Summary
Class 1 deacetylases ההיסטון (hdacs) כמו rpda השיגו חשיבות כמטרות פוטנציאליות לטיפול בזיהומים פטרייתיים. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור העשרת הספציפי של ברז מתויג RpdA בשילוב עם שיטת הפעילות HDAC המאפשר בדיקות היעילות של מבחנה של האבן מעכבי deאצטקלז.
Abstract
מחלקה 1 היסטון deacetylases (hdacs) כמו rpda יש חשיבות כמטרות פוטנציאליות לטיפול בזיהומים פטרייתיים ועל כריית הגנום של מטבוליטים פטרייתיים משניים. הקרנת מעכב, לעומת זאת, דורשת פעילות אנזימים מטוהרים. מאז class 1 deacetylases להפעיל את תפקידם כמו מכלולי חלבון רב, הם בדרך כלל לא פעיל כאשר מתבטא כמו פוליפפטידים יחיד בחיידקים. לכן, מתחמי אנדוגני צריך להיות מבודדים, אשר, כאשר טכניקות קונבנציונאלי כמו חילופי יונים כרומטוגרפיה הוצאת הגודל מוחלים, הוא מפרך זמן רב. טיהור האהדה טנדם פותחה ככלי להעשיר מתחמי מרובת חלבון מתאים וכך התברר להיות אידיאלי עבור בידוד של אנזימים אנדוגניים. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור העשרה צעד אחד של מתחמי RpdA פעיל באמצעות צעד הטיהור הראשון של C-סופני טוק-מתויגים RpdA מ אספרגיליוס nidulans. מתחמי מטוהרים ניתן להשתמש לאחר מכן ההקרנה המעכב הבאים החלת שיטת דרחייקלז. ניתן להשלים את העשרת החלבון יחד עם שיטת הפעילות האנזימטית תוך יומיים.
Introduction
Histone deacetylases (HDACs) הם Zn2 +-התלויים אנזימים הידרוליטיים מסוגל להסיר קבוצות מרחלים משקעים ליזין של האבנים וחלבונים אחרים. בהתבסס על הדמיון ברצף, HDACs מקובצים למספר כיתות1. לאחרונה, מחלקה פטרייתי 1 HDAC RpdA, אורתולוג של שמרים של בייקר (סכביתנוסcerevisiae ס) Rpd3p, הוכח להיות חיוני עבור הפתוגן פטריות אופורטוניסטי אספרגייוס מדבייוס2. לכן, RpdA צבר חשיבות כיעד פוטנציאלי לטיפול בזיהומים פטרייתיים2. הערכה של פעילות דפרקלז בתחום החוץ הינה חשובה לאפיון של תכונות אנזימטיות ומאפשרת לקבוע את יעילותם של חומרים חדשניים לפיתוח מעכבי. למרות הביטוי הרקומביננטי של גרסה ממוטבת של הHDAC1 האנושי בבית הקולי של Es chia דווחה לאחרונה3, ניסיונות לבטא rpda באורך מלא במחשב מארח זה נכשל4. יתר על כן, מאז מחלקה פטרייתי 1 HDACs כגון RpdA ו HosA להפעיל את תפקידם כמו מתחמי מרובת חלבון, זה נוח להשתמש מתחמי אנדוגניים מקומיים למחקרים מעכבי אנזימטיות. עם זאת, בשל גורמים מעכבים ונוכחות של HDACs שונים בפטריות lysates, פעילות קטליטי נמדד תמציות חלבון שלם הוא נמוך יחסית לא ניתן להקצות אנזימים בודדים. יתר על כן, המחקרים הקודמים בפטריה filamentous a. nidulans זיהה מחלקה 2 Hdac, HdaA, כמו de, השולט בשברים כרומטוגרפיים של תמציות פטרייתי. כך, מספר שלבים קונבנציונליים כרומטוגרפיים לטיהור נחוצים כדי להפריד פעילות שאינה HdaA מתוך זנים פטרייתיים4. המבוא של האסטרטגיה לטיהור הזיקה הדו (ברז) בא. נידולנס5 הקלו באופן משמעותי את העשרת הפעילויות הספציפיות של הדרחקלז. תג ה-טאפ המקורי מורכב משני חלבון תחומים ופפטיד כריכה קלומודולין (CBP) מופרדים על-ידי וירוס איכול מעטפת טבק (TEV) מחשוף באתר6. זה מאפשר טיהור מקורי והימנעות של חלבונים מתויגים כולל שותפים אינטראקציה שלהם7. כאשר משתמשים בחלבונים מועשר לצורך הפעילות, הימנעות מתונה תחת תנאים מקומיים על ידי מחשוף פרוטאז היא תכונה חשובה של טיהור תג הקש. חלבון GFP מתויג, למשל, יכול להיות מועשר על ידי נוגדנים קיבוע גם, אולם, לא ניתן להתחמק תחת תנאים מקומיים.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור העשרה צעד אחד של מתחמי RpdA פעיל באמצעות צעד הטיהור הראשון של C-סופני ברז מתויג RpdA מ -a. ni, הפרדה igg ו-tev מחשוף) עבור ההקרנה מעכבי החלה החלת שיטת הדיקלז. כפי שהוכח להיות מספיק, העשרה אהדה הוגבלה רק צעד טיהור אחד גם בגלל הפעילות האנזימטית הופחת באופן משמעותי לאחר לטיהור שני שלבים לאחר בהשוואה לטיהור IgG בלבד.
עם זאת, הפרוטוקול שהוצג צריך גם להיות ישים להעשרת אנזימים מתויגים אחרים המעורבים ברגולציה כרומטין כגון acetyltransferases, מתילדיסים ודמתיטיות. על ידי הוספת צעד הטיהור השני של פרוטוקול הקש, חלבונים שיתוף מטוהר עם פיתיונות מתויג יכול להיחשב שותפים מורכבים של (רומן) מתחמים אנזימטיים.
Protocol
1. טיפוח של א. נידולנים
- הכנה לרשת
הערה: יש לבצע את כל הצעדים מלבד הדגירה באמצעות ארון זרימה למינארי.- פס out מאמץ הקש (g. טיב 32.12) מתוך מלאי גליצרול (-80 ° c) אל גלוקוז/xylose אבד בינונית מינימלית (gxmm; ליטר: 10.0 g של גלוקוז, 0.5 g של מגרד, 10 מ ל 1 M די-אמוניום הפתרון tartrate, 20 מ ' 50 × תמיסת מלח [ליטר: 26.0 KCl, 26.0 g MgSO4 · 7 H2O, 76.0 g KH2PO4, 1 מ ל של כלורופורם], 1 מ ל של 1,000 × יסודות המעקב של הויטנר8) כולל 1.5% (w/v) אגר ואת התוספים הדרושים כפי שמתואר על ידי טוד et al. 20079. מודטה עבור 2 – 3 ימים ב 37 ° c.
הערה: טיב 32.1 מכיל Rpda:: פיוז ' ן ברז נשלט על ידי מקדם מinducible הפסד, xylp(p)10. זו הסיבה קסיל כלול במתכון לעיל. השמט את xylose כאשר גדל זנים המבטא מבנים שאינם תחת שליטה Xylp(p). - הכנת שפופרת צנטריפוגה 1.5 mL סטרילית עם 1.5 mL של פתרון con, ההשעיה סטרילי (CSS; 0.9% (w/v) הנאל, 0.01% (v/v) polysorbate 80).
- להרטיב לולאה החיסון חד פעמי ב-CSS, לגרד את המחט מן הצלחת משלב 1.1.1 ולהשעות את הצינור משלב 1.1.2.
- העבר 150 μL כל אחד השעיית con, כדי 10 25 ס מ2 תרבות התא מבחנות עם כובע אוורור המכיל GXMM אגר כולל תוספי מזון ו200 μl של CSS.
