Summary
Класс 1 гистоун ДеАцетилазы (HDACs) как РКПК приобрели значение как потенциальные цели для лечения грибковых инфекций. Здесь мы представляем протокол для конкретного обогащения TAP-меткой RpdA в сочетании с HDAC анализа активности, что позволяет в пробирке тестирования эффективности ингибиторов гистоун деацетилазы.
Abstract
Класс 1 гистоун деацетилаз (HDACs), подобный РКПК, приобрел значение как потенциальные мишени для лечения грибковых инфекций и для геномного майнинга грибковых вторичных метаболитов. Ингибитор скрининга, однако, требует очищенных ферментов деятельности. Так как деацетилазы класса 1 выполняют свои функции как мультипротеиновые комплексы, они обычно не активны, когда выражаются как одиночные полипептиды в бактериях. Таким образом, эндогенные комплексы должны быть изолированы, которые, когда применяются традиционные методы, такие как обмен иона и размер исключения хроматографии, трудоёмкие и отнимает много времени. Тандем очищение близость была разработана в качестве инструмента для обогащения мультипротеиновых комплексов из клеток и, таким образом, оказался идеальным для изоляции эндогенных ферментов. Здесь мы предоставляем подробный протокол для одноэтапного обогащения активных РКПК комплексов через первый этап очистки C-неизлечимо-меткой RpdA от Аспергилуса нидуанс. Затем очищенные комплексы могут быть использованы для последующего скрининга ингибитора с применением анализа деацетилазы. Обогащение белка вместе с ферментативной активностью анализа может быть завершена в течение двух дней.
Introduction
Гистоун ДеАцетилазы (HDACs)-это Zn2 +-зависимые гидролитические ферменты, способные удалять ацетил-группы из остатков лизина гикамней и других белков. На основе сходства последовательности, HDACs сгруппированы в несколько классов1. В последнее время, грибковые класса 1 HDAC РКПК, ортолог Хлебопекарные дрожжи(сахаромицеты цервиии) Rpd3p, было показано, что необходимо для оппортунистических грибковых патогенов аспергилус фумиатус2. Таким образом, РКПК приобрела значение в качестве потенциальной цели для лечения грибковых инфекций2. Оценка активности деацетилазы в пробирке имеет важное значение для характеризации ферментативных свойств и позволяет определить эффективность новых веществ для развития ингибитора. Хотя рекомбинантное выражение Кодона оптимизированная версия человеческого HDAC1 в кишечной палочки было сообщено в последнее время3, попытки выразить полноформатный rpda в этом хоста не удалось4. Кроме того, так как грибковые класс 1 HDACs, такие как РКПК и Мохи выполняют свои функции как мультипротеиновые комплексы, это выгодно использовать родные эндогенные комплексы для ферментативных исследований ингибитора. Однако, вследствие ингибирующих факторов и наличия различных HDACs в грибковых литах, каталитическая активность, измеряемая в цельных экстрактах белка, является относительно низкой и не может быть присвоена отдельным ферментам. Кроме того, предыдущие исследования в нитчатых грибок a. niдулаанс определены класса 2 HDAC, HDAC, как преобладающее деацетилазы в хроматографических фракций грибковых экстрактов. Таким образом, несколько обычных хроматографических мер очистки необходимы для разделения не-HdaA деятельности от грибковых штаммов4. Внедрение стратегии сродства в тандеме (TAP) в а. нидуланс5 значительно облегчило обогащение специфической деятельности деацетилазы. Оригинальный тег TAP состоит из двух белков а домены и кальцино-связывающего пептида (СБПО), разделенных вирусом протеазы (ТэВ) расщепления табака на сайте6. Это позволяет для родного очищения и революции тегами белков, включая их партнеров взаимодействия7. При использовании обогащенных белков для деятельности анализов, мягкая революция в местных условиях расщепления протеазы является важной особенностью очистки тегов TAP. Например, белок с меткой GFP может быть обогащен обездвижимой антителами, однако, не может быть неуловим в местных условиях.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для одноэтапного обогащения активных РКПК комплексов через первый этап очистки C-неизлечимо-меткой RpdA из а. нидули (IgG разделение и РАСЩЕПЛЕНИЕ ТэВ) для последующего скрининга ингибитора применения анализ гистоун деацетилазазы. Как оказалось достаточным, обогащение сродства было ограничено только одним шагом очищения также потому, что ферментативной активности значительно снижается после двухступенчатый очистки крана по сравнению с IgG очистки в одиночку.
Тем не менее, введенный протокол должен также применяться для обогащения других тегами ферментов, участвующих в регулировании хроматина, таких как ацетилтрансферазы, метилтрансферазы и деметилиназы. Путем завершения второго этапа очистки протокола TAP белки, очищенные от помеченных приманок, можно считать сложными партнерами (новых) ферментативных комплексов.
