Summary
Klasse 1 histone deacetylases (Hdac) som RpdA har fått betydning som potensielle mål å behandle fungal infeksjoner. Her presenterer vi en protokoll for den spesifikke berikelse av TAP-Tagged RpdA kombinert med en HDCA aktivitet analysen som gjør at in vitro effekt testing av Histone deacetylase hemmere.
Abstract
Klasse 1 histone deacetylases (Hdac) som RpdA har fått betydning som potensielle mål for behandling av soppinfeksjoner og for Genova gruvedrift av fungal sekundære metabolitter. Hemmer screening, men krever renset enzym aktiviteter. Siden klasse 1 deacetylases utøve sin funksjon som multiprotein komplekser, de er vanligvis ikke aktive når uttrykt som enkelt polypeptider i bakterier. Derfor endogene komplekser må isoleres, som, når konvensjonelle teknikker som ion utveksling og størrelse eksklusjon kromatografi brukes, er arbeidskrevende og tidkrevende. Tandem affinitet rensing har blitt utviklet som et verktøy for å berike multiprotein komplekser fra celler og dermed viste seg å være ideell for isolering av endogene enzymer. Her gir vi en detaljert protokoll for ett-trinns berikelse av aktive RpdA komplekser via den første rensing trinn av C-uhelbredelig TAP-Tagged RpdA fra Aspergillus nidulans. Den renset komplekser kan deretter brukes for påfølgende inhibitor screening bruke en deacetylase analysen. Proteinet berikelse sammen med enzymatisk aktivitet analysen kan gjennomføres innen to dager.
Introduction
Histone deacetylases (Hdac) er Zn2 +-avhengige hydrolytisk enzymer som kan fjerne acetyl grupper fra lysin rester av histoner og andre proteiner. Basert på sekvens likheten er Hdac gruppert i flere klasser1. Nylig ble fungal klasse 1 HDCA RpdA, en ortholog av Baker gjær (Saccharomyces cerevisiae) Rpd3p, vist å være avgjørende for opportunistiske fungal patogen Aspergillus fumigatus2. Derfor har RpdA fått betydning som et potensielt mål å behandle fungal infeksjoner2. Vurdering av deacetylase aktivitet in vitro er viktig for karakterisering av enzymatisk egenskaper og gjør det mulig å bestemme effekten av romanen stoffer for hemmer utvikling. Selv om rekombinant uttrykk for en Codon-optimalisert versjon av humant HDAC1 i Escherichia coli er rapportert nylig3, forsøk på å uttrykke full lengde RpdA i denne verten mislyktes4. Videre, siden fungal klasse 1 Hdac som RpdA og HosA utøve sin funksjon som multiprotein komplekser, er det gunstig å bruke innfødte endogene komplekser for enzymatisk inhibitor studier. Men på grunn av hemme faktorer og tilstedeværelsen av ulike Hdac i fungal lysater, katalysator målt i hele protein ekstrakter er relativt lav og kan ikke tildeles individuelle enzymer. Videre tidligere studier i trådformede soppen a. nidulans identifiserte en klasse 2 Hdca, HdaA, som dominerende deacetylase i kromatografiske fraksjoner av fungal ekstrakter. Således, mangfoldig tradisjonell kromatografiske rensing skritt er behøvde å separat ingen-HdaA aktivitet fra fungal belastninger4. Innføringen av den tandem affinitet rensing (TAP) strategi i A. nidulans5 har betydelig lettet berikelse av spesifikke deacetylase aktiviteter. Den opprinnelige TAP-taggen består av to protein A-domener og et calmodulin bindende peptid (CBP) atskilt av en tobakk etch virus protease (TEV) kløft sted6. Dette gjør det mulig for innfødt rensing og eluering av merkede proteiner inkludert deres samspill partnere7. Når du bruker de beriket proteiner for aktivitet analyser, den milde eluering under native forhold av protease kløft er en viktig funksjon i TAP tag rensing. En GFP-Tagged protein, for eksempel, kan bli beriket av immobilisert antistoffer også, men kan ikke eluert under native forhold.
Her gir vi en detaljert protokoll for ett-trinns berikelse av aktive RpdA komplekser via den første rensing trinn av C-uhelbredelig TAP-Tagged RpdA fra a. nidulans (IgG SEPARASJON og TEV kløft) for påfølgende inhibitor screening bruke en Histone deacetylase analysen. Som viste seg å være tilstrekkelig, var affinitet berikelse begrenset til bare én rensing trinn også fordi enzymatisk aktivitet ble betydelig redusert etter to-trinns TAP rensing sammenlignet med IgG rensing alene.
Likevel, den innførte protokollen bør i tillegg være aktuelt for berikelse av andre merkede enzymer involvert i kromatin regulering som acetyltransferases, methyltransferases, og demethylases. Ved å tilføye den andre rensing trinnet av TAP-protokollen, proteiner co-renset med den merkede agn kan betraktes som komplekse partnere av (romanen) enzymatisk komplekser.
Protocol
1. dyrking av A. nidulans
- Inokulum forberedelse
Merk: alle trinn bortsett fra inkubasjons skal utføres under en laminær Flow kabinett.- Stamme ut TAP av trykk (F.eks. Tib 32.12) fra glyserol (-80 ° c) til glukose/XYLOSE minimal medium (GXMM; per liter: 10,0 g glukose, 0,5 g xylose, 10 ml 1 M di-ammonium Tartrate løsning, 20 ml 50 × saltoppløsning [per liter: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2PO4, 1 mL av kloroform], 1 ml av 1 000 × Hutner ' s sporstoffer8) inkludert 1,5% (w/v) agar og de nødvendige kosttilskudd som beskrevet av Todd et al. 20079. Ruge for 2 – 3 dager ved 37 ° c.
Merk: TIB 32.1 inneholder en rpdA:: tap-fusjon styrt av en xylose-induserbart promoter, xylP(p)10. Dette er grunnen xylose er inkludert i ovenstående oppskrift. Utelat xylose når økende stammer uttrykker konstruksjoner som ikke er under xylP(p) kontroll. - Forbered et sterilt 1,5 mL sentrifugerør med 1,5 mL steril conidial fjærings løsning (CSS; 0,9% (w/v) NaCl, 0,01% (v/v) polysorbat 80).
- Fukt en disponibel inoculation sløyfe i CSS, skrape av conidia fra platen fra trinn 1.1.1 og suspendere i røret fra trinn 1.1.2.
- Transfer 150 μL hver av conidial suspensjon til 10 25 cm2 cellekulturflasker med ventil cap inneholder GXMM agar inkludert kosttilskudd og 200 ΜL av CSS.
- Spre conidial suspensjon i flaskene ved hjelp av en steril inoculation løkke og ruge flaskene ved 37 ° c i 2 – 3 dager.
- Å høste conidia, bruker 10 mL av CSS per kolbe. Hell oppløsningen i en kolbe, tett lukke flasken med den med følgende skruen cap og kraftig riste flasken.
- Etter fukting av fungal overflaten, helt skrape av gjenværende conidia med en steril inoculation loop.
- Pass conidia gjennom 40 μm celle siler plassert på et sterilt 50 mL sentrifugerør og samle suspensjonen av fem flasker i ett rør.
- Sentrifuger røret ved 1 000 × g i 10 min.
- Dekanter den supernatanten og resuspend pellet i 10 mL av CSS per tube.
- Samle begge suspensjoner i ett rør, skyll den tomme slangen med 40 mL CSS, legge til suspensjonen, og sentrifuger som beskrevet i trinn 1.1.9.
- Dekanter den supernatanten og resuspend den conidial pellet i 4 mL av CSS.
- Forbered to serielle 1:50-fortynninger av conidial fjæringen og Bestem antall conidia i den resulterende 1:2, 500-fortynnede suspensjonen med et telle kammer som beskrevet11.
- Stamme ut TAP av trykk (F.eks. Tib 32.12) fra glyserol (-80 ° c) til glukose/XYLOSE minimal medium (GXMM; per liter: 10,0 g glukose, 0,5 g xylose, 10 ml 1 M di-ammonium Tartrate løsning, 20 ml 50 × saltoppløsning [per liter: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2PO4, 1 mL av kloroform], 1 ml av 1 000 × Hutner ' s sporstoffer8) inkludert 1,5% (w/v) agar og de nødvendige kosttilskudd som beskrevet av Todd et al. 20079. Ruge for 2 – 3 dager ved 37 ° c.
- Vekst og høsting av mycelier
- Mens du arbeider under en laminær Flow kabinett, vaksinere 4-6 en-liters koniske flasker hver inneholder 250 mL av GXMM inkludert passende kosttilskudd ved en tetthet på 5 × 106 Conidia/ml og ruge ved 180 rpm ved 37 ° c i 14 – 16 timer.
- Plasser ost klut i en trakt på toppen av en kolbe og filtrere mycelier gjennom kluten. Vask kort med deionisert vann.
- Fjern så mye fuktighet som mulig ved å klemme mycelier fanget i osten klut mellom første hendene og deretter papirhåndklær.
- Overfør de tørkede mycelier som flate ark til et plast beger med en skrue lokk og blits fryse med flytende nitrogen. Dette sikrer et høyt område/volum-forhold for følgende lyophilization prosess.
- Oppbevar den frosne mycelier ved-80 ° c før lyophilization.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. - Lyophilize mycelier over natten.
- Stopp fryse tørkeprosessen når temperaturen på mycelier forblir konstant (18 – 24 timer). Fjern kanner og umiddelbart forsegle med de med følgende skruen caps.
Merk: Når tett forseglet, kan lyofilisert mycelier lagres i flere uker på RT.
2. ett-trinns berikelse av TAP-Tagged HDCA (tilpasset fra Bayram et al. 2012)12
- Utarbeidelse av buffere og løsninger
Merk: Tilsett 2-mercaptoethanol (EtSH) og protease hemmere til buffere direkte før bruk. Filtrer alle buffere som brukes til kromatografi gjennom 0,22 μm nitrocellulose membraner for å unngå innføring av urenheter/forurensninger til kromatografi harpiks. Instruksjonene i trinnene nedenfor refererer til utarbeidelse av 1 L av hver buffer. Lagre buffere ved 4 ° c.- Avsugs buffer (B250): 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Løs opp 12,35 g av Tris-HCl, 2,62 g Tris (gratis base), og 13,2 g NaCl i 800 mL deionisert vann og tilsett 10 mL av en 10% (v/v) TX-100 løsning.
- Kontroller pH ved RT og Juster til pH 7,5 med enten NaOH eller HCl [5 M], om nødvendig.
- Gjør opp til 1 L og Filtrer gjennom en 0,22 μm nitrocellulose membran.
- Tilsett 35 μL av EtSH per 100 mL buffer (5 mM sluttkonsentrasjon) rett før bruk.
- Vaskebuffer 250 (WB250): 250 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Forbered WB250 som beskrevet for B250 (2.1.1), men med 3,59 g Tris-HCl, og 2,08 g av Tris (gratis base).
- Vaskebuffer 150 (WB150): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Forbered WB150 som beskrevet for B250 (2.1.1), men med 3,59 g Tris-HCl, 2,08 g av Tris (gratis base), og 8,77 g av NaCl.
- TEV likevekts buffer (TEB): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Samme som WB150 men legge EDTA til 0,5 mM endelige konsentrasjon.
- TEV kløft buffer (TCB): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 10% (v/v) glyserol, 5 mM EtSH.
- Forbered som beskrevet i trinn 2.1.1 med 3,59 g Tris-HCl, 2,08 g Tris (gratis base), og 8,77 g NaCl og tilsett 100 mL glyserol før du justerer volumet til 1 L.
- 50 × protease inhibitor cocktail: oppløse 1 tablett av en kommersielt tilgjengelig cocktail av protease hemmere i 1 mL vann og lagre ved-20 ° c.
- TBS-T: 50 mM Tris-HCl pH 7,6 (RT), 0,9% (w/v) NaCl, 0,1% (v/v) polysorbat 20.
- Klargjør som beskrevet i trinn 2.1.1. Bruk 6,06 g av Tris-HCl, 1,40 g av Tris (gratis base), 9 g NaCl, og 1 mL polysorbat 20.
- 5 × LSB (Laemmli sample buffer): 315 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 25% (v/v) EtSH, 50% (v/v) glyserol, 10% (w/v) SDS, 0,05% (w/v) bromophenol blå.
- Avsugs buffer (B250): 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Utarbeidelse av protein ekstrakt
- Tilsett 1,5 g lyofilisert mycelier og en slipe ball i slipe glasset på en ball mølle.
Merk: fersk mycelier kan også brukes. Når du gjør dette, tørk mycelier så grundig som mulig før frysing og sørg for å forkjøle slipe glassene i flytende nitrogen for sliping av ferske mycelier. - Grind mycelier til pulver ved 25 Hz for 30 s.
Merk: i tilfeller der ingen slipemaskin er tilgjengelig, slipe mycelier til et pulver ved hjelp av en mørtel og morter, som beskrevet av Bayram et al. Det er 12. - Overfør Mycelial pulver til et 15 mL sentrifugerør.
- Vipp sentrifuge røret inkludert bakken mycelier å tillate påfølgende blanding av mycelier med buffer.
- Tilsett 6 mL iskald B250 inkludert 1 × protease inhibitor cocktail per gram av Mycelial pulver og bland med en liten slikkepott til fullstendig homogenisering av råolje ekstrakt er oppnådd. Ved bruk av ferske mycelier, se Bayram et al. 12 for å oppnå riktig biomasse til utvinning buffer ratio.
- Hold røret på isen i 5 min.
- Plasser røret og en balanserør i en sentrifuge og Spin ved 40 000 × g for ≥ 20 min ved 4 ° c. Utfør likevekts av IgG harpiks (trinn 2,3) under sentrifugering.
- Etter sentrifugering, Fjern 10 μL av supernatanten for SDS-side analyse. Plasser prøven i et 1,5 mL rør inneholdende 40 μL av vann og 12,5 μL av 5 × LSB; referert til som "ex" i figur 1.
- Fjern forsiktig supernatanten (ryddet lysat) ved hjelp av en serologisk pipette og overføre til kolonnen inneholder equilibrated IgG perler (trinn 2.3) og tett tett ved hjelp av den med følgende endestykket.
- Tilsett 1,5 g lyofilisert mycelier og en slipe ball i slipe glasset på en ball mølle.
- Likevekts av IgG harpiks (utføres under trinn 2.2.7)
- Forbered en 10 mL disponibel kromatografi søyle og Pipet 300 μL av resuspendert IgG harpiks (50% slurry) i kolonnen. Fyll opp kolonnen til 10 mL med B250 og la buffer strømme gjennom av tyngdekraften.
- Tilsett 1 mL B250 inkludert 1 × protease inhibitor cocktail og la flyte gjennom. Plugg bunnen av kolonnen.
- Batch rensing av TAP-Tagged HDCA
- Ruge den kromatografi søylen som inneholder equilibrated perlene og den tomme lysat fra trinn 2.2.9 på en roterende mikser ved 10 RPM ved 4 ° c for 2 – 4 timer.
- Etter batch binding, fjerne hetten og åpne kolonnen nederst for å samle gjennomstrømning.
- Ta en prøve for SDS-side analyse som beskrevet i trinn 2.2.8; referert til som "FT" i figur 1.
- Vask perler med 10 mL WB250. Bruk først 1 mL buffer for å fjerne fanget perler fra Kol onne lokket ved hjelp av en pipettehjelper og overføre denne suspensjonen i en flush på avgjort harpiks å tillate blanding av perlene. Så fylle opp kolonnen å overdelen, slutte benytter en stabel lua og forbinde å en peristaltisk pumpe. Juster en strømningshastighet på ca. 1 – 5 mL/min. hindre at harpiks kjører tørt.
- Gjenta trinn 2.4.4 tre ganger for totalt fire vasker med WB250.
- Vask perlene tre ganger med 10 mL TEB som beskrevet i trinn 2.4.4.
- Lukk kromatografi-kolonnen nederst, resuspend IgG-perler i 1 mL TCB, og tilsett 20 μL av 50 × protease inhibitor cocktail, samt 10 ΜL av TEV (~ 1 mg/ml lager, S219V mutant variant produsert internt).
- Cap kolonnen og ruge på en roterende mikser ved 10 RPM ved 4 ° c over natten for å eluere protein komplekser bundet via den kodede HDCA.
Merk: du kan også utføre TEV-Sammendrag ved forhøyet temperatur (16 – 25 ° c), noe som reduserer reaksjonstiden, men øker risikoen for protein forringelse. - Neste dag åpner du kolonnen og samler eluatet i et 2 mL sentrifugerør. Bruk 0,7 mL TCB å fjerne perler fra hetten og skyll veggen av kolonnen.
- Plasser kolonnen på den åpne 2 mL røret fra det forrige trinnet som selv er plassert i et 50 mL sentrifugerør.
- Overfør denne forsamlingen til en bordplate sentrifuger og Spin på 300 × g for 2 min. Dette er TEV eluatet.
Merk: Når du utfører tandem affinitet rensing, bruk TEV eluatet som input for calmodulin affinitet trinnet. Du kan også dele TEV eluatet og bruke en del for HDCA aktivitet besluttsomhet og den andre delen for å fullføre TAP rensing. - Fjern 50 μL fra TEV-eluatet og tilsett 12,5 μL av 5 × LSB for SDS-PAGE (referert til som "TE" i figur 1 og 2) og Behold de resterende eluatet på isen.
- For å vurdere effekten av protease eluering, tilsett 2 mL 5% (v/v) eddiksyre og ruge ved RT i 5 min. Igjen, bruk den første mL til å resuspend harpiks.
- Samle syre eluatet og igjen ta 50 μL prøve og tilsett 12,5 μL av 5 × LSB (referert til som "AE" i figur 1). LSB vil bli gult når det tilsettes til den sure løsningen. For å nøytralisere syren, tilsett 10 M NaOH i trinn på 1 μL og bland godt til fargen endres til blå igjen.
- Re-likevekt IgG harpiks med TBS-T for å nøytralisere syren. Oppbevar harpiks i TBS-T/20% (v/v) etanol ved 4 ° c for gjenbruk med samme merket protein.
- Lagring av eluering fraksjoner
- Alikvot eluatet i ~ 100 μL fraksjoner, for å unngå flere fryse-tine sykluser.
- Frys alikvoter i flytende nitrogen og hold ved-80 ° c.
Merk: prøver som er lagret på denne måten, vil være stabile i flere måneder uten å miste enzymatisk aktivitet.
3. analyse av rensing av SDS-PAGE og vestlig blotting
- Bruk standardprotokoller for støping SDS-polyakrylamid gels eller bruke prefabrikerte gels13. Denaturere gel prøver fra forrige avsnitt ved 95 ° c i 5 min, sentrifuger ved ≥ 15 000 × g i 5 min, og Last inn på 12% gels. Anbefalt lasting volumer er gitt i legenden om figur 1. Electrophorese prøvene i 1 × Tris-Glycine SDS-PAGE kjører buffer på 180 V konstant for 60 – 70 min, til den bromophenol blå markør av SDS-side lasting buffer begynner å migrere ut av gelen.
- Bruk standardprotokoller for sølv farging av gels. For eksempel bruke protokollen av Blum et al. 198714 som også er kompatibel med MS analyse.
- Bruk standardprotokoller for vestlige blotting15. For generering av representative resultater nedenfor ble det brukt et kommersielt tilgjengelig blotting-system.
- Probe blots med kommersielt tilgjengelig anti-calmodulin bindende protein (anti-CBP) antistoff i 5% (w/v) melkepulver i TBS-T ved 4 ° c over natten.
Merk: anti-CBP antistoff er rettet mot den delen av TAP-koden som fortsatt er til stede etter TEV kløft. - Bruk standardprotokoller for påvisning og utvikling av blots. For eksempel, anti-kanin IgG-alkalisk fosfatase bøye og en BCIP/NBT farge utvikling substrat ble brukt for generering av representative resultater nedenfor.
4. deacetylase analysen med in vitro [3H] acetate-merket kylling reticulocyte histoner (tilpasset fra Trojer et al. 2003)4
- Referer til protokollen av Kölle et al. 199816 for utarbeidelse av [3H] acetate-merket kylling reticulocyte histoner.
- Per analysen tilstand sted tre 1,5 mL sentrifugerør på isen for målinger i triplicates. Også forberede tre rør for buffer-bare bakgrunns kontroll.
- Sett 25 μL av WB150 i hvert rør og tilsett 25 μL av TEV-eluatet fra trinn 2.4.11 og hold på isen.
- Varm opp en slange inkubator til 25 ° c.
- Bruk 15 s intervaller (stoppeklokke) for tilsetning av 10 μL av merket histoner [1,5 mg/mL] til hvert rør.
- Før du starter analysen, ta opp 10 μL av [3H] acetate-merket kylling histoner og starte stoppeklokke.
- Fem sekunder etter starten, tilsett merket histoner, Lukk røret tett, Vortex, og legg den inn i inkubator.
- Bruk 15 s intervaller for tillegg av 10 μL av merket histoner og fortsett som beskrevet i forrige trinn.
- Etter 60 min inkubasjons tilsett 50 μL stopp løsning (1 M HCl/0,4 M eddiksyre) til hvert rør i 15 s intervaller; Vortex umiddelbart. Etter tilsetning av syrlig løsning, analysen Mix er stabil og kan holdes på RT til neste trinn.
- Tilsett 800 μL av etanol til hvert rør for å trekke ut den frigitte [3H] eddiksyre.
- Tett lukke rørene og Vortex hvert rør for 5 s.
- Plasser røret i en mikrosentrifugen og spinne på 10 000 × g i 10 min ved RT.
- I mellomtiden, utarbeide en scintillation hetteglass per analysen prøven og tilsett 3 mL scintillation cocktail for hydrofobe prøver.
- Etter sentrifugering (trinn 2,12), må du forsiktig overføre 600 μL av den øvre organiske fasen til de klargjorte scintillation rørene og lukke rørene tett.
- Mål radioaktiviteten som tilsvarer HDCA-aktiviteten i en flytende scintillation-teller.
Representative Results
Et typisk resultat av den presenterte enkelt-trinns berikelse av RpdA er vist i figur 1 (referert til som "IgG"). For å oppnå fullstendighet, har vi også inkludert gjennomstrømnings-og eluering fraksjoner ("CFT" og "CE") som illustrerer det andre rense trinnet med en calmodulin harpiks ("CaM") som beskrevet12. Den viste sølv-beiset gel (A) tydelig illustrerer effekten av den første affinitet skritt som er enda ytterligere økt når du utfører tandem rensing. De fleste fremtredende proteiner som finnes i protein ekstraktet og gjennomstrømning er imidlertid allerede utarmet i TEV eluatet (TE). Det er viktig å legge merke til at TEV eluering fraksjoner er > 100 × konsentrert i forhold til ekstrakt og gjennomstrømning. Stjernene merker merket RpdA (sammenlign panel B). Den beregnede MW av RpdA inkludert CBP (RpdA:: CBP) er 82 kDa, men proteinet migrerer på en mye høyere synlig molekylvekt på ca. 120 kDa. Dette fenomenet har tidligere blitt observert og kan tildeles de spesifikke egenskapene til sin C-Terminus4,17. Immunoblot (B) viser sterke signaler som migrerer ca. 120 KDA som tilsvarer CBP-Tagged full-length RpdA (RpdA:: CBP) i TEV eluatet ("te"), calmodulin ("CFT"), og eluatet ("CE") fraksjoner. I syre eluatet ("AE") er et andre signal med en litt større MW synlig. Dette representerer andelen av TAP-Tagged RpdA bundet til IgG harpiks som ikke ble utgitt av TEV kløft. Forskjellen i størrelse tilsvarer 16 kDa av proteinet en gjentakelse av uncleaved RpdA:: TAP. Som forventet, kunne ingen band oppdages av anti-CBP antistoff i vill-type kontroll fraksjoner (panel B, "Wild type").
Resultatene av en representativ deacetylase aktivitet analysen med den spesifikke HDCA inhibitor trichostatin A (TSA) vises i figur 2. Denne analysen ble opprinnelig utviklet for planter18 og har også blitt brukt for hemmer screening mot pattedyr deacetylases19,20. Histoner som ble brukt til analysen, ble merket og klargjort som beskrevet16. Effekten av økende konsentrasjoner av TSA på katalysator av beriket RpdA kompleks ("TE ± TSA") er vist. Følsomheten av aktiviteten bekrefter at målt CPM verdier er faktisk på grunn av RpdA og ikke forårsaket av løs protease aktivitet. Dette er en viktig observasjon som det tyder på at TEV, som er tilstede på ganske høy konsentrasjon, ikke forstyrrer HDCA aktivitet analysen. For å tildele målt HDCA aktivitet til RpdA ble det brukt en "Wild-type"-stamme som negativ kontroll ("co"). Som forventet ble bare marginal HDCA-aktivitet (ca. 5-10% av RpdA-beriket fraksjoner) påvist i TEV-eluatet av vill typen. Interessant, HDCA aktivitet er betydelig redusert etter den andre affinitet rensing trinn ("CE") sammenlignet med TEV eluatet.
Figur 1. Tandem affinitet purificationof TAP-merket RpdA. En sølv-farget 10% SDS-polyakrylamid gel (A) og en vestlig blot analysert med anti-CBP antistoff (B) vises. Lane merking og lastet volumer er som følger: "M": 2 μL av 1:10 fortynnet unstained protein markør (sølv flekk), 3,5 μL av prestained protein markør (Western Blot); "Ex": protein ekstrakt prøve som utarbeidet i trinn 2.2.8 (2 μl av 1:10 fortynning, 5 μL); "FT": IgG harpiks gjennomstrømning prøve som utarbeidet i trinn 2.4.3 (2 μl av 1:10 fortynning, 5 μl); "AE": Acid eluatet av trinn 2.4.14 (10 μl, 10 μl); "TE": TEV eluatet av natten eluering av TEV kløft, trinn 2.4.12 (10 μl, 10 μl); "CFT": calmodulin gjennomstrømning (20 μL, 20 μL); "CE": calmodulin eluatet (10 μL, 10 μL). Størrelsen på valgt markør proteiner er indikert på venstre side av panelene. Volumene gitt i parentes tilsvarer sample belastninger for sølv beis og vestlig blot, henholdsvis. Stjerner i sølv-farget gel indikere RpdA Fusion protein. Immunoblot (B) ble oppdaget med alkalisk fosfatase ved hjelp av BCIP/NBT farge utviklingssystem. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. HDCA aktivitet analysen under økende konsentrasjoner av trichostatin A. Effekten av RpdA hemming ble testet med 25 μL av affinitet-renset rekombinant RpdA ("TE") og 25 μL av 0, 10, 50 og 500 nM for HDCA-hemmer TSA fortynnet i RPMI-1640 medium. RPMI ble brukt til å vurdere bakgrunns aktivitet ("blank"). Aktivitetene til den endelige eluatet etter det andre calmodulin affinitet trinn ("CE") og av en umerkede belastning etter det første affinitet rensing trinn (negativ kontroll, "co") vises. Aktiviteter vises som prosent av beriket RpdA uten TSA (100%, "TE"). Feilfelt angir standardavviket for tre replikeres. Dette tallet har blitt modifisert fra Bauer et al. 20162. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Denne protokollen beskriver et enkelt-trinns berikelse av en TAP-Tagged klasse 1 HDCA fra trådformede soppen a. nidulans for vurderingen av in vitro deacetylase aktivitet. The TAP tag ble opprinnelig introdusert i Baker gjær for identifisering av protein-protein interaksjon partnere av merket protein6. Deretter ble taggen Codon-optimalisert for bruk i A. nidulans5. Her gir vi en rett frem trinn-for-trinn protokoll for anvendelse av den første affinitet rensing trinn av TAP strategi for ett-trinns berikelse av klassen 1 HDCA RpdA. Den andre affinitet rensing trinn klart øker nivået av rensing, noe som er spesielt viktig for identifisering av agn-samspill proteiner. Likevel, bare det første trinnet anbefales for påfølgende aktivitet testing, siden mangelen på betydelig forurensning etter første skritt ble bekreftet av en kontroll eksperiment ved hjelp av en vill-type belastning. Videre er eluert aktivitet betydelig høyere etter ett-trinns berikelse i forhold til det av full TAP. I tillegg til RpdA2, ble denne protokollen også med hell brukt for rensing A. nidulans komplekser av andre klasse 1 hdca HosA21.
På grunn av våre observasjoner at fungal klasse 1 Hdac bygge opp stabile komplekser4, har vi lyktes å endre protokollen ved Bayram et al. 201212 som representerer grunnlaget for denne metoden. Likevel, noen viktige skritt må nevnes. Utarbeidelse av svært konsentrerte protein ekstrakter for å sikre nær fysiologiske forhold er avgjørende for kompleks stabilitet. Derfor er det viktig å tenke på gitte anbefalinger om biomasse/utvinning buffer forholdet. I denne forbindelse er det også viktig å bruke godt bakken fine Mycelial pulver for å sikre riktig ekstraksjon. Her er bruken av en slipemaskin klart fordelaktig. Som nevnt i protokollen delen, er det verdt å prøve TEV-kløft trinn for 1-2 h ved romtemperatur for å fremskynde rensing. Dette ble testet for RpdA uten å observere noen skadelige effekter på stabilitet (upublisert observasjon, Bauer I, 2018). I tillegg er utskifting av NP40 (brukt i den opprinnelige protokollen) med TX-100 kanskje ikke egnet for andre protein komplekser. Når du bruker denne metoden for rensing av andre TAP-Tagged proteiner, bør man også referere til Bayram protokollen, som inneholder en rekke verdifulle hint som kan være nyttig for en tilstrekkelig rensing av andre protein komplekser12.
I tillegg til her beskrevet TAP-metoden, andre affinitet koder og teknikker er ofte brukt for ett-trinns berikelse av protein av trådformede sopp, inkludert hans-og GFP-Tags. Men som klasse 1 Hdac generelt er funksjonell som høy molekylvekt komplekser, innfødte eluering forhold er en forutsetning for berikelse av katalytisk aktive Hdac. Viktigere er mange andre affinitet renselser utføres under ugunstige forhold. For eksempel, berikelse av Hdac via GFP-Trap, som er basert på antigen-antistoff interaksjon, er ikke egnet på grunn av Sure eluering forhold forstyrrer protein-protein interaksjon av HDCA komplekser bundet til harpiks. Videre, forsøk på å rense hans-Tagged RpdA av metall chelate affinitet kromatografi22, resulterte i et betydelig tap av katalysator under rensing prosedyren selv om imidazole i stedet for lav-pH-forhold ble brukt for eluering ( upubliserte data, Bauer, I, 2010).
En begrensning av den beskrevne enzymatisk analysen protokollen er bruken av det radioaktive underlaget. Imidlertid har analysene på et fluorescerende grunnlag blitt utviklet i tillegg23,24 og er kommersielt tilgjengelige. Disse analysene er utført i godt plater og dermed er egnet også for høy gjennomstrømming screening av HDCA-hemmere. I så fall ville en oppskalere av de presenterte prosedyren være nødvendig.
Potensielle kommende anvendelser av denne protokollen inkluderer berikelse av spesifikke sub-komplekser av klasse 1 Hdac å vurdere deres spesifikke fysiologiske roller og/eller forskjeller i deres mottakelighet for HDCA-hemmere. Ved etablering av den beskrevne metoden for andre enzymer, er det sterkt anbefalt å utføre en negativ kontroll eksperiment med en umerkede belastning. Dette sikrer spesifisitet av målte enzym aktiviteter og ville avdekke forurensning av uspesifikt bundet enzymer.
Rensing og aktivitet analysen beskrevet her kan utføres innen to dager og beriket enzymer er stabile i minst flere måneder, når de oppbevares i alikvoter ved-80 ° c. Som konklusjon, denne protokollen gir en relativt enkel og kostnadseffektiv måte å oppnå klasse 1 HDCA komplekser for aktivitet måling og bestemmelse av hemmer effekt.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Petra Merschak, avdeling for molekylærbiologi (Biocenter, Medical University of Innsbruck), for hennes hjelp og støtte angående dette manuskriptet. I tillegg vil vi gjerne takke anmeldere for sine verdifulle kommentarer.
Dette arbeidet ble finansiert av den østerrikske Science Fund (P24803 til SG og P21087 til GB) og ved intramural finansiering (MUI Start, ST201405031 til IB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x SDS-PAGE running buffer | Novex | ||
| 2-mercaptoethanol (EtSH) | Roth | 4227 | |
| 25 cm2 cell culture flasks with vent cap | Sarstedt | 833910002 | For spore production |
| 47 mm vacuum filtration unit | Roth | EYA7.1 | |
| AccuFLEX LSC-8000 | HITACHI | – | Scintillation counter |
| Acetic acid | Roth | 7332 | |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody | Millipore | 07-482 | Used at 1:1333 dilution |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody | Sigma-Aldrich | A3687 | |
| Ball mill | Retsch | 207450001 | Mixer Mill MM 400 |
| BCIP/NBT | Promega | S3771 | Color development substrate for AP |
| Cell strainer | Greiner | 542040 | |
| Cheese cloth for harvesting mycelia | BioRen | H0028 | Topfentuch |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Roth | 4720 | |
| EDTA | Prolabo | 20309.296 | |
| Ethyl acetate | Scharlau | Ac0155 | |
| Freeze Dryer | LABCONCO | 7400030 | FreeZone Triad |
| Glycerol | Roth | 3783 | |
| HCl | Roth | 4625 | |
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | IgG Sepharose 6 Fast Flow |
| Inoculation loops | VWR | 612-2498 | |
| KOH | Merck | 5033 | |
| Laminar flow cabinet | Thermo Scientific | – | Hera Safe KS |
| Mixed Cellulose Esters Membrane Filters | Millipore | GSWP04700 | |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NaOH | Roth | 6771 | |
| Neubauer counting chamber improved | Roth | T728 | |
| Novex gel system | Thermo Scientific | For SDS-PAGE | |
| Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) | Thermo Scientific | LC2675 | Running buffer for SDS-PAGE |
| peqGold protein-marker II | VWR | 27-2010P | Protein ladder used for silver stain |
| Peristaltic Pump P-1 | GE Healthcare | 18111091 | |
| Pipette controller | Brand | 26302 | accu-jet pro |
| Poly-Prep chromatography columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProSieve QuadColor protein marker | Biozym | 193837 | Prestained protein ladder used for western blot |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free |
| Rotary mixer | ELMI | – | Intelli-Mixer RM-2 S |
| Rotiszint eco plus | Roth | 0016 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Scintillation vials | Greiner | 619080 | |
| Sorvall Lynx 4000 | Thermo Scientific | ||
| Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| TIB32.1 | A. nidulans rpdA::TAP strain. Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1; argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+ |
||
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 1704271 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | 1704150 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma-Aldrich | T8552 | 5 mM stock in DMSO |
| Tris (free base) | Serva | 37190 | |
| Tris-HCl | Roth | 9090 | |
| Polysorbate 20 | Roth | 9127 | Tween 20 |
| Polysorbate 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | Tween 80 |
| TX-100 | Acros Organics | 215682500 | Triton X-100, Octoxynol-9 detergent |
References
- Gregoretti, I. V., Lee, Y. -M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. Journal of Molecular Biology. 338 (1), 17-31 (2004).
- Bauer, I., et al. A Class 1 Histone Deacetylase with Potential as an Antifungal Target. mBio. 7 (6), (2016).
- Stefan, A., et al. Purification of active recombinant human histone deacetylase 1 (HDAC1) overexpressed in Escherichia coli. Biotechnology Letters. 40 (9-10), 1355-1363 (2018).
- Trojer, P., et al. Histone deacetylases in fungi: novel members, new facts. Nucleic Acids Research. 31 (14), 3971-3981 (2003).
- Bayram, Ö, et al. VelB/VeA/LaeA complex coordinates light signal with fungal development and secondary metabolism. Science. 320 (5882), 1504-1506 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48, (2001).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Zadra, I., Abt, B., Parson, W., Haas, H. xylP promoter-based expression system and its use for antisense downregulation of the Penicillium chrysogenum nitrogen regulator NRE. Applied and Environmental Microbiology. 66 (11), 4810-4816 (2000).
- Stolz, D. J., et al. Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Bayram, Ö, et al. Identification of protein complexes from filamentous fungi with tandem affinity purification. Methods in Molecular Biology. 944, 191-205 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Kölle, D., et al. Biochemical methods for analysis of histone deacetylases. Methods. 15 (4), 323-331 (1998).
- Tribus, M., et al. A novel motif in fungal class 1 histone deacetylases is essential for growth and development of Aspergillus. Molecular Biology of the Cell. 21 (2), 345-353 (2010).
- Sendra, R., Rodrigo, I., Salvador, M. L., Franco, L. Characterization of pea histone deacetylases. Plant Molecular Biology. 11 (6), 857-866 (1988).
- Valente, S., et al. 1,3,4-Oxadiazole-containing histone deacetylase inhibitors: anticancer activities in cancer cells. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (14), 6259-6265 (2014).
- Mai, A., et al. Synthesis and biological properties of novel, uracil-containing histone deacetylase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (20), 6046-6056 (2006).
- Pidroni, A., et al. A Class 1 Histone Deacetylase as Major Regulator of Secondary Metabolite Production in Aspergillus nidulans. Frontiers in Microbiology. 9, 2212 (2018).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Wegener, D., Wirsching, F., Riester, D., Schwienhorst, A. A fluorogenic histone deacetylase assay well suited for high-throughput activity screening. Chemistry & Biology. 10 (1), 61-68 (2003).
- Peng, L., Yuan, Z., Seto, E. Histone deacetylase activity assay. Methods in Molecular Biology. 1288, 95-108 (2015).
