Summary
הליך זה מוצג להמחיש החלבון קינאז פעילות בעכברים קבועים ומתנהגים. כתבת הפעילות המשופרת של א-קינאז, tAKARα, מתבטאת בנוירונים בקליפת הגולגולת והפכה לנגישה להדמיה דרך חלון גולגולתי. מיקרוסקופ הדמיה של שני פוטון באורך החיים משמש כדי להמחיש פעילויות PKA ב vivo במהלך תנועה נאכף.
Abstract
הנוירואומודולציה מפעילה שליטה. חזקה על תפקוד המוח בעיות נוירולוגיות ופסיכיאטריות. למרות החשיבות שלהם, טכנולוגיות למעקב אחר אירועים נוירומודולטוריים עם רזולוציה תאית רק מתחילים להופיע. נוירומודולטיות, כגון דופמין, נוראדרנלין, אצטילכולין, וסרוטונין, ההדק אירועים תאיים מאותת באמצעות משולב חלבון G שלהם קולטנים כדי לווסת את היכולת הנוירולית, תקשורת סינפטית, ועוד עצבי ובכך להסדיר את עיבוד המידע ברשת העצבית. הנוירומודולטורים שהוזכרו לעיל מתכנסים אל המסלול של המחנה/חלבון קינאז A (PKA). לכן, ב vivo PKA הדמיה עם רזולוציה תא יחיד פותחה כבדיקה עבור אירועים נוירומודולאליות באופן אנלוגי לדימות סידן לפעילויות חשמל עצבי. להלן, שיטה מוצגת כדי להמחיש פעילות PKA ברמה של נוירונים בודדים בקליפת הראש-קבוע עכברים מתנהגים. לשם כך, נעשה שימוש בכתב משופר מבית א-קינאז (AKAR), הקרוי tAKARα, המבוסס על העברת אנרגיית תהודה של Förster (לדאוג). זה חיישן ה-pka מקודד גנטית הוא הציג לתוך קליפת המנוע באמצעות אלקטרופורציה הרחם (iue) של DNA פלמידים, או הזרקה סטריאוטקטית של וירוס הקשורים adeno (aav). שינויי השימוש בשיטת הצילום הם הדמיה באמצעות שני פוטון מיקרוסקופ גלגול החיים (2pFLIM), אשר מציע יתרונות על פני מדידות מחדש של מדידת מדידה עבור לכמת את האות ברקמת המוח פיזור אור. כדי ללמוד פעילויות PKA במהלך תנועה נאכף, tAKARα היא התמונה באמצעות חלון הגולגולת כרונית מעל קליפת הראש של הערה, הראשי קבוע עכברים, אשר לרוץ או לנוח על מהירות מבוקרת ממונע הליכון. גישה זו הדמיה יחולו על אזורים רבים אחרים במוח כדי ללמוד התנהגות הנגרמת המושרה פעילויות PKA ועל חיישנים אחרים מבוססי FLIM מבוסס על הדמיה vivo.
Introduction
הנגיף העצבי, הידוע גם כשידור הסינפטית איטי, מטיל שליטה חזקה על תפקוד המוח במהלך מצבים התנהגותיים שונים, כגון לחץ, עוררות, תשומת לב, ו תנועה1,2,3, 4. למרות חשיבותו, המחקר של מתי והיכן מתרחשים אירועים נוירומודולטוריים הוא עדיין בחיתוליו. נוירואומודולטורים, כולל אצטילכולין, דופמין, נוראדרנלין, סרוטונין, ונוירופפטידים רבים, להפעיל את G חלבון מצמידים קולטנים (GPCRs), אשר בתורו ההדק תאיים מסלולים השני עם חלון רחב של צירי זמן ועד משניות לשעות. בעוד כל מטפל עצבי מפעיל קבוצה ברורה של אירועים איתות, המחנה/חלבון קינאז a (pka) מסלול הוא מסלול מצוי במורד הזרם עבור הרבה נוירומודולטורים1,5. מסלול המחנה/pka מווסת את היכולות הנוירואליות, העברת הסינפטית והפלסטיות6,7,8,9, ולכן, מנגינות את הדינמיקה של רשת עצבית. מכיוון נוירונים שונים או סוגים עצביים לבטא סוגים שונים או רמות של קולטני עצבי מחדש10, את ההשפעות התאיים של אותו מיאואואואואואואואואואואואואואואוטור זהה עשוי להיות הטרוגנית על פני נוירונים שונים, ולכן, צריך להיות למדה ברזולוציה תאית. עד היום, הוא נשאר מאתגר לפקח על אירועים נוירומודולאליים בנוירונים בודדים בvivo במהלך ההתנהגות.
כדי ללמוד את הדינמיקה הטמפורלית של הנוירומודולציה, נדרש מודאליות של הקלטה מתאימה. מיקרודיאליזה ומחזורי סריקה מחזורית משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד שחרור של נוירומודולטורים, אבל הם חסרים את הרזולוציה המרחבית לפקח על אירועים סלולריים11,12. מקבילה לדינמיקה של סידן בשימוש כפרוקסי לפעילות החשמלית העצבית בדימות האוכלוסייה13, הדמיה pka עשוי לשמש כדי לקרוא את האירועים הנוירומודולדיטוריים ברחבי האוכלוסייה העצבית ברזולוציה התאית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בכתבת הפעילות המשופרת של א-קינאז (AKAR) כדי לפקח על פעילויות ה-PKA בvivo במהלך התנהגות בעלי חיים. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה בו של אוכלוסיות נירואליות ברזולוציה תת-תאית עם רזולוציה טמפורלית שעוקבת אחר אירועים נוירומודולטוריים פיזיולוגיים.
Akars מורכב מתורם ו לקבלה חלבונים פלואורסצנטי המקושרים על ידי pka זירחון המצע פפטיד ו forkhead הקשורים (fha) התחום הנקשר סרין זרחנת או טראונין של המצע14,15. עם הפעלת מסלול PKA, פפטיד המצע של AKAR הוא זרחי. כתוצאה מכך, התחום FHA נקשר את פפטיד המצע זרחני, ובכך להביא את שני fluorophores לסמיכות, המכונה מצב סגור של AKAR. המצב הסגור של AKAR זרחט מגדיל את העברת האנרגיה של התהודה המוגברת (למעלה) בין התורם לבין הקבלה. מאז שיעור של akars זרחמיים קשורה לרמה של פעילות pka16, את כמות הסריג במדגם ביולוגי ניתן להשתמש כדי לכמת את הרמה של פעילות pka16,17,18, 19,20.
גרסאות מוקדמות של AKARs תוכננו בעיקר עבור שני צבע הדמיה טימטרי14. כאשר הדמיה עמוקה יותר לרקמת המוח, השיטה הטיברמטרית סובלת מעיוות האותות בשל פיזור אור באורך הגל17,18,21. כפי שמתואר להלן, מיקרוסקופ הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית (flim) מבטלת את הבעיה כי flim רק מודד פוטונים הנפלטים על ידי fluorophore התורם18,21. כתוצאה מכך, הקוונפיקציה של הפלימטר של הסריג אינה מושפעת מעומק הרקמה17. בנוסף, "כהה" (כלומר, תשואה קוונטית נמוכה [QY]) המשתנה של הקבלה fluorophore ניתן להשתמש. פעולה זו משחררת ערוץ צבע כדי להקל על מדידת מדידה של תכונות נוירואליות אורתוגונאליות באמצעות הדמיה בו של חיישן שני או מסמן מורפולוגי17,19,20.
הדמיה FLIM לכמת את הזמן כי fluorophore מבלה במצב נרגש, כלומר, החיים הפלואורסצנטית18. שובו של פלואור למדינת הקרקע, ולכן סופו של המדינה הנרגשת, לעתים קרובות מקשר עם פליטת פוטון. למרות פליטת פוטון עבור מולקולה נרגש בודדים הוא סטוכסטי, באוכלוסייה החיים מרושע הזריחה הוא מאפיין של fluorophore מסוים. כאשר אוכלוסייה טהורה של fluorophores מתרגש בו זמנית, הזריחה המתקבלת יהיה לאחר ריקבון מעריכי אחד. קבוע הזמן של ריקבון מעריכי זה מתאים לאורך חיים הזריחה הממוצע, אשר בדרך כלל נע בין אחד לארבע ננושניות עבור חלבונים פלואורסצנטי. שובו של התורם הנלהב fluorophore למדינה הקרקע יכול להתרחש גם על ידי לדאוג. בנוכחות של לדאוג, החיים הפלואורסצנטית של התורם fluorophore מופחת. האקארים הבלתי זרחנים מציגים. אורך חיים של התורמים הארוכים יותר עם זרחון על ידי PKA, החיישן מציג חיים קצרים יותר כי התורם ואת הקבלה fluorophores הובאו זה לזה, והוא מוגבר. הקוונפיקציה של החיים הפלואורסצנטית באוכלוסייה של AKARs ולכן מייצגת את רמת פעילות PKA.
גירסאות מוקדמות של AKARs לא השתמשו בהצלחה עבור הדמיה vivo ברזולוציה תא יחיד. זה נובע בעיקר משרעת האות נמוך של חיישני AKAR להפעלות פיזיולוגיות17. לאחרונה, על ידי השוואת באופן שיטתי חיישני AKAR זמינים עבור שני פוטון הדמיה מיקרוסקופ גלגול החיים (2pFLIM), חיישן שנקרא FLIM-AKAR נמצא כדי להערים על חיישנים חלופיים. יתר על כן, סדרה של משתני flim-akar שנקרא akar ממוקד (takars) פותחו כדי להמחיש פעילות pka במיקומים משניים ספציפיים: microtubules (takarα), ציטוסול (tAKARβ), אקטין (tAKARδ), filamentous אקטין (tAKARε), קרום (tAKARγ), וצפיפות פוסט-סינפטית (tAKARζ). בין טאטרים, takarα הגדילה את משרעת האות הרוויח על ידי נוראדרנלין על ידי 2.7-קיפול. זה מתאים עם הידע כי רוב pka בנוירונים מעוגנת microtubules במצב מנוחה22,23. tAKARα היה האמן הטוב ביותר בין AKARs קיימים עבור 2pFLIM. יתר על כן, tAKARα זיהה פעילות מבחינה פיזיולוגית הרלוונטית PKA הרוויח על ידי נוירומודולטורים מרובים, ואת הביטוי של tAKARα לא לשנות פונקציות נוירואליות17.
לאחרונה, tAKARα השתמשו בהצלחה כדי להמחיש את הפעילויות PKA בראש קבוע עכברים התנהגות17. זה הוכח כי נאכף תנועה המופעל הפעילות pka בסומה של נוירונים בשכבה שטחית (שכבה 1 עד 3, עד עומק של ~ 300 יקרומטר מ pia) ב מנוע, חבית, ויזואלית מערבולות. פעילות PKA תנועה המופעל היה חלק תלוי על איתות באמצעות קולטנים β-אדרררגיות ו קולטני דופמין D1, אבל לא הושפע על ידי היריב D2 הקולטן הדופמין. עבודה זו ממחישה את היכולת של tAKARs לעקוב אחר אירועים נוירומודולליות בvivo באמצעות 2pFLIM.
בפרוטוקול הנוכחי, השיטה כולה לדימות פעילות PKA בעכברים הערים קבועים בראש במהלך פרדיגמה תנועה נאכף מתואר בשישה שלבים. ראשית, תוספת של יכולות 2pFLIM למיקרוסקופ רגיל 2-פוטון (איור 1). שנית, בניית הליכון ממונע (איור 2). שלישית, הביטוי של חיישן tAKARα בקליפת העכבר על ידי אלקטרופורציה של הרחם (IUE) של ה-DNA, או הזרקת סטריאוטקאית של וירוס הקשורים adeno (AAV). פרוטוקולים מצוינים עבור ניתוחים של iue24,25 והזרקת סטריאוטקאית של חלקיקים ויראלי26 פורסמו בעבר. הפרמטרים המרכזיים שבהם השתמשנו מתוארים להלן. . קדימה, התקנת חלון גולגולת פרוטוקולים מצוינים פורסמו בעבר עבור ניתוח חלון הגולגולת27,28. מתוארים מספר שלבים ששונו מהפרוטוקולים הסטנדרטיים. . חמישית, מופיעה בvivo 2pFLIM שישית, הניתוח של התמונות 2pFLIM (איור 3 ואיור 4). גישה זו צריכה להיות ישימה בקלות רבים אחרים בראש קבוע התנהגות ושטחים המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אורגון בריאות ומדע אוניברסיטת.
1.2Flim התקנת מיקרוסקופ
- התקן מודול ספירת הפוטון (לפטין, טבלת החומרים) והתחבר למחשב (איור 1) לפי המדריך של היצרן.
הערה: בדרך כלל, מדובר בלוח מחשבים המקבל קלט "מסונכרן" עבור התזמון של דופק הלייזר וכניסת פוטון מהצינור הפוטופולפי (PMT). זה גם מקבל תזמון השעון עבור פיקסלים, קווים, ומסגרות, מתוך שני פוטון בקרת הדמיה תוכנה. ה-פטין משתמש באותות השעון כדי להפריד פוטונים בודדים לפיקסלים ומסגרות שונים. - הוסף פוטודיודה עם רוחב פס של > 200 מגה-הרץ כדי למדוד את תזמון הלייזר. מניחים שמיכות זכוכית סטנדרטי בנתיב האור כדי לשקף חלק קטן של אור הלייזר לתוך פוטודיודה ממוקם בניצב לנתיב האור (איור 1). חבר את פלט ה-פוטודיודה לקלט "סנכרון" של ה-"מסונכרן".
הערה: לייזרים מודרניים רבים גם פלט את העיתוי לייזר. עבור לייזרים אלה, פוטודיודה אינה הכרחית, וניתן לחבר ישירות את פלט הזמן לייזר לקלט המסונכרן של ה-פטין. -
להחליף את PMT, במקרה של tAKARα, את הערוץ הירוק PMT, עם רעש נמוך, מהיר GaAsP PMT (איור 1). חבר את פלט ה-PMT לקלט האות של ה-פטין.
- הוסף מפצל אותות אופציונלי (איור 1) אם יש צורך ברכישה בו של עוצמה באמצעות ערוץ ההדמיה הרגיל של שני הפוטונים. חבר את פלט ה-PMT למפצל האותות וחבר את פלט המפצל למודול הדמיה של שני הפוטונים.
הערה: GaAsP PMTs לתת מהיר יותר אותות פוטון בודד מאשר PMTs קונבנציונאלי ולאפשר קביעה מדויקת יותר של העיתוי פוטון. מודלים מסוימים של GaAsP PMTs יכול להיות מקורר 10-35 ° c מתחת לטמפרטורת הסביבה, המאפשר דיכוי של ספירות כהה לרמה מתחת כמה מאות לשנייה (בדרך כלל ≤ 200 ספירות/s). זו רמת רעש נמוכה חשוב למדידה מדויקת של תקופות חיים של הזריחה, משום רעש הפוטון לא יכול להיות מכובד בקלות או מופחתים מתוך עקומת החיים של הזריחה.
- הוסף מפצל אותות אופציונלי (איור 1) אם יש צורך ברכישה בו של עוצמה באמצעות ערוץ ההדמיה הרגיל של שני הפוטונים. חבר את פלט ה-PMT למפצל האותות וחבר את פלט המפצל למודול הדמיה של שני הפוטונים.
- הוסף מסנן פליטת הקרינה הפלואורסצנטית המקזער את הזיהום הספקטרלי, אם בכלל, מתוך האישור fluorophore. לדוגמה, עבור takarα, 500 nm ± 20 מסנן המכשול nm עבור הערוץ הירוק משמש כדי להפחית את הזיהום מן הקבלה להגיע, אשר כהה (QY ~ 0.07) חלבון פלורסנט צהוב (yfp)29,30. חבר אותות תזמון, כגון השעונים לפיקסלים בודדים בתמונה, לקווים ולמסגרות, בהתאם לתוכנת הבקרה ומתואר במדריך למשתמש של משתמשים בעלי משתמש. התקן את התוכנה המתאימה לבקרת נתונים ורכישה.
הערה: חלק מיצרני ה-"פטין" (טבלת חומרים) מספקים את התוכנה שלהם לדימות של 2pFLIM. כאן משתמשים בתוכנה מותאמת אישית שנקראת פלימיקוסמת, שפותחה על ידי מעבדת יאסרודה (מקס פלאנק פלורידה, באמצעות תקשורת אישית). תוכנה זו פועלת כפונקציה משתמש הרחבה לתוכנת רכישה מסוימת של שני פוטונים (טבלת חומרים). הוא שולט ומתקשר עם ה-לפטין בעיתוי המתאים במהלך הדמיה של שני הפוטונים לרכישת תמונות 2pFLIM.
2. בניית הליכון ממונע
הערה: העיצוב של הליכון ממונע בנוי אישית מוצג באיור 2.
- חותכים רולר קצף (Ø = 200 מ"מ) כדי 150 מ"מ באורך עם המסור מסור משובח. לחילופין, להדביק את שני החצאים של כדור קצף יחד למקם את הקלטת על התפר. באופן אופציונלי, להדביק מחצלת גומי עם פרופיל על הרולר כדי להגדיל את המתיחה על הרולר.
- מקדחה 1/4 חור בקוטר אינץ ' במרכז הגלגלת על הצד השטוח של רולר או מקדחה 1/4 חור קוטר אינץ ' באמצע כל חצי של הכדור אם הכדור קצף משמש.
-
התקן 1/4 הציר פלדה קוטר אינץ דרך החור. הדבק את רולר קצף/הכדור אל הציר באמצעות קצף תואם דבק. באופן אופציונלי, לשנות שני מצמדים פיר גמיש (1/4 בקוטר הפנימי אינץ) כדי לחזק את הצימוד של הציר את הגלגלת קצף/כדור.
הערה: שים לב כי דבקים נפוצים רבים עשויים להמיס קצף.- עבור כל צימוד פיר, מקם את צימוד הפיר בצד השטוח ובמרכז לוחית המתכת של המלבן (0.7 מ"מ x 15 מ"מ x 76 מ"מ). . לרתך את הצלחת לצימוד הפיר מקדחה 1/4 חור אינץ במרכז הלוח כדי לאפשר התקנה של צימוד פיר שונה על הציר ושני חורים בורג לתוך לוחית המתכת לרוחב מהמרכז.
- התקן את הצימוד פיר על הציר על הגלגלת קצף/כדור. אם השימוש האחרון, לכופף מעט את הצלחת כדי להתאים את העקמומיות של הכדור. מקום ברגים לתוך החורים לרוחב כדי לתקן את הרולר/הכדור על הציר.
- לקדוח ולהקיש על חוט 3/8-32 במרכז צלחת הכלוב ולהתקין את מקודד רוטרי. מקדחה חור בורג לתוך הבסיס של המנוע הימני זווית מנוע כדי לאפשר החזקה של המנוע על מחזיק ההודעה. חברו את מקודד הרוטרי ואת המנוע לסוף הציר באמצעות צימוד פיר גמיש.
- התקן את ההליכון התאספו על לוח לחם אלומיניום באמצעות הצבות עבור מקודד ורוטרי מנוע (איור 2). חבר את כניסות המנוע לבקר מהירות, ואת הפלט מקודד רוטרי לקלט אנלוגי של רכישת נתוני המחשב (DAQ) הלוח.
הערה: מהירות הסיבוב זוויתי מקודד על ידי מקודד רוטרי כמו מתח והוא סרוקים באמצעות תוכנה מותאמת אישית בשם AnimalTracker כתוב MATLAB. - התקן את המחזיק בלוח הקדמי התואם לסוגר זווית ימין. התקן הצבה מוצק על צלחת הלחם מול ההליכון ולהתקין את מחזיק לוחית הראש התאספו עם מסגרת זווית ימין על ההודעה (איור 2). ודא כי הסורגים מחזיק לוחית הראש מיושרים עם הציר כך העכבר יכול לאמץ מיקום הליכה נאותה ונוח על ההליכון (איור 2C).
3. ביטוי חיישן tAKARα בקליפת העכבר
-
באלקטרופורציה של הרחם
- הכנת פתרון ה-DNA עבור IUE על-ידי הוספת 0.2% הריכוז הסופי של צבע ירוק מהיר (עבור ויזואליזציה במהלך ההזרקה) ל-DNA פלמיד (3 על 4 μg/μL; המבנים חיישן המכיל מקדם הקאג, רצף חיישן, וירוס הפטיטיס מרמיטה לאחר ההמרה אלמנט התגובה [WPRE] משפר) מומס/מדולל במים או טריס-EDTA.
- להכין עכבר מתוזמן בהריון נקבה (למשל, C57BL/6) עבור IUE ב E1624. לשפל את העכבר עם isofלוריאן (4% עבור אינדוקציה ו 1.5% עבור תחזוקה, ב 95% O2 עם 5% CO2) ולהחיל הזרקה תת עורית של כאבים פרי-פעיל המכיל 5 מ"ג/ק"ג מלוקסיעם ו 4 מ"ג/ק"ג בופיטין. לחתוך לפתוח את חלל הבטן עם אזמל וזוג מספריים בזהירות לחשוף את קרני הרחם.
- הכנס 1 μL של פתרון ה-DNA לעובר בחדר הצדדי של חצי הכדור השני, כפי שמתואר בעבר24.
- לבצע IUE רגיל24 עבור נוירונים בקליפת המוח על ידי הצבת את כף הרגל החיובית לסיים בקליפת ושימוש 5 100-ms פולסים רבועים (38 V) ב 1 הרץ עם אלקטרופוראטור.
הערה: אזורים קורטיקליים שונים יכולים להיות מיועדים לאלקטרופורציה על ידי שינוי מיקום כף הרגל של האלקטרודה ביחס לחדר הצדדי.
-
הזרקת סטריאוטקאית
- הכינו עכבר ביום שלאחר הלידה 30 לניתוח סטריאוטקאית26. מורדם את העכבר כמתואר בשלב 3.1.2., ולהחיל הזרקה תת עורית של משככי כאבים פרי-פעיל המכיל 5 מ"ג/ק"ג Carprofen.
- לדלל aav מגרסה 2/1 (AAV2/1) ביטוי hsyn-takarα-wpre כדי סיכוייו נחוש מדעית (~ 1 x 109-1 x 1010 genomes/μl) ב מזרק-מסוננים (0.2 יקרומטר ממברנה אצטט תאית) פוספט מאגור תמיסת מלח.
- מקדחה חור בקוטר ~ 500 יקרומטר באמצעות מקדחה כף יד תחת stereomicroscope בנקודות הציון הבאות עבור קליפת המנוע: 0.5 מ"מ קדמית לברגמה, 1.2 מ"מ לרוחב לקו האמצע.
- הר מזרק (למשל, שמן הידראולי מניפולטור, עם מחזיק מותאם אישית בבוכנה/זכוכית מאחז) כדי מניפולטור ממונע. הניחו את מחט ההזרקה בזווית של 15 ° ביחס למישור הברגמה-למדא. תוכנית תנועה אלכסונית על פני x ו z-צירים שווה ערך 700 יקרומטר ו 200 יקרומטר התקדמות לאורך הצירים האחורי הקדמי והגעיים, בהתאמה.
הערה: כדי למנוע נזק הרקמה ישירות מעל שדה הדמיה מיועד, חלקיקי AAV מוזרק בזווית יחסית למישור bregma-למדא. - הצב את קצהו של מחט ההזרקה בתוך הפיה במרכז חור המקדחה והפעל באיטיות את התנועה האלכסונית (~ 25 μm/s) המתוארים לעיל. הליך זה יהיה למקם את מרכז ההזרקה ב 1.2 מ"מ הקדמי לברגמה, 1.2 מ"מ לרוחב לקו האמצע, 0.2 מ"מ מתחת לפיה.
- הכנס 20 nL של חלקיקים ויראליים מדולל (~ 10 nL/מזערי). לחכות לפחות 10 דקות ובאיטיות למשוך את המחט ההזרקה (~ 12.5 μm/s).
- לסיים את הליך ההזרקה סטריאוטקאית ודבק/תפר את העור26.
4. התקנת חלון הגולגולת
- בצע את המיקום של חלון הגולגולת על עכברים ביטוי tAKARα דרך IUE (סעיף 3.1) או סטריאוטקאית הזרקה של חלקיקים ויראליים (סעיף 3.2), בין לאחר הלידה ימים 30 ו 60. עבור העכבר נגוע חלקיקים ויראלי, ליישם את חלון הגולגולת לפחות שבועיים לאחר הזרקת וירוס. התקן את חלון הגולגולת כפי שמתואר בעבר27,28, עם הפרטים הבאים. להסית את העכבר כפי שמתואר בשלב 3.1.2., ולהחיל הזרקה תת עורית של משככי כאבים פרי-פעיל 0.075 mg/ק"ג בופריקס ואנטי דלקתית הסוכן Dexamethone ב 4 מ"ג/ק"ג.
- הסירו את הקרום. ומשכי את שריר הצוואר הדבק את קצה העור לגולגולת עם דבק רקמה כדי למנוע חשיפה של שרירי הצוואר לאחר הניתוח.
- להתייבש ולהסיר כל קרום מהגולגולת על ידי גירוד בעדינות באמצעות אזמל. הנח את לוחית ההדמיה (קוטר פנימי של 8 מ"מ) כדי להקיף את שדה ההדמיה המיועד. הדבק את צלחת הראש לגולגולת באמצעות דבק ציאנואקרילט מבוסס, ואחריו מלט אקריליק שיניים. לצורך הדבקה אופטימלית, ודא שלוחית העליונה נשענת על הגולגולת החשופה והיבשה. מאיץ דבק ניתן להשתמש כדי להאיץ את התקשות.
- לצייר מעגל של 5 מ"מ קוטר מעל שדה הדמיה מיועד (קואורדינטות כפי שצוין בשלב 3.2.3) באמצעות מקדחה שיניים לחשוף את מאטר דורא.
- החלת שכבה דקה של פולימר שקוף, הנקראת גם דורא מלאכותית, למשטח הדורא כדי לכסות את כל חלון הגולגולת. הפולימר יגן ויייצב. את מאטר הדורא מניחים שמיכות מעגלית סטרילי (בקוטר 5 מ"מ) על מאטר דורא. לאבטח את הכיסויים עם דבק ציאנואקרילט מוחל סביב קצות החלון ואחריו מלט אקריליק שיניים.
5. ב Vivo Two-פוטון הדמיה מיקרוסקופ חיים מיקרונטית
- התחל הדמיה 2pFLIM ב או מעבר 2 שבועות לאחר ההתקנה של חלון הגולגולת (סעיף 4). מזער הפרעות נסיוניות עקב הלחץ על ידי טיפול תכוף והתערגת של העכבר לפני תחילת מחקר ההדמיה כדי לhabituate את העכבר.
- קבע את אורך הגל לייזר שני-פוטון ל960 ננומטר באמצעות התוכנה השולטת על לייזר שני פוטון.
- הרדים את העכבר באמצעות 4% isofלאנה. לאשר ההרדמה הנכונה על ידי הזנב צביטה והתבוננות שיעורי נשימה. כלומר, לא צריכה להיות תגובה לצביטה הזנב ואת קצב הנשימה יש להפחית ~ 1 נשימה לשנייה. כדי למזער את הזמן הפרוצדורלי המיותר ומכיוון שההרדמה נמשכת רק למשך 2-3 דקות, לא נעשה שימוש בחומרי סיכה לעיניים.
- העבר את העכבר רדימים אל ההליכון ממונע (איור 2C) ו הר את לוחית הראש של העכבר על מחזיק לוחית הראש של ההתקנה הליכון (ראה איור 2 לפרטים). לנקות את פני השטח של שמיכות חלון הגולגולת על העכבר עם 70% אתנול.
- מניחים את ההליכון ממונע עם העכבר רכוב תחת המטרה 2pFLIM. למרוח טיפה של מים מזוקקים בין המסווה של חלון הגולגולת ואת המטרה.
- תן את העכבר רכוב להתעורר מתוך הרדמה ולהיות הסתגלות הליכון וסביבה מיקרוסקופ עבור לפחות 10 דקות לעקוב אחר קצב הנשימה של העכבר בעוד העכבר רכוב מתעורר מן ההרדמה.
- נווטו למיקום ההזרקה תחת התאורה-אפינפרין. מסמך fiducial תכונות (כלומר, כלי דם) תחת ברייטפילד לסייע הדמיה של אותו אזור של ריבית (ROI) במהלך הפעלות הדמיה עוקבות.
- לסלק את האור הנכנס שאינו האור הנפלט מרקמת המוח. כבה את מקור האור של האפינפרין וסגור את המארז של המתקן 2pFLIM. הפעל את ה-2pFLIM PMT על-ידי החלפת בקרת מתח החומרה.
- לרכוש תמונה של מחסנית z 2pFLIM באמצעות תוכנת הרכישה 2pFLIM באמצעות ההגדרות המומלצות הבאות עבור הדמיה tAKARα-חיובי somata בעכברים ערים. הגדר את המסגרת בממוצע ל-3 מסגרות, מהירות סריקה ל-2 אלפיות שתיים, גודל תמונה ל-128 x 128 פיקסלים ושדה תצוגה ל-90-100 μm. כוונן את הגדרות הדימות בהתבסס על תצורת ההכנה והחומרה.
-
בדוק את התמונה הנרכשת ב-FLIMview (תוכנה מותאמת אישית שפותחה בתוך הבית; ראה סעיף 6). כוונן את הגדרות הדימות לאחר שלב 5.9 כדי למטב את ספירת הפוטון ולמזער את הלבנת התמונות.
הערה: הפוטונים משולבים הפוטון לספור ב-ROI עבור הדמיה לכל החיים של הvivo tAKARα-חיובית ב-a ~ 1000-10000 בפוטונים בהתאם משרעת האות הנובעת גירוי מסוים (ראה דיון).- במידת הצורך, השתמש בשדה מופחת של תצוגה, ירידה במהירות הסריקה, כוח לייזר מוגבר, ומספר גדל של מסגרות להיות ממוצעים כדי להגדיל את ספירות פוטון משולב ולהפחית את שגיאת שערוך במשך החיים. באותו זמן, הקפד להשתמש בכוח לייזר חיוני מינימלי, מסגרת בממוצע, וסריקה מהירות כדי למזער את הלבנת התמונות.
- תמונה בפרק זמן קבוע (לדוגמה, כל 30-60 שישים) על-ידי חזרה על רכישת מחסנית z באמצעות הגדרות שנקבעו בשלב 5.10. לרכוש תמונות 2pFLIM בסיסית עבור לפחות 15 דקות במהירות אפס הליכון.
- הגדר את מהירות סיבוב ההליכון ~ 15 ס"מ/s עבור 15 דקות תוך רכישת תמונות 2pFLIM. המשך הדמיה עבור ≥ 20 דקות לאחר החלפת סיבוב הליכון, כדי להעריך את משך הפעילות PKA לאחר הפסקת התנועה כפויה.
6. ניתוח תמונות של 2pFLIM
-
פתח את התמונות שנרכשו ב-FLIMview והגדר את הפרמטרים הבאים ב-FLIMview.
הערה: פרטי הפרמטרים מתוארים בדיון.- לחץ על ספירת פוטון בודד (SPC) שדות טווח מינימלי ומקסימלי ב FLIMview. הזינו ערך מינימלי ומקסימלי של טווח ה-SPC, בדרך כלל בין 1.2-2 ל-10-12 ₪ בהתאמה.
- לחץ על שדה t0 Value ב FLIMview והזן את ערך ה-t0 (בדרך כלל ~ 2 ns). לחץ על שדות החיים של הסף המינימלי לזוהר השדה ב FLIMview ולהזין את הערך הסף הרצוי 5-30 שבפוטונים.
- לחץ על לחצן הקבוצה החדשה (N) והקצה שם קבוצת ניסוי. פעולה זו תיצור קבוצה המשלבת נתונים מכל תמונת FLIM שנוספה.
- לחץ על לחצן roi ב שולטת roi מודול של FLIMVIEW ולצייר ROI סביב הסומה takarα-חיובית. הפחת את טווח מחסנית z, על-ידי הזזת המגבלה הנמוכה והעליונה של z במחווני הבקרה של מחסנית z ב- FLIMview, כדי למזער את זיהום האותות שמקורם בפוטונים ברקע בעומקים אחרים של z.
- לחץ על כפתור + כדי להוסיף את תמונת flim לקבוצה (שלב 6.2). לחץ על לחצן חישוב כדי לחשב את אורך החיים ממוצע (LT, המכונה גם ממוצע פליטת פוטון זמן [המפט]), עבור ROI ואת שגיאת שערוך במשך החיים (δτ).
- פתח את הקובץ הבא בסדרת ההדמיה 2pFLIM הכרותית. חזור על שלב 6.4. הקפד להתאים את המיקום של ההחזר ROI ו-z טווח למדוד את אותו tAKARα חיובי-חיובית לאורך זמן, כי יכול להיות הרקמה להיסחף לאורך זמן.
- בחר את האפשרות Deltampet / מחלק 0 בתפריט הנפתח של הקבוצה שולטת במודול. לחץ על השדה בסיסית והזן את האינדקס (es) (לדוגמה, 1 2 3 4 5 עבור חמשת התמונות הראשונות בקבוצה שנוצרה בשלב 6.3). פעולה זו תגדיר את התמונות המשמשות לחישוב אורך חיים בסיסי (LT0).
- לחץ על העלילה כדי ליצור גרף המכיל את תגובת flim (ΔLT/LT0) של takarα במהלך הניסוי ב-rois המוגדר. שינויים מנורמאליים בחיים (ΔLT) של ROIs בודדים על-ידי תקופת החיים הבסיסית המתאימה (LT0) מאפשרים השוואה של פעילות pka במהלך תנועה על פני rois שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
החיישנים מאפשרים הדמיה של מסלולים רבים ושונים של אותות, כולל מסלול המחנה/PKA המעורב במניפולציה עצבית. הפרוטוקול הנוכחי מנצל את חיישן tAKARα שפותחה לאחרונה בשילוב עם 2pFLIM כדי להמחיש את פעילויות PKA לתוך הראש קבוע עכברים התנהגות. ניתן לשדרג את רוב שני הפוטונים הקיימים באמצעות יכולות 2pFLIM באמצעות הוספת שלושה לארבעה רכיבים, כפי שמודגם באיור 1 (ראו גם סעיף 1). כדי להמחיש את התמונה בתמונות שנרכשו ב-2pFLIM, כימות החיים המשמעות בוצעו על חלקות היסטוגרמה של תזמון פוטון שנאסף לכל פיקסל (איור 3 א, ב). משמעות החיים היתה דמיינו באמצעות תמונה בצבע מדומה, שבו גבוה (צבע קר) נמוך (צבע חם) מתכוון תקופות חיים נמוכות וגבוהות PKA, בהתאמה, מאז הפעלת PKA מוביל לירידה של החיים. יש לנקוט טיפול כדי לקבוע את טווח ה-SPC כראוי; טווח זה צריך להיות מוגדר בתוך מרווח לייזר הדופק (למשל, 12.5 ns של קצב הדופק של 80 MHz) עם ממצאים בקצה חומרה ממוזער (ראה גם סעיף 6 ו דיון). חישוב של פעילות PKA בתוך ROIs בוצעה על ידי שילוב LT של כל הפיקסלים בתוך ROI נתון (איור 3C, D). בראש קבוע עכברים ערים החיים הבזליים נע בין 1.3 ו 1.8 ns (איור 3E). הדמיה של tAKARα בקליפת המנוע בראש קבוע עכברים ער מותר עבור כימות בזמן אמת של פעילות PKA עם רזולוציה תאית במהלך תנועה בסיס ונאכף (איור 4). ניתן לחזור על הניסוי בימים ובחודשים. נאכף תנועה גורמים PKA פעילות באוכלוסיה של נוירונים בתוך שכבות שטחיות של קליפת העכבר מנוע17. פעילות זו מותנית בהפעלה עצבית באמצעות הפעלת β-אדרכולינרגיות וקולטני D117.
איור 1: סכימטי של מערכת 2pFLIM. 2pflim ניתן ליישם על מיקרוסקופ שני הפוטון קונבנציונאלי על ידי תוספת של רכיבי חומרה מודגשים צהוב: תזמון הפוטון מודול ספירת, שפופרת הרעש נמוך מהיר האור (PMT), פוטודיודה (נחוץ רק אם לייזר אין איתות פלט עבור תזמון לייזר), ומפצל אותות אופציונלי. דמות זו שונתה מ-Ma et al.17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עיצוב של הליכון ממונע בנוי אישית. (A) סכמטי של עיצוב ההליכון מלפנים (למעלה משמאל), צד (למעלה מימין), ותצוגות העליון (למטה משמאל). ההליכון (כדור קצף) הסרן מחובר מקודד רוטרי מנוע כי הם באופן קולקטיבי רכוב על שתי הצבות על צלחת לחם אלומיניום מוצק. לוחית הראש תואמת מחזיק על סוגר זווית ימין הוא קבוע לעמוד מוצק ממוקם מעל ההליכון. רישומים סכמטית הם לא לשנות את קנה המידה. חזית (ב) ו צד (ג) נוף תצלומים של ההליכון. המיקום הנכון של העכבר על ההליכון מוצג פאנל C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הקוונפיקציה של נתוני 2pFLIM. (א) תמונה flim עם כל פיקסל בצבע מדומה כדי לייצג את החיים הממוצע (LT), ביחס לתזמון הלייזר, של כל הפוטונים בפיקסל זה. (ב) שעות ההגעה פוטון בתוך פיקסל אחד (ריבוע סגול בלוח a) הותוו בהיסטוגרמה (פאנל שמאלי). גבולות האינטגרציה נקבעו כדי לקבוע את טווח ספירת הפוטון היחיד (SPC, אפור). בתוך טווח SPC, האינטגרל של תזמון פוטון חולקה על ידי המספר הכולל של פוטונים ולאחר מכן מופחתים על ידי t0 (1.65 ns, קו מקווקו), וכתוצאה מכך חיים מרושע (LT, מרחק בין קווים מקווקווים ומנוקד) של 1.74 ns. כימות החיים מתכוון של השדה כולו של נוף (ריבוע כחול אור בלוח A) מעורב שילוב של עיתוי פוטון שנאסף בכל הפיקסלים (הפאנל הימני), וכתוצאה מכך חיים ממוצע של 1.7 ns. מערכות insets מציגות את אותם הנתונים בקנה מידה למחצה יומן. (C ו -D) הכמת של חיים מתכוון לכל אזור של ריבית (ROI). (ג) דוגמה ייצוגית של תמונת 2pFLIM. שני ROIs נמשכו סביב שני somata בשכבה 2/3 של קליפת המנוע. (ד) פוטון עיתוי הפצות משולבים בכל הפיקסלים בתוך כל ROI (הפאנל השמאלי). תא ROIs היו מסומנים בצבע (כפי שמוצג בלוח C) אדום, תא 1; כחול, תא 2 ספירות פוטון מנורמלות מאפשרות השוואה של הפצות העיתוי פוטון בין שני ROIs (הפאנל הימני, ממוצע החיים; תא 1, 1.33 ns; תא 2, 1.73 ns). מערכות insets מציגות את אותם הנתונים בקנה מידה למחצה יומן. (ה) התפלגות מגרש של אורך חיים בסיס ממוצע מ 254 תאים התמונה בשכבות שטחיות של קליפת המנוע. L1 תאים (n = 186 תאים/11 בעלי חיים, הפאנל השמאלי), המתגוררים בתוך 100 יקרומטר מתחת לפיה, הביע takarα אחרי הזרקה סטריאוטקאית של AAV2/1-hsyn-takarα-wpre, ו-L2/3 התאים (n = 68 תאים/4 בעלי חיים, בלוח הימני 150) הביע את האיחוד לאחר הצורך. בבניית דנ א של הקאג אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: tAKARα מסלולים נאכף תנועה המושרה פעילויות PKA בקליפת המנוע. (א) העוצמה המייצגת (פאנל שמאלי) והחיים (לוחות האמצע והימין) תמונות של שלושה תאים L1 בקליפת המנוע. התא ROIs היה מקודד בצבע: כתום, תא 1; כחול, תא 2; צהוב, תא 3 (ב) פוטון עיתוי הפצות נמדד בתא 1 (הפאנל העליון) במהלך המצב הבזלי (סימן כתום, כפי שנמדד בלוח האמצעי Α) ו תנועה נאכף (לוקו., סימן כתום קל, כפי שנמדד בלוח הימני A). מונה פוטון מנורמל מותר להשוואה ישירה של התפלגות העיתוי פוטון (פאנל תחתון, ממוצע החיים: בסיס, 1.72 ns; תנועה, 1.42 ns). מערכות insets מציגות את אותם הנתונים בקנה מידה למחצה יומן. (ג) Δlifetime/חיים0 (ΔLT/LT0) עקבות של התאים המתאימים (הפאנל העליון, ראה פאנל A) עם מהירות התנועה נאכף ( הפאנל התחתון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מדגים את השימוש של חיישן-FLIM מחיישנים tAKARα כדי להמחיש את הפעילות העצבית-הפעלת PKA פעולה בראש-קבוע עכברים התנהגות. יישום זה מבוסס על בדיקות נרחבות ומאפיין של tAKARα ב מבחנה ובvivo להפגין כי האות FLIM שהושג הוא רלוונטי לאירועים נוירומודולטיים פיזיולוגיים17. כאן, אחד ביישום vivo, פעילות PKA המושרה בקליפת המנוע, משמש כדי לתאר את ההליכים לאספקת החיישן למוח, ניתוח בעלי חיים עבור דימות, חומרה ותוכנה דרישות עבור התנהגות ורכישת נתונים הדמיה , תוכנות ואלגוריתמים לניתוחי נתונים בהדמיה.
חיישן tAKARα הוא הציג את קליפת המוח על ידי IUE של ה-DNA או הזרקת סטריאוטקאית של חלקיקי AAV. בהתאם לפרמטרים אלקטרופורציה ואת ריכוזי ה-DNA, iue התוצאות בצפיפות שונים התיוג של נוירונים בקליפת המוח על שטח גדול יחסית בקליפת25. שכבת קליפת המוח המסומנת באמצעות IUE נקבעת על ידי השלב העובריים כאשר הניתוח מבוצע. הזרקת סטריאוטקאית של חלקיקי AAV משמשת כאשר רצוי לדמות תאים רבים בתוך תת המוח המוגדר באזור. זה בדרך כלל יוצר נוירונים בעלי תוויות בצפיפות במרכז ההזרקה ותיוג דליל יותר ויותר מהמרכז. חשוב מכך, יעילות הזיהום של תאים בתוך המוח תלויה בסוג AAV המשמש. AAV2/1 מציע יעילות רבה בקליפת הקורטילית, התלתלמי, ו הנירמול נוירונים עם פעילות נמוכה יחסית תיוג נסיגה. מומלץ להקים בצורה מדעית איזה סוג AAV הוא היעיל ביותר עבור אזור המוח המיועד וסוג התא. שתי שיטות החצייה הביעו בהצלחה את טקרα. "המקום המתוק" עבור רמת הביטוי נקבע באמפירי.
תוצאות תנועה נאכף בפעילויות PKA מוגברת בשכבה 2/3 נוירונים בקליפת המוח המוטורית. כיום, 2pflim מגביל את טווח התנהגויות ברת עקב קיבוע ראש של העכבר. עם זאת, רשימה ההולכת וגוברת של תבניות התנהגותיות יושמו בהצלחה בתוך אילוץ זה, החל מדיווח גירויים ב go/no-go משימות לכיוון מרחבי במציאות וירטואלית31,32,33 . בנוסף, שיטות משופרות עשויות לאפשר הדמיה באזורי מוח עמוקים, כגון הסטריאטום, האמיגדלה וההיפוקמפוס, באמצעות מדד הדרגתי כמו מחט (גרין) עדשה13 (תצפיות שלא פורסמו). לכן, הפרוטוקול הנוכחי המפרט את השימוש של tAKARα ו-2pFLIM עבור בvivo ויזואליזציה של האירועים העצביים צריך להיות ישימה בקלות על אזורי מוח רבים בהקשר של התנהגות הראש קבוע.
חישוב של תקופת החיים לכל פיקסל או ROI באמצעות התאמה עקומה מבחינה חישובית זמן רב, ואת ספירת פוטון הכולל מוגבל לפיקסל לעתים קרובות תוצאות שגיאות התאמה. לפיכך, המשמעות של תקופת חיים (LT) היא חישוב אריתמטי כקירוב לאורך חיים (τ)17,34:
(משוואה 1)
כאשר SPCmin, ו-SPCmax הם חלון המדידה (SPC) גבולות ו-F (t) הוא עקומת החיים של הדעיכה הפלואורסצנטית. במלים אחרות, עבור כל אמצעי אחסון מחושב (פיקסל או ROI, איור 3A) התפלגות התזמון הפוטון מותווית בהיסטוגרמה (איור 3a). בתוך ה-SPC טווח האינטגרל משוקלל (עם הזמן להיות המשקל) של התפלגות זו מחולקת על ידי ספירת הפוטון הכולל כדי לגרום לזמן פליטה ממוצע. הפעם לאחר מכן תוקנה עבור t0. כדי ליצור תמונה לכל החיים (איור 3A) הליך זה מבוצע עבור כל פיקסל, ואילו החישוב של תקופת החיים לכל ROI (איור 3a, D) משלב את כל הפוטונים מכל הפיקסלים הנמצאים מעל לסף בתוך אמצעי האחסון של ROI. שגיאת הערכה לכל החיים (δτ) מחושבת באמצעות העוצמה המשולבת (Nפוטון: סה כ הפוטונים מספור):
(משוואה 2)
כדי למזער שגיאת שערוך במשך החיים, δτ, ולהניב זיהוי האותות הנכון לצורך הרכישה של מספיק פוטונים לכל ROI. על מנת להשיג יחס אות לרעש הרצוי (SNR), δτ צריך גם לעמוד במשוואה הבאה:
(משוואה 3)
לדוגמה, מדידה אופיינית במהלך תנועה בתוך המוח העצבי בקליפת המנוע (LT = 1.57 ns, Nפוטון = 9075, ΔLT = 0.15 ns; איור 4, תא 1) מניב שגיאת שערוך לכל החיים:
δτ 0.016 ns (משוואה 4)
שתוצאתה היחס של אות לרעש של:
SNR 
= 9.4 (משוואה 5)
אם SNR הרצויה היא רק 5, בהינתן ΔLT = 0.15 ns δτ מותר:
שדורש ספירת פוטון מינימלית מוחלטת של:
כפי שמתואר לעיל, כימות החיים דורש הגדרה נאותה של מספר פרמטרים, כגון טווח SPC, t0, ואת סף מינימום לזוהר החיים. טווח ה-SPC קובע את חלון המדידה של הפוטונים הנפלטים בחלון המדידה של החומרה (משוואה 1; חלון המדידה של החומרה הוא בדרך כלל 0-12.5, כאשר הלייזר חוזר על 80 MHz). הדבר נחוץ מכיוון שלפטין שבשימוש בפרוטוקול זה יש ממצאים מהקצה. טווח ה-SPC מוגדר לשלב את רוב הפצת הפוטון בתקופת החיים מבלי לכלול את ממצאים הקצה. כדי לחשב את החיים הממוצע, התזמון מתכוון פוטון מחלון המדידה מופחתים על ידי t0, אשר מתאים את העיתוי של הדופק בלייזר בתוך החלון (משוואה 1, איור 3a, B)17,34. ניתן לכוונן את האות t0 על-ידי שינוי אורך כבל האותות או הגדרות ה-פטין, והוא מותאם בדרך כלל להיות ~ 2 ns מתחילת חלון המדידה של החומרה. לאחר האפיון הראשוני של המערכת, בדרך כלל בוצע תחת תנאי הדמיה אידיאלי (g., כאשר הדמיה 5 Μescein פתרון), הן טווח SPC ו-t0 מוגדרים כפרמטרים קבועים של תצורת חומרה נתונה. הסף המינימלי לזוהר מוגדר כך שרק פיקסלים עם ספירת פוטון מוחלטת שווים או גבוהים מהסף ייכללו בתצוגה ובניתוח. זה מפחית ביעילות את הרעש בשל ספירות פוטון ברקע, כולל התאמה אוטומטית, אור סביבתי, ו-PMT הספירות הכהות ספונטנית. הסף הזה נקבע באמפירי.
חיישנים מצליחים מוצלחת-FLIM עבור בהדמיה vivo 2pFLIM יש לפחות שלוש תכונות נפוצות. ראשית, לגבי הבחירה של fluorophores, יעילות אוסף פוטון הוא בדרך כלל נמוך תחת מאתגרת בסביבה vivo הדמיה בחלק בשל פיזור אור חמור רקמת המוח. באותו זמן, מספר גבוה של פוטונים שזוהו נדרש כדי להשיג SNR (≥ 1,000 פוטונים יידרש כדי להשיג SNR של 1 עבור ΔLT/LT0 של 0.03; ראה משוואות 2 ו-3). לכן, fluorophore התורם עם תקציב פוטון גבוה (כלומר, המספר המקסימלי של פוטונים לגילוי לפני fluorophore הוא הולבן) הוא המועדף. כיום, אין השוואה שיטתית של fluorophores תורמים שונים במונחים של תקציב פוטון שלהם תחת עירור שני פוטון. באופן אמפירי, eGFP הוא בהיר יחסית בעוד להיות פוטואורוות יותר לעומת fluorophores רבים אחרים בספקטרום ירוק/צהוב, מה שהופך אותו fluorop, תורם גדול עבור בשימוש vivo של חיישנים-FLIM. בנוסף, עבור כימות מיטבית של הפרט, fluorophores תורם עם הריקבון יחיד מעריכי לאורך החיים הם המועדף. רבים המשמש לשימוש נפוץ בחלבונים התורמים עבור הדמיה מטימטרית, כגון eCFP, יש מולטי מעריכי החיים הזריחה decays מציע כי הם מורכבים אוכלוסיות מעורבות של fluorophores. אלה חלבונים פלורסנט ולכן אינם אידיאליים עבור לדאוג-FLIM21. בניגוד fluorophore התורם, תשואה קוונטית נמוכה של הקבלה fluorophore יכול להיות מועיל עבור חיישנים-FLIM. המילה "האפלה" הנמוכה והקורנת מגיעה לטקזרים. תשואה קוונטית נמוכה של הקבלה fluorophore ממזער את זיהום פוטון בספקטרום פליטה fluorophore התורם ומשחרר ערוץ גילוי ניאון אחד עבור הדמיה בו של חיישן פלורסנט השני או סמן מורפולוגיה בספקטרום האדום במקרה של טקרα.
שנית, כדי להשיג SNR מספיק לאורך טווח השבר הכריכה, יעילות מיטבית של ~ 0.5-0.7 הוא המועדף21. האות, דהיינו, תקופת החיים הממוצע משתנה תחת שינוי יחס מסוים של התורם לקבלה, תלוי ביעילות של הדאגה. מערכת יחסים זו בין יעילות ומשמעות שינוי לכל החיים היא, עם זאת, לא ליניארי. אם היעילות מתקרבת לאחד, fluorophores התורם במצב מאוגד הם פולטות ביעילות כמעט ללא פוטונים. לכן, אלא אם כן היחס המחייב הוא 100% (זה אף פעם לא המקרה כי אין מאשר fluorophore מתבגר ל 100%29) את החיים הממוצע מתקרב לחיים של התורמים של התורם במצב פתוח, ואת היכולת לזהות חיישנים מדינה מאוגד קטין. ההערכה החסכונית של tAKARα מוערך להיות ~ 0.7, בתוך הטווח הנוח.
שלישית, חיישנים-FLIM לדווח על אותות עם רגישות וקינטיקה הרלוונטיות לפיזיולוגיה של בעלי חיים. רגישות וקינטיקה חיישן צריך להיבדק בהרחבה בתחום החוץ לפני השימוש בו ב vivo, ו, במידת הצורך, ניתן לכוונן באמצעות מגוון של גישות, כגון התאמת המצע מחייב התחום זיקה ו קינטיקה, מקשר-אופטימיזציה, ו subcellular פילוח של החיישן. בעבודה הקודמת, זה הוקם כי tAKARα יכול לזהות פעילות PKA הנגרמת על ידי מהדורות של דופמין אנדודוגני, וכי הקינטיקה והרגישות של החיישן ליישר עם תהליך ביולוגי מוכר PKA תלוי, שהוא norepinephrine-המושרה חוסר הפעלה של הזרם האיטי אחרי היפרפולריזציה17. יתר על כן, הביטוי של tAKARα לא נראה לשנות את הפונקציות העצבי, כאשר המכונה על ידי אלקטרופיזיולוגיה17 ומדידה של הפלסטיות הקונסטרוקטיבי של הקוצים הבודדים (תצפיות שלא פורסמו).
המגבלות הטכניות הנוכחיות של הדמיה של 2pFLIM קשורות לטיפול בנתונים ובתפוקות של ספירת פוטון. ראשית, FLIM דורש אחסון של זמני הגעה פוטון עבור כל פיקסל. גודל הזיכרון של ה-פטין מגביל את רזולוציית הפיקסלים השגה. עבור PCTM תיאר כאן, עד 256 x 256 פיקסלים לכל מסגרת תמונה עם רזולוציית זמן של 64-point ניתן להשיג. בנוסף, מהירות ההעברה של נתוני תמונה FLIM מהלוח לאחסון המחשב היא איטית יחסית, שוב, הצבת מגבלות מעשיות על הרזולוציה ותדר הדגימה. שיפור טכנולוגי מתמשך של קיבולת זיכרון וטיפול בנתונים עלול לפתור את המגבלות האלה בעתיד. שנית, בדרך כלל השימוש בפטין הם מערכות אנלוגי לדיגיטלי והם מוגבלים על ידי שלהם לאפס הפוטון שלהם שעות הזיהוי (כלומר, "זמן מבוי"). משמעות הדבר היא כי לאחר האיתור של פוטון אחד הפטין לא לרשום את הגעתו של פוטון הבאים (s) עבור 100-125 לאחר מכן18,21. יתרה מזאת, מדידת החיים היא מוטה כלפי הפוטון הראשון הגיע לאחר פעימת לייזר (כביכול "הערמה"). אלה מגבילים את תעריפי ספירת הפוטונים כדי < 107 פוטונים לסופרן. למרות ברוב טיפוסי שני פוטון הדמיה משטרים זו אינה בעיה גדולה, הטיפול צריך להילקח לא יעלה על מגבלות שיעור ספירת הפוטון. מערכת לפטין חדשה יותר המונה זמן קצר יותר או שמערכת רכישת נתונים רציפה של ג'יגה-הרץ יכולה להקל על מגבלה זו (עבור האחרון ראו את יאלן ומונדג'ן18).
חיישני פלורסנט עבור מסלולים איתות, כגון מחנה/pka, akt/pka, pkc, ו טיפשה, הם ברציפות נוצרות וממוטבת16,35. עבור רוב החיישנים הנוכחיים, אפיון ואופטימיזציה נוספים נחוצים להצטיין בסביבת הדימות הvivo. במיוחד, משרעת האות מוגברת חשוב, כמו כל עלייה בשרעת האות מפחיתה את הביקוש על תקציבי פוטון עם קשר מרובע. בשביל tAKARα, התגובה שלה משרעת לנוירומודולניים האנדוגניים, כגון נוראדרנלין, שופרה על ידי 2.7-קיפול לעומת החיישן הקודם הטוב ביותר. זה תורגם לירידה ~ 7-קיפול בפוטונים נדרש. בפועל, זה הפחית במידה ניכרת את מספר התשלילים השקרית (כלומר, לא מגיבים) בבעלי חיים במהלך התנהגות17. האות tAKARα המקסימלי שנצפתה היא ~ 30% (ΔLT/LT0). עד היום, זהו אות FLIM הגדול ביותר שדווח עבור מחלקות דומות של חיישנים. שיפור נוסף עשוי להיות אפשרי גם על ידי אופטימיזציה של הקבלה fluorophore ואת הזיקה של FHA לתוך הזיצין זרחניות. בנוסף, השימוש בחיישנים המפקחים על היבטים שונים של אותו מסלול איתות עשוי לספק גישה רבת עוצמה לכלי מכניא לחקור את הוויסות של מסלולי האיתות בvivo. בעתיד, היישום המוצלח של חיישנים FLIM להמחיש מסלולים נוירומודולטוריים בvivo יספק תובנות חשובות לגבי היכן ומתי המניפולציה העצבית מתרחשת ברשתות נוירואליות שלמות של עכברים מתנהגים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לגב טס י. לאמייר, גב' רות פרנק וד ר מיכאל א. מוניק לעריכה והערות, וד ר ריודהי יאסין במקס פלאנק פלורידה לתוכנת הרכישה של 2pFLIM. עבודה זו נתמכת על ידי שני פרסי יוזמת המוח U01NS094247 (ז ו ט) ו R01NS104944 (ז ו ט), R01 המענק R01NS081071 (ט), ו R21 מענק R21NS097856 (ז). כל הפרסים הם מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ, ארצות הברית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
| 3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
| Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
| AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
| Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
| Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Circular coverslip (5 mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
| Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
| Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
| Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
| Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
| Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
| Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
| FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
| Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
| Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
| Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
| Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
| Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
| Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
| Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
| Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
| Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
| Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
| Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
| Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
| Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
| Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
| Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
| Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
| Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
| Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
| Rotation encoder | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
| Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
| Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
| Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
| Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
| Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
| Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
| Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
| White PE foam roller (8 inch x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
| White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |
References
- Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).
- Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).
- Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety. Neuron. 87 (3), 468-470 (2015).
- Berke, J. D. What does dopamine mean? Nature Neuroscience. 21 (6), 787-793 (2018).
- Chen, Y., et al. Endogenous Gαq-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A. Neuron. 96 (5), 1070-1083 (2017).
- Madison, D. V., Nicoll, R. A. Cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 372 (1), 245-259 (1986).
- Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction. Nature Neuroscience. 6 (1), 15-16 (2003).
- Pedarzani, P., Storm, J. F. PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons. Neuron. 11 (6), 1023-1035 (1993).
- Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection. Current Opinion in Neurobiology. 7 (3), 397-403 (1997).
- Radnikow, G., Feldmeyer, D. Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex. Frontiers in Neuroanatomy. 12 (January), (2018).
- Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
- Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. Hitchhiker’s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach. Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochemical and Biophysical Research Communications. 348 (2), 716-721 (2006).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging. Frontiers in Pharmacology. 5 (April), 1-12 (2014).
- Ma, L., et al. A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice. Neuron. 99 (4), 665-679 (2018).
- Yellen, G., Mongeon, R. Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).
- Tang, S., Yasuda, R. Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity. Neuron. 93 (6), 1315-1324 (2017).
- Tillo, S. E., et al. Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates. Cell Reports. 19 (3), 617-629 (2017).
- Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16 (5), 551-561 (2006).
- Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2. Journal of Biological Chemistry. 257 (6), 3284-3290 (1982).
- Zhong, H., et al. Subcellular dynamics of type II PKA in neurons. Neuron. 62 (3), 363-374 (2009).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP. Brain Cell Biology. 36 (1-4), 31-42 (2008).
- Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of Förster resonance energy transfer. Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
- Yu, K., et al. The central amygdala controls learning in the lateral amygdala. Nature Neuroscience. 20 (12), 1680-1685 (2017).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Yasuda, R. Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1121-1128 (2012).
- Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nature Cell Biology. 20 (10), 1215-1225 (2018).