- הפיצו את ההשעיה הקונאידיאל בתוך מבחנות באמצעות לולאה החיסון סטרילי ו דגירה את צלוחיות ב 37 ° c עבור 2 – 3 ימים.
- כדי לקצור את עצי המחט, השתמש ב-10 מ ל של CSS לכל בקבוקון. יוצקים את הפתרון לתוך בקבוקון, לסגור היטב את הבקבוקון עם כובע בורג סיפק לנער נמרצות את הבקבוקון.
- לאחר הרטבת משטח פטרייתי, לגרד לחלוטין את המחט הנותרים עם לולאת החיסון סטרילי.
- לעבור המחט דרך מ40 יקרומטר תא ממוקמים על שפופרת סטרילי 50 mL ולאסוף את ההשעיה של חמש מבחנות בצינור אחד.
- צנטריפוגה את הצינור ב 1,000 × g עבור 10 דקות.
- הדנט את הסופר והשהה מחדש את הגלולה ב-10 מ ל של CSS לכל צינור.
- לאסוף את שתי ההשעיה בצינור אחד, לשטוף את הצינור הריק עם 40 mL של CSS, להוסיף את ההשעיה, ואת צנטריפוגה כפי שמתואר בשלב 1.1.9.
- הדנט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הקונאידיאל ב-4 מ ל של CSS.
- הכינו שני 1:50 מדלל סדרתי של ההשעיה הקונפותית וקבעו את מספר המחט בתוך 1:2, 500-מדולל ההשעיה עם תא ספירה כמתואר11.
- פס out מאמץ הקש (g. טיב 32.12) מתוך מלאי גליצרול (-80 ° c) אל גלוקוז/xylose אבד בינונית מינימלית (gxmm; ליטר: 10.0 g של גלוקוז, 0.5 g של מגרד, 10 מ ל 1 M די-אמוניום הפתרון tartrate, 20 מ ' 50 × תמיסת מלח [ליטר: 26.0 KCl, 26.0 g MgSO4 · 7 H2O, 76.0 g KH2PO4, 1 מ ל של כלורופורם], 1 מ ל של 1,000 × יסודות המעקב של הויטנר8) כולל 1.5% (w/v) אגר ואת התוספים הדרושים כפי שמתואר על ידי טוד et al. 20079. מודטה עבור 2 – 3 ימים ב 37 ° c.
- צמיחה וקציר של מיסיליה
- בזמן העבודה תחת הקבינט למינארי הזרימה, האיחסן 4 – 6 מבחנות חרוט ליטר אחד כל המכיל 250 mL של GXMM כולל תוספי מזון בצפיפות של 5 × 106 המחט/mL ו דגירה ב 180 rpm ב 37 ° c עבור 14 – 16 h.
- מניחים בד גבינה לתוך משפך על גבי בקבוקון ולסנן את תפטיר דרך הבד. רוחצים בקצרה עם מים מפוהים.
- הסר כמו לחות ככל האפשר על ידי לסחוט את תפטיר לכוד בתוך מטלית גבינה בין הראשון הידיים ולאחר מכן מגבות נייר.
- העבר את המיוסיליה היבשים כסדינים שטוחים לגביע פלסטיק עם מכסה בורג והקפא הבזק עם חנקן נוזלי. פעולה זו מבטיחה יחס של שטח/נפח גבוה עבור תהליך הליאופליזציה הבא.
- אחסן את המיסיליה הקפואה ב-80 ° צ' לפני הליאופליזציה.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. - ליאופליז המיסיליה בן לילה.
- הפסיקו את תהליך ייבוש ההקפאה כאשר הטמפרטורה של מיסיליה נותרה קבועה (18 – 24 שעות). הסירו את הספלים ואטמו מיד. עם כובעי הברגים המסופקים
הערה: כאשר היא אטומה היטב, ניתן לאחסן ליאופליה במשך מספר שבועות ב-RT.
2. העשרת צעד אחד של ברז מתויג hdac (המותאם מ2012 בית bayram ואח ') 12
- הכנת מאגרים ופתרונות
הערה: הוסף 2-mercaptoethanol (EtSH) ו מעכבי פרוטאז למאגרים ישירות לפני השימוש. לסנן את כל המאגרים המשמשים כרומטוגרפיה דרך 0.22 יקרומטר ניטרוצלולוזה הקרומים כדי למנוע הקדמה של זיהומים/זהום לשרף כרומטוגרפיה. הוראות בשלבים שלהלן מתייחסות להכנת L 1 לכל מאגר. מאגרי מאגר ב-4 ° c.- מאגר החילוץ (B250): 250 mM הנאסל, 100 mM טריס-HCl pH 7.5 (RT), 0.1% (v/v) TX-100, 5 מ"מ EtSH.
- התמוססות 12.35 g של Tris-HCl, 2.62 g של טריס (בסיס חופשי), ו 13.2 g של הנאל ב 800 mL של מים מוכי מוכי להוסיף 10 מ ל של 10% (v/v) TX-100 פתרון.
- בדוק את ה-pH ב RT ולהתאים ל-pH 7.5 עם NaOH או HCl [5 M], במידת הצורך.
- לפצות על 1 L ולסנן באמצעות קרום 0.22 יקרומטר ניטרוצלולוזה.
- הוסף 35 μL של EtSH לכל 100 mL של מאגר (5 מילימטר הריכוז הסופי) ישירות לפני השימוש.
- מאגר כביסה 250 (WB250): 250 mM הנאסל, 40 mM טריס-HCl pH 8.0 (RT), 0.1% (v/v) TX-100, 5 מ"מ EtSH.
- להכין WB250 כמתואר עבור B250 (2.1.1) אבל עם 3.59 g של טריס-HCl, ו 2.08 g של טריס (בסיס חופשי).
- מאגר כביסה 150 (WB150): 150 mM הנאסל, 40 mM טריס-HCl pH 8.0 (RT), 0.1% (v/v) TX-100, 5 מ"מ EtSH.
- להכין WB150 כמתואר עבור B250 (2.1.1) אבל עם 3.59 g של טריס-HCl, 2.08 g של טריס (בסיס חופשי), ו 8.77 g של הנאל.
- TEV מאגר שיווציה (TEV): 150 מ"מ היאl, 40 mM טריס-HCl pH 8.0 (RT), 0.5 mM EDTA, 0.1% (v/v) TX-100, 5 מ"מ EtSH.
- זהה WB150 אבל להוסיף EDTA ל 0.5 מ"מ ריכוז סופי.
- מאגר מחשוף TEV (TCB): 150 מ"מ, 40 mM טריס-HCl pH 8.0 (RT), 0.5 mM EDTA, 0.1% (v/v) TX-100, 10% (v/v) גליצרול, 5 מ"מ EtSH.
- להכין כמתואר בשלב 2.1.1 עם 3.59 g של טריס-HCl, 2.08 g של טריס (בסיס חופשי), ו 8.77 g של נרוג ולהוסיף 100 mL של גליצרול לפני התאמת נפח ל 1 L.
- 50 × פרוטאז מעכבי קוקטייל: לפזר 1 טבליה של קוקטייל זמין מסחרית של מעכבי פרוטאז ב 1 מ ל של מים וחנות ב-20 ° c.
- TBS-T: 50 mM טריס-HCl pH 7.6 (RT), 0.9% (w/v) הנאל, 0.1% (v/v) polysorbate 20.
- היכונו כמתואר בשלב 2.1.1. השתמש 6.06 g של Tris-HCl, 1.40 g של טריס (בסיס חופשי), 9 גרם של הנאל, ו 1 מ ל של polysorbate 20.
- 5 × LSB (Laemmli מאגר לדוגמה): 315 mM טריס-HCl pH 6.8 (RT), 25% (v/v) EtSH, 50% (v/v) גליצרול, 10% (w/v) SDS, 0.05% (w/v) ברומאופנול כחול.
- מאגר החילוץ (B250): 250 mM הנאסל, 100 mM טריס-HCl pH 7.5 (RT), 0.1% (v/v) TX-100, 5 מ"מ EtSH.
- הכנת תמצית חלבון
- להוסיף 1.5 g של ליאופ, מייסיליה וכדור שיוף לצנצנת שחיקה של טחנת כדור.
הערה: עשוי לשמש גם מיסיליה טרייה. כאשר עושה זאת, יבש תפטיר ביסודיות ככל האפשר לפני הקפאה ולוודא precool הצנצנות לטחינת בחנקן נוזלי לטחינת מייסיליה טרי. - לטחון את מייסיליה לאבקה. ב -25 הרץ בשביל 30
הערה: במקרים שבהם לא ניתן להשתמש במכונת שיוף, יש לטחון את מיסיליה לאבקה באמצעות מרגמה ומכתש, כפי שמתואר בידי בייראם ואח '. . שתיים עשרה - העבר אבקה mycelial לשפופרת צנטריפוגה 15 מ ל.
- להטות את צינורית צנטריפוגה כולל הקרקע תפטיר כדי לאפשר ערבוב הבא של תפטיר עם מאגר.
- הוסף 6 מ ל של קרח קר B250 כולל 1 × פרוטאז מעכב הקוקטייל לגרם של אבקת mycelial ולהתמזג עם מרית קטנה עד השלמות הגון להוציא את התמצית גולמי מושגת. כשמשתמשים במיסיליה הטרייה, התייחס לבייראם ואח '. 12 כדי להשיג את ביומסה הנכון ליחס מאגר החילוץ.
- . תשאיר את השפופרת על הקרח למשך 5 דקות
- מניחים את הצינור ואת צינור האיזון לתוך צנטריפוגה ו ספין ב 40,000 × g עבור ≥ 20 דקות ב 4 ° c. ביצוע הequiציה של שרף IgG (שלב 2.3) במהלך צנטריפוגה.
- לאחר צנטריפוגה, להסיר 10 μL של supernatant עבור ניתוח SDS-PAGE. מניחים את המדגם לתוך צינור 1.5 mL המכיל 40 μL של מים ו12.5 μL של 5 × LSB; המכונה "Ex" באיור 1.
- הסר בזהירות את הסופרנטנט (ניקוי ליפוסט) באמצעות פיפטה סרוולוגית והעבר אל העמודה המכילה את חרוזי IgG הניתנים לשימוש (שלב 2.3) והתקרב בחוזקה באמצעות כובע הסיום המסופק.
- להוסיף 1.5 g של ליאופ, מייסיליה וכדור שיוף לצנצנת שחיקה של טחנת כדור.
- שיווציה של שרף IgG (שבוצעה במהלך שלב 2.2.7)
- הכן 10 mL כרומטוגרפיה חד פעמי העמודה pipet 300 μL של היטב-מושעה שרף IgG (50% ליטר) לתוך העמודה. ממלאים את העמודה 10 mL עם B250 ולתת לחיץ לזרום דרך כוח הכבידה.
- הוסף 1 מ ל של B250 כולל קוקטייל 1 × פרוטאז מעכבי ולתת לזרום. חבר את החלק התחתון של העמודה.
- טיהור אצווה של הקשה מתויגים HDAC
- מודטה את העמודה כרומטוגרפיה המכילה את החרוזים מעורפלת ואת ליפוסט נקי משלב 2.2.9 על מיקסר רוטרי ב 10 סל ד ב 4 ° צ' עבור 2 – 4 h.
- לאחר כריכת האצווה, הסר את המכסה ופתח את העמודה בתחתית כדי לאסוף את הזרימה.
- קח דוגמה לניתוח SDS-PAGE כמתואר בשלב 2.2.8; מכונה "FT" באיור 1.
- שטוף חרוזים עם 10 מ ל של WB250. ראשית, השתמש 1 mL של מאגר כדי להסיר חרוזים לכודים מתוך כובע הטור באמצעות פיטאור ולהעביר את ההשעיה הזאת סומק אחד על שרף התיישבו כדי לאפשר השעיה של החרוזים. לאחר מכן, מלא את העמודה למעלה, סגור באמצעות אות מחסנית והתחבר למשאבה פריסטטית. כוונן קצב זרימה של כ-1 – 5 מ"ל/min. מנע משרף להתייבש.
- חזור על שלב 2.4.4 שלוש פעמים עבור מספר כולל של ארבעה שוטפים עם WB250.
- שטוף חרוזים שלוש פעמים עם 10 מ ל של TEB כמתואר בשלב 2.4.4.
- סגור את העמודה כרומטוגרפיה בחלק התחתון, להשעות את החרוזים IgG מחדש 1 מ ל של TCB, ולהוסיף 20 μl של 50 × פרוטאז מעכב הקוקטייל, כמו גם 10 ΜL של tev (~ 1 מ"ג/mL מלאי, S219V מוטציה variant המיוצר ב-house).
- Cap את הטור ואת הדגירה על מיקסר רוטרי ב 10 סל ד ב 4 ° c לילה כדי elute מכלולי חלבונים המאוגדים דרך HDAC המתויג.
הערה: לחלופין, בצע תקציר TEV בטמפרטורה גבוהה (16 – 25 ° c), אשר מפחית את זמן התגובה, לעומת זאת, מעלה את הסיכון לירידה בחלבון. - ביום למחרת לפתוח את הטור ולאסוף את האלוטה בשפופרת צנטריפוגה 2 מ ל. השתמש 0.7 mL של TCB להסיר חרוזים מן הכיפה ולשטוף את הקיר של הטור.
- מניחים את העמודה על הצינור הפתוח 2 מ"ל מהשלב הקודם שהוא עצמו ממוקם בתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL.
- להעביר את ההרכבה לתוך צנטריפוגה השולחן העליון ספין ב 300 × g עבור 2 דקות. . זה הדבר הנכון לעשות
הערה: בעת ביצוע טיהור של אהדה דו-מושביים, השתמש ב-TEV כקלט לשלב האהדה של הקלמודוללין. אתה יכול גם לפצל את TEV להתחמק ולהשתמש בחלק אחד לקביעת פעילות HDAC ואת החלק השני כדי להשלים את הטיהור ברז. - הסרת 50 μL מ-TEV משחרלי ולהוסיף 12.5 μL של 5 × LSB עבור SDS-PAGE (המכונה "TE" באיורים 1 ו-2) ולשמור על שארית שנותר על הקרח.
- כדי להעריך את היעילות של הימנעות פרוטאז, להוסיף 2 מ ל של 5% (v/v) חומצה אצטית ומטה ב RT עבור 5 דקות. שוב, השתמש ב-mL הראשון כדי להשעות את שרף.
- לאסוף את החומצה משחרל ושוב לקחת 50 μL לדוגמה ולהוסיף 12.5 μL של 5 × LSB (המכונה "AE" באיור 1). LSB יהפוך צהוב כאשר יתווסף לפתרון החומצי. כדי לנטרל את החומצה, להוסיף 10 M NaOH בשלבים של 1 μL ומערבבים היטב עד שהצבע משתנה לכחול שוב.
- מחדש את שרף IgG עם TBS-T כדי לנטרל את החומצה. לאחסן את השרף ב-TBS-T/20% (v/v) אתנול ב 4 ° צ' לשימוש חוזר עם אותו חלבון מתויג.
- אחסנה של שברי הימנעות
- לאחר הימנעות לתוך ~ 100 μL שברים, כדי למנוע מחזורים להפשיר הקפאה מרובים.
- מקפיאים בחנקן נוזלי ושומרים ב-80 ° c.
הערה: דוגמאות שאוחסנו באופן זה יהיו יציבות במשך חודשים מבלי לאבד פעילות אנזימטית.
3. ניתוח טיהור באמצעות SDS-עמוד ומערב מערבי
- השתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים ליציקת SDS-פוליאקרילאמיד ג'ל או להשתמש בעזרת ג'ל לשימוש13. דגימות הספרות מהחלק הקודם ב 95 ° c עבור 5 דקות, צנטריפוגה ב ≥ 15,000 × g עבור 5 דקות, ו לטעון על 12% ג ' לים. אמצעי אחסון מומלצים לטעינה מקבלים במקרא של איור 1. אלקטרופורזה הדגימות ב 1 × טריס-גליצין SDS-עמוד מאגר פועל בשעה 180 V קבוע עבור 60 – 70 דקות, עד הסמן הכחול ברומרופנול של מאגר הטעינה של SDS-PAGE מתחיל לנדוד מתוך ג'ל.
- השתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים עבור כתמים כסף של ג ' לים. לדוגמה, השתמש בפרוטוקול של בלום ואח '. 198714 התואם גם לניתוח MS.
- השתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים עבור כתמים מערביים15. עבור הדור של תוצאות הנציגה להלן, נעשה שימוש במערכת מסחרית זמינה.
- בדיקת הכלים עם חלבון מסחרית נגד calmodulin כריכה (anti-cbp) הנוגדן ב 5% (w/v) אבקת חלב ב-TBS-T ב 4 ° c הלילה.
הערה: הנוגדן נגד CBP מופנה לחלק של תג הקש עדיין נוכח לאחר מחשוף TEV. - השתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים לאיתור ופיתוח של blots. לדוגמה, אנטי ארנבת IgG-אלקליין פוספספטאז המשלים ו BCIP/NBT פיתוח צבע המצע שימשו עבור הדור של תוצאות הנציג להלן.
4. מימוש בשיטת דפורקלז באמצעות מבחנה באמצעות מתורבת (3ש ח) מתויג עוף (מותאם Trojer et al. 2003)4
- עיין בפרוטוקול של Kölle ואח ' . 199816 לקראת הכנת העוף [3ה] אצטט-התווית של העופות.
- לכל מקום בתנאי מיקום שלושה 1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגה על קרח עבור מדידות בטרילקטים. הכן גם שלוש שפופרות לבקרת רקע של מאגר בלבד.
- שים 25 μL של WB150 לתוך צינור כל ולהוסיף 25 μL של TEV להתחמק משלב 2.4.11 ולשמור על קרח.
- מחממים אינקובטור צינור ל -25 ° c.
- השתמש במרווחי זמן של 15 (להפסיק לצפות) עבור תוספת של 10 μl של התווית יסטוניים [1.5 mg/mL] לכל צינור.
- לפני תחילת השיטת, לקחת את 10 μL של [3ח] אצטט מתויג עוף האבנים ולהתחיל לצפות לעצור.
- חמש שניות לאחר ההתחלה, להוסיף את האבנים המסומנות, לסגור את הצינור בחוזקה, מערבולת, ולשים אותו לתוך החממה.
- השתמש במרווחי זמן של 15 s עבור תוספת של 10 μL של התוויות המסומנות והמשך כמתואר בשלב הקודם.
- אחרי 60 דקות דגירה להוסיף 50 μL של פתרון להפסיק (1 M HCl/0.4 M חומצה אצטית) לכל צינור במרווחי זמן של 15; ערבולת מיידית לאחר הוספת התמיסה החומצית, השילוב הקבוע הוא יציב וניתן לשמור אותו ב-RT עד לשלב הבא.
- הוסף 800 μL של אתיל אצטט לכל צינור כדי לחלץ את שוחרר [3H] חומצה אצטית.
- סגור היטב את הצינורות ומערבולת כל צינור עבור 5 s.
- מניחים את הצינור לתוך מיקרוצנטריפוגה ו ספין ב 10,000 × g עבור 10 דקות ב-RT.
- בינתיים, הכינו בקבוקון אחד לדגימת שיטת הדגימה, והוסיפו 3 מ ל של קוקטייל של בדיקת המים לדגימות הידרופובי.
- לאחר צנטריפוגה (שלב 2.12), בזהירות להעביר 600 μL של השלב האורגני העליון לתוך הצינורות מוכנים של שפופרות ולסגור את הצינורות בחוזקה.
- מדוד את הרדיואקטיביות המתאימה לפעילות ה-HDAC בתוך מונה.
Representative Results
תוצאה אופיינית של העשרת הצעדים החד המוצגים של RpdA מוצג באיור 1 (המכונה "igg"). למען השלמות, כללנו גם שברי זרימה והימנעות ("cft" ו-"CE") המדגימה את צעד הטיהור השני על ידי שרף קלמודולין ("CaM") כמתואר12. ג'ל מוכתם כסף (A) ממחיש בבירור את היעילות של צעד האהדה הראשון, כי הוא גדל עוד יותר בעת ביצוע טיהור טנדם. חלבונים בולטים ביותר נוכח תמצית החלבון ואת הזרימה-דרך, עם זאת, כבר מרוקנים את TEV משחרלי (TE). חשוב להבחין כי השברים TEV הם > 100 × מרוכז לעומת חילוץ וזרימה. סימון הכוכביות מתויג RpdA (השוואת לוח B). הMW המחושב של RpdA כולל CBP (RpdA:: CBP) הוא 82 kDa, עם זאת, החלבון נודד במשקל מולקולרי הרבה יותר ברור של כ. 120 kDa. תופעה זו נצפתה בעבר, ניתן להקצות את המאפיינים הספציפיים של C-הטרמינוס שלה4,17. כתמי החיסוני (ב) מראה מעבר אותות חזקים ב כ. 120 kda המתאים cbp-מתויג באורך מלא rpda (rpda:: cbp) ב tev להתחמק ("TE"), את הזרימה קלמודולין ("cbp"), ו משחרל ("CE") שברים. ב להתחמק חומצה ("AE") אות שנייה עם מגוואט מעט גדול יותר גלוי. זה מייצג את הפרופורציה של RpdA מתויג הקש מאוגד שרף IgG שלא שוחרר על ידי מחשוף TEV. ההפרש בגודל מקביל ל-16 kDa של החלבון חוזר של RpdA בלתי ניתן לביטול:: ברז. כצפוי, לא ניתן לזהות להקות על ידי נוגדן anti-CBP בשברים בעלי סוג פראי (פאנל B, "פראי סוג").
התוצאות של שיטת הפעילות הייצוגית של מירחייקלז עם מעכב HDAC הספציפי trichostatin A מוצגים באיור 2. שיטת הפעולה פותחה במקור עבור צמחים18 והיא שימש גם לסינון מעכבי נגד מdeacetylases היונקים19,20. האבנים ששימשו לצורך התיכול סומנו בתווית והוכנו כמתואר ב-16. ההשפעה של ריכוזים גוברת של ה-מע על פעילות קטליטית של קומפלקס RpdA מועשר ("TE ± המון") מוצג. רגישות הפעילות מאשרת כי ערכי cpm שנמדדו הם אכן עקב RpdA ולא נגרמת על ידי פעילות פרוטאז מסוימת. זוהי התבוננות חשובה כפי שהיא מציינת כי TEV, אשר נוכח בריכוז גבוה למדי, אינו מפריע ליישום הפעילות HDAC. כדי להקצות פעילות HDAC נמדד RpdA, זן פראי שימש שליטה שלילית ("Co"). כצפוי, רק פעילות HDAC שולית (כ. 5-10% של שברים RpdA-מועשר) זוהה ב-TEV מטורף של סוג פראי. מעניין, פעילות HDAC מופחת באופן משמעותי לאחר שלב הטיהור השני של הזיקה ("לסה נ") בהשוואה ל-TEV להתחמק.
איור 1. שהיות מתויג בעזרת שתייגת מתויