Summary
Klass 1 histondeacetylaser (HDACs) som RpdA har vunnit betydelse som potentiella mål för att behandla svamp infektioner. Här presenterar vi ett protokoll för den specifika berikningen av TAP-märkta RpdA kombinerat med en HDAC aktivitets analys som gör in vitro effektivitets test av histondeacetylashämmare.
Abstract
Klass 1 histondeacetylaser (HDACs) som RpdA har vunnit betydelse som potentiella mål för behandling av svamp infektioner och för genombrytning av svamp sekundära metaboliter. Inhibitor screening kräver dock renade enzym aktiviteter. Eftersom klass 1 deacetylaser utövar sin funktion som multiproteinkomplex, är de vanligt vis inte aktiva när de uttrycks som enstaka polypeptider i bakterier. Därför, endogena komplex måste isoleras, som, när konventionella tekniker som jonbyte och storlek uteslutning kromatografi tillämpas, är mödosam och tids krävande. Tandem affinitet rening har utvecklats som ett verktyg för att berika multiprotein komplex från celler och därmed visade sig vara idealisk för isolering av endogena enzymer. Här ger vi ett detaljerat protokoll för ett steg berikning av aktiva RpdA komplex via den första rening steg C-terminally TAP-märkta RpdA från Aspergillus nidulans. De renade komplexen kan sedan användas för den efterföljande inhibitor screening som tillämpar en deacetylasanalys. Proteinberikningen tillsammans med enzymatisk aktivitets analys kan slutföras inom två dagar.
Introduction
Histone deacetylaser (HDACs) är Zn2 +-beroende Hydrolytiska enzymer som kan ta bort acetylgrupper från lysinrester av histoneroch andra proteiner. Baserat på sekvensen likhet, är HDACs grupperas i flera klasser1. Nyligen, den svamp klass 1 HDAC RpdA, en ortolog av bagerijäst (Saccharomyces cerevisiae) Rpd3p, visades vara avgörande för opportunistiska svamp patogenen Aspergillus fumigatus2. Därför har RpdA vunnit betydelse som ett potentiellt mål att behandla svamp infektioner2. Bedömning av deacetylasaktivitet in vitro är viktigt för karakterisering av enzymatiska egenskaper och gör det möjligt att bestämma effekten av nya substanser för inhibitor utveckling. Även om rekombinant uttryck för en Codon-optimerad version av mänskliga HDAC1 i Escherichia coli har rapporter ATS nyligen3, försök att uttrycka ful längds rpda i denna värd misslyckades4. Dessutom, eftersom svamp klass 1 HDACs såsom RpdA och HosA utövar sin funktion som multiprotein komplex, det är gynnsamt att använda infödda endogena komplex för enzymatiska inhibitor studier. På grund av hämmande faktorer och förekomst av olika HDACs i svamplysater, är katalytisk aktivitet mätt i hela protein extrakt relativt låg och kan inte hänföras till enskilda enzymer. Dessutom tidigare studier i trådformiga svampen a. nidulans identifierat en klass 2 HDAC, hdaa, som dominerande histondeacetylas i kromatografiska fraktioner av svamp extrakt. Således behövs flera konventionella kromatografiska renings steg för att separera icke-HdaA-aktivitet från svamp stammar4. Introduktionen av tandem-affinitetsrenings strategin (TAP) i A. nidulans5 har avsevärt minskat anrikningen av specifika deacetylasaktiviteter. Den ursprungliga TAP-taggen består av två protein A-domäner och en calmodulinbindande peptid (CBP) som skiljs åt av ett tobaks virus (TEV) klyvning plats6. Detta möjliggör inhemsk rening och eluering av taggade proteiner inklusive deras interaktions partners7. Vid användning av berikade proteiner för aktivitets analyser är den milda elueringen under infödda förhållanden genom proteasklyvning ett viktigt inslag i TAP-taggen rening. Ett GFP-märkt protein, till exempel, kan berikas av immobiliserade anti kroppar samt, dock, kan inte elueras under inhemska förhållanden.
Här ger vi ett detaljerat protokoll för enstegs berikning av aktiva RpdA-komplex via den första renings steget av C-terminally TAP-märkta RpdA från a. nidulans (IgG separation och TeV klyvning) för efterföljande inhibitor screening tillämpa en av histondeacetylasanalys. Som visat sig vara tillräcklig, affinitet berikning begränsades till bara ett renings steg också eftersom den enzymatiska aktiviteten reducerades signifikant efter två steg rening jämfört med IgG rening ensam.
Icke desto mindre bör det införda protokollet också vara tillämpligt för berikning av andra märkta enzymer som är involverade i kromatin-reglering såsom acetyltransferaser, metyltransferaser och demetylaser. Genom att lägga till det andra renings steget i TAP-protokollet kan proteiner som är samrenas med de taggade beten betraktas som komplexa partners av (roman) enzymatiska komplex.
Protocol
1. odling av A. nidulans
- Förberedelse av inoculum
Anmärkning: alla steg bortsett från inkubation bör utföras under ett laminärt flöde skåp.- Stryk ut TAP-stammen (t. ex. TIB 32,12) från glycerolbeståndet (-80 ° c) till glukos/Xylose minimalt medium (gxmm; per liter: 10,0 g glukos, 0,5 g Xylose, 10 ml 1 M Ammoniumtartratlösning, 20 ml 50 × saltlösning [per liter: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2Po4, 1 ml kloroform], 1 ml 1 000 × hutners spår element8) inklusive 1,5% (w/v) agar och de nödvändiga kost tillskott som beskrivs av Todd et al. 20079. Inkubera i 2 – 3 dagar vid 37 ° c.
Anmärkning: TIB 32.1 innehåller en Rpda:: Tap fusion kontrol leras av en Xylose inducerbara promotor, xylp(p)10. Det är därför Xylosen ingår i ovanstående recept. Utelämna Xylosen när växande stammar uttrycker konstruktioner som inte är under Xylp(p) kontroll. - Förbered en steril 1,5 mL centrifug tub med 1,5 mL steril konidial SUS pension lösning (CSS, 0,9% (w/v) NaCl, 0,01% (v/v) polysorbat 80).
- Blöt en disponibel ympning slinga i CSS, skrapa av barr träd från plattan från steg 1.1.1 och suspendera i röret från steg 1.1.2.
- Överför 150 μL vardera av barr upphängningen till 10 25 cm2 -cellskulturkolvar med ventilations lock innehåll ande GXMM-agar, inklusive tillägg och 200 ΜL av CSS.
- Sprid ut Barr träds upphängningen i kolvar med hjälp av en steril inympningsloop och Kubera kolvar vid 37 ° c i 2 – 3 dagar.
- För att skörda conidia, Använd 10 mL av CSS per kolv. Häll lösningen i en kolv, Stäng kolven tätt med det medföljande skruv locket och skaka flaskan kraftigt.
- Efter vätning av svamp ytan, skrapa helt av kvarvarande Barr träd med en steril inympningsloop.
- Passera conidia genom 40 μm cell silar placeras på en steril 50 mL centrifug röret och samla in SUS pensionen av fem kolvar i ett rör.
- Centrifugera röret vid 1 000 × g i 10 min.
- Häll av supernatanten och återupplägg pelleten i 10 mL CSS per tub.
- Samla båda SUS pensioner i ett rör, skölj Tom röret med 40 mL av CSS, tillsätt i SUS pensionen, och centrifugera enligt beskrivningen i steg 1.1.9.
- Häll av supernatanten och omsuspendera conidial pelleten i 4 mL CSS.
- Bered två seriella 1:50 utspädningar av barr upphängningen och bestäm antalet Barr träd i den resulterande 1:2, 500-utspädda SUS pensionen med en räknings kammare enligt beskrivningen11.
- Stryk ut TAP-stammen (t. ex. TIB 32,12) från glycerolbeståndet (-80 ° c) till glukos/Xylose minimalt medium (gxmm; per liter: 10,0 g glukos, 0,5 g Xylose, 10 ml 1 M Ammoniumtartratlösning, 20 ml 50 × saltlösning [per liter: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2Po4, 1 ml kloroform], 1 ml 1 000 × hutners spår element8) inklusive 1,5% (w/v) agar och de nödvändiga kost tillskott som beskrivs av Todd et al. 20079. Inkubera i 2 – 3 dagar vid 37 ° c.
- Tillväxt och skörd av mycelier
- Under arbete under ett laminärt flödes skåp, Inokulera 4 – 6 enliterskolvar som vardera innehåller 250 mL GXMM inklusive lämpliga kost tillskott med en densitet av 5 × 106 conidia/ml och inkubation vid 180 rpm vid 37 ° c i 14 – 16 timmar.
- Placera ostduk i en tratt ovanpå en kolv och filtrera mycelier genom trasan. Tvätta kort med avjoniserat vatten.
- Ta bort så mycket fukt som möjligt genom att klämma mycelier fångade i ost duken mellan först händerna och sedan pappers hand dukar.
- Överför den torkade mycelier som platta ark till en plast bägare med ett skruv lock och Flash frysa med flytande kväve. Detta säkerställer ett högt Area/volym förhållande för följande frystorkad process.
- Förvara den frysta mycelier vid-80 ° c före frystorkad.
Obs: protokollet kan pausas här. - Lyophilize den mycelier över natten.
- Stoppa frys torkning när temperaturen på mycelier förblir konstant (18-24 h). Ta bort bäckar och försegla omedelbart med de medföljande skruv locken.
Obs: när tätt tätad, frystorkad mycelier kan lagras i flera veckor vid RT.
2. ett steg berikande av TAP-märkta HDAC (anpassad från Bayram et al. 2012)12
- Beredning av buffertar och lösningar
Obs: Tillsätt 2-merkaptoetanol (EtSH) och proteashämmare till buffertar direkt före användning. Filtrera alla buffertar som används för kromatografi genom 0,22 μm nitrocellulosamembran för att undvika att föroreningar/kontamineringar förs in i kromatografiharts. Instruktionerna i stegen nedan avser beredning av 1 L för varje buffert. Lagra buffertar vid 4 ° c.- Extraktionsbuffert (B250): 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Lös upp 12,35 g av Tris-HCl, 2,62 g av tris (fri bas) och 13,2 g av NaCl i 800 mL avjoniserat vatten och tillsätt 10 mL 10% (v/v) TX-100 lösning.
- Kontrol lera pH vid RT och justera till pH 7,5 med antingen NaOH eller HCl [5 M], om det behövs.
- Gör upp till 1 L och filtrera genom ett 0,22 μm nitrocellulosa membran.
- Tillsätt 35 μL EtSH per 100 mL buffert (5 mM slutlig koncentration) direkt före användning.
- Tvättbuffert 250 (WB250): 250 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Förbered WB250 enligt beskrivningen för B250 (2.1.1) men med 3,59 g av Tris-HCl, och 2,08 g av tris (fri bas).
- Tvättbuffert 150 (WB150): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Förbered WB150 enligt beskrivningen för B250 (2.1.1) men med 3,59 g av Tris-HCl, 2,08 g av tris (fri bas) och 8,77 g av NaCl.
- TEV-utjämningsbuffert (TEB): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Samma som WB150 men tillsätt EDTA till 0,5 mM slutlig koncentration.
- TEV-klyvning buffert (TCB): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 10% (v/v) glycerol, 5 mM EtSH.
- Förbered enligt beskrivningen i steg 2.1.1 med 3,59 g av Tris-HCl, 2,08 g av tris (fri bas) och 8,77 g av NaCl och tillsätt 100 mL glycerol innan du justerar volymen till 1 L.
- 50 × proteashämmare, cocktail: lös upp 1 tablett av en kommersiellt tillgänglig cocktail av proteashämmare i 1 mL vatten och förvara vid-20 ° c.
- TBS-T: 50 mM Tris-HCl pH 7,6 (RT), 0,9% (vikt/volym) NaCl, 0,1% (v/v) polysorbat 20.
- Förbered enligt beskrivningen i steg 2.1.1. Använd 6,06 g av Tris-HCl, 1,40 g av tris (fri bas), 9 g NaCl och 1 mL polysorbat 20.
- 5 × lsb (laemmli provbuffert): 315 mm Tris-HCl pH 6,8 (RT), 25% (v/v) etsh, 50% (v/v) glycerol, 10% (vikt/volym) SDS, 0,05% (w/v) bromfenolblått blå.
- Extraktionsbuffert (B250): 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Beredning av protein extrakt
- Tillsätt 1,5 g frystorkad mycelier och en slipboll i slipburken på en kulkvarn.
Obs: färska mycelier kan användas också. När du gör det, torka mycelier så grundligt som möjligt innan frysning och se till att förkyla slipburkar i flytande kväve för slipning färsk mycelier. - Slipa mycelier till pulver vid 25 Hz i 30 s.
Anmärkning: i de fall där ingen slipmaskin finns, slipa mycelier till ett pulver med hjälp av en mur bruk och mortelstöt, som beskrivs av Bayram et al. med 12. - Överför Mycelial pulver till en 15 mL centrifug tub.
- Luta centrifug röret inklusive marken mycelier att tillåta efterföljande blandning av mycelier med buffert.
- Tillsätt 6 mL iskall B250 inklusive 1 × proteashämmare cocktail per gram Mycelial pulver och blanda med en liten spatel tills fullständig homogenisering av rå extraktet uppnås. När du använder färska mycelia, hänvisa till Bayram et al. 12 för att uppnå rätt bio massa för extraktion Buffertkvot.
- Håll röret på is i 5 min.
- Placera röret och ett balans rör i en centrifug och snurra på 40 000 × g i ≥ 20 min vid 4 ° c. Utför jämvikt av IgG-harts (steg 2,3) under centrifugering.
- Efter centrifugering, ta bort 10 μL av supernatanten för SDS-PAGE analys. Placera provet i ett 1,5 mL-rör som innehåller 40 μL vatten och 12,5 μL 5 × LSB. kallas "ex" i figur 1.
- Ta försiktigt bort supernatanten (rensat lysat) med hjälp av en serologisk pipett och överför den till kolonnen som innehåller de utjämnat IgG-pärlorna (steg 2.3) och tätt nära med det medföljande änd locket.
- Tillsätt 1,5 g frystorkad mycelier och en slipboll i slipburken på en kulkvarn.
- Jämvikt mellan IgG-harts (utförd under steg 2.2.7)
- Bered en 10 mL disponibel kromatografikolonn och Pipettera 300 μL väl resuspenderat IgG-harts (50% flyt gödsel) i kolonnen. Fyll upp kolonnen till 10 mL med B250 och låt bufferten flöda igenom genom gravitation.
- Tillsätt 1 mL B250 inklusive 1 × proteashämmare cocktail och låt flöda igenom. Koppla in kolumnens nederkant.
- Batchrening av TAP-märkta HDAC
- Inkubera kromatografikolonnen innehåll ande de utjämnbara pärlorna och det renade lysatet från steg 2.2.9 på en roterande mixer vid 10 rpm vid 4 ° c i 2 – 4 timmar.
- Efter batchbindningen, ta bort locket och öppna kolumnen längst ned för att samla in genomflödet.
- Ta ett prov för SDS-PAGE analys som beskrivs i steg 2.2.8; kallas "FT" i figur 1.
- Tvätta pärlor med 10 mL WB250. Använd först 1 mL buffert för att ta bort fångade pärlor från kolonnlocket med hjälp av en pipett och överför denna SUS pension i en färg till den reglerade kådan för att möjliggöra återfjädring av pärlorna. Fyll sedan upp kolumnen till toppen, nära med en stack mössa och ansluta till en peristaltisk pump. Justera en flödes hastighet på ca 1 – 5 mL/min. förhindra att kådan går torrt.
- Upprepa steg 2.4.4 tre gånger för sammanlagt fyra tvättar med WB250.
- Tvätta pärlor tre gånger med 10 mL TEB enligt beskrivningen i steg 2.4.4.
- Stäng kromatografikolonnen längst ner, omsuspendera IgG-pärlor i 1 mL TCB och tillsätt 20 μL av 50 × proteashämmare och cocktail samt 10 ΜL TeV (~ 1 mg/ml lager, S219V Mutant variant produceras i egen hus).
- Locket kolonnen och inkubera på en roterande mixer vid 10 rpm vid 4 ° c över natten till eluera protein komplex bunden via taggade HDAC.
Obs: alternativt utföra TEV sammandrag vid förhöjd temperatur (16-25 ° c), vilket minskar reaktions tiden, dock ökar risken för protein nedbrytning. - På nästa dag öppna kolonnen och samla eluatet i en 2 mL centrifug röret. Använd 0,7 mL TCB för att ta bort pärlor från locket och skölj kolonnens vägg.
- Placera kolonnen på det öppna 2 mL-röret från föregående steg som själv är placerad inom ett 50 mL centrifugerör.
- Överför denna församling till en bords skiva centrifug och snurra på 300 × g i 2 min. Detta är TEV eluatet.
Anmärkning: när du utför tandem tillhörighet rening, använda TEV eluatet som indata för den calmodulin tillhörighet steg. Du kan också dela TEV eluatet och använda en del för HDAC aktivitet beslutsamhet och den andra delen att slutföra TAP rening. - Avlägsna 50 μL från TEV-eluatet och tillsätt 12,5 μL 5 × LSB för SDS-PAGE (kallat "TE" i figurerna 1 och 2) och behåll den kvarvarande eluatet på isen.
- För att bedöma effekten av proteaseluering, tillsätt 2 mL 5% (v/v) ättiksyra och inkubera vid RT i 5 min. Återigen, Använd den första mL att återuppta kådan.
- Samla syraeluatet och ta igen 50 μL prov och tillsätt 12,5 μL 5 × LSB (kallas "AE" i figur 1). LSB kommer att bli gult när det läggs till den sura lösningen. För att neutralisera syran, tillsätt 10 M NaOH i steg om 1 μL och blanda väl tills färgen ändras till blått igen.
- Re-equilibrate den IgG harts med TBS-T att neutralisera syran. Förvara kådan i TBS-T/20% (v/v) etanol vid 4 ° c för åter användning med samma taggade protein.
- Förvaring av elutionfraktioner
- Alikvot eluatet till ~ 100 μL fraktioner, för att undvika flera frys-tö cykler.
- Frys Ali kvoter i flytande kväve och Behåll vid-80 ° c.
Obs: prover lagras på detta sätt kommer att vara stabila i månader utan att förlora enzymatisk aktivitet.
3. analys av rening genom SDS-PAGE och Western blotting
- Använd standard protokoll för gjutning av SDS-polyakrylamid-geler eller Använd förtillverkade gels13. Prov från den föregående sektionen vid 95 ° c i 5 min, Centrifugera vid ≥ 15 000 × g i 5 min, och lasta på 12% geler. Rekommenderade lastnings volymer anges i förklaringen till figur 1. Electrophorese proverna i 1 × tris-Glycine SDS-Page kör buffert på 180 V konstant för 60 – 70 min, tills bromfenolblått blå markör för SDS-Page lastning buffert börjar migrera ut ur gelen.
- Använd standard protokoll för silver färgning av gelerna. Använd till exempel protokollet Blum et al. 198714 som också är förenlig med MS-analys.
- Använd standard protokoll för Western blotting15. För att generera representativa resultat nedan användes ett kommersiellt tillgängligt blotting-system.
- Sond blotting med kommersiellt tillgängliga anti-calmodulin bindande protein (anti-CBP) anti kropp i 5% (w/v) mjölk pulver i TBS-T vid 4 ° c över natten.
Anmärkning: anti-CBP anti kropp riktas mot den del av TAP-taggen fortfarande närvarande efter TEV klyvning. - Använd standard protokoll för detektering och utveckling av blots. Till exempel, anti-kanin IgG-alkaliskt fosfatas konjugat och en BCIP/NBT färg utveckling substrat användes för generering av representativa resultat nedan.
4. deacetylasanalys med in vitro-[3H] acetat-märkta kyckling retikulocyte histoner (anpassad från trojer et al. 2003)4
- Hänvisa till protokollet av Kölle et al. 199816 för beredning av [3H] acetat-märkt kyckling retikulocyte histones.
- Per assay villkor plats tre 1,5 mL Centrifugera rör på is för mätningar i treplicates. Förbered också tre rör för endast buffert bakgrunds kontroll.
- Sätt 25 μL WB150 i varje tub och tillsätt 25 μL av TEV eluatet från steg 2.4.11 och fortsätt på isen.
- Värm en rörinkubator till 25 ° c.
- Använd 15 s intervall (stoppur) för tillsats av 10 μl märkta histoner [1,5 mg/ml] till varje tub.
- Innan analysen påbörjas, ta upp 10 μl av [3H] acetat-märkta kyckling histoner och starta stoppur.
- Fem sekunder efter starten, tillsätt märkta histones, Stäng röret tätt, Vortex, och Lägg den i inkubator.
- Använd 15 s intervall för tillsats av 10 μl märkta histoner och Fortsätt enligt beskrivningen i föregående steg.
- Efter 60 min inkubation Tillsätt 50 μL stopp lösning (1 M HCl/0,4 M ättiksyra) till varje tub i 15 s intervall; omedelbart. Efter tillsats av den sura lösningen, är analysen blandningen stabil och kan hållas på RT tills nästa steg.
- Tillsätt 800 μL etylacetat i varje tub för att extrahera den släppta [3H] ättiksyra.
- Tätt nära rören och virvel varje tub för 5 s.
- Placera röret i en mikrocentrifug och snurra på 10 000 × g i 10 min vid RT.
- Under tiden, Förbered en scintillation injektions flaska per analys prov och tillsätt 3 mL scintillation cocktail för hydrofoba prover.
- Efter centrifugering (steg 2,12), överför försiktigt 600 μL av den övre organiska fasen till de preparerade scintillationsrören och stäng rören tätt.
- Mät den radio aktivitet som motsvarar HDAC-aktiviteten i en flytande scintillationsräknare.
Representative Results
Ett typiskt resultat av den presenterade enstegs berikningen av RpdA visas i figur 1 (kallas "IgG"). För fullständighetens skull har vi också inkluderat genomflödes-och elutionsfraktioner ("CFT" och "CE") som illustrerar det andra renings steget genom en calmodulinharts ("CaM") enligt beskrivningen12. Den visade silverfärgade gelén (a) illustrerar tydligt effekten av det första affinitetssteget som ännu ökas ytterligare när man utför tandem rening. De mest framträdande proteiner som finns i protein extraktet och genomflödet är dock redan uttömda i TEV eluatet (TE). Det är viktigt att notera att TEV-elutionfraktionerna är > 100 × koncentrerade jämfört med extrakt och genomflöde. Asteriskerna markerar taggade RpdA (jämför panel B). Den beräknade MW av RpdA inklusive CBP (RpdA:: CBP) är 82 kDa, emellertid, proteinet migrerar på en mycket högre skenbar molekyl vikt av ca. 120 kDa. Detta fenomen har observerats tidigare och kan hänföras till de specifika egenskaperna hos dess C-terminus4,17. Den immunoblot (B) visar starka signaler migrerar på ca. 120 kDa motsvarande CBP-märkta ful längds RpdA (rpda:: CBP) i TeV eluatet ("te"), den calmodulin genomflöde ("CFT"), och eluatet ("CE") fraktioner. I syran eluatet ("AE") är en andra signal med en något större MW synlig. Detta motsvarar andelen TAP-märkta RpdA bunden till IgG-harts som inte släpptes av TEV klyvning. Skillnaden i storlek motsvarar 16 kDa av proteinet en upprepning av uncleaved RpdA:: TAP. Som väntat kunde inga band detekteras av anti-CBP-antikroppen i de vildtyps-kontrollfraktionerna (panel B, "vildtyp").
Resultaten av ett representativt deacetylasaktivitetstest med den specifika HDAC-hämmaren trichostatin A (TSA) visas i figur 2. Denna analys utvecklades ursprungligen för växter18 och har också använts för inhibitor screening mot däggdjurs deacetylaser19,20. De histoner som används för analysen var märkta och beredda enligt beskrivningen16. Effekten av att öka koncentrationerna av TSA på den katalytiska aktiviteten hos det anrikade RpdA-komplexet ("TE ± TSA") visas. Aktivitetens känslighet bekräftar att uppmätta CPM-värden verkligen beror på RpdA och inte orsakas av ospecifik proteasaktivitet. Detta är en viktig observation eftersom det tyder på att TEV, som är närvarande vid ganska hög koncentration, inte stör HDAC aktivitets analysen. För att tilldela uppmätt HDAC aktivitet till RpdA, en Wild-Type stam användes som negativ kontroll ("co"). Som väntat detekterades endast marginell HDAC-aktivitet (ca 5-10% av RpdA-anrikade fraktioner) i TEV-eluatet av vildtyp. Intressant, HDAC aktivitet reduceras signifikant efter den andra affiniteten rening steg ("CE") jämfört med TEV eluatet.
I figur 1. Tandem affinitet purificationof TAP-märkta RpdA. En silver-betsad 10% SDS-polyakrylamid gel (a) och en västerländsk blot probed med anti-CBP anti kropp (B) visas. Lane märkning och laddade volymer är följande: "M": 2 μL av 1:10 utspädd obefläckad protein markör (Silver fläck), 3,5 μL av prefärgade protein markör (Western blot); "Ex": protein extrakt prov som framställs i steg 2.2.8 (2 μl av 1:10 utspädning, 5 μl); "FT": genomflöde av IgG-harts som bereds i steg 2.4.3 (2 μl av 1:10 utspädning, 5 μl). "AE": syraeluat i steg 2.4.14 (10 μl, 10 μl); "TE": TEV eluat för över natten genom TEV-klyvning, steg 2.4.12 (10 μl, 10 μl); "CFT": calmodulin genomflöde (20 μL, 20 μL). "CE": calmodulineluat (10 μL, 10 μL). Storleken på valda markör proteiner indikeras på vänster sida av panelerna. De volymer som anges inom parentes motsvarar prov belastningen för silver fläcken respektive Western blot. Asterisker i silver-färgade gel indikerar RpdA fusions protein. Immunoblot (B) upptäcktes med alkaliskt fosfatas med hjälp av färg utvecklings systemet bcip/NBT. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 2. HDAC-aktivitetstest under ökande koncentrationer av trichostatin A. Effekten av RpdA-hämning testades med 25 μL av affinitet-renad rekombinant RpdA ("TE") och 25 μL av 0,10, 50 och 500 nM av HDAC-hämmaren TSA utspädd i RPMI-1640 medium. RPMI användes för att bedöma bakgrunds aktivitet ("blank"). Verksamhet av den slutliga eluatet efter den andra calmodulin affinitet steg ("CE") och av en omärkta stam efter den första affinitetsrenings steg (negativ kontroll, "co") visas. Aktiviteterna visas i procent av anrikad RpdA utan TSA (100%, "TE"). Felstaplar anger standard avvikelsen för tre replikat. Denna siffra har modifierats från Bauer et al. 20162. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta protokoll beskriver en enda steg berikning av en Tap-märkta klass 1 HDAC från trådformiga svampen a. nidulans för bedömning av in vitro histondeacetylas aktivitet. TAP-taggen infördes ursprungligen i bagerijäst för identifiering av protein-protein interaktion partner av taggade protein6. Därefter var taggen Codon-optimerad för dess användning i A. nidulans5. Här ger vi ett rakt framåt steg-för-steg-protokoll för tillämpning av den första affinitetsrenings steget i TAP-strategin för enstegs berikning av klass 1 HDAC RpdA. Den andra affinitetsrenings steget ökar tydligt renings nivån, vilket är särskilt viktigt för identifieringen av bete-samverkande proteiner. Ändå, bara det första steget rekommenderas för efterföljande verksamhet testning, eftersom avsaknaden av betydande förorening efter det första steget bekräftades av ett kontroll experiment med hjälp av en vild-typ stam. Dessutom är elerad aktivitet betydligt högre efter ett steg berikning jämfört med den fulla kranen. Förutom RpdA2, detta protokoll har också framgångs rikt använts för rening A. nidulans komplex av andra klass 1 HDAC hosa21.
På grund av våra observationer att svamp klass 1 HDACs bygga upp stabila komplex4, har vi lyckats ändra protokollet av Bayram et al. 201212 som representerar grunden för denna metod. Vissa kritiska steg måste dock nämnas. Beredningen av högkoncentrerade protein extrakt för att säkerställa nära fysiologiska förhållanden är avgörande för komplex stabilitet. Därför är det viktigt att tänka på de givna rekommendationerna om förhållandet bio massa/extraktion buffert. I detta avseende, det är också viktigt att använda väl mark fina Mycelial pulver för att säkerställa korrekt extraktion. Här är användningen av en slipmaskin helt klart fördelaktig. Som nämnts i protokollet avsnittet, är det värt att prova TEV-Cleavage steg för 1-2 h vid rums temperatur för att påskynda reningen. Detta testades för RpdA utan att observera några skadliga effekter på stabiliteten (opublicerad observation, Bauer I, 2018). Dessutom, utbyte av NP40 (används i det ursprungliga protokollet) med TX-100 kanske inte lämpar sig för andra protein komplex. När du använder denna metod för rening av andra TAP-märkta proteiner, bör man också hänvisa till Bayram protokollet, som innehåller ett antal värdefulla tips som kan vara till hjälp för en tillräcklig rening av andra protein komplex12.
Förutom den här beskrivna TAP-metoden, andra affinitet Taggar och tekniker används ofta för ett steg berikning av protein av trådformiga svampar, inklusive hans-och GFP-Taggar. Men eftersom klass 1 HDACs i allmänhet är funktionella som hög molekyl vikt komplex, är infödda eluering villkor en förutsättning för berikning av katalytiskt aktiva HDACs. Viktigt, många andra affinitet reningar utförs under ogynnsamma förhållanden. Till exempel är berikning av HDACs via GFP-Trap, som bygger på interaktion mellan antigen och anti kropp, inte lämplig på grund av de sura elutionsförhållanden som stör protein-proteininteraktion hos HDAC-komplex som binds till hartser. Dessutom försök att rena hans-märkta RpdA av metall kelat affinitet kromatografi22, resulterade i en betydande förlust av katalytisk aktivitet under renings förfarandet även Imidazol i stället för låg-pH-tillstånd användes för eluering ( opublicerade data, Bauer, I, 2010).
En begränsning av det beskrivna enzymatiska analys protokollet är användningen av det radioaktiva underlaget. Emellertid, analyser på fluorescerande basis har utvecklats samt23,24 och är kommersiellt tillgängliga. Dessa analyser utförs i brunn-pläterar och är thus passande också för kick-throughput screening av HDAC-inhibitorer. I så fall skulle det krävas ett exklusivt förfarande för det presenterade förfarandet.
Potentiella kommande tillämpningar av detta protokoll inkluderar berikning av specifika sub-komplex av klass 1 HDACs att bedöma deras specifika fysiologiska roller och/eller skillnader i deras känslighet för HDAC-hämmare. Vid upprättandet av den beskrivna metoden för andra enzymer, rekommenderas det starkt att utföra ett negativt kontroll experiment med en otaggad stam. Detta säkerställer specificitet av uppmätt enzym aktivitet och skulle avslöja kontaminering av ospecifikt bundna enzymer.
Rening och aktivitets analys som beskrivs här kan utföras inom två dagar och de berikade enzymerna är stabila i minst flera månader, när de lagras i Ali kvoter vid-80 ° c. Sammanfattnings vis ger detta protokoll ett relativt enkelt och kostnads effektivt sätt att uppnå klass 1 HDAC-komplex för aktivitets mätning och bestämning av inhibitor effekt.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Petra Merschak, avdelningen för molekylär biologi (bio Center, Medical University of Innsbruck), för hennes hjälp och stöd för detta manuskript. Dessutom vill vi tacka granskarna för deras värdefulla kommentarer.
Detta arbete finansierades av den österrikiska vetenskaps fonden (P24803 till SG och P21087 till GB) och genom interna finansiering (MUI start, ST201405031 till IB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x SDS-PAGE running buffer | Novex | ||
| 2-mercaptoethanol (EtSH) | Roth | 4227 | |
| 25 cm2 cell culture flasks with vent cap | Sarstedt | 833910002 | For spore production |
| 47 mm vacuum filtration unit | Roth | EYA7.1 | |
| AccuFLEX LSC-8000 | HITACHI | – | Scintillation counter |
| Acetic acid | Roth | 7332 | |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody | Millipore | 07-482 | Used at 1:1333 dilution |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody | Sigma-Aldrich | A3687 | |
| Ball mill | Retsch | 207450001 | Mixer Mill MM 400 |
| BCIP/NBT | Promega | S3771 | Color development substrate for AP |
| Cell strainer | Greiner | 542040 | |
| Cheese cloth for harvesting mycelia | BioRen | H0028 | Topfentuch |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Roth | 4720 | |
| EDTA | Prolabo | 20309.296 | |
| Ethyl acetate | Scharlau | Ac0155 | |
| Freeze Dryer | LABCONCO | 7400030 | FreeZone Triad |
| Glycerol | Roth | 3783 | |
| HCl | Roth | 4625 | |
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | IgG Sepharose 6 Fast Flow |
| Inoculation loops | VWR | 612-2498 | |
| KOH | Merck | 5033 | |
| Laminar flow cabinet | Thermo Scientific | – | Hera Safe KS |
| Mixed Cellulose Esters Membrane Filters | Millipore | GSWP04700 | |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NaOH | Roth | 6771 | |
| Neubauer counting chamber improved | Roth | T728 | |
| Novex gel system | Thermo Scientific | For SDS-PAGE | |
| Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) | Thermo Scientific | LC2675 | Running buffer for SDS-PAGE |
| peqGold protein-marker II | VWR | 27-2010P | Protein ladder used for silver stain |
| Peristaltic Pump P-1 | GE Healthcare | 18111091 | |
| Pipette controller | Brand | 26302 | accu-jet pro |
| Poly-Prep chromatography columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProSieve QuadColor protein marker | Biozym | 193837 | Prestained protein ladder used for western blot |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free |
| Rotary mixer | ELMI | – | Intelli-Mixer RM-2 S |
| Rotiszint eco plus | Roth | 0016 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Scintillation vials | Greiner | 619080 | |
| Sorvall Lynx 4000 | Thermo Scientific | ||
| Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| TIB32.1 | A. nidulans rpdA::TAP strain. Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1; argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+ |
||
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 1704271 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | 1704150 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma-Aldrich | T8552 | 5 mM stock in DMSO |
| Tris (free base) | Serva | 37190 | |
| Tris-HCl | Roth | 9090 | |
| Polysorbate 20 | Roth | 9127 | Tween 20 |
| Polysorbate 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | Tween 80 |
| TX-100 | Acros Organics | 215682500 | Triton X-100, Octoxynol-9 detergent |
References
- Gregoretti, I. V., Lee, Y. -M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. Journal of Molecular Biology. 338 (1), 17-31 (2004).
- Bauer, I., et al. A Class 1 Histone Deacetylase with Potential as an Antifungal Target. mBio. 7 (6), (2016).
- Stefan, A., et al. Purification of active recombinant human histone deacetylase 1 (HDAC1) overexpressed in Escherichia coli. Biotechnology Letters. 40 (9-10), 1355-1363 (2018).
- Trojer, P., et al. Histone deacetylases in fungi: novel members, new facts. Nucleic Acids Research. 31 (14), 3971-3981 (2003).
- Bayram, Ö, et al. VelB/VeA/LaeA complex coordinates light signal with fungal development and secondary metabolism. Science. 320 (5882), 1504-1506 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48, (2001).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Zadra, I., Abt, B., Parson, W., Haas, H. xylP promoter-based expression system and its use for antisense downregulation of the Penicillium chrysogenum nitrogen regulator NRE. Applied and Environmental Microbiology. 66 (11), 4810-4816 (2000).
- Stolz, D. J., et al. Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Bayram, Ö, et al. Identification of protein complexes from filamentous fungi with tandem affinity purification. Methods in Molecular Biology. 944, 191-205 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Kölle, D., et al. Biochemical methods for analysis of histone deacetylases. Methods. 15 (4), 323-331 (1998).
- Tribus, M., et al. A novel motif in fungal class 1 histone deacetylases is essential for growth and development of Aspergillus. Molecular Biology of the Cell. 21 (2), 345-353 (2010).
- Sendra, R., Rodrigo, I., Salvador, M. L., Franco, L. Characterization of pea histone deacetylases. Plant Molecular Biology. 11 (6), 857-866 (1988).
- Valente, S., et al. 1,3,4-Oxadiazole-containing histone deacetylase inhibitors: anticancer activities in cancer cells. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (14), 6259-6265 (2014).
- Mai, A., et al. Synthesis and biological properties of novel, uracil-containing histone deacetylase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (20), 6046-6056 (2006).
- Pidroni, A., et al. A Class 1 Histone Deacetylase as Major Regulator of Secondary Metabolite Production in Aspergillus nidulans. Frontiers in Microbiology. 9, 2212 (2018).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Wegener, D., Wirsching, F., Riester, D., Schwienhorst, A. A fluorogenic histone deacetylase assay well suited for high-throughput activity screening. Chemistry & Biology. 10 (1), 61-68 (2003).
- Peng, L., Yuan, Z., Seto, E. Histone deacetylase activity assay. Methods in Molecular Biology. 1288, 95-108 (2015).
