Summary
Ein Verfahren wird vorgestellt, um Proteinkinase-A-Aktivitäten in kopffesten, sich verhaltenden Mäusen zu visualisieren. Ein verbesserter A-Kinase-Aktivitätsreporter, tAKAR, wird in kortikalen Neuronen ausgedrückt und für die Bildgebung durch ein Schädelfenster zugänglich gemacht. Die zweiphotonenfluoreszenzspezifische Bildmikroskopie wird verwendet, um PKA-Aktivitäten in vivo während der erzwungenen Fortbewegung zu visualisieren.
Abstract
Neuromodulation übt starke Kontrolle über die Gehirnfunktion aus. Dysfunktion der neuromodulatorischen Systeme führt zu neurologischen und psychiatrischen Störungen. Trotz ihrer Bedeutung, Technologien für die Verfolgung neuromodulatorischen Ereignisse mit zellulärer Auflösung sind gerade erst beginnen zu entstehen. Neuromodulatoren, wie Dopamin, Noradrenalin, Acetylcholin und Serotonin, lösen intrazelluläre Signalereignisse über ihre jeweiligen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren aus, um neuronale Erregbarkeit, synaptische Kommunikation und andere neuronale Funktionen, wodurch die Informationsverarbeitung im neuronalen Netzwerk reguliert wird. Die oben genannten Neuromodulatoren konvergieren auf den cAMP/Proteinkinase A (PKA) Weg. Daher wurde die in vivo PKA-Bildgebung mit einzelzelliger Auflösung als Auslese für neuromodulatorische Ereignisse in einer Art und Weise entwickelt, die der Kalzium-Bildgebung für neuronale elektrische Aktivitäten entspricht. Hierbei wird eine Methode zur Visualisierung der PKA-Aktivität auf der Ebene einzelner Neuronen im Kortex von kopffixierten Benehmen von Mäusen vorgestellt. Dazu kommt ein verbesserter A-Kinase-Aktivitätsreporter (AKAR), genannt tAKAR, zum Einsatz, der auf der Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET) basiert. Dieser genetisch kodierte PKA-Sensor wird über die Utero-Elektroporation (IUE) von DNA-Plasmiden oder die stereotaxic-Injektion des Adeno-assoziierten Virus (AAV) in den motorischen Kortex eingeführt. FRET-Änderungen werden mit der zweiphotonenfluoreszenz-Lebensdauermikroskopie (2pFLIM) dargestellt, die Vorteile gegenüber ratiometrischen FRET-Messungen zur Quantifizierung des FRET-Signals im lichtstreuenden Hirngewebe bietet. Um PKA-Aktivitäten während der erzwungenen Fortbewegung zu untersuchen, wird tAKAR durch ein chronisches Schädelfenster über dem Kortex von wachen, kopffixierten Mäusen abgebildet, die auf einem geschwindigkeitsgesteuerten motorisierten Laufband laufen oder ruhen. Dieser bildgebende Ansatz wird auf viele andere Hirnregionen anwendbar sein, um entsprechende verhaltensinduzierte PKA-Aktivitäten zu untersuchen, und auf andere FLIM-basierte Sensoren für die In-vivo-Bildgebung.
Introduction
Neuromodulation, auch bekannt als langsame synaptische Übertragung, erzwingt eine starke Kontrolle über die Gehirnfunktion während verschiedener Verhaltenszustände, wie Stress, Erregung, Aufmerksamkeit, und Fortbewegung1,2,3, 4. Trotz seiner Bedeutung steckt die Untersuchung, wann und wo neuromodulatorische Ereignisse stattfinden, noch in den Kinderschuhen. Neuromodulatoren, einschließlich Acetylcholin, Dopamin, Noradrenalin, Serotonin und viele Neuropeptide, aktivieren G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die wiederum intrazelluläre zweite Botenwege mit einem breiten Zeitskala-Spektrum auslösen von Sekunden bis Stunden. Während jeder Neuromodulator eine reihe von Signalereignissen auslöst, ist der cAMP/Proteinkinase A (PKA) Signalweg ein gemeinsamer downstreamer Weg für viele Neuromodulatoren1,5. Der cAMP/PKA-Signalweg reguliert die neuronale Erregbarkeit, synaptische Übertragung und Plastizität6,7,8,9, und stimmt daher die neuronale Netzwerkdynamik an. Da verschiedene Neuronen oder neuronale Typen unterschiedliche Typen oder Ebenen von Neuromodulatorrezeptorrezeptoren10ausdrücken, können die intrazellulären Wirkungen desselben extrazellulären Neuromodulators über verschiedene Neuronen hinweg heterogen sein und müssen daher mit zellulärer Auflösung untersucht. Bis heute, Es bleibt schwierig, neuromodulatorische Ereignisse in einzelnen Neuronen in vivo während des Verhaltens zu überwachen.
Um die raumzeitliche Dynamik der Neuromodulation zu untersuchen, ist eine geeignete Aufzeichnungsmodalität erforderlich. Mikrodialyse und schnell-scanzyklische Voltammetrie werden häufig verwendet, um die Freisetzung von Neuromodulatoren zu untersuchen, aber sie haben keine räumliche Auflösung, um zelluläre Ereignisse zu überwachen11,12. Analog zu Kalzium-Dynamik als Proxy für neuronale elektrische Aktivität in der Population Bildgebung verwendet werden13,PKA-Bildgebung kann verwendet werden, um neuromodulatorische Ereignisse über eine neuronale Bevölkerung bei zellulärer Auflösung auszulesen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung eines verbesserten A-Kinase-Aktivitätsreporters (AKAR), um PKA-Aktivitäten in vivo während des Verhaltens von Tieren zu überwachen. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung neuronaler Populationen mit subzellulärer Auflösung mit einer zeitlichen Auflösung, die physiologische neuromodulatorische Ereignisse nachverfolgt.
AKARs bestehen aus einem Spender und einem Akzeptor fluoreszierenden Proteinen, die durch ein PKA-Phosphorylierungssubstratpeptid und eine Gabelkopf-assoziierte Domäne (FHA) miteinander verbunden sind, die an das phosphorylierte Serin oder Threonin des Substrats14,15bindet. Bei Aktivierung des PKA-Signalwegs wird das Substratpeptid von AKAR phosphoryliert. Dadurch bindet die FHA-Domäne an das phosphorylierte Substratpeptid und bringt so die beiden Fluorophore in die Nähe, die als geschlossener Zustand von AKAR bezeichnet werden. Der geschlossene Zustand eines phosphorylierten AKAR führt zu einer erhöhten Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET) zwischen Spender und Akzeptorfluorophoren. Da der Anteil der phosphorylierten AKARs mit dem Niveau der PKA-Aktivität16zusammenhängt, kann die Menge an FRET in einer biologischen Probe verwendet werden, um das Niveau der PKA-Aktivität16,17,18, 19,20.
Frühe Versionen von AKARs wurden in erster Linie für zweifarbige ratiometrische Bildgebung14entwickelt. Bei der Tieferung der Bildgebung in das Hirngewebe leidet die ratiometrische Methode unter Signalverzerrungen durch wellenlängenabhängige Lichtstreuung17,18,21. Wie unten erläutert, beseitigt die Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) dieses Problem, da FLIM nur Photonen misst, die vom Spenderfluorophor18,21emittiert werden. Daher ist die FLIM-Quantifizierung von FRET nicht von der Gewebetiefe17betroffen. Darüber hinaus kann eine "dunkle" (d.h. niedrige Quantenausbeute [QY]) Variante des Akzeptorfluorophors verwendet werden. Dies befreit einen Farbkanal, um die Multiplexmessung orthogonaler neuronaler Eigenschaften durch gleichzeitige Abbildung eines zweiten Sensors oder eines morphologischen Markers17,19,20zu erleichtern.
FLIM Imaging quantifiziert die Zeit, die ein Fluorophor im angeregten Zustand verbringt, d.h. die Fluoreszenzlebensdauer18. Die Rückkehr eines Fluorophors in den Bodenzustand, also das Ende des aufgeregten Zustandes, koncomitiert oft mit der Emission eines Photons. Obwohl die Emission eines Photons für ein einzelnes angeregtes Molekül stochastisch ist, ist in einer Population die mittlere Fluoreszenzlebensdauer ein Merkmal dieses bestimmten Fluorophors. Wenn eine reine Population von Fluorophoren gleichzeitig angeregt wird, folgt die resultierende Fluoreszenz einem einzigen exponentiellen Zerfall. Die Zeitkonstante dieses exponentiellen Zerfalls entspricht der mittleren Fluoreszenzlebensdauer, die bei fluoreszierenden Proteinen in der Regel zwischen einer und vier Nanosekunden liegt. Die Rückkehr eines angeregten Spenderfluorophors in den Bodenzustand kann auch durch FRET erfolgen. In Gegenwart von FRET wird die Fluoreszenzlebensdauer des Spenderfluorophors reduziert. Die nichtphosphorylierten AKARs weisen eine relativ längere Spenderfluoreszenzlebensdauer auf. Nach der Phosphorylierung durch PKA weist der Sensor eine kürzere Lebensdauer auf, da Spender- und Akzeptorfluorophore nahe beieinander gebracht werden und FRET erhöht wird. Die Quantifizierung der Fluoreszenzlebensdauer in einer Population von AKARs stellt daher das Niveau der PKA-Aktivität dar.
Frühe Versionen von AKARs wurden nicht erfolgreich für die In-vivo-Bildgebung bei einzelliger Auflösung eingesetzt. Dies ist vor allem auf die geringe Signalamplitude der AKAR-Sensoren zu physiologischen Aktivierungen17zurückzuführen. Kürzlich wurde durch den systematischen Vergleich verfügbarer AKAR-Sensoren für die zweiphotonenfluoreszenzspezifische Mikroskopie (2pFLIM) ein Sensor namens FLIM-AKAR gefunden, der alternative Sensoren übertrifft. Darüber hinaus wurde eine Reihe von FLIM-AKAR-Varianten, die als gezielte AKARs (tAKARs) bezeichnet werden, entwickelt, um die PKA-Aktivität an bestimmten subzellulären Standorten zu visualisieren: Mikrotubuli (tAKAR), Cytosol (tAKAR), Actin (tAKAR), fadenförmiges Actin (tAKAR), Membran (tAKAR), postsynaptische Dichte (tAKAR). Bei den tAKARs erhöhte tAKAR die Signalamplitude, die durch Noradrenalin ausgelöst wurde, um das 2,7-fache. Dies steht im Einklang mit dem Wissen, dass die Mehrheit der PKA in Neuronen in Mikrotubuli im Ruhezustand verankert sind22,23. tAKAR war der beste Performer unter den bestehenden AKARs für 2pFLIM. Darüber hinaus erkannte tAKAR-Funktion physiologisch relevante PKA-Aktivität, die von mehreren Neuromodulatoren ausgelöst wurde, und die Expression von tAKAR-Funktion verändert enden keine neuronalen Funktionen17.
Kürzlich wurde tAKAR- erfolgreich eingesetzt, um PKA-Aktivitäten bei kopffixierten Benahmemäusen17zu visualisieren. Es wurde gezeigt, dass erzwungene Fortbewegung DIE PKA-Aktivität im Soma der oberflächlichen Schichtneuronen (Schicht 1 bis 3, bis zu einer Tiefe von 300 m von Pia) im Motor, Fass und visuellen Kortiken auslöste. Die durch Fortbewegung ausgelöste PKA-Aktivität war zum Teil von der Signalisierung über adrenerge Rezeptoren und D1-Dopamin-Rezeptoren abhängig, wurde aber nicht von einem D2-Dopamin-Rezeptor-Antagonisten beeinflusst. Diese Arbeit veranschaulicht die Fähigkeit von tAKARs, Neuromodulationsereignisse in vivo mit 2pFLIM zu verfolgen.
Im aktuellen Protokoll wird die gesamte Methode zur PKA-Aktivitätsbildgebung bei kopffesten Wachmäusen während eines erzwungenen Fortbewegungsparadigmas in sechs Schritten beschrieben. Erstens, die Hinzufügung von 2pFLIM-Fähigkeiten zu einem herkömmlichen Zwei-Photon-Mikroskop (Abbildung 1). Zweitens der Bau eines motorisierten Laufbandes (Abbildung 2). Drittens, die Expression des tAKAR-Sensors im Mauskortex durch Utero-Elektroporation (IUE) von DNA-Plasmiden oder stereotaxic-Injektion des Adeno-assoziierten Virus (AAV). Ausgezeichnete Protokolle für Operationen für IUE24,25 und stereotaxic Injektion von Viruspartikeln26 wurden bereits veröffentlicht. Die wichtigsten Parameter, die wir verwendet haben, werden unten beschrieben. Forth, die Installation eines Schädelfensters. Ausgezeichnete Protokolle wurden bereits für die Schädelfensterchirurgie veröffentlicht27,28. Es werden mehrere Schritte beschrieben, die aus den Standardprotokollen geändert wurden. Fünftens, Durchführung in vivo 2pFLIM. Sechstens, die Analysen von 2pFLIM-Bildern (Abbildung 3 und Abbildung 4). Dieser Ansatz sollte leicht auf viele andere kopffixierte Verhaltensparadigmen und Gehirnbereiche anwendbar sein.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Oregon Health and Science University genehmigt.
1. 2pFLIM Mikroskop-Setup
- Installieren Sie ein Photonen-Timing-Zählmodul (PTCM, Materialtabelle) und verbinden Sie sich gemäß herstellerhandbuch mit dem Computer (Abbildung 1).
HINWEIS: Das PTCM ist in der Regel eine Computerplatine, die einen "Sync"-Eingang für das Laserpuls-Timing und einen Photoneneingang aus dem Photomultiplier-Rohr (PMT) erhält. Es empfängt auch Takt-Timing für Pixel, Linien und Frames, von Zwei-Photon-Imaging-Steuerungssoftware. Der PTCM verwendet die Taktsignale, um einzelne Photonen in verschiedene Pixel und Frames zu unterteilen. - Fügen Sie eine Photodiode mit >200 MHz Bandbreite hinzu, um das Laser-Timing zu messen. Legen Sie einen Standard-Glasdeckel in den Lichtpfad, um einen kleinen Bruchteil des Laserlichts in die Photodiode zu reflektieren, die senkrecht zum Lichtpfad platziert ist (Abbildung 1). Schließen Sie den Photodiodenausgang an den "Sync"-Eingang des PTCM an.
HINWEIS: Viele moderne Laser geben auch das Laser-Timing aus. Für diese Laser ist die Photodiode nicht notwendig, und man kann den Laser-Timing-Ausgang direkt an den Sync-Eingang des PTCM anschließen. -
Tauschen Sie das PMT, im Falle des tAKAR, des grünen Kanals PMT, mit einem geräuscharmen, schnellen GaAsP PMT (Abbildung 1) aus. Schließen Sie den PMT-Ausgang an den Signaleingang des PTCM an.
- Fügen Sie einen optionalen Signalsplitter hinzu (Abbildung 1), wenn eine gleichzeitige Erfassung der Intensität über den herkömmlichen Zwei-Photon-Bildkanal gewünscht wird. Schließen Sie den PMT-Ausgang an den Signalteiler an und verbinden Sie den Splitterausgang mit dem PTCM und dem herkömmlichen Zwei-Photon-Bildgebungsmodul.
HINWEIS: GaAsP-PMTs geben schnellere Single-Photon-Signale als herkömmliche Bialkali-PMTs und ermöglichen eine genauere Bestimmung des Photonen-Timings. Bestimmte Modelle von GaAsP PMTs können auf 10 bis 35 °C unter der Umgebungstemperatur gekühlt werden, so dass die Unterdrückung von Dunkelzahlen auf ein Niveau unter einigen hundert pro Sekunde (in der Regel 200 Zählungen/s) möglich ist. Dieser niedrige Geräuschpegel ist wichtig für die präzise Messung der Fluoreszenzlebensdauer, da die Anzahl der Rauschenphotonen nicht einfach von der Fluoreszenzlebensdauerkurve unterschieden oder subtrahiert werden kann.
- Fügen Sie einen optionalen Signalsplitter hinzu (Abbildung 1), wenn eine gleichzeitige Erfassung der Intensität über den herkömmlichen Zwei-Photon-Bildkanal gewünscht wird. Schließen Sie den PMT-Ausgang an den Signalteiler an und verbinden Sie den Splitterausgang mit dem PTCM und dem herkömmlichen Zwei-Photon-Bildgebungsmodul.
- Fügen Sie einen Bandpass-Fluoreszenz-Emissionsfilter hinzu, der die Spektralkontamination, falls vorhanden, durch das Akzeptorfluorophor minimiert. Zum Beispiel wird für tAKAR- ein 500 nm x 20 nm Barrierefilter für den grünen Kanal verwendet, um die Kontamination durch den Akzeptor sREACh zu reduzieren, das ein dunkles (QY 0,07) gelbes fluoreszierendes Protein (YFP)29,30ist. Verbinden Sie Timing-Signale, wie z. B. die Uhren für einzelne Bildpixel, Linien und Frames, entsprechend der Steuerungssoftware, die im PTCM-Benutzerhandbuch beschrieben ist. Installieren Sie die entsprechende Datensteuerungs- und Erfassungssoftware.
HINWEIS: Einige PTCM-Hersteller (Tabelle der Materialien) bieten ihre Software für 2pFLIM Bildgebung. Hier kommt eine benutzerdefinierte Software namens FLIMimage zum Einsatz, die vom Yasuda Lab (Max-Planck-Florida, über persönliche Kommunikation) entwickelt wurde. Diese Software fungiert als Add-on-Benutzerfunktion zu bestimmten Zwei-Photonen-Erfassungssoftware (Tabelle der Materialien). Es steuert und kommuniziert mit dem PTCM zu dem geeigneten Zeitpunkt während der Zwei-Photon-Bildgebung, um 2pFLIM-Bilder zu erfassen.
2. Bau eines motorisierten Laufbandes
HINWEIS: Das Design des kundenspezifischen motorisierten Laufbandes ist in Abbildung 2dargestellt.
- Mit einer feinen Hacksäge eine Schaumstoffwalze (ca. 200 mm) auf 150 mm Länge schneiden. Alternativ können Sie die beiden Hälften einer Schaumkugel zusammenkleben und Klebeband über die Naht legen. Optional kleben Sie eine Gummimatte mit Profil auf der Rolle, um die Traktion auf der Walze zu erhöhen.
- Bohren Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 1,4 Zoll durch die Mitte der Walze an der flachen Seite der Walze oder bohren Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 1,4 Zoll durch die Mitte jeder Kugelhälfte, wenn die Schaumkugel verwendet wird.
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Installieren Sie eine Stahlachse mit einem Durchmesser von 1/4 Zoll durch das Loch. Kleben Sie die Schaumstoffwalze/Kugel mit schaumkompatiblem Kleber an die Achse. Optional können Sie zwei flexible Wellenkupplungen (1/4 Zoll Innendurchmesser) modifizieren, um die Kopplung der Achse an die Schaumwalze/Kugel zu verstärken.
HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass viele gängige Klebstoffe Schaum auflösen können.- Positionieren Sie die Wellenkupplung für jede Wellenkupplung auf ihrer flachen Seite und in der Mitte der Rechteck-Metallplatte (0,7 mm x 15 mm x 76 mm). Schweißen Sie die Platte an die Wellenkupplung. Bohren Sie ein 1/4 Zoll Loch in der Mitte der Platte, um den Einbau der modifizierten Wellenkupplung auf die Achse und zwei Schraublöcher in die Metallplatte seitlich von der Mitte zu ermöglichen.
- Installieren Sie die Wellenkupplung auf der Achse gegen die Schaumstoffwalze/Kugel. Wenn Sie letztere verwenden, biegen Sie die Platte leicht, um die Krümmung des Balles zu passen. Legen Sie Schrauben in die seitlichen Löcher, um die Rolle/Kugel an der Achse zu befestigen.
- Bohren und tippen Sie auf ein 3/8-32 Gewinde in der Mitte einer Käfigplatte und installieren Sie den Drehgeber. Bohren Sie ein Schraubloch in die Basis der rechtwinkligen Motorhalterung, um die Befestigung des Motors am Pfostenhalter zu ermöglichen. Befestigen Sie sowohl den Drehgeber als auch den Motor mit einer flexiblen Wellenkupplung am Ende der Achse.
- Installieren Sie das montierte Laufband auf einer Aluminium-Brotplatine mit Pfosten für motorisch und Drehgeber (Abbildung 2). Schließen Sie die Motoreingänge an den Drehzahlregler und den Drehgeberausgang an einen analogen Eingang der Datenerfassungsplatine (DATA Acquisition).
HINWEIS: Die Drehwinkelgeschwindigkeit wird vom Drehgeber als Spannung kodiert und mit einer benutzerdefinierten Software namens AnimalTracker in MATLAB digitalisiert. - Installieren Sie den Kopfplatten-kompatiblen Halter an einer rechtwinkligen Halterung. Installieren Sie einen massiven Pfosten auf der Brotplatte vor dem Laufband und installieren Sie den montierten Kopfplattenhalter mit der rechtwinkligen Halterung am Pfosten (Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass die Kopfplattenhalter an der Achse so ausgerichtet sind, dass die Maus eine angemessene und bequeme Gehposition auf dem Laufband einnehmen kann (Abbildung 2C).
3. Ausdruck des tAKAR-Sensors im Maus-Cortex
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In der Utero-Elektroporation
- Bereiten Sie eine DNA-Lösung für IUE vor, indem Sie einer Plasmid-DNA (3,4 g/l) eine Endkonzentration von 0,2 % des schnellen grünen Farbstoffs (zur Visualisierung während der Injektion) hinzufügen; der Sensor konstruktiert, die einen CAG-Promotor, eine Sensorsequenz und ein Holzhacken-Hepatitis-Virus enthält. post-transkriptionsresponse element [WPRE] translational enhancer) gelöst/verdünnt in Wasser oder Tris-EDTA.
- Bereiten Sie eine schwangere weibliche Maus (z. B. C57BL/6) für IUE bei E1624vor. Anästhesisieren Sie die Maus mit Isofluran (4% für Dieduktion und 1,5%für die Wartung, auf 95% O2 mit 5% CO2 ) und subkutane Injektion von perioperativen Analgetika mit 5 mg/kg Meloxicam und 4 mg/kg Bupivacaine anwenden. Die Bauchhöhle mit einem Skalpell und einer Schere aufschneiden und die Uterushörner vorsichtig aussetzen.
- Injizieren Sie 1 L DNA-Lösung pro Embryo in den lateralen Ventrikel einer Hemisphäre, wie zuvor beschrieben24.
- Führen Sie regelmäßige IUE24 für kortikale Neuronen durch, indem Sie den positiven Elektrodenendfuß am Kortex platzieren und fünf 100-ms-Quadratimpulse (38 V) bei 1 Hz mit einem Elektroporator verwenden.
HINWEIS: Verschiedene kortikale Bereiche können für die Elektroporation gezielt werden, indem die Platzierung des Elektrodenendfußes relativ zum seitlichen Ventrikel geändert wird.
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Stereotaxic-Injektion
- Bereiten Sie eine Maus am postnatalen Tag 30 für stereotaxic Chirurgie26. Anästhesisieren Sie die Maus wie in Schritt 3.1.2 beschrieben, und wenden Sie subkutane Injektion von perioperativen Analgetika mit 5 mg/kg Carprofen an.
- Verdünnung des AAV-Serotyps 2/1 (AAV2/1) mit dem Ausdruck von hSyn-tAKAR-WPRE zu einem empirisch ermittelten Titer (1 x 109x 1010 Genome/L) in spritzgefilterter (0,2 m Celluloseacetatmembran) Phosphat-gepufferter Saline.
- Bohren Sie ein Loch mit einem Handbohrer unter einem Stereomikroskop mit folgenden Koordinaten für den Motorkortex: 0,5 mm vordem zum Bregma, 1,2 mm seitlich bis mittelseitig.
- Montieren Sie einen Injektor (z. B. ölhydraulischer Manipulator, mit maßgeschneidertem Kolben-Glas-Pipette-Halter) an einem motorisierten Manipulator. Legen Sie die Injektionsnadel in einem 15°-Winkel relativ zur Bregma-Lambda-Ebene. Programmieren Sie eine diagonale Bewegung über die x- und z-Achsen, die einer Progression von 700 m bzw. 200 m entlang der vorderen-posterioren bzw. dorsal-ventralen Achsen entspricht.
HINWEIS: Um Schäden am Gewebe direkt über dem vorgesehenen Bildfeld zu vermeiden, werden AAV-Partikel in einem Winkel relativ zur Bregma-Lambda-Ebene injiziert. - Positionieren Sie die Spitze der Injektionsnadel an der Pia in der Mitte des Bohrlochs, und führen Sie langsam die oben beschriebene Diagonalbewegung (ca. 25 m/s) aus. Bei diesem Verfahren wird der Injektionsmittelpunkt bei 1,2 mm vor dem Bregma, 1,2 mm seitlich bis mittelseitig, 0,2 mm unterhalb der Pia positioniert.
- Injizieren Sie 20 nL verdünnte Viruspartikel (ca. 10 nL/min). Warten Sie mindestens 10 min und ziehen Sie die Injektionsnadel langsam ein (ca. 12,5 m/s).
- Beenden Sie das stereotaxic Injektionsverfahren und kleben /nähen Sie die Haut26.
4. Installation des Cranial-Fensters
- Führen Sie die Platzierung des Schädelfensters an Mäusen durch, die tAKAR über IUE (Abschnitt 3.1) oder stereotaxic Injektion von Viruspartikeln (Abschnitt 3.2) zwischen den postnatalen Tagen 30 und 60 exezieren. Für Maus mit Viralpartikeln infiziert, implementieren Sie das Schädelfenster mindestens zwei Wochen nach der Virusinjektion. Installieren Sie das Schädelfenster wie zuvorbeschrieben 27,28, mit den folgenden Details. Anästhesisieren Sie die Maus wie in Schritt 3.1.2. beschrieben, und wenden Sie subkutane Injektion von perioperativen Analgetika 0,075 mg/kg Buprenex und entzündungshemmendem Mittel Dexamethason bei 4 mg/kg an.
- Entfernen Sie das Periosteum und ziehen Sie den Nackenmuskel zurück. Kleben Sie den Rand der Haut mit Gewebekleber an den Schädel, um eine Exposition der Halsmuskulatur nach der Operation zu vermeiden.
- Trocknen und entfernen Sie jedes Periost aus dem Schädel, indem Sie sanft mit einem Skalpell kratzen. Platzieren Sie die bildgebende Kopfplatte (8 mm Innendurchmesser), um das vorgesehene Bildgebungsfeld zu umgeben. Kleben Sie die Kopfplatte mit Cyanoacrylat-Kleber an den Schädel, gefolgt von zahnärztlichem Acrylzement. Für eine optimale Haftung sorgen Sie dafür, dass die Kopfplatte auf dem freiliegenden und getrockneten Schädel ruht. Kleberbeschleuniger kann verwendet werden, um die Härtung zu beschleunigen.
- Zeichnen Sie mit einem Zahnbohrer einen Kreis mit einem Durchmesser von 5 mm über dem vorgesehenen Bildfeld (Koordinaten gemäß Schritt 3.2.3) und setzen Sie die Dura mater aus.
- Tragen Sie eine dünne Schicht aus transparentem Polymer, auch künstliche Dura genannt, auf die Dura-Oberfläche auf, um das gesamte Schädelfenster zu bedecken. Das Polymer schützt und stabilisiert die Dura mater. Legen Sie einen sterilen kreisförmigen Abdeckslip (5 mm Durchmesser) auf die Dura mater. Sichern Sie den Deckelrutsch mit Cyanoacrylatkleber, der um die Ränder des Fensters aufgetragen wird, gefolgt von Zahnacrylzement.
5. In Vivo Zweiphotonen Fluoreszenz Lifetime Imaging Mikroskopie
- Beginnen Sie 2pFLIM Bildgebung bei oder darüber hinaus 2 Wochen nach der Installation des Schädelfensters (Abschnitt 4). Minimieren Sie experimentelle Interferenzen durch Stress durch häufige Handhabung und Scruffing der Maus vor Dem Beginn der Bildgebungsstudie, um die Maus zu gewöhnen.
- Stellen Sie die Wellenlänge des zweiphotonen Anregungslasers auf 960 nm mit der Software ein, die den Zwei-Photonen-Laser steuert.
- Anästhesisieren Sie die Maus mit 4% Isofluran. Bestätigen Sie die richtige Anästhesisierung durch Schwanz-Pinch und beobachten Atemfrequenzen. Das heißt, es sollte keine Reaktion auf die Schwanz-Pinch geben und die Atemfrequenz sollte auf 1 Atempro Sekunde reduziert werden. Um unnötige Verfahrenszeit zu minimieren und da die Anästhesie nur zwei bis drei Minuten dauert, werden keine Augenschmierstoffe verwendet.
- Übertragen Sie die anästhesierte Maus auf das motorisierte Laufband (Abbildung 2C) und montieren Sie die Kopfplatte der Maus am Kopfplattenhalter des Laufbandaufbaus (Details siehe Abbildung 2). Reinigen Sie die Oberfläche des Schädelfensterdeckels an der Maus mit 70% Ethanol.
- Platzieren Sie das motorisierte Laufband mit der montierten Maus unter das 2pFLIM-Objektiv. Tragen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser zwischen dem Schädelfenster-Abdeckungsrutsch und dem Objektiv auf.
- Lassen Sie die montierte Maus aus der Anästhesie aufwachen und sich für mindestens 10 min an das Laufband und die Mikroskopumgebung akklimatisieren. Überwachen Sie die Beatmungsrate der Maus, während die montierte Maus aus der Anästhesie erwacht.
- Navigieren Sie unter Epi-Beleuchtung zur Injektionsposition. Dokumentieren Sie die handelsrechtlichen Merkmale (d. h. blutgefäße) unter hellem Feld, um die Bildgebung derselben Region von Interesse (ROI) während nachfolgender Bildgebungssitzungen zu unterstützen.
- Beseitigen Sie jedes eintreffende Licht außer dem emittierten Licht aus dem Gehirngewebe. Schalten Sie die Epi-Beleuchtungslichtquelle aus und schließen Sie das Gehäuse des 2pFLIM-Rigs. Aktivieren Sie den 2pFLIM PMT, indem Sie die Hardware-Befehlsspannungssteuerung einschalten.
- Erwerben Sie ein z-stack 2pFLIM-Bild mit der 2pFLIM Erfassungssoftware FLIMimage mit den folgenden empfohlenen Einstellungen für die Abbildung von tAKAR-positivem Somata bei wachen Mäusen. Legen Sie die Bildmittelung auf 3 Frames, die Scangeschwindigkeit auf 2 ms/Linie, die Bildgröße auf 128 x 128 Pixel und das Sichtfeld auf 90 bis 100 m fest. Passen Sie die Bildeinstellungen basierend auf der Vorbereitung s- und Hardwarekonfiguration an.
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Prüfen Sie das aufgenommene Bild in FLIMview (inhouse entwickelte benutzerdefinierte Software; siehe Abschnitt 6). Passen Sie die Bildeinstellungen nach Schritt 5.9 an, um die Photonenanzahl zu optimieren und photobleaching zu minimieren.
HINWEIS: Eine praktikabelintegrierte Photonenanzahl in einem ROI für die lebensdauer Bildgebung eines tAKAR-positiven Soma in vivo beträgt 1.000 bis 10.000 Photonen, abhängig von der Signalamplitude, die sich aus einem bestimmten Stimulus ergibt (siehe Diskussion).- Verwenden Sie bei Bedarf ein verringertes Sichtfeld, eine verringerte Scangeschwindigkeit, eine erhöhte Laserleistung und eine erhöhte Anzahl von Frames, die gemittelt werden sollen, um die anzahl der integrierten Photonen zu erhöhen und den Schätzfehler für die Lebensdauer zu reduzieren. Achten Sie gleichzeitig darauf, die minimale wichtige Laserleistung, Frame-Mittelung und Scangeschwindigkeit zu verwenden, um photobleaching zu minimieren.
- Bild in einem regelmäßigen Zeitintervall (z.B. alle 30 bis 60 s) durch Wiederholung der Z-Stack-Erfassung unter Verwendung der in Schritt 5.10 ermittelten Einstellungen. Erfassen Sie Baseline 2pFLIM-Bilder für mindestens 15 min bei Null Laufbandgeschwindigkeit.
- Stellen Sie die Drehgeschwindigkeit des Laufbandes für 15 min auf 15 cm/s, während Sie 2pFLIM-Bilder erfassen. Setzen Sie die Bildgebung für 20 min nach dem Abschalten der Laufbandrotation fort, um die Dauer der PKA-Aktivität nach Beendigung der erzwungenen Fortbewegung zu bewerten.
6. Analyse von 2pFLIM Bildern
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Öffnen Sie die erfassten Bilder in FLIMview, und legen Sie die folgenden Parameter in der FLIMview fest.
HINWEIS: Parameterdetails werden in DISCUSSION beschrieben.- Klicken Sie in FLIMview auf die Minimal- und Maximalbereichsfelder (Single Photon Counting, SPC). Geben Sie den entsprechenden minimalen und maximalen SPC-Bereichswert ein, der in der Regel zwischen 1,2 und 10 bis 12 ns liegt.
- Klicken Sie in FLIMview auf das T 0-Wertfeld und geben Sie den t 0-Wert ein (in der Regel 2 ns). Klicken Sie in FLIMview auf das Feld für den Mindestschwellenwert für die Lebensdauer der Luminanz in FLIMview, und geben Sie den gewünschten Schwellenwert auf 5 bis 30 Photonen ein.
- Klicken Sie auf die neue Gruppenschaltfläche (N) und weisen Sie einen Versuchsgruppennamen zu. Dadurch wird eine Gruppe generiert, die Daten aus jedem hinzugefügten FLIM-Image kombiniert.
- Klicken Sie auf die ROI-Schaltfläche im Roi Controls-Modul von FLIMview und zeichnen Sie einen ROI um ein tAKAR-positives Soma. Reduzieren Sie den Z-Stack-Bereich, indem Sie die untere und obere Z-Grenze in den Z-Stack Control-Schiebereglern in FLIMview verschieben, um die Signalkontamination durch Hintergrundphotonen in anderen z-Tiefen zu minimieren.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche +, um das FLIM-Bild zur Gruppe hinzuzufügen (Schritt 6.2). Klicken Sie auf die Schaltfläche Calc, um die mittlere Lebensdauer (LT, auch als mittlere Photonenemissionszeit [MPET] bezeichnet) für den ROI und den Lebensdauerschätzungsfehler zu berechnen.
- Öffnen Sie die nächste Datei in der chronischen 2pFLIM Bildgebungsserie. Wiederholen Sie Schritt 6.4. Achten Sie darauf, die Position des ROI- und Z-Stack-Bereichs anzupassen, um das gleiche tAKAR-positive Soma im Laufe der Zeit zu messen, da es im Laufe der Zeit zu Gewebedriften führen kann.
- Wählen Sie deltaMPET/MPET0 im Dropdown-Menü des Moduls Gruppensteuerungen aus. Klicken Sie auf das Basisfeld und geben Sie den Index(es) ein (z. B. 1 2 3 4 5 für die ersten fünf Bilder in der in Schritt 6.3 erstellten Gruppe). Dadurch werden die Bilder definiert, die zur Berechnung der Basislebensdauer verwendet werden (LT0).
- Klicken Sie auf Plotten, um ein Diagramm zu generieren, das während des Experiments in den definierten ROIs die FLIM-Antwort (LT/LT0) von tAKAR enthält. Normalisierte Veränderungen der Lebensdauer einzelner ROIs durch die entsprechende Basislebensdauer (LT0) ermöglichen den Vergleich der PKA-Aktivität während der Fortbewegung über verschiedene ROIs hinweg.
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Representative Results
FRET-FLIM-Sensoren ermöglichen die Visualisierung vieler verschiedener Signalwege, einschließlich des cAMP/PKA-Signalwegs, der an der Neuromodulation beteiligt ist. Das aktuelle Protokoll nutzt den kürzlich entwickelten tAKAR-Sensor in Kombination mit 2pFLIM, um PKA-Aktivitäten bei kopffesten Benahmemäusen zu visualisieren. Die meisten vorhandenen Zwei-Photonen-Mikroskope können mit 2pFLIM-Fähigkeiten aufgerüstet werden, indem drei zu vier Komponenten hinzugefügt werden, wie in Abbildung 1 dargestellt (siehe auch Abschnitt 1). Um FRET in 2pFLIM-aufgenommenen Bildern zu visualisieren, wurde die Quantifizierung der mittleren Lebensdauer auf Histogramm-Plots des Photonen-Timings durchgeführt, die pro Pixel gesammelt wurden (Abbildung 3A,B). Die mittlere Lebensdauer wurde mit einem pseudofarbenen Bild visualisiert, in dem hohe (kalte Farbe) und niedrige (warme Farbe) mittlere Lebensdauer niedrige bzw. hohe PKA-Aktivitäten darstellen, da die PKA-Aktivierung zur Verringerung der Lebensdauer führt. Es ist darauf zu achten, dass der SPC-Bereich richtig eingestellt wird. dieser Bereich sollte innerhalb des Laserpulsintervalls (z. B. 12,5 ns einer Pulsrate von 80 MHz) mit minimierten Hardware-Kantenartefakten eingestellt werden (siehe auch Abschnitt 6 und DISKUSSION). Die Berechnung der PKA-Aktivität innerhalb von ROIs wurde durchgeführt, indem der LT aller Pixel innerhalb eines bestimmten ROI kombiniert wurde (Abbildung 3C,D). Bei kopffesten wachen Mäusen lag die Basallebensdauer zwischen 1,3 und 1,8 ns (Abbildung 3E). Die Bildgebung von tAKAR im motorischen Kortex bei kopffesten wachen Mäusen ermöglichte die Echtzeitquantifizierung der PKA-Aktivität mit zellulärer Auflösung während der basalen und erzwungenen Fortbewegung (Abbildung 4). Das Experiment kann über Tage und Monate wiederholt werden. Erzwungene Fortbewegung löst PKA-Aktivität in einer Population von Neuronen innerhalb der oberflächlichen Schichten des Mausmotorkortex17aus. Diese PKA-Aktivität ist abhängig von der Neuromodulation durch Aktivierung von A-Adrenergen- und D1-Rezeptoren17.
Abbildung 1: Schemat eines 2pFLIM-Systems. 2pFLIM kann auf einem herkömmlichen Zwei-Photonen-Mikroskop durch die Zugabe der gelb hervorgehobenen Hardwarekomponenten implementiert werden: ein Photon Timing-Zählmodul, ein geräuscharmes schnelles Photomultiplierrohr (PMT), eine Photodiode (nur erforderlich, wenn der Laser keine Ausgangssignal für Laser-Timing) und einen optionalen Signalteiler. Diese Zahl wurde von Ma et al.17geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Design eines kundenspezifischen motorisierten Laufbandes. (A) Schematic des Laufbanddesigns von vorne (oben links), Seite (oben rechts) und oberen Ansichten (unten links). Die Laufbandachse (Schaumkugel) ist mit einem Drehgeber und einem Motor verbunden, die gemeinsam an zwei Pfosten auf einer massiven Aluminium-Brotplatte montiert sind. Der kopfplattenkompatible Halter an der rechtwinkligen Halterung ist an einem festen Pfosten befestigt und über dem Laufband positioniert. Schematische Zeichnungen dürfen nicht skaliert werden. Vorne (B) und Seite (C) Fotos des Laufbandes anzeigen. Die richtige Positionierung der Maus auf dem Laufband ist im Panel Cdargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Quantifizierung von 2pFLIM-Daten. (A) Ein FLIM-Bild mit jedem Pixel pseudofarben, um die mittlere Lebensdauer (LT) relativ zum Laser-Timing aller Photonen in diesem Pixel darzustellen. (B) Die Photonenankunftszeiten innerhalb eines einzelnen Pixels (lila Quadrat in Panel A) wurden in einem Histogramm (linkes Panel) dargestellt. Integrationsgrenzen wurden festgelegt, um den einzelnen Photonenzählbereich (SPC, grau) zu bestimmen. Innerhalb des SPC-Bereichs wurde das Integral des Photonen-Timings durch die Gesamtzahl der Photonen dividiert und dann durch die t0 (1,65 ns, gestrichelte Linie) subtrahiert, was zu einer mittleren Lebensdauer (LT, Abstand zwischen gestrichelten und gepunkteten Linien) von 1,74 ns führte. Die Quantifizierung der mittleren Lebensdauer des gesamten Sichtfeldes (hellblaues Quadrat in Panel A) beinhaltete die Integration des Photonen-Timings, das in allen Pixeln (rechtes Panel) gesammelt wurde, was zu einer durchschnittlichen Lebensdauer von 1,7 ns führte. Einmengen zeigen dieselben Daten im Halbprotokollmaßstab an. (C und D) Quantifizierung der mittleren Lebensdauer pro Interessenregion (ROI). (C) Repräsentatives Beispiel für ein 2pFLIM-Bild. Zwei ROIs wurden um zwei Somata in Schicht 2/3 des Motorkortex gezeichnet. (D) Photonen-Timing-Verteilungen, die über alle Pixel innerhalb jedes ROI (linkes Panel) integriert sind. Zell-ROIs waren farbkodiert (wie in Panel Cgezeigt) rot, Zelle 1; blau, Zelle 2. Normalisierte Photonenzahlen ermöglichen den Vergleich der Photonen-Timing-Verteilungen zwischen den beiden ROIs (rechtes Panel, mittlere Lebensdauer; Zelle 1, 1,33 ns; Zelle 2, 1,73 ns). Einmengen zeigen dieselben Daten im Halbprotokollmaßstab an. (E) Verteilungsdiagramm der mittleren Basallebensdauer n.Ä. von 254 abgebildeten Zellen in den oberflächlichen Schichten des Motorkortex. L1-Zellen (n = 186 Zellen/11 Tiere, linkes Panel), die sich innerhalb von 100 m unter Pia befinden, nach einer stereotaxic-Injektion von AAV2/1-hSyn-tAKAR-WPRE und L2/3 Pyramidenzellen (n = 68 Zellen/4 Tiere, rechtes Panel), die sich mindestens 150 m unterhalb der Pia befinden, tAKAR-nach IUE eines CAG-tAKAR-WPRE-DNA-Konstrukts exprimiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: tAKAR- verfolgt erzwungene, durch Fortbewegung induzierte PKA-Aktivitäten im Motorkortex. (A) Repräsentative Intensität (linkes Panel) und Lebensdauer (mittlere und rechte Panels) Bilder von drei L1-Zellen im Motorkortex. Zell-ROIs waren farbkodiert: orange, Zelle 1; blau, Zelle 2; gelb, Zelle 3. (B) Photonen-Timing-Verteilungen, gemessen in Zelle 1 (obere Platte) während der Basalbedingung (orange Spur, gemessen im mittleren Schaltfeld ) und erzwungene Fortbewegung (Loco., hellorange Spur, gemessen in der rechten Tafel A). Normalisierte Photonenzahlen für den direkten Vergleich der Photonen-Timing-Verteilung (unteres Panel, mittlere Lebensdauer: basal, 1,72 ns; Fortbewegung, 1,42 ns). Einmengen zeigen dieselben Daten im Halbprotokollmaßstab an. (C) -Lebensdauer/Lebensdauer0 (LT/LT0) Spuren der entsprechenden Zellen (oberes Panel, siehe Panel A) mit erzwungener Fortbewegungsgeschwindigkeit (unteres Panel). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung des FRET-FLIM-Sensors tAKAR, um neuromodulationsgesteuerte PKA-Aktivität bei kopffixierten Verhaltensmäusen zu visualisieren. Diese Anwendung basiert auf umfangreichen Tests und Charakterisierungen von tAKAR in vitro und in vivo, um zu zeigen, dass das erhaltene FLIM-Signal für physiologische neuromodulatorische Ereignisse relevant ist17. Hier wird eine In-vivo-Anwendung, die bewegungsinduzierte PKA-Aktivität im motorischen Kortex, verwendet, um die Verfahren zur Bereitstellung des Sensors an das Gehirn, tierchirurgische Bildgebungs-, Hardware- und Softwareanforderungen für verhaltens- und bildgebende Datenerfassung zu beschreiben. und Software und Algorithmen für bildgebende Datenanalysen.
Der tAKAR-Sensor wird durch IUE von DNA-Plasmiden oder stereotaxic-Injektion von AAV-Partikeln in den Kortex eingeführt. Abhängig von den Elektroporationsparametern und DNA-Konzentrationen führt IUE zu einer unterschiedlichen Beschriftungsdichte kortikaler Neuronen über eine relativ große Fläche im Kortex25. Die mit IUE gekennzeichnete kortikale Schicht wird durch das embryonale Stadium bestimmt, wenn die Operation durchgeführt wird. Stereotaxic Injektion von AAV-Partikel numes wird verwendet, wenn es gewünscht wird, viele Zellen innerhalb einer definierten Hirnsubregion abzubilden. Es führt in der Regel zu dicht beschrifteten Neuronen im Injektionszentrum und zunehmend spärliche Etikettierung weiter vom Zentrum entfernt. Wichtig ist, infektionseffizienz der Zellen im Gehirn ist abhängig von der AAV-Serotyp verwendet. AAV2/1 bietet eine hohe Effizienz bei kortikalen, thalamischen und striatalen Neuronen mit relativ niedrigen retrograden Etikettierungsaktivitäten. Es wird empfohlen, empirisch festzustellen, welcher AAV-Serotyp für die Zielhirnregion und den Zelltyp am effizientesten ist. Beide Transfektionsmethoden haben erfolgreich tAKAR ausgedrückt. Der "süße Fleck" für die Ausdrucksstufe ist empirisch bestimmt.
Erzwungene Fortbewegung führt zu erhöhten PKA-Aktivitäten in Schicht 2/3 Neuronen des motorischen Kortex. Derzeit begrenzt 2pFLIM den Bereich der testbaren Verhaltensweisen aufgrund der Kopffixierung der Maus. Eine ständig wachsende Liste von Verhaltensparadigmen wurde jedoch innerhalb dieser Einschränkung erfolgreich umgesetzt, von der Berichterstattung über Reize in Go/No-Go-Aufgaben bis hin zur räumlichen Orientierung in der virtuellen Realität31,32,33 . Darüber hinaus können verbesserte Methoden die Bildgebung in tiefen Hirnregionen wie Striatum, Amygdala und Hippocampus über eine nadelähnliche Gradientenindexlinse (GRIN) 13 (unveröffentlichte Beobachtungen) ermöglichen. Daher sollte das vorliegende Protokoll, das die Verwendung von tAKAR und 2pFLIM zur In-vivo-Visualisierung von Neuromodulationsereignissen detailliert darlegt, im Kontext von kopffixierten Verhaltensparadigmen problemlos auf viele Hirnregionen anwendbar sein.
Die Berechnung der Lebensdauer pro Pixel oder ROI mit Kurvenanpassung ist rechnerisch zeitaufwändig, und die begrenzte Gesamtanzahl der Photonen pro Pixel führt häufig zu Anpassungsfehlern. Daher wird die mittlere Lebensdauer (LT) arithmetisch als Annäherung für die Lebensdauer berechnet ()17,34:
(Gleichung 1)
wobei SPCminund SPCmax die SPC-Grenzen (Measurement Window) und F(t) die Fluoreszenzlebensdauer-Zerfallskurve ist. Mit anderen Worten, für jedes berechnete Volumen (Pixel oder ROI, Abbildung 3A) wird die Photonen-Timing-Verteilung in einem Histogramm dargestellt (Abbildung 3B). Innerhalb des SPC-Bereichs wird das gewichtete Integral (wobei die Zeit das Gewicht ist) dieser Verteilung durch die Gesamtphotonenanzahl geteilt, um eine gemittelte Emissionszeit zu erzielen. Diese Zeit wird dann für t0korrigiert. Um ein Lebensdauerbild zu generieren (Abbildung 3A), wird dieses Verfahren für jedes Pixel durchgeführt, während die Berechnung der Lebensdauer pro ROI (Abbildung 3C,D) alle Photonen aller Pixel integriert, die den Schwellenwert innerhalb des ROI-Volumens überschreiten. Der Lebensdauer-Schätzfehler wird anhand der integrierten Intensität berechnet (NPhoton: Gesamtphotonenanzahl):
(Gleichung 2)
Um die Lebensdauer-Schätzfehler zu minimieren, erfordert FRET-FLIM die Erfassung von ausreichend Photonen pro ROI und die richtige Signalerkennung. Um ein gewünschtes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) zu erreichen, muss auch die folgende Gleichung erfüllt werden:
(Gleichung 3)
Zum Beispiel typische Messung bei fortatokarg bei einem neuronalen Soma im motorischen Kortex (LT = 1,57 ns, NPhoton = 9075, -LT = 0,15 ns; Abbildung 4, Zelle 1) ergibt einen lebenslangen Schätzfehler von:
0,016 
ns (Gleichung 4)
die zu einem Signal-Rausch-Verhältnis von:
SNR 
= 9.4 (Gleichung 5)
Wenn ein gewünschter SNR nur 5 ist, ist ein s-WERT erlaubt:
die eine minimale Gesamtphotonenanzahl von erfordert:
Wie oben beschrieben, erfordert die Lebensdauerquantifizierung das entsprechende Festlegen mehrerer Parameter, z. B. SPC-Bereich, t0und Mindestschwellenwert für die Lebensdauerderluminanz. Der SPC-Bereich bestimmt das Messfenster der emittierten Photonen innerhalb des Hardware-Messfensters (Gleichung 1; Hardware-Messfenster beträgt typischerweise 0 x 12,5 ns, da sich der Laser bei 80 MHz wiederholt). Dies ist notwendig, da der in diesem Protokoll verwendete PTCM Edge-Artefakte enthält. Der SPC-Bereich ist so eingestellt, dass er den größten Teil der Spenderphotonen-Lebensdauerverteilung enthält, ohne die Kantenartefakte einzubeziehen. Um die mittlere Lebensdauer zu berechnen, wird das mittlere Photonen-Timing aus dem Messfenster durch t0subtrahiert, was dem Timing des Laserpulses innerhalb des Fensters entspricht (Gleichung 1, Abbildung 3A,B)17,34. t0 kann durch Ändern der Signalkabellängen oder der PTCM-Einstellungen eingestellt werden und wird in der Regel von Anfang an auf 2 ns eingestellt. Nach der ersten Charakterisierung des Systems, die in der Regel unter nahezu idealen Bildgebungsbedingungen durchgeführt wird (z. B. bei der Abbildung von 5 -M-Fluorescein-Lösung), werden sowohl der SPC-Bereich als auch t0 als feste Parameter einer bestimmten Hardwarekonfiguration festgelegt. Der Mindestschwellenwert für die Lebensdauer der Luminanz wird so festgelegt, dass nur Pixel mit einer Gesamtanzahl von Photonen, die gleich oder höher als der Schwellenwert ist, in die Anzeige und Analyse einbezogen werden. Dadurch wird das Rauschen aufgrund der Anzahl von Hintergrundphotonen, einschließlich Autofluoreszenz, Umgebungslicht und spontaner PMT-Dunkelzahl, effektiv reduziert. Dieser Schwellenwert ist empirisch bestimmt.
Erfolgreiche FRET-FLIM-Sensoren für in vivo 2pFLIM-Bildgebung haben mindestens drei gemeinsame Merkmale. Erstens, was die Auswahl von Fluorophoren betrifft, ist die Effizienz der Photonensammlung unter der anspruchsvollen In-vivo-Bildgebungsumgebung zum Teil aufgrund einer starken Lichtstreuung im Hirngewebe in der Regel gering. Gleichzeitig ist eine hohe Anzahl von nachgewiesenen Photonen erforderlich, um eine wünschenswerte SNR zu erreichen (1.000 Photonen wären erforderlich, um einen SNR von 1 für einen LT/LT0 von 0,03 zu erreichen; siehe Gleichungen 2 und 3). Daher wird ein Spenderfluorophor mit einem hohen Photonenbudget (d. h. die maximale Anzahl nachweisbarer Photonen, bevor ein Fluorophor gebleicht wird) bevorzugt. Derzeit gibt es keinen systematischen Vergleich verschiedener Spenderfluorophore in Bezug auf ihr Photonenbudget unter Zwei-Photonen-Erregung. Empirisch ist eGFP relativ hell, während es im Vergleich zu vielen anderen Fluorophoren im grün-gelben Spektrum mehr fotoierbar ist, was es zu einem großartigen Spenderfluorophor für den Einsatz von FRET-FLIM-Sensoren in vivo macht. Darüber hinaus werden für eine optimale Quantifizierung von FRET Spenderfluorophore mit einem einexponentiellen Fluoreszenz-Lebensdauerzerfall bevorzugt. Viele häufig verwendete Spenderfluoreszenzproteine für die ratiometrische Bildgebung, wie eCFP, weisen multiexponentielle Fluoreszenz-Lebensdauer-Zerfalle auf, was darauf hindeutet, dass sie aus gemischten Populationen von Fluorophoren bestehen. Diese fluoreszierenden Proteine sind daher nicht ideal für FRET-FLIM21. Im Gegensatz zum Spenderfluorophor kann eine geringe Quantenausbeute des Akzeptorfluorophors für FRET-FLIM-Sensoren von Vorteil sein. Der "dunkle" niedrigstrahlende Fluorophor sREACh wird für tAKARs verwendet. Niedrige Quantenausbeute des Akzeptorfluorophors minimiert photonenkontamination im Spenderfluorophor-Emissionsspektrum und gibt einen Fluoreszenzdetektionskanal für die gleichzeitige Abbildung eines zweiten Fluoreszenzsensors oder Morphologiemarkers im roten Spektrum frei im Falle von tAKAR.
Zweitens wird eine optimale FRET-Effizienz von 0,5 bis 0,7 bevorzugt, um ausreichendSNR über den Bindungsfraktionsbereich zu erhalten. Das Signal, d.h. die mittlere Lebensdaueränderung unter einer gegebenen Änderung des Spender-Akzeptanz-Bindungsverhältnisses, hängt von der Effizienz von FRET ab. Diese Beziehung zwischen FRET-Effizienz und mittlerer Lebensdaueränderung ist jedoch nicht linear. Wenn sich die FRET-Effizienz einem nähert, emittieren die Spenderfluorophore im gebundenen Zustand praktisch keine Photonen. Daher nähert sich die mittlere Lebensdauer der Lebensdauer des Spenderfluorophors im offenen Zustand und die Fähigkeit, Grenzzustandssensoren zu erkennen, sofern die bindungsquote nicht 100 % beträgt (dies ist nie der Fall, da kein Akzeptor Fluorophor zu 100%29reift). Verringert. Die FRET-Effizienz für tAKAR wird auf 0,7 USD geschätzt, und das im günstigen Bereich.
Drittens sollten FRET-FLIM-Sensoren Signale mit einer Empfindlichkeit und Kinetik melden, die für die Tierphysiologie relevant sind. Sensorempfindlichkeit und Kinetik sollten vor ihrer Verwendung in vivo in vitro ausgiebig getestet werden und können bei Bedarf mit einer Vielzahl von Ansätzen optimiert werden, wie z. B. Anpassung der Substratbindungsdomänenaffinität und Kinetik, Linker-Optimierung und subzellulärer Ausrichtung des Sensors. In früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass tAKAR-Unternehmen PKA-Aktivität erkennen kann, die durch die Freisetzung endogenes Dopamin ausgelöst wird, und dass die Kinetik und Empfindlichkeit des Sensors mit einem bekannten PKA-abhängigen biologischen Prozess übereinstimmen, der Noradrenalin-induziert ist. Inaktivierung des langsamen Nachhyperpolarisationsstroms17. Darüber hinaus scheint die Expression von tAKAR-A die neuronalen Funktionen nicht zu verändern, wie die Elektrophysiologie17 und die Messung der strukturellen Plastizität einzelner Stacheln (unveröffentlichte Beobachtungen) zeigen.
Aktuelle technische Einschränkungen der 2pFLIM-Bildgebung beziehen sich auf die Datenverarbeitung und photonenzählende Durchsätze. Zunächst erfordert FLIM die Speicherung der Photonenankunftszeiten für jedes Pixel. Die Speichergröße des PTCM begrenzt die erhaltene Pixelauflösung. Für das hier beschriebene PCTM können bis zu 256 x 256 Pixel pro Bildrahmen mit einer 64-Punkte-Zeitauflösung erreicht werden. Darüber hinaus ist die Übertragungsgeschwindigkeit von FLIM-Bilddaten von der Platine auf den Computerspeicher relativ langsam, was wiederum die Auflösung und Abtastfrequenz praktisch begrenzt. Kontinuierliche technologische Verbesserung der Speicherkapazität und Datenverarbeitung kann diese Einschränkungen in der Zukunft beheben. Zweitens sind häufig verwendete PTCMs analoge zu digitale Systeme und werden durch ihre Zurücksetzenszeiten für die Photonenerkennung (d. h. "Tote Zeit") begrenzt. Dies bedeutet, dass die PTCM nach der Erkennung eines Photons die Ankunft nachfolgender Photonen für die nächsten 100-125 ns18,21nicht registriert. Darüber hinaus ist die Lebensdauermessung auf das erste angekommene Photon nach einem Laserpuls (sog. "Pile-up") ausgerichtet. Diese begrenzen die Photonenzählraten auf <107 Photonen pro s. Obwohl dies in den meisten typischen Zwei-Photon-Bildgebungsregimen kein großes Problem darstellt, sollte darauf geachtet werden, die Grenzwerte für die Photonenzählung nicht zu überschreiten. Neuere PTCMs mit kürzerer Totzeit oder einem Gigahertz-System zur kontinuierlichen Datenerfassung können diese Einschränkung lindern (für letztere siehe Yellen und Mongeon18).
Fluoreszierende Sensoren für Signalwege wie cAMP/PKA, Akt/PKB, PKC und ERK werden kontinuierlich erzeugt und optimiert16,35. Für die meisten aktuellen Sensoren sind weitere Charakterisierungen und Optimierungen erforderlich, um sich in der anspruchsvollen In-vivo-Bildgebungsumgebung zu übertreffen. Insbesondere ist eine erhöhte Signalamplitude wichtig, da jede Erhöhung der Signalamplitude die Nachfrage nach Photonenbudgets mit einer quadratischen Beziehung reduziert. Für tAKAR wurde seine Ansprechamplitude auf endogene Neuromodulatoren, wie Noradrenalin, im Vergleich zum bisherigen besten Sensor um das 2,7-fache verbessert. Dies führte zu einer 7-fachen Abnahme der benötigten Photonen. In der Praxis reduzierte dies die Anzahl der falschen Negative (d. h. Nicht-Responder) bei Tieren während des Verhaltens17stark. Das beobachtete maximale tAKAR-Signal beträgt 30 % (LT/LT0). Bis heute ist dies das größte FLIM-Signal, das für ähnliche Klassen von FRET-Sensoren gemeldet wurde. Eine weitere Verbesserung kann auch durch die Optimierung des Akzeptorfluorophors und der Affinität des FHA zum phosphorylierten Threonin möglich sein. Darüber hinaus kann die Verwendung von Sensoren, die verschiedene Aspekte desselben Signalwegs überwachen, einen leistungsstarken Ansatz bieten, um die Regulierung der Signalwege in vivo mechanistisch zu untersuchen. In Zukunft wird der erfolgreiche Einsatz von FLIM-Sensoren zur Visualisierung neuromodulatorischer Signalwege in vivo wichtige Erkenntnisse darüber liefern, wo und wann Neuromodulation in intakten neuronalen Netzwerken von verhaltensbildenden Mäusen stattfindet.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Frau Tess J. Lameyer, Frau Ruth Frank und Dr. Michael A. Muniak für die Bearbeitungen und Kommentare und Dr. Ryohei Yasuda von Max Planck Florida für 2pFLIM Akquisitionssoftware. Diese Arbeit wurde unterstützt durch zwei BRAIN Initiative Auszeichnungen U01NS094247 (H.Z. und T.M.) und R01NS104944 (H.Z. und T.M.), ein R01 Stipendium R01NS081071 (T.M.) und ein R21 Grant R21NS097856 (H.Z.). Alle Auszeichnungen stammen vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
| 3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
| Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
| AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
| Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
| Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Circular coverslip (5 mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
| Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
| Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
| Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
| Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
| Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
| Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
| FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
| Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
| Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
| Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
| Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
| Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
| Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
| Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
| Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
| Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
| Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
| Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
| Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
| Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
| Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
| Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
| Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
| Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
| Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
| Rotation encoder | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
| Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
| Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
| Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
| Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
| Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
| Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
| Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
| White PE foam roller (8 inch x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
| White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |
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