Protocol
1. культивирование а. нидуанов
- Подготовка к инокулям
Примечание: все шаги, кроме инкубации должны быть выполнены под Ламинар потока шкафа.- Испещрять напряжение TAP (например , Тиб 32.12) от Фонда ликерометра (-80 ° с) на глюкозу/ксилосную минимальную среду (gxmm; за литр: 10,0 г глюкозы, 0,5 г ксилосного раствора, 10 мл 1 м ди-аммония тартрат раствор, 20 мл 50 × солевой раствор [на литр: 26,0 г KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g х2PO4, 1 мл хлороформа], 1 мл 1 000 × хытнер в микроэлементов8), включая 1,5% (w/v) агар и необходимые добавки, как описано Тодд et al. 20079. Инкубировать в течение 2 – 3 дней при температуре 37 °C.
Примечание: Тиб 32.1 содержит Rpda:: TAP слияния контролируется ксилонист-индусбл промоутер, ксилф(p)10. Вот почему ксило включен в вышеуказанный рецепт. Опустить ксило при выращивании штаммов, выражающих конструкции, которые не находятся под контролем ксилпа(р). - Подготовьте стерильную трубку 1,5 мл центрифуги с 1,5 мл стерильного решения для суспензии (CSS; 0,9% (w/v), 0,01% (v/v) Полисорбат 80).
- Влажная одноразовая петля прививки в CSS, соскрести конидии от пластины от шага 1.1.1 и приостановить в трубе от шага 1.1.2.
- Передача 150 мкл каждого из кодикал подвески до 10 25 cm2 ячейки культуры колбы с вентиляционной крышкой содержащие GXMM агар в том числе добавки и 200 мкл CSS.
- Распространение конусоидная подвеска в колбы с использованием стерильной петли прививки и инкубировать фляги при температуре 37 ° c в течение 2-3 дней.
- Для сбора коелдий используйте 10 мл CSS в колбе. Вылейте раствор в колбу, плотно закройте колбу с предоставленной винтовой шапкой и энергично встряхните колбу.
- После смачивания грибковой поверхности, полностью соскрести оставшихся хвойных пород с стерильными прививки цикла.
- Pass хвойных через 40 мкм сетчатые фильтры размещены на стерильных 50 мл трубки центрифуги и собирать подвески из пяти фляг в одной трубе.
- Центрифуга трубки на 1 000 × g для 10 мин.
- Decant супернатант и ресуспензируем гранулы в 10 мл CSS на трубе.
- Соберите оба суспензии в одной трубе, промойте пустую трубку с 40 мл CSS, добавьте к подвеске, и центрифугу, как описано в шаге 1.1.9.
- Декант супернатант и ресуспензируем гранулы в 4 мл CSS.
- Подготовьте два серийных 1:50 разведений суспензии и определить количество кохвойных в результате 1:2, 500-Разводненная подвеска с Счетной камерой, как описано11.
- Испещрять напряжение TAP (например , Тиб 32.12) от Фонда ликерометра (-80 ° с) на глюкозу/ксилосную минимальную среду (gxmm; за литр: 10,0 г глюкозы, 0,5 г ксилосного раствора, 10 мл 1 м ди-аммония тартрат раствор, 20 мл 50 × солевой раствор [на литр: 26,0 г KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g х2PO4, 1 мл хлороформа], 1 мл 1 000 × хытнер в микроэлементов8), включая 1,5% (w/v) агар и необходимые добавки, как описано Тодд et al. 20079. Инкубировать в течение 2 – 3 дней при температуре 37 °C.
- Рост и заготовка мицелии
- Во время работы под Ламинар поток кабинета, прививать 4-6 1-литровый конической колбы каждый из которых содержит 250 mL из GXMM включая соответствующие добавки при плотности 5 × 106 хвойных/мл и инкубировать при 180 оборотов в минуту при 37 ° c для 14-16 h.
- Поместите сырную ткань в воронку поверх колбы и процедите мицелию через ткань. Мойте кратко с обожионизированной водой.
- Удалите столько влаги, как это возможно, сжимая мицелия захваченных в сырную ткань между первой руки, а затем бумажные полотенца.
- Передача сушеных мицелий в виде плоских листов в пластиковый стакан с винтовой крышкой и флэш заморозить с жидким азотом. Это обеспечивает высокое соотношение площади/объема для следующего процесса лиофилизации.
- Храните замороженную мицелию при температуре-80 ° c до лиофилизации.
Примечание: протокол может быть приостановлен здесь. - Лиофилизировать мицелию на ночь.
- Остановите сублимированный процесс сушки, когда температура мицелий остается неизменной (18 – 24 ч). Снимите стаканы и сразу же печать с помощью винта шапки.
Примечание: при плотно закрытой, лиофилизированный мицелия может храниться в течение нескольких недель в рт.
2. одноэтапное обогащение крана с меткой HDAC (адаптировано из Байрама и др. 2012)12
- Подготовка буферов и решений
Примечание: добавьте 2-меркаптоэтанол (EtSH) и ингибиторы протеазы в буферы непосредственно перед использованием. Фильтр всех буферов, используемых для хроматографии через 0,22 мкм нитроцеллюлозных мембран, чтобы избежать введения примесей/загрязнений в смолу хроматографии. Инструкции в приведенных ниже шагах касаются подготовки 1 л каждого буфера. Буферы хранилища при температуре 4 °C.- Буфер извлечения (B250): 250 mM перламутр, 100 mM рис-Совместлф 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Растворите 12,35 g из рис-совместимого, 2,62 g из рис (свободная основа), и 13,2 g перламутр в 800 мл деионизированной воды и добавить 10 мл 10% (v/v) решение TX-100.
- Проверьте рН на RT и приспособиться к pH 7,5 с или NaOH или совместимого [5 M], если это необходимо.
- Сделать до 1 л и фильтр через 0,22 мкм нитроцеллюлозной мембраны.
- Добавить 35 мкл из EtSH за 100 мл буфера (5 мм окончательная концентрация) непосредственно перед использованием.
- Буфер для мытья 250 (WB250): 250 mM перламутр, 40 mM рис-совместный рН 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Подготовьте WB250, как описано для B250 (2.1.1), но с 3,59 g из рис-совместимого, и 2,08 g из рис (свободная база).
- Буфер для мытья 150 (WB150): 150 mM перламутр, 40 mM рис-совместный рН 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Подготовьте WB150, как описано для B250 (2.1.1), но с 3,59 g из рис-совместимого, 2,08 g из рис (свободная база), и 8,77 g НАУ.
- Буфер выравнивания в ТэВ (TEB): 150 mM перламутр, 40 mM рис-Совместлф 8,0 (RT), 0,5 mM ЭДТА, 0,1% (v/v) TX-100, 5 мм EtSH.
- То же, что WB150, но добавить ЭДТА 0,5 мм окончательной концентрации.
- Буфер расщепления ТэВ (TCB): 150 mM перламутр, 40 mM рис-Совместлф 8,0 (RT), 0,5 mM ЭДТА, 0,1% (v/v) TX-100, 10% (v/v), 5 мм EtSH.
- Подготовьтесь как описано в шаге 2.1.1 с 3,59 g из рис-совместимого, 2,08 g из рис (бесплатная база), и 8,77 g из нав и добавить 100 мл в гном, прежде чем регулировать громкость до 1 L.
- 50 × ингибитор коктейля протеазы: растворить 1 таблетку коммерчески доступного коктейля ингибиторов протеазы в 1 мл воды и хранить при температуре-20 °C.
- Столовая ложка-т: 50 мм рис-совместный pH 7,6 (RT), 0,9% (Вт/в), 0,1% (v/v) Полисорбат 20.
- Подготовьтесь как описано в шаге 2.1.1. Используйте 6,06 g из рис-совместимого, 1,40 г из рис (свободная база), 9 г НАУ и 1 мл полисорбата 20.
- 5 × LSB (буфер образца Laemmli): 315 mM Рикс-Совместлф 6,8 (RT), 25% (v/v) EtSH, 50% (v/v), 10% (w/v) СДД, 0,05% (w/v) бромофенол синий.
- Буфер извлечения (B250): 250 mM перламутр, 100 mM рис-Совместлф 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Приготовление экстракта белка
- Добавить 1,5 г лиофилизированный мицелия и шлифовальные мяч в шлифовальной банку шарик мельницы.
Примечание: также можно использовать свежую мицелию. При этом сухой мицелия как можно тщательнее до замораживания и убедитесь, что предварительно шлифовальные банки в жидком азоте для измельчения свежих мицелий. - Молоть мицелия в порошок на 25 Гц на 30 с.
Примечание: в тех случаях, когда нет шлифовальных машина доступна, молоть мицелия в порошок с использованием раствора и пещ, как описано Байрам et al. 12. - Передача порошок мицелия порошка на 15 мл трубки центрифуги.
- Наклоните центрифугу трубки, включая землю мицелия, чтобы последующее смешивание мицелия с буфером.
- Добавить 6 мл ледяной B250, включая 1 × ингибитор протеазы коктейль на грамм порошка порошок мицелия и смешать с небольшой шпателем до полного гомогенизации сырой экстракт достигается. При использовании свежей мицелии, обратитесь к Байрам и др. 12 для достижения правильной биомассы для извлечения буферного соотношения.
- Держите трубку на льду в течение 5 минут.
- Поместите трубку и баланс трубки в центрифугу и спина при температуре 40 000 × g для 20 минут при температуре 4 °c. Выполните состояния смолы IgG (шаг 2,3) во время центрифугирования.
- После центрифугирования удалите 10 мкл супернатант для анализа СДПБ-PAGE. Поместите образец в трубку 1,5 mL, содержащую 40 мкл воды и 12,5 мкл 5 × LSB; именуемый "ex" на рисунке 1.
- Осторожно удалите супернатант (очищенная lyнасыт) с помощью серологических пипетки и передачи на колонке, содержащей хаотичны IgG бусы (шаг 2.3) и плотно закрыть с помощью предоставленных конец крышки.
- Добавить 1,5 г лиофилизированный мицелия и шлифовальные мяч в шлифовальной банку шарик мельницы.
- Equilibration смолы IgG (выполняется во время шага 2.2.7)
- Подготовка 10 мл одноразовой хроматографии колонки и пипетки 300 мкл well-ресуспендирован IgG смолы (50% суспензии) в колонке. Заполните столбец до 10 мл с B250 и дайте буферу течь через гравитацию.
- Добавьте 1 мл B250, включая 1 × ингибитор коктейля протеазы и дайте течь через. Подключите нижнюю часть столбца.
- Пакетная очистка TAP-меткой HDAC
- Инкубируйте хроматографию колонки, содержащей хаотичны бисер и очищенная линасыт от шага 2.2.9 на роторный миксер при 10 оборотов в минуту при температуре 4 ° c для 2-4 ч.
- После пакетной привязки, снимите крышку и откройте колонну внизу, чтобы собрать поток.
- Возьмем образец для анализа СДПБ-PAGE, как описано в шаге 2.2.8; именуемый "FT" на рисунке 1.
- Вымойте бисер с 10 мл WB250. Во-первых, используйте 1 mL буфера для того чтобы извлечь захваченного шарики от крышки колонки использующ пицепту и перенести эту подвеску в одном заподлицо на оседлый смолу для того чтобы позволить ресуспендирования шариков. Затем заполните столбец к началу, закрыть с помощью крышки стека и подключиться к перисталетический насос. Отрегулируйте скорость потока приблизительно. 1 – 5 мл/мин. предотвратить смолу от иссякают.
- Повторите шаг 2.4.4 три раза в общей сложности четыре моет с WB250.
- Вымойте шарики 3 времени с 10 mL TEB как описано в 2.4.4 шага.
- Закройте колонку хроматографии в нижней части, ресуспензируем IgG бусины в 1 мл TCB и добавьте 20 μl 50 × ингибитор коктейля протеазы, а также 10 мкл ТэВ (~ 1 мг/мл БУЛЬОНА, S219V Мутантный вариант производства в доме).
- Крышка колонны и инкубировать на вращающийся миксер при 10 оборотов в минуту при температуре 4 ° с на ночь, чтобы элюировать белковых комплексов связаны через помеченные HDAC.
Примечание: в качестве альтернативы следует выполнять дайджест ТэВ при повышенной температуре (16 – 25 °C), что уменьшает время реакции, однако, повышается риск деградации белка. - На следующий день откройте колонну и соберите элюсат в трубке центрифуги 2 мл. Используйте 0,7 mL TCB для того чтобы извлечь шарики от крышки и прополоскать стену колонки.
- Поместите колонну на открытую 2 мл трубки с предыдущего шага, который сам находится в трубе центрифуги 50 mL.
- Передача этой сборки в таблице верхней центрифуги и спина на 300 × g для 2 мин. Это-увэлюсат ТэВ.
Примечание: при выполнении очистки тандем сродство, использовать ТэВ в качестве ввода для Кальмодулин шаг сродства. Вы также можете разделить ТэВ и использовать одну часть для определения активности HDAC и второй части для завершения очистки TAP. - Удалите 50 мкл с элюэтом ТэВ и добавьте 12,5 мкл 5 × LSB для СДБ-PAGE (именуемый "TE" в цифрах 1 и 2) и сохранить оставшийся эусат на льду.
- Чтобы оценить эффективность протеазы, добавьте 2 мл 5% (v/v) ацететической кислоты и Инкубируйте в RT в течение 5 мин. Опять же, использовать первый mL для ресуспензируем смолы.
- Соберите кислотный элюсат и снова Возьмите образец 50 мкл и добавьте 12,5 мкл 5 × LSB (именуемый "AE" на рисунке 1). LSB пожелтеет при добавлении к кислым раствором. Чтобы нейтрализовать кислоту, добавьте 10 м NaOH на ступени 1 мкл и хорошо перемешайте, пока цвет не изменится на синий.
- Re-equilibrate IgG смолы с ти-т, чтобы нейтрализовать кислоту. Храните смолу в х-т/20% (v/v) этанол при температуре 4 °C для повторного использования с тем же тегом белка.
- Хранение фракций революции
- Aliquot элюта в ~ 100 мкл фракций, чтобы избежать многократных циклов замораживания-оттаивания.
- Заморозить аликуты в жидком азоте и держать при температуре-80 ° c.
Примечание: образцы, хранящиеся таким образом, будут стабильными в течение нескольких месяцев без потери ферментативной активности.
3. анализ очистки по СДС-Пейдж и Западной промокательной
- Используйте стандартные протоколы для литья ГДС-полиакриламида гели или использовать сборного железобетона гели13. Образцы геля дентурации из предыдущего раздела при температуре 95 ° c в течение 5 мин, центрифуга на уровне 15 000 × g для 5 мин, и нагрузка на 12% гели. Рекомендуемые объемы погрузки приведены в легенду рисунка 1. Электрофорезе образцы в 1 × рис-глицин ГДС-PAGE работает буфер на 180 V константа в течение 60-70 мин, пока брофенанол синий маркер буфера СДС-страницы загружается начинает мигрировать из геля.
- Используйте стандартные протоколы для серебра окрашивание гели. Например, используйте протокол Блюм et al. 198714 , что также совместимо с анализом MS.
- Используйте стандартные протоколы для Западной промокательной15. Для генерации репрезентативных результатов ниже использовалась коммерчески доступная система промокательной работы.
- Пробковые пятна с коммерчески доступными антикальциносвязывающими белками (анти-УТПО) антителами в 5% (w/v) сухое молоко в ТБС-т при температуре 4 °C в одночасье.
Примечание: анти-УТС антитела направлен против части Теги TAP еще присутствуют после расщепления ТэВ. - Используйте стандартные протоколы для обнаружения и разработки blots. Например, anti-кролик IgG-щелочная фосфатазы сопрягать и субстрат развития BСИГ/NBT цвет был использован для поколения репрезентативных результатов ниже.
4. деацетилазы анализ с использованием в пробирке [3ч] ацетат-помечены куриные ретикулоцитов гистоны (взято из троер et al. 2003)4
- Обратитесь к протоколу Келле и др . 199816 для подготовки [3ч] ацетата-помечены куриные ретикулоцитов гистоны.
- За состояние пробирки поместить три 1,5 mL центрифужные трубы на льду для измерений в трикличатов. Также подготовьте три трубы для буфера только фоновый контроль.
- Положите 25 мкл из WB150 в каждую трубку и добавьте 25 мкл из элюсат ТэВ из 2.4.11 шага и продолжайте лед.
- Разогреть трубку инкубатора до 25 °C.
- Используйте интервалы 15 s (стоп-часы) для добавления 10 мкл маркированные гистоны [1,5 mg/mL] к каждой трубе.
- Перед началом анализа, занимают 10 мкл из [3ч] ацетат-помечены куриные хистоны и начать стоп-часы.
- Через пять секунд после старта, добавить помечены гистоны, закройте трубку плотно, вихрь, и положил его в инкубатор.
- Используйте интервалы 15 с для добавления 10 мкл маркированные Гистоны и продолжайте, как описано в предыдущем шаге.
- После 60 мин инкубация добавить 50 мкл стоп-решения (1 M совместимого/0,4 м ацететической кислоты) для каждой трубки в 15 с интервалом; вихря немедленно. После добавления Кислотный раствор, пробирные смеси является стабильным и может храниться в РТ до следующего шага.
- Добавьте 800 мкл этилацетата к каждой трубке для извлечения выпущенной [3ч] ацететической кислоты.
- Плотно закройте трубы и вихрь каждую трубку на 5 с.
- Поместите трубку в микроцентрифугу и спина на 10 000 × g в течение 10 минут на RT.
- В то же время подготовить один Сцинтилляционный флакон на анализ образца и добавить 3 мл Сцинтилляционный коктейль для гидрофобных образцов.
- После центрифугирования (шаг 2,12), осторожно перенесите 600 мкл верхней органической фазы в подготовленные сцинтилляционных труб и плотно закройте трубы.
- Измерить радиоактивность, соответствующую активности HDAC в жидкой сцинтилляционных счетчике.
Representative Results
Типичный результат представленного одноэтапного обогащения РКПК показан на рисунке 1 (именуемый "IgG"). В целях полноты, мы также включили дроби-сквозные фракции ("CFT" и "CE"), иллюстрирующие второй шаг очищения Кальмодулин смолы ("CaM"), как описано12. Отображаемое серебристо-окрашенный гель (A) наглядно иллюстрирует эффективность первого шага сродства, который еще больше увеличивается при выполнении очистки тандем. Наиболее известные белки, присутствующие в белковом экстракте, и проток, однако, уже истощены в элюэте ТэВ (TE). Важно обратить внимание на то, что дробные фракции ТэВ являются > 100 × концентрированными по сравнению с экстрактом и потоком. Звездочки отмечают меткой RpdA (Сравните панель B). Расчетные МВт РКПК, включая СБВ (РКПК:: УТПО) является 82 kDa, однако, белок мигрирует на гораздо более высокую кажущуюся молекулярную массу около. 120 kDa. Это явление наблюдалось ранее и может быть назначено на конкретные свойства его C-конечной остановки4,17. Иммунообмного (B) показывает сильные сигналы, мигрирующие в приблизительно. 120 kDa, соответствующие СБК маркированного полноформатный RpdA (РКПК:: УТПО) в ЭЛЮЭТЕ ТэВ ("Te"), Кальмодулин поток через ("CFT"), и элюсат ("CE") фракций. В кислотной элюте ("AE") виден второй сигнал со слегка более крупной МВт. Это представляет собой долю с меткой RpdA TAP, связанной с смолой IgG, которая не была выпущена расщепление ТэВ. Разница в размере соответствует 16 kDa белка повторение uncleaved РКПК:: TAP. Как и ожидалось, никакие группы не могут быть обнаружены антителами анти-УТС в группах дикого типа (группа B, "Дикий тип").
Результаты репрезентативного анализа активности деацетилазы при конкретном ингибитор HDAC трихолостатин а (TSA) отображаются на рисунке 2. Этот анализ был первоначально разработан для растений18 и также используется для ингибитора скрининга против млекопитающих деацетилазы19,20. Гистоны используемые для анализа были маркированы и подготовлены как описано16. Показано влияние повышения концентраций TSA на каталитическую активность обогащенного РКПК комплекса ("TE ± TSA"). Чувствительность деятельности подтверждает, что измеренные значения за тысячу показов действительно обусловлены РКПК и не вызваны неспецифическая активность протеазы. Это важное замечание, поскольку это указывает на то, что ТэВ, который присутствует в довольно высокой концентрации, не вмешивается в анализ активности HDAC. Для того, чтобы назначить измеренное действие HDAC на РКПК, штамм дикого типа использовался как отрицательный элемент управления ("Co"). Как и ожидалось, лишь незначительная активность HDAC (приблизительно 5-10% от доли обогащенных РКПК) была обнаружена в ТэВ элюсат дикого типа. Интересно отметить, что активность HDAC значительно снижается после второго шага по очистке сродства («CE») по сравнению с эувелой ТэВ.
На рисунке 1. Тандем близость пурификацииз TAP-меткой RpdA. Из серебра окрашенных 10% ГДС-полиакриламида гель (а) и Вестерн-блот зондируемой с анти-УТС антитела (B) отображаются. Лейн маркировки и загружены объемы следующие: "м": 2 μL из 1:10 разбавленный белковый маркер (серебро пятно), 3,5 μl из предварительно окрашенных белка маркер (Вестерн-блот); "Ex": образец белка экстракт, подготовленный в шаге 2.2.8 (2 μL 1:10 разбавления, 5 μl); "FT": IgG смолы потока через образец, подготовленный в шаге 2.4.3 (2 μL из 1:10 разбавления, 5 μL); "AE": кислотный элюсат 2.4.14 шага (10 μl, 10 μl); "TE": ТэВ элюта ночной елкой на расщепление ТэВ, шаг 2.4.12 (10 μL, 10 μl); "CFT": проток кальмодулина (20 мкл, 20 мкл); "CE": кальмодулина элюат (10 мкл, 10 мкл). Размер выбранных протеинов маркера показан на левой стороне панелей. Объемы, приведенные в скобках, соответствуют примерным нагрузкам на серебряные пятна и западную помарку соответственно. Звездочки в серебристо-окрашенный гель указывают на RpdA синтеза белка. Иммунооблот (б) был обнаружен с помощью щелочных фосфатазы с использованием системы цветового развития бсиб/НБТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунке 2. HDAC анализ активности при повышении концентрации трихотин а. Эффективность ингибирования РКПК была протестирована с 25 мкл сродо-очищенных рекомбинантных РКПК ("TE") и 25 мкл 0, 10, 50, и 500 Нм ингибитора HDAC в TSA, разбавленного в RPDA-1640 среде. RPMI использовался для оценки фоновой активности ("пустой"). Показаны действия конечного элюта после второй ступени Кальмодулин-сродства («CE») и немаркированного штамма после первого шага очищения сродства (отрицательный элемент управления, «CO»). Мероприятия показаны в процентах от обогащенного РКПК без TSA (100%, "TE"). Бары ошибок обозначают стандартное отклонение трех реплицирует. Эта цифра была изменена с Бауэр et al. 20162. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Discussion
Этот протокол описывает одноэтапное обогащение крана с меткой класса 1 HDAC от нитевидные гриба а. niдуланы для оценки активности в пробирке деацетилазы. Тег TAP был первоначально введен в Хлебопекарные дрожжи для идентификации белок-белок взаимодействия партнеров тегами белка6. Впоследствии, тег был Codon-оптимизирован для его использования в A. широко5. Здесь мы предоставляем прямой шаг за шагом протокол для применения первого шага очистки сродства стратегии TAP для одноэтапного обогащения класса 1 HDAC RpdA. Второй этап очищения сродства явно повышает уровень очищения, что особенно важно для идентификации взаимодействующих с приманкой белков. Тем не менее, только первый шаг рекомендуется для последующего тестирования активности, так как отсутствие существенного загрязнения после первого шага было подтверждено контрольным экспериментом с использованием штамма дикого типа. Кроме того, неуловенная активность значительно выше после одноэтапного обогащения по сравнению с полным TAP. В дополнение к RpdA2, этот протокол был также успешно использован для очистки а. нидуанс комплексов второго класса 1 HDAC Мохи21.
Из-за наших наблюдений, что грибковые класса 1 HDACs строить стабильные комплексы4, нам удалось изменить протокол Bayram et al. 201212 , что представляет собой основу этого метода. Тем не менее необходимо упомянуть некоторые критические шаги. Подготовка высококонцентрированных протеиновых экстрактов для обеспечения почти физиологических условий имеет решающее значение для комплексной стабильности. Поэтому важно учитывать приведенные рекомендации относительно соотношения биомассы и экстракции. В этом отношении, также важно использовать хорошо измельчению тонких порошков порошок мицелия для обеспечения надлежащей добычи. Здесь использование шлифовального станка явно выгодно. Как упоминалось в секции протокола, стоит попробовать шаг к расщеплению ТэВ для 1-2 h при комнатной температуре, чтобы ускорить очистку. Это было проверено на РКПК без соблюдения каких-либо пагубных последствий для стабильности (неопубликованные наблюдения, Бауэр I, 2018). Кроме того, замена NP40 (используется в оригинальном протоколе) с TX-100 может не подходить для других белковых комплексов. При использовании этого метода для очистки других белков с тегами TAP следует также обратиться к протоколу Байрама, который содержит ряд ценных подсказок, которые могут быть полезны для достаточного очищения других белковых комплексов12.
Кроме того, здесь описано TAP-метод, другие теги сродство и методы обычно используются для одноэтапного обогащения белка нитевидные грибы, в том числе его-и GFP-Теги. Однако, поскольку класс 1 HDACs обычно функционируют как высокомолекулярно-Весовые комплексы, условия его создания являются предпосылкой для обогащения каталитически активных HDACs. Важно, что многие другие очищения сродства выполняются при неблагоприятных условиях. Например, обогащение HDACs через GFP-ловушка, которая основана на антиген-антитело взаимодействия, не подходит из-за кислых условий, мешающих с белково-белковым взаимодействием комплексов HDACS, связанных с смол. Кроме того, попытки очистить его-меткой RpdA металла челате близость хроматографии22, привели к значительной потере каталитической активности во время процедуры очищения, хотя имидазол вместо низкого pH условия был использован для революции ( неопубликованные данные, Бауэр, I, 2010).
Одним из ограничений описанного протокола ферментативного анализа является использование радиоактивного субстрата. Тем не менее, исследования на флуоресцентной основе были разработаны, а23,24 и являются коммерчески доступными. Эти анализы выполняются в хорошо пластин и, таким образом, подходят также для высокой пропускной способностью скрининга ингибиторов HDAC. В этом случае потребуется высококлассные из представленных процедур.
Потенциальные предстоящие применения этого протокола включают обогащение конкретных суб-комплексов класса 1 HDACs для оценки их специфических физиологических функций и/или различий в их восприимчивости к ингибиторам HDACS. При создании описанного метода для других ферментов настоятельно рекомендуется выполнить отрицательный контроль эксперимента с немаркированного штамма. Это обеспечивает специфичность измеренных видов деятельности фермента и покажет загрязнение неопределенно связанными ферментами.
Очищение и анализ активности, описанный здесь, могут быть выполнены в течение двух дней, а обогащенные ферменты стабильны в течение по крайней мере нескольких месяцев, при хранении в аликвоте при температуре-80 ° c. В заключение, этот протокол представляет собой относительно простой и экономически эффективный способ достичь комплексов HDAC класса 1 для измерения активности и определения эффективности ингибитора.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Петру Мершак, Отдел молекулярной биологии (Биоввод, медицинский университет Инсбрук), за помощь и поддержку в отношении этой рукописи. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить рецензентов за их ценные комментарии.
Эта работа была профинансирована австрийским научным фондом (P24803 к SG и P21087 к GB) и интрамурально фондировать (Муи старт, ST201405031 к IB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x SDS-PAGE running buffer | Novex | ||
| 2-mercaptoethanol (EtSH) | Roth | 4227 | |
| 25 cm2 cell culture flasks with vent cap | Sarstedt | 833910002 | For spore production |
| 47 mm vacuum filtration unit | Roth | EYA7.1 | |
| AccuFLEX LSC-8000 | HITACHI | – | Scintillation counter |
| Acetic acid | Roth | 7332 | |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody | Millipore | 07-482 | Used at 1:1333 dilution |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody | Sigma-Aldrich | A3687 | |
| Ball mill | Retsch | 207450001 | Mixer Mill MM 400 |
| BCIP/NBT | Promega | S3771 | Color development substrate for AP |
| Cell strainer | Greiner | 542040 | |
| Cheese cloth for harvesting mycelia | BioRen | H0028 | Topfentuch |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Roth | 4720 | |
| EDTA | Prolabo | 20309.296 | |
| Ethyl acetate | Scharlau | Ac0155 | |
| Freeze Dryer | LABCONCO | 7400030 | FreeZone Triad |
| Glycerol | Roth | 3783 | |
| HCl | Roth | 4625 | |
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | IgG Sepharose 6 Fast Flow |
| Inoculation loops | VWR | 612-2498 | |
| KOH | Merck | 5033 | |
| Laminar flow cabinet | Thermo Scientific | – | Hera Safe KS |
| Mixed Cellulose Esters Membrane Filters | Millipore | GSWP04700 | |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NaOH | Roth | 6771 | |
| Neubauer counting chamber improved | Roth | T728 | |
| Novex gel system | Thermo Scientific | For SDS-PAGE | |
| Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) | Thermo Scientific | LC2675 | Running buffer for SDS-PAGE |
| peqGold protein-marker II | VWR | 27-2010P | Protein ladder used for silver stain |
| Peristaltic Pump P-1 | GE Healthcare | 18111091 | |
| Pipette controller | Brand | 26302 | accu-jet pro |
| Poly-Prep chromatography columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProSieve QuadColor protein marker | Biozym | 193837 | Prestained protein ladder used for western blot |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free |
| Rotary mixer | ELMI | – | Intelli-Mixer RM-2 S |
| Rotiszint eco plus | Roth | 0016 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Scintillation vials | Greiner | 619080 | |
| Sorvall Lynx 4000 | Thermo Scientific | ||
| Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| TIB32.1 | A. nidulans rpdA::TAP strain. Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1; argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+ |
||
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 1704271 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | 1704150 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma-Aldrich | T8552 | 5 mM stock in DMSO |
| Tris (free base) | Serva | 37190 | |
| Tris-HCl | Roth | 9090 | |
| Polysorbate 20 | Roth | 9127 | Tween 20 |
| Polysorbate 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | Tween 80 |
| TX-100 | Acros Organics | 215682500 | Triton X-100, Octoxynol-9 detergent |
References
- Gregoretti, I. V., Lee, Y. -M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. Journal of Molecular Biology. 338 (1), 17-31 (2004).
- Bauer, I., et al. A Class 1 Histone Deacetylase with Potential as an Antifungal Target. mBio. 7 (6), (2016).
- Stefan, A., et al. Purification of active recombinant human histone deacetylase 1 (HDAC1) overexpressed in Escherichia coli. Biotechnology Letters. 40 (9-10), 1355-1363 (2018).
- Trojer, P., et al. Histone deacetylases in fungi: novel members, new facts. Nucleic Acids Research. 31 (14), 3971-3981 (2003).
- Bayram, Ö, et al. VelB/VeA/LaeA complex coordinates light signal with fungal development and secondary metabolism. Science. 320 (5882), 1504-1506 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48, (2001).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Zadra, I., Abt, B., Parson, W., Haas, H. xylP promoter-based expression system and its use for antisense downregulation of the Penicillium chrysogenum nitrogen regulator NRE. Applied and Environmental Microbiology. 66 (11), 4810-4816 (2000).
- Stolz, D. J., et al. Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Bayram, Ö, et al. Identification of protein complexes from filamentous fungi with tandem affinity purification. Methods in Molecular Biology. 944, 191-205 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Kölle, D., et al. Biochemical methods for analysis of histone deacetylases. Methods. 15 (4), 323-331 (1998).
- Tribus, M., et al. A novel motif in fungal class 1 histone deacetylases is essential for growth and development of Aspergillus. Molecular Biology of the Cell. 21 (2), 345-353 (2010).
- Sendra, R., Rodrigo, I., Salvador, M. L., Franco, L. Characterization of pea histone deacetylases. Plant Molecular Biology. 11 (6), 857-866 (1988).
- Valente, S., et al. 1,3,4-Oxadiazole-containing histone deacetylase inhibitors: anticancer activities in cancer cells. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (14), 6259-6265 (2014).
- Mai, A., et al. Synthesis and biological properties of novel, uracil-containing histone deacetylase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (20), 6046-6056 (2006).
- Pidroni, A., et al. A Class 1 Histone Deacetylase as Major Regulator of Secondary Metabolite Production in Aspergillus nidulans. Frontiers in Microbiology. 9, 2212 (2018).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Wegener, D., Wirsching, F., Riester, D., Schwienhorst, A. A fluorogenic histone deacetylase assay well suited for high-throughput activity screening. Chemistry & Biology. 10 (1), 61-68 (2003).
- Peng, L., Yuan, Z., Seto, E. Histone deacetylase activity assay. Methods in Molecular Biology. 1288, 95-108 (2015).
