتوكولات ممتازة سابقا لجراحة نافذة الجمجمة27,28. يتم وصف العديد من الخطوات التي تم تعديلها من البروتوكولات القياسية. الخامس، أداء في الجسم الحي 2pFLIM. سادساً، تحليلات صور 2pFLIM (الشكل3 والشكل 4). وينبغي أن يكون هذا النهج قابلاً للتطبيق بسهولة على العديد من النماذج السلوكية الأخرى الثابتة الرأس ومناطق الدماغ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة أوريغون للصحة والعلوم.

1. 2pFLIM المجهر الإعداد 2.

  1. قم بتثبيت وحدة عد توقيت الفوتون (PTCM، جدولالمواد) والاتصال بالكمبيوتر (الشكل 1) وفقا لدليل الشركة المصنعة.
    ملاحظة: وPTCM هو عادة لوحة الكمبيوتر التي تتلقى إدخال "المزامنة" لتوقيت نبض الليزر ومدخلات فوتون من أنبوب المضاعف الضوئي (PMT). كما يتلقى توقيت الساعة للبيكسلات والخطوط والإطارات، من برنامج التحكم في التصوير باثنين من الفوتونات. يستخدم PTCM إشارات الساعة لفصل الفوتونات الفردية إلى بيكسلات وإطارات مختلفة.
  2. أضف صمام ضوئي مع عرض نطاق ترددي 200 ميجاهرتز لقياس توقيت الليزر. وضع غطاء زجاجي قياسي في مسار الضوء ليعكس جزء صغير من ضوء الليزر في الصمام الضوئي وضععمودي على مسار الضوء (الشكل 1). قم بتوصيل إخراج الصمام الضوئي بإدخال "المزامنة" لـ PTCM.
    ملاحظة: العديد من الليزر الحديثة أيضا إخراج توقيت الليزر. لهذه الليزر، الصمام الضوئي ليس ضروريا، ويمكن للمرء أن يربط مباشرة إخراج توقيت الليزر إلى إدخال المزامنة من PTCM.
  3. تبادل PMT، في حالة tAKARα، وقناة خضراء PMT، مع انخفاض مستوى الضجيج، سريع GaAsP PMT (الشكل1). قم بتوصيل إخراج PMT بإدخال إشارة PTCM.
    1. أضف مقسم إشارة اختياري(الشكل 1) إذا كان الحصول المتزامن على الكثافة من خلال قناة التصوير التقليدية ذات الفوتونين مرغوبًا فيه. قم بتوصيل إخراج PMT بمقسم الإشارة وقم بتوصيل خرج الخائن بـ PTCM ووحدة التصوير التقليدية ذات الفوتونين.
      ملاحظة: تعطي PMTs GaAsP إشارات فوتون واحدة أسرع من PMTs ثنائي ة الكالي التقليدية وتسمح بتحديد أكثر دقة لتوقيت الفوتون. يمكن تبريد نماذج معينة من PMTs GaAsP إلى 10-35 درجة مئوية تحت درجة الحرارة المحيطة، مما يسمح بقمع العد اتّصال الظلام إلى مستوى أقل من بضع مئات في الثانية (عادة ≤ 200 التهم/ثانية). هذا المستوى المنخفض من الضوضاء مهم للقياس الدقيق لعمر الفلورة لأن عدد الفوتون الضوضاء لا يمكن تمييزه بسهولة أو طرحه من منحنى عمر الفلورة.
  4. إضافة مرشح انبعاثات الفلورة تمرير النطاق الذي يقلل من التلوث الطيفي، إن وجد، من الفلوروفور المقبول. على سبيل المثال، بالنسبة لtAKARα، يتم استخدام 500 نانومتر ± 20 نانومتر مرشح حاجز للقناة الخضراء للحد من التلوث من sREACh مقبول، وهو الظلام (QY ~ 0.07) بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP)29،30. قم بتوصيل إشارات التوقيت، مثل الساعات لبيكسلات الصور الفردية والخطوط والإطارات، بما يتناسب مع برنامج التحكم والموضحفي دليل المستخدم PTCM. قم بتثبيت برنامج التحكم في البيانات والاكتساب المناسب.
    ملاحظة: بعض الشركات المصنعة PTCM (جدولالمواد)توفير برامجها للتصوير 2pFLIM. هنا، يتم استخدام البرمجيات المخصصة تسمى FLIMimage، والتي تم تطويرها من قبل مختبر ياسودا (ماكس بلانك فلوريدا، عن طريق الاتصالات الشخصية). يعمل هذا البرنامج كوظيفة مستخدم إضافية لبعض برامج اكتساب الفوتون (جدولالمواد). فإنه يتحكم ويتصل مع PTCM في الوقت المناسب أثناء التصوير اثنين من الفوتون للحصول على صور 2pFLIM.

2. بناء جهاز المشي الآلية

ملاحظة: يظهر تصميم جهاز المشي الآلي المخصص في الشكل2.

  1. قطع الأسطوانة رغوة (Ø = 200 مم) إلى 150 ملم في الطول مع منشارا غرامة. بدلا من ذلك، الغراء نصفين من الكرة رغوة معا ووضع الشريط على التماس. اختياريا، الغراء حصيرة المطاط مع الملف الشخصي على الأسطوانة لزيادة الجر على الأسطوانة.
  2. حفر حفرة قطرها 1/4 بوصة من خلال مركز الأسطوانة في الجانب المسطح من الأسطوانة أو حفر حفرة قطرها 1/4 بوصة من خلال منتصف كل نصف الكرة إذا تم استخدام الكرة رغوة.
  3. قم بتثبيت محور فولاذي قطره بوصة من خلال الثقب. الغراء الأسطوانة رغوة / الكرة إلى المحور باستخدام رغوة متوافقة الغراء. اختياريا، تعديل اثنين من وصلات رمح مرنة (1/4 بوصة القطر الداخلي) لتعزيز اقتران المحور إلى الأسطوانة رغوة / الكرة.
    ملاحظة: يرجى ملاحظة أن العديد من الغراء المشتركة قد تذوب رغوة.
    1. لكل اقتران رمح، ضع اقتران رمح على جانبها المسطح وفي وسط لوحة معدنية مستطيل (0.7 مم × 15 مم × 76 مم). لحام لوحة لاقتران رمح. حفر حفرة 1/4 بوصة في وسط لوحة للسماح لتركيب اقتران رمح المعدلة على المحور واثنين من الثقوب المسمار في اللوحة المعدنية الجانبية من المركز.
    2. تثبيت اقتران رمح على المحور ضد الأسطوانة رغوة / الكرة. إذا كنت تستخدم هذا الأخير، وثني قليلا لوحة لتناسب انحناء الكرة. وضع مسامير في الثقوب الجانبية لإصلاح الأسطوانة / الكرة على المحور.
  4. حفر والاستفادة من 3/8-32 الموضوع في وسط لوحة قفص وتثبيت التشفير الدوارة. حفر ثقب المسمار في قاعدة قوس المحرك الزاوية اليمنى للسماح مرفق المحرك على حامل آخر. إرفاق كل من التشفير الدوارة والمحرك إلى نهاية المحور باستخدام اقتران رمح مرنة.
  5. تثبيت المطحنة تجميعها على لوحة الخبز الألومنيوم باستخداموظائف للمحرك والتشفير الدوارة (الشكل 2). قم بتوصيل مدخلات المحرك بوحدة تحكم السرعة، وإخراج التشفير الدوار إلى إدخال تناظري للوحة الحصول على بيانات الكمبيوتر (DAQ).
    ملاحظة: يتم ترميز سرعة الزاوي دوران بواسطة التشفير الدوارة كما الجهد ويتم رقمنة باستخدام برامج مخصصة تسمى AnimalTracker مكتوبة في MATLAB.
  6. قم بتثبيت الحامل المتوافق مع اللوحة الأمامية على قوس الزاوية اليمنى. تثبيت وظيفة صلبة على لوحة الخبز أمام المطحنة وتثبيت حامل لوحة الرأس تجميعها معقوس الزاوية اليمنى على آخر (الشكل 2). تأكد من محاذاة قضبان حامل اللوحة مع المحور بحيث يمكن للماوس اعتماد موقف المشي كافية ومريحة على المطحنة (الشكل2C).

3. التعبير عن جهاز استشعار tAKARα في قشرة الماوس

  1. في الكهرباء الرحمية
    1. إعداد محلول الحمض النووي لـ IUE بإضافة تركيز نهائي بنسبة 0.2% من الصبغة الخضراء السريعة (للتصور أثناء الحقن) إلى الحمض النووي البلازميد (3−4 ميكروغرام/ميكرولتر؛ وبنيات المستشعر التي تحتوي على محرك كاج promotor، وتسلسل الاستشعار، وفيروس التهاب الكبد woodchuck عنصر الاستجابة ما بعد النسخ [WPRE] محسن الترجمة) حل / مخفف ة في الماء أو Tris-EDTA.
    2. إعداد فأرة حامل موقوتة (على سبيل المثال، C57BL/6) لIUE في E1624. التخدير الماوس مع isoflurane (4٪ للحث و 1.5٪ للصيانة، على 95٪O2 مع 5٪ CO 2) وتطبيق الحقن تحت الجلد من المسكنات المحيطة بالجراحة التي تحتوي على 5 ملغ / كغ ميلوكسيكام و 4 ملغ / كغ بوباكاين. قطع فتح تجويف البطن مع مشرط وزوج من مقص وفضح بعناية قرون الرحم.
    3. حقن 1 ميكرولتر من محلول الحمض النووي لكل جنين في البطين الجانبي لنصف الكرة الأرضية، كما سبق وصفه24.
    4. أداء IUEالعادية 24 للخلايا العصبية القشرية عن طريق وضع القدم نهاية القطب الإيجابي في القشرة واستخدام خمسة 100 مللي ثانية البقول مربع (38 V) في 1 هرتز مع الكهربائي.
      ملاحظة: يمكن استهداف مناطق القشرية المختلفة للكهرباء عن طريق تغيير موضع القدم نهاية القطب بالنسبة إلى البطين الجانبي.
  2. حقن مجسم
    1. إعداد الماوس في يوم ما بعد الولادة 30 لجراحة مجسمة26. التخدير الماوس كما هو موضح في الخطوة 3.1.2.، وتطبيق الحقن تحت الجلد من المسكنات المحيطة بالجراحة التي تحتوي على 5 ملغ /كغ كاربروفين.
    2. تمييع AAV serotype 2/1 (AAV2/1) معبراً عن hSyn-tAKARα-WPRE إلى titer محدد تجريبياً (~ 1 × 109−1 × 1010 جينوم/ميكرولتر) في المحاقن المصفاة (0.2 ميكرومتر غشاء خلات السليلوز) المملح ة المخزنة بالفوسفات.
    3. حفر حفرة قطرها حوالي 500 ميكرومتر باستخدام حفر المحمولة تحت مجهر مجسم في الإحداثيات التالية لقشرة المحرك: 0.5 مم الأمامي إلى بريغا، 1.2 مم الجانبية إلى خط الوسط.
    4. قم بتركيب محقن (على سبيل المثال، متلاعب هيدروليكي زيتي، مع حامل ماصة/مغطس زجاجي مصنوع حسب الطلب) إلى متلاعب آلي. ضع إبرة الحقن بزاوية 15 درجة بالنسبة إلى الطائرة بريجما لامدا. برنامج حركة قطري عبر محاور x و z ما يعادل تقدم 700 ميكرومتر و 200 ميكرومتر على طول المحاور الأمامية الخلفية والظهرية البطنية، على التوالي.
      ملاحظة: لتجنب تلف الأنسجة مباشرة فوق حقل التصوير المقصود، يتم حقن جزيئات AAV في زاوية بالنسبة إلى الطائرة بريجما لامدا.
    5. وضع غيض من إبرة الحقن في بيا في وسط ثقب الحفر وتنفيذ ببطء الحركة قطري (~ 25 درجة مئوية / ثانية) المذكورة أعلاه. هذا الإجراء سوف يضع مركز الحقن في 1.2 مم الأمامي إلى بريما، 1.2 مم الجانبية إلى خط الوسط، 0.2 ملم تحت بيا.
    6. حقن 20 مل من الجسيمات الفيروسية المخففة (~ 10 نمل / دقيقة). انتظر 10 دقائق على الأقل وتراجع ببطء إبرة الحقن (~ 12.5 درجة مئوية / ثانية).
    7. الانتهاء من إجراء حقن stereotaxic والغراء / خياطة الجلد26.

4. تركيب نافذة الجمجمة

  1. إجراء وضع نافذة الجمجمة على الفئران التي تعبر عن tAKARα عن طريق IUE (القسم 3.1) أو حقن الجسيمات الفيروسية بستيريوتاكسي (القسم 3.2)، بين أيام ما بعد الولادة 30 و60. للماوس المصاب بالجسيمات الفيروسية، قم بتنفيذ نافذة الجمجمة بعد أسبوعين على الأقل من حقن الفيروس. تثبيت نافذة الجمجمة كما هو موضح سابقا27،28، مع التفاصيل التالية. التخدير الماوس كما هو موضح في الخطوة 3.1.2.، وتطبيق الحقن تحت الجلد من المسكنات المحيطة بالجراحة 0.075 ملغ / كغ Buprenex والعوامل المضادة للالتهابات Dexamethasone في 4 ملغ / كغ.
  2. إزالة periosteum وسحب عضلة الرقبة. الغراء حافة الجلد إلى الجمجمة مع لاصق الأنسجة لتجنب التعرض للعضلات الرقبة بعد الجراحة.
  3. تجفيف وإزالة أي periosteum من الجمجمة عن طريق كشط بلطف باستخدام مشرط. ضع لوحة التصوير (قطرها الداخلي 8 مم) لإحاطة حقل التصوير المقصود. الغراء لوحة الرأس إلى الجمجمة باستخدام الغراء على أساس سيانوكريلات، تليها الاسمنت الاكريليك الأسنان. للالتصاق الأمثل، تأكد من أن اللوحة تقع على الجمجمة المكشوفة والمجففة. ويمكن استخدام مسرع الغراء لتسريع تصلب.
  4. رسم دائرة قطرها 5 مم فوق حقل التصوير المقصود (الإحداثيات كما هو محدد في الخطوة 3-2-3) باستخدام مثقاب الأسنان وفضح الأم دورا.
  5. تطبيق طبقة رقيقة من البوليمر شفافة، وتسمى أيضا دورا الاصطناعية، على سطح دورا لتغطية نافذة الجمجمة بأكملها. سوف البوليمر حماية وتثبيت الأم دورا. ضع غطاء دائري معقم (قطره 5 مم) على ماتر دورا. تأمين غطاء مع الغراء cyanoacrylate تطبيقها حول حواف النافذة تليها الاسمنت الاكريليك الأسنان.

5. في فيفو اثنين من الفوتون الفلورة التصوير مدى الحياة المجهرية

  1. بدء التصوير 2pFLIM في أو بعد 2 أسابيع بعد تركيب نافذة الجمجمة (القسم 4). تقليل التداخل التجريبي بسبب الإجهاد من خلال التعامل المتكرر والوخز من الماوس قبل بدء دراسة التصوير لسكن الماوس.
  2. تعيين اثنين من الفوتون الإثارة الليزر الطول الموجي إلى 960 نانومتر باستخدام البرنامج الذي يتحكم في الليزر اثنين من الفوتون.
  3. تخدير الماوس باستخدام 4٪ isoflurane. تأكيد التخدير السليم عن طريق قرصة الذيل ومراقبة معدلات التنفس. وهذا يعني، لا ينبغي أن يكون هناك استجابة لقرصة الذيل وينبغي خفض معدل التنفس إلى ~ 1 التنفس في الثانية الواحدة. لتقليل الوقت الإجرائي غير الضروري ولأن التخدير يستمر لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق فقط، لا يتم استخدام زيوت تشحيم العين.
  4. نقل الماوس التخدير إلى المطحنة الآلية(الشكل 2C)وجبل لوحة رأس الماوس إلى حامل لوحة الرأس من إعداد المطحنة (انظر الشكل 2 للحصول على التفاصيل). تنظيف سطح غطاء النافذة القحفية على الماوس مع الإيثانول 70٪.
  5. ضع المطحنة الآلية مع الماوس المثبت تحت هدف 2pFLIM. تطبيق قطرة من الماء المقطر بين غطاء النافذة القحفية والهدف.
  6. دع الفأر المُركب يستيقظ من التخدير ويصبح متأقلماً مع بيئة المطحنة والمجهر لمدة 10 دقائق على الأقل.
  7. انتقل إلى موقع الحقن تحت الإضاءة الظهارية. توثيق الخصائص fiducial (أي الأوعية الدموية) تحت brightfield للمساعدة في تصوير نفس المنطقة ذات الأهمية (ROI) خلال جلسات التصوير اللاحقة.
  8. القضاء على أي ضوء واردة غير الضوء المنبعث من أنسجة الدماغ. قم بإيقاف مصدر ضوء الإضاءة الظّهة للضوء وأغلق الضميمة الخاصة بجهاز الحفر 2pFLIM. تنشيط PMT 2pFLIM عن طريق التبديل على التحكم في الجهد قيادة الأجهزة.
  9. الحصول على صورة z-كومة 2pFLIM باستخدام برنامج اكتساب 2pFLIM FLIMimage مع الإعدادات الموصى بها التالية لتصوير tAKARα إيجابية سوماتا في الفئران مستيقظا. تعيين الإطار في المتوسط إلى 3 إطارات، وسرعة المسح الضوئي إلى 2 مللي ثانية / خط، وحجم الصورة إلى 128 × 128 بكسل، ومجال الرؤية إلى 90-100 ميكرومتر. ضبط إعدادات التصوير استنادًا إلى إعداد وتكوين الأجهزة.
  10. فحص الصورة المكتسبة في FLIMview (تم تطوير برامج مخصصة داخلية؛ انظر القسم 6). اضبط إعدادات التصوير بعد الخطوة 5.9 لتحسين عدد الفوتونات وتقليل ابيضاض الصور.
    ملاحظة: عدد الفوتونات المدمجة القابلة للتطبيق في عائد الاستثمار للتصوير مدى الحياة للسوما إيجابية tAKARα في الجسم الحي هو ~ 1,000-10,000 فوتون اتّبعاً على سعة الإشارة الناتجة عن حافز معين (انظر المناقشة).
    1. عند الحاجة، استخدم مجال رؤية منخفض، وانخفاض سرعة المسح الضوئي، وزيادة قوة الليزر، وزيادة عدد الإطارات التي سيتم متوسطها لزيادة عدد الفوتونات المتكاملة وتقليل خطأ التقدير مدى الحياة. وفي الوقت نفسه، تأكد من استخدام الحد الأدنى من طاقة الليزر الأساسية، ومتوسط الإطار، وسرعة المسح الضوئي لتقليل ابيضاض الصور.
  11. صورة في فاصل زمني منتظم (على سبيل المثال، كل 30-60 s) عن طريق تكرار الحصول على مكدس z باستخدام الإعدادات المحددة في الخطوة 5.10. احصل على صور خط الأساس 2pFLIM لمدة 15 دقيقة على الأقل بسرعة المطحنة الصفرية.
  12. اضبط سرعة دوران المطحنة إلى 15 سم/ث لمدة 15 دقيقة مع الحصول على صور 2pFLIM. مواصلة التصوير ل ≥ 20 دقيقة بعد إيقاف دوران المطحنة، لتقييم مدة نشاط PKA بعد وقف الحركة القسرية.

6. تحليل صور 2pFLIM

  1. افتح الصور التي تم الحصول عليها في FLIMview وقمت بتعيين المعلمات التالية في FLIMview.
    ملاحظة:
    يتم وصف تفاصيل المعلمة في المناقشة.
    1. انقر على حقول الحد الأدنى والحد الأقصى لعد الفوتون (SPC) في FLIMview. أدخل قيمة النطاق الأدنى والحدالي المناسب ة SPC، التي تتراوح عادة بين 1.2-2 و10-12 ns، على التوالي.
    2. انقر على الحقل قيمة t0 في FLIMview وأدخل قيمة t0 (عادةً ~ 2 ns). انقر على حقل قيمة الحد الأدنى لقيمة الحد الأدنى للإضاءة مدى الحياة في FLIMview وأدخل قيمة العتبة المطلوبة إلى 5−30 فوتون.
  2. انقر على زر المجموعة الجديدة (N) وتعيين اسم مجموعة تجربة. سيؤدي هذا إلى إنشاء مجموعة تجمع البيانات من كل صورة FLIM المضافة.
  3. انقر على زر عائد الاستثمار في وحدة التحكم في عائد الاستثمار من FLIMview ورسم عائد الاستثمار حول سوما tAKARα إيجابية. تقليل نطاق z-stack، عن طريق تحريك الحد z السفلي والعلوي في أشرطة التمرير التحكم z-كومة في FLIMview، لتقليل تلوث الإشارة الناشئة من الفوتونات الخلفية في أعماق z الأخرى.
  4. انقر على زر + لإضافة صورة FLIM إلى المجموعة (الخطوة 6.2). انقر على زر Calc لحساب متوسط العمر (LT، ويسمى أيضًا متوسط وقت انبعاث الفوتون [MPET])، لعائد الاستثمار وخطأ تقدير العمر (δי).
  5. افتح الملف التالي في سلسلة التصوير المزمنة 2pFLIM. كرر الخطوة 6.4. تأكد من ضبط موضع عائد الاستثمار ومجموعة z-stack لقياس نفس سوما إيجابية tAKARα مع مرور الوقت، لأنه يمكن أن يكون هناك الانجراف الأنسجة مع مرور الوقت.
  6. حدد deltaMPET/MPET0 في القائمة المنسدلة من الوحدة النمطية "عناصر تحكم المجموعة". انقر على الحقل "الأساس#" وأدخل الفهرس (الفهرسات) (على سبيل المثال، 1 2 3 4 5 للصور الخمس الأولى في المجموعة التي تم إنشاؤها في الخطوة 6.3). سيؤدي ذلك إلى تعريف الصورة (الصور) المستخدمةلحساب عمر الأساس (LT 0).
  7. انقر على مؤامرة لإنشاء رسم بياني يحتوي على استجابة FLIM (ΔLT/LT0)من tAKARα أثناء التجربة في ROIs المعرفة. تسمح التغييرات التي تمت تسويتها في عمر (ΔLT)لـ ROIs الفردية حسب عمر الأساس المقابل (LT 0) بمقارنة نشاط PKA أثناء الحركة عبر علاقات عامة مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تسمح مستشعرات FRET-FLIM بتصور العديد من مسارات الإشارات المختلفة، بما في ذلك مسار CAMP/PKA المتضمن في التشكيل العصبي. يستخدم البروتوكول الحالي مستشعر tAKARα الذي تم تطويره مؤخرًا مع 2pFLIM لتصور أنشطة PKA في الفئران التي تتصرف بالرأس. ويمكن ترقية معظم المجاهر القائمة ذات الفوتونين بقدرات 2pFLIM بإضافة ثلاثة إلى أربعة مكونات، كما هو موضح في الشكل 1 (انظر أيضا ً القسم 1). لتصور FRET في الصور التي تم الحصول عليها 2pFLIM، تم تنفيذ القياس الكمي لمتوسط العمر على قطع الرسم البياني من توقيت الفوتون التي تم جمعها لكل بكسل (الشكل3A،B). تم تصور متوسط العمر باستخدام صورة ذات ألوان زائفة، حيث متوسط العمر العالي (اللون البارد) والمنخفض (اللون الدافئ) متوسط العمر تمثل أنشطة PKA منخفضة وعالية، على التوالي، حيث أن تنشيط PKA يؤدي إلى انخفاض العمر. يجب توخي الحذر لتعيين نطاق SPC بشكل صحيح; وينبغي تعيين هذا النطاق ضمن الفاصل الزمني لنبض الليزر (على سبيل المثال، 12.5 ns من معدل النبض البالغ MHz 80) مع تقليل القطع الأثرية لحافة الأجهزة (انظر أيضاً القسم 6 والنقاش). تم حساب نشاط PKA داخل ROIs عن طريق الجمع بين LT من جميع وحدات البكسل ضمن عائد استثمار معين (الشكل3C,D). في الرأس ثابت ة الفئران مستيقظا الأعمار القاعدية تراوحت بين 1.3 و 1.8 ns (الشكل3E). يسمح تصوير tAKARα في القشرة الحركية في الفئران مستيقظا ثابتالرأس لتحديد كمية في الوقت الحقيقي من نشاطPKA مع القرار الخلوي أثناء الحركة القاعدية والقسري (الشكل 4). يمكن تكرار التجربة على مدى أيام وأشهر. فرض الحركة يؤدي نشاط PKA في مجموعة من الخلايا العصبية داخل طبقات سطحية من القشرة الحركية الماوس17. هذا النشاط PKA يعتمد على التشكيل العصبي عن طريق تفعيل β-adrenergic ومستقبلات D117.

Figure 1
الشكل 1: مخطط نظام 2pFLIM. يمكن تنفيذ 2pFLIM على المجهر التقليدي ذي الفوتون اتّصال بإضافة مكونات الأجهزة الصفراء المميزة: وحدة عد توقيت الفوتون، أنبوب مضاعف ضوئي سريع منخفض الضوضاء (PMT)، وهو صمام ضوئي (مطلوب فقط إذا لم يكن الليزر يحتوي على إشارة الإخراج لتوقيت الليزر)، ومقسم إشارة اختياري. تم تعديل هذا الرقم من Ma et al.17. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تصميم جهاز للمشي آلي مصمم خصيصاً. (أ) التخطيطي لتصميم المطحنة من الأمام (أعلى اليسار)، الجانب (أعلى اليمين)، ووجهات النظر العليا (أسفل اليسار). يتم توصيل المحور المطحنة (الكرة رغوة) إلى التشفير الدوارة والمحرك التي شنت بشكل جماعي على اثنين من المشاركات على لوحة الخبز الألومنيوم الصلبة. يتم تثبيت حامل متوافق مع اللوحة على قوس الزاوية اليمنى إلى وظيفة صلبة ووضعها فوق المطحنة. الرسومات التخطيطية ليست للتحجيم. الجبهة (B) والجانب (C) عرض الصور من المطحنة. يظهر تحديد المواقع المناسب للماوس على المطحنة في اللوحة C. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التحديد الكمي لبيانات 2pFLIM. (أ) صورة FLIM مع كل بكسل الزائفة اللون لتمثيل متوسط العمر (LT)، نسبة إلى توقيت الليزر، من جميع الفوتونات في هذا البكسل. (ب) تم رسم أوقات وصول الفوتون ضمن بكسل واحد (مربع أرجواني في اللوحة A)في الرسم البياني (اللوحة اليسرى). تم تعيين حدود التكامل لتحديد نطاق عد الفوتون المفرد (SPC، رمادي). ضمن نطاق SPC، تم تقسيم جزء لا يتجزأ من توقيت الفوتون على العدد الإجمالي للفوتونات ثم طرح هاد0 (1.65 ns، خط متقطع)، مما أدى إلى متوسط العمر (LT، المسافة بين خطوط متقطعة ومتقطعة) من 1.74 ns. التحديد الكمي لمتوسط عمر مجال الرؤية بأكمله (مربع أزرق فاتح في اللوحة A) ينطوي على دمج توقيت الفوتون الذي تم جمعه في جميع وحدات البكسل (اللوحة اليمنى)، مما أدى إلى متوسط عمر 1.7 ns. إظهار Insets نفس البيانات في مقياس شبه السجل. (جيم ودال) تحديد متوسط العمر لكل منطقة اهتمام (ROI). (C) مثال تمثيلي لصورة 2pFLIM. تم رسم اثنين من ROIs حول اثنين من somata في طبقة 2/3 من القشرة الحركية. (D) توزيعات توقيت الفوتون المدمجة عبر جميع وحدات البكسل داخل كل عائد استثمار (اللوحة اليسرى). تم ترميز ROIs الخلية (كما هو موضح في لوحة C) الأحمر، الخلية 1؛ الأزرق، الخلية 2. تسمح عمليات حساب الفوتون العادية بمقارنة توزيعات توقيت الفوتون بين نقطتي التحكم في الألواح (اللوحة اليمنى، متوسط العمر؛ الخلية 1، 1.33 ns؛ الخلية 2، 1.73 ns). إظهار Insets نفس البيانات في مقياس شبه السجل. (E) رسم توزيع متوسط العمر القاعدي من 254 خلية مصوّرة في الطبقات السطحية من القشرة الحركية. خلايا L1 (n = 186 خلية/11 خلية/ 11 الحيوانات، اللوحة اليسرى)، التي تقيم في حدود 100 ميكرومتر تحت بيا، أعرب عن tAKARα بعد حقن مجسمة من AAV2/1-hSyn-tAKARα-WPRE، وL2/3 الخلايا الهرمية (ن = 68 خلية / 4 الحيوانات، لوحة الحق)، ويقيم على الأقل 150 ميكرومتر تحت بيا، عبّر عن [تكر] بعد [إيو] من [كغ-تكر]-[وبر] [دنا] بناء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: tAKARα المسارات القسري الأنشطة التي يسببها الحركة PKA في القشرة الحركية. (أ) كثافة تمثيلية (اللوحة اليسرى) وصور العمر (الألواح الوسطى واليسرى) لثلاث خلايا L1 في القشرة الحركية. تم ترميز ROIs الخلية الملونة: البرتقالي، الخلية 1. الأزرق، الخلية 2؛ الأصفر، الخلية 3. (B) توزيعات توقيت الفوتون المقاسة في الخلية 1 (اللوحة العليا) أثناء الحالة القاعدية (تتبع البرتقال، كما تقاس في اللوحة الوسطى Α)والحركة القسرية (loco.، تتبع برتقالي فاتح، كما تقاس في اللوحة اليمنى A). يسمح بمقارنة الفوتون العادية للمقارنة المباشرة لتوزيع توقيت الفوتون (اللوحة السفلية، متوسط العمر: القاعدية، 1.72 ns؛ الحركة، 1.42 ns). إظهار Insets نفس البيانات في مقياس شبه السجل. (C) Δlifetime/lifetime0 (ΔLT/LT0)آثار الخلايا المقابلة (اللوحة العليا، راجع اللوحة A)مع سرعة الحركة المفروضة (اللوحة السفلى). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوضح هذا البروتوكول استخدام جهاز استشعار FRET-FLIM tAKARα لتصور نشاط PKA الذي يتم تشغيله بالتشكيل العصبي في الفئران التي تتصرف في الرأس الثابتة. ويستند هذا التطبيق على اختبار واسعة النطاق وتوصيف اتاكر في المختبر وفي الجسم الحي لإثبات أن إشارة FLIM التي تم الحصول عليها ذات الصلة للأحداث العصبية الفسيولوجية17. هنا، واحد في تطبيق الجسم الحي، نشاط PKA الناجم عن الحركة في القشرة الحركية، ويستخدم لوصف إجراءات تسليم جهاز الاستشعار إلى الدماغ، والجراحة الحيوانية للتصوير، ومتطلبات الأجهزة والبرامج للسلوك والحصول على بيانات التصوير ، والبرامج والخوارزميات لتحليل بيانات التصوير.

يتم إدخال جهاز استشعار tAKARα إلى القشرة من قبل IUE من بلازميدات الحمض النووي أو حقن مجسمة من جزيئات AAV. اعتمادا على المعلمات الكهربائي وتركيزات الحمض النووي، IUE النتائج في كثافة وضع العلامات المختلفة من الخلايا العصبية القشرية على مساحة كبيرة نسبيا في القشرة25. يتم تحديد الطبقة القشرية التي تحمل اسم IUE من خلال المرحلة الجنينية عند إجراء الجراحة. يتم استخدام حقن مجسمة من جزيئات AAV عندما يكون من المرغوب فيه لتصوير العديد من الخلايا داخل منطقة فرعية الدماغ محددة. وعادة ما يؤدي إلى الخلايا العصبية وصفت بكثافة في مركز الحقن ووضع العلامات متفرقة على نحو متزايد أبعد من المركز. الأهم من ذلك، كفاءة العدوى من الخلايا داخل الدماغ يعتمد على النمط المصلي AAV المستخدمة. AAV2/1 يقدم كفاءة كبيرة في الخلايا العصبية القشرية، الثالاميك، وstriatal مع أنشطة وضع العلامات الرجعية منخفضة نسبيا. ينصح لتحديد تجريبيا أي نوع مصلي AAV هو الأكثر كفاءة لمنطقة الدماغ المستهدفة ونوع الخلية. وقد عبرت كل من أساليب التغوط بنجاح tAKARα. يتم تحديد "بقعة حلوة" لمستوى التعبير تجريبيا.

يؤدي الحركة القسرية إلى زيادة أنشطة PKA في الخلايا العصبية للطبقة 2/3 من القشرة الحركية. حاليا، 2pFLIM يحد من نطاق السلوكيات القابلة للاختبار بسبب تثبيت الرأس من الماوس. ومع ذلك، تم تنفيذ قائمة متزايدة باستمرار من النماذج السلوكية بنجاح في إطار هذا القيد، بدءا من الإبلاغ عن المحفزات في الذهاب / المهام التي لا تذهب إلى التوجه المكاني في الواقع الافتراضي31،32،33 . بالإضافة إلى ذلك، قد تمكّن الأساليب المحسنة التصوير في مناطق الدماغ العميقة، مثل السترياتوم، واللوزة، والحصين، من خلال عدسة مؤشر تدرج يشبه الإبرة (GRIN)13 (ملاحظات غير منشورة). ولذلك، فإن البروتوكول الحالي الذي يفصل استخدام tAKARα و2pFLIM في التصور الحي لأحداث التشكيل العصبي ينبغي أن يكون قابلاً للتطبيق بسهولة على العديد من مناطق الدماغ في سياق النماذج السلوكية الثابتة الرأس.

حساب العمر لكل بكسل أو عائد الاستثمار باستخدام منحنى المناسب هو حسابيا تستغرق وقتا طويلا، وعدد الفوتون الكلي المحدود لكل بكسل غالبا ما يؤدي إلى أخطاء تركيب. وبالتالي، يتم حساب متوسط العمر (LT) حسابيًا كتقريب للعمر (ت)17،34:


Equation 1(المعادلة 1)


حيث SPCدقيقة،وSPCماكس هي حدود نافذة القياس (SPC) وF(t) هو منحنى الاضمحلال مدى الحياة الفلورية. وبعبارة أخرى، لكل وحدة تخزين محسوبة (بكسل أو عائد الاستثمار، الشكل 3A)يتم رسم توزيع توقيت الفوتون في الرسم البياني (الشكل3B). ضمن ال [سبك] محدّزة التكامل مرجحة (مع وقت يكون الوزن) من هذا توزيع قسمت بالإجماليّة فوتون حساب أن ينتج في معدّلة إذاعة وقت. يتم تصحيح هذه المرة ثم لt0. لإنشاء صورة مدى الحياة (الشكل3A)يتم تنفيذ هذا الإجراء لكل بكسل، في حين أن حساب العمر لكل عائد استثمار (الشكل3C,D)يدمج جميع الفوتونات من جميع البيكسلات التي هي أعلى من العتبة ضمن حجم عائد الاستثمار. يتم حساب خطأ تقدير مدى الحياة (δי) باستخدام الكثافة المتكاملة (Nالفوتون: إجمالي عدد الفوتونات):


Equation 2(المعادلة 2)

لتقليل خطأ تقدير مدى الحياة، تتطلب δי، وينتج الكشف عن إشارة مناسبة FRET-FLIM الحصول على ما يكفي من الفوتونات لكل عائد الاستثمار. من أجل تحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء المطلوبة (SNR)، يجب على δο أيضًا تلبية المعادلة التالية:


Equation 3(المعادلة 3)


على سبيل المثال، قياس نموذجي أثناء الحركة في سوما الخلايا العصبية في القشرة الحركية (LT = 1.57 ns, Nفوتون = 9075، ΔLT = 0.15 ns; الشكل 4، الخلية 1) ينتج خطأ تقدير مدى الحياة من:

δο Equation 4 Equation 5 Equation 4 0.016 ns (المعادلة 4)

مما يؤدي إلى نسبة إشارة إلى الضوضاء من:

SNR Equation 4 Equation 6 Equation 7 Equation 4 = 9.4 (المعادلة 5)

إذا كان SNR المطلوب هو 5 فقط، نظراً لΔLT = 0.15 ns يسمح δο من:

Equation 8

الذي يتطلب الحد الأدنى من إجمالي عدد الفوتونمن:

Equation 9

كما هو موضح أعلاه، يتطلب القياس الكمي مدى الحياة بشكل مناسبوضع عدة معلمات، مثل نطاق SPC، t 0، والحد الأدنى للإضاءة مدى الحياة. يحدد نطاق SPC نافذة قياس الفوتونات المنبعثة داخل نافذة قياس الأجهزة (المعادلة 1؛ ونافذة قياس الأجهزة عادةً 0−12.5 ns، كما يكرر الليزر عند MHz 80). هذا ضروري لأن PTCM المستخدمة في هذا البروتوكول يحتوي على نتائج ملموسة الحافة. تم تعيين نطاق SPC لدمج معظم توزيع عمر الفوتون المانح دون تضمين القطع الأثرية الحافة. لحساب متوسط العمر، يتم طرح متوسط توقيت الفوتون من نافذة القياس بواسطة t0، والذي يتوافق مع توقيت نبض الليزر داخل النافذة (المعادلة 1، الشكل 3A،B)17،34. t0 يمكن تعديلها عن طريق تغيير أطوال كابل إشارة أو إعدادات PTCM، ويتم عادة ضبط هاهو 2 ns من بداية إطار قياس الأجهزة. بعد التوصيف الأولي للنظام، الذي يتم عادة في ظل ظروف التصوير المثالية القريبة (على سبيل المثال، عند التصوير 5 μm fluorescein الحل)، يتم تعيين كل من نطاق SPC و t0 كمعلمات ثابتة لتكوين جهاز معين. يتم تعيين الحد الأدنى للإضاءة مدى الحياة بحيث يتم تضمين البيكسلات التي يبلغ عدد الفوتونات فيها إجمالي أو أعلى من العتبة في العرض والتحليل. وهذا يقلل بشكل فعال من الضوضاء بسبب عدد الفوتون الخلفية، بما في ذلك الفلورة الذاتية، والضوء المحيط، والتهم الخلفية PMT عفوية. وتحدد هذه العتبة تجريبيا.

أجهزة الاستشعار الناجحة FRET-FLIM للتصوير في الجسم الحي 2pFLIM لديها ما لا يقل عن ثلاث ميزات مشتركة. أولا، فيما يتعلق باختيار الفلوروفور، عادة ما تكون كفاءة جمع الفوتون منخفضة في ظل بيئة التصوير الحية الصعبة ويرجع ذلك جزئيا إلى تشتت الضوء الشديد في أنسجة الدماغ. وفي الوقت نفسه، يلزم وجود عدد كبير من الفوتونات المكتشفة لتحقيق SNR مرغوب فيه (سيتطلب ≥ 000 1 فوتون لتحقيق SNR من 1 لΔLT/LT0 من 0.03؛ انظر المعادلتين 2 و 3). ولذلك، يفضل الفلوروفور المانح بميزانية فوتون عالية (أي العدد الأقصى من الفوتونات القابلة للكشف قبل تبييض الفلوروفور). وفي الوقت الراهن، لا توجد مقارنة منهجية بين مختلف الفلورورو من المانحين من حيث ميزانيتهم الفوتونية تحت الإثارة بفوتونين. ومن الناحية التجريبية، فإن eGFP مشرق نسبياً بينما يكون أكثر قابلية للتصوير مقارنة بالعديد من الفلوروفورات الأخرى في الطيف الأخضر/الأصفر، مما يجعله فلوروفور مانحكبير للاستخدام الحي لمستشعرات FRET-FLIM. وبالإضافة إلى ذلك، من أجل التحديد الكمي الأمثل للفريت، يفضل الفلوروفورون المانحة مع تسوس مدى الحياة الفلورية واحد الأسي. العديد من البروتينات الفلورية المانحة شائعة الاستخدام للتصوير المتري النسبي، مثل eCFP، لها تسوس متعدد الأسيمدى الفلورية، مما يشير إلى أنها تتكون من مجموعات مختلطة من الفلوروفور. هذه البروتينات الفلورية هي بالتالي ليست مثالية لفريت-FLIM21. وعلى عكس الفلوروفور المانح، يمكن أن يكون انخفاض غلة كمية الفلوروفور المقبول مفيداً لأجهزة استشعار فريت-فليم. يتم استخدام sREACh الفلوروفور منخفض اللاإرادي "المظلم" لtAKARs. يقلل انخفاض غلة الكم من الفلوروفور المقبول إلى أدنى حد من التلوث بالفوتون اتّبأ في طيف انبعاثات الفلوروفور المانحة ويحرر قناة واحدة للكشف عن الفلورة من أجل التصوير المتزامن لمستشعر فلورسنت ثانٍ أو علامة مورفولوجيا في الطيف الأحمر في حالة takaRα.

ثانياً، للحصول على ما يكفي من SNR عبر نطاق الكسر الملزم، يفضل كفاءة FRET المثلى البالغة حوالي 0.5−0.721. وتعتمد الإشارة، أي متوسط التغير مدى الحياة في ظل تغيير معين في نسبة ربط المانحين والمقبولين، على كفاءة القوة الثورية لتيمور الشرقية المستقلة. غير أن هذه العلاقة بين كفاءة فريت ومتوسط التغير مدى الحياة غير خطية. وإذا ما اوشكت كفاءة فريت على تحقيق ذلك، فإن الفلوروفور المانحفي الحالة المقيدة لا يصدر عنه أي فوتون تقريباً. لذلك، ما لم تكن نسبة الربط 100٪ (وهذا ليس هو الحال أبدا لأنه لا ينضج الفلوروفور المقبول إلى 100٪29) متوسط العمر يقترب من عمر الفلوروفور المانح في الدولة المفتوحة، والقدرة على الكشف عن أجهزة الاستشعار في حالة ملزمة يقلل. ويقدر كفاءة فريت لtAKARα أن يكون ~ 0.7، ضمن نطاق مواتية.

ثالثاً، ينبغي أن تقوم أجهزة استشعار FRET-FLIM بالإبلاغ عن الإشارات ذات الحساسية والحركية ذات الصلة بعلم وظائف الأعضاء الحيوانية. يجب اختبار حساسية الاستشعار وحركيته على نطاق واسع في المختبر قبل استخدامه في الجسم الحي، وإذا لزم الأمر، يمكن ضبطها باستخدام مجموعة متنوعة من النهج، مثل ضبط تقارب المجال الملزم بالركيزة والحركية، وتحسين الرابط، ودون الخلوية استهداف جهاز الاستشعار. في العمل السابق، ثبت أن tAKARα يمكن الكشف عن نشاط PKA الناجمة عن إطلاقات الدوبامين الذاتية، وأن حركية وحساسية جهاز الاستشعار تتماشى مع عملية بيولوجية معروفة تعتمد على PKA، والتي هي التي يسببها إفراز تعطيل بطيئة بعد فرط الاستقطاب الحالي17. وعلاوة على ذلك، لا يبدو أن التعبير عن tAKARα يغير وظائف الخلايا العصبية، كما هو مُسَنَسِّم بالفيزيولوجيا الكهربائية17 وقياس اللدونة الهيكلية للعمود الفقري الفردي (ملاحظات غير منشورة).

ترتبط القيود التقنية الحالية للتصوير 2pFLIM بمعالجة البيانات ومعالجة الفوتونات من خلال الإنتاجية. أولا، يتطلب FLIM تخزين أوقات وصول الفوتون لكل بكسل. يحد حجم الذاكرة PTCM من دقة البكسل التي يمكن الحصول عليها. بالنسبة لـ PCTM الموضحة هنا، يمكن تحقيق ما يصل إلى 256 × 256 بكسل لكل إطار صورة مع دقة زمنية من 64 نقطة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن سرعة نقل بيانات صورة FLIM من اللوحة إلى تخزين الكمبيوتر بطيئة نسبيا، مرة أخرى، مما يضع حدودا عملية على القرار وتواتر أخذ العينات. وقد يؤدي التحسين التكنولوجي المستمر لقدرة الذاكرة ومعالجة البيانات إلى حل هذه القيود في المستقبل. ثانياً، تعتبر التدابير الكُتَيَّة للأجهزة التي يُستخدم عادة أنظمة تناظرية إلى رقمية ومحدودة بأوقات إعادة إعادة تعيين الكشف عن الفوتون (أي "الوقت الميت"). وهذا يعني أنه بعد اكتشاف فوتون واحد لن تسجل PTCM وصول أي فوتون لاحق للز (الفوتونات) التالية 100−125 ns18,21. وعلاوة على ذلك، فإن قياس مدى الحياة منحاز نحو الفوتون الأول الذي وصل بعد نبضة الليزر (ما يسمى "كومة المتابعة"). هذه تحد من معدلات عد الفوتون إلى <107 فوتونات لكل s. على الرغم من أن معظم أنظمة التصوير الفوتون اثنين نموذجية هذه ليست مشكلة رئيسية، وينبغي الحرص على عدم تجاوز حدود معدل العد الفوتون. أحدث PTCMs التي لديها وقت أقصر الطريق المسدود أو نظام الحصول على البيانات المستمر gigahertz يمكن أن تخفف من هذا القيد (لهذا الأخير انظر يلين وMongeon18).

أجهزة الاستشعار الفلورية لمسارات الإشارات، مثل CAMP / PKA، AKT / PKB، PKC، وERK، يتم توليدها باستمرار وتحسين16،35. بالنسبة لمعظم أجهزة الاستشعار الحالية، هناك حاجة إلى مزيد من التوصيف والتحسين للتفوق في بيئة التصوير الحية الصعبة. وعلى وجه الخصوص، فإن زيادة سعة الإشارة أمر مهم، حيث أن أي زيادة في سعة الإشارة تقلل من الطلب على ميزانيات الفوتون ذات العلاقة المربعة. بالنسبة لـ tAKARα، تم تحسين السعة استجابة للمغيرات العصبية الذاتية، مثل إفراز، بنسبة 2.7 أضعاف مقارنة مع أفضل جهاز استشعار سابق. وترجم ذلك إلى انخفاض قدره حوالي 7 أضعاف في الفوتونات المطلوبة. في الممارسة العملية، وهذا يقلل إلى حد كبير من عدد السلبيات كاذبة (أي غير المستجيبين) في الحيوانات أثناء السلوك17. الحد الأقصى للإشارة takaRα الملاحظ هو~ 30% (ΔLT/LT 0). وحتى الآن، هذه هي أكبر إشارة FLIM المبلغ عنها لفئات مماثلة من أجهزة الاستشعار فريت. وقد يكون من الممكن أيضاً تحقيق مزيد من التحسن عن طريق تحسين الفلوروفور المقبول وتقارب FHA مع الثرونين الفوسفوري. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام أجهزة الاستشعار التي ترصد جوانب مختلفة من نفس مسار الإشارة قد يوفر نهجا قويا للتحقيق الآلي في تنظيم مسارات الإشارة في الجسم الحي. في المستقبل، فإن التطبيق الناجح لأجهزة الاستشعار FLIM لتصور مسارات الإشارات neuromodulatory في الجسم الحي سوف توفر رؤى هامة فيما يتعلق أين ومتى يتم التشكيل العصبي في الشبكات العصبية سليمة من الفئران تتصرف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر السيدة ج. لاماير، والسيدة روث فرانك، والدكتور مايكل أ. مونياك على التعليقات والتعليقات، والدكتور ريوهي ياسودا في ماكس بلانك فلوريدا على برامج الاستحواذ 2pFLIM. وقد تم دعم هذا العمل من قبل اثنين من جوائز مبادرة الدماغ U01NS094247 (H.Z. و T.M.) و R01NS10444 (H.Z. و T.M.)، ومنحة R01 R01NS081071 (T.M.)، ومنحة R21 R21NS097856 (H.Z.). جميع الجوائز هي من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية، الولايات المتحدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm cellulose acetate syringe filter Nalgene 190-2520 Step 3.2.2.
16x 0.8 NA water-immersion objective Nikon MRP07220 Step 5.5.
3-pin cable US digital CA-MIC3-SH-NC Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope
Aluminum bread board Thorlabs MB1012 Step 2.5.
AnimalTracker MATLAB software N/A N/A Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author
Band-pass barrier filter Chroma ET500-40m Step 1.4.
Cage plate Thorlabs CP01 Step 2.4. Used as mount for rotation sensor
Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter FST 19007-05 Steps 3.2.3. and 4.4.
Circular coverslip (5 mm diameter) VWR 101413-528 Step 4.5.
Custom-made injection needle holder N/A N/A Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author
Dental acrylic Yates Motloid 44114 Steps 4.3. and 4.5.
Dental drill; Microtorque ii Ram products 66699 Steps 3.2.3. and 4.4.
Dowsil transparent polymer The Dow Chemical Company 3-4680 Step 4.5. Artificial dura
Electroporation electrode Bex LF650P5 Step 3.1.4.
Electroporator Bex CUY21 Step 3.1.4.
Fast green FCF Sigma-aldrich F7258-25G Step 3.1.1.
FLIMimage MATLAB software N/A N/A Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida
FLIMview MATLAB software N/A N/A Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author
Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) Gorilla 5201204 Step 2.3.
Headplate N/A N/A Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author
Headplate holder N/A N/A Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket
Hydraulic micromanipulator Narishige MO-10 Step 3.2.4.
Krazy glue Krazy glue KG82648R Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue
Low-noise fast photomultiplier tube Hamamatsu H7422PA-40 or H10769PA-40 Step 1.3.
MATLAB 2012b Mathworks N/A Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software
Motor Zhengke ZGA37RG Step 2.4.
Motor speed controller Elenker EK-G00015A1-1 Step 2.5.
Motorized micromanipulator Sutter MP-285 Step 3.2.4.
Mounting base Thorlabs BA1S Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2
Mounting post Thorlabs P14 Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2
Mounting post base Thorlabs PB2 Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14
Mounting post bracket Thorlabs C1515 Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder
Optical post Thorlabs TR2 Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4
Phosphate-buffered saline Ν/Α Ν/Α Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247
Photodiode Thorlabs FDS010 Step 1.2.
Photon timing counting module Becker and Hickl SPC-150 Step 1.1.
Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) Addgene 119913 Step 3.1.3.
Post holder Thorlabs PH4 Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2
Right-angle bracket Thorlabs AB90 Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder
Rotation encoder US digital MA3-A10-250-N Step 2.4.
Rubber mat Rubber-Cal B01DCR5LUG Step 2.1.
Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) McMaster 6208K433 Steps 2.3. and 2.4.
ScanImage 3.6 Svoboda Lab/Vidrio Technology N/A Steps 5.9. and 6.1.
Signal splitter Becker and Hickl HPM-CON-02 Step 1.3.1.
Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) McMaster 1327K66 Step 2.3.
Stereotaxic alignment systsem David kopf 1900 Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator
Two-photon microscope N/A N/A Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)
Vetbond tissue adhesive 3M 14006 Step 3.2.6.
Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) Addgene 119921 Step 3.2.2.
White PE foam roller (8 inch x 12 inch) Fabrication enterprises INC. 30-2261 Step 2.1.1.
White polystyrene fom ball halves GrahamSweet 200mm diameter 2 hollow halves Step 2.1.1.
Zipkicker PACER PT29 Step 4.3. Hardening accelerator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294, (5544), 1024-1030 (2001).
  2. Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35, (2), 73-89 (2012).
  3. Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety. Neuron. 87, (3), 468-470 (2015).
  4. Berke, J. D. What does dopamine mean? Nature Neuroscience. 21, (6), 787-793 (2018).
  5. Chen, Y., et al. Endogenous Gαq-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A. Neuron. 96, (5), 1070-1083 (2017).
  6. Madison, D. V., Nicoll, R. A. Cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 372, (1), 245-259 (1986).
  7. Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction. Nature Neuroscience. 6, (1), 15-16 (2003).
  8. Pedarzani, P., Storm, J. F. PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons. Neuron. 11, (6), 1023-1035 (1993).
  9. Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection. Current Opinion in Neurobiology. 7, (3), 397-403 (1997).
  10. Radnikow, G., Feldmeyer, D. Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex. Frontiers in Neuroanatomy. 12, (January), (2018).
  11. Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17, (5), 860-867 (2013).
  12. Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. Hitchhiker’s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8, (2), 221-234 (2017).
  13. Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach. Neuron. 86, (1), 140-159 (2015).
  14. Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochemical and Biophysical Research Communications. 348, (2), 716-721 (2006).
  15. Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (26), 14997-15002 (2001).
  16. Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging. Frontiers in Pharmacology. 5, (April), 1-12 (2014).
  17. Ma, L., et al. A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice. Neuron. 99, (4), 665-679 (2018).
  18. Yellen, G., Mongeon, R. Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).
  19. Tang, S., Yasuda, R. Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity. Neuron. 93, (6), 1315-1324 (2017).
  20. Tillo, S. E., et al. Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates. Cell Reports. 19, (3), 617-629 (2017).
  21. Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16, (5), 551-561 (2006).
  22. Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2. Journal of Biological Chemistry. 257, (6), 3284-3290 (1982).
  23. Zhong, H., et al. Subcellular dynamics of type II PKA in neurons. Neuron. 62, (3), 363-374 (2009).
  24. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, (2), 151-158 (2005).
  25. Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).
  26. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).
  27. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).
  28. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4, (8), 1128-1144 (2009).
  29. Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP. Brain Cell Biology. 36, (1-4), 31-42 (2008).
  30. Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of Förster resonance energy transfer. Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).
  31. Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS ONE. 9, (2), (2014).
  32. Yu, K., et al. The central amygdala controls learning in the lateral amygdala. Nature Neuroscience. 20, (12), 1680-1685 (2017).
  33. Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461, (7266), 941-946 (2009).
  34. Yasuda, R. Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, (11), 1121-1128 (2012).
  35. Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nature Cell Biology. 20, (10), 1215-1225 (2018).
تصور البروتين كيناز نشاط في الفئران يتصرف الرأس ثابتة باستخدام في فيفو اثنين من الفوتون الفلورة التصوير مدى الحياة المجهرية
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Jongbloets, B. C., Ma, L., Mao, T., Zhong, H. Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59526, doi:10.3791/59526 (2019).More

Jongbloets, B. C., Ma, L., Mao, T., Zhong, H. Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59526, doi:10.3791/59526 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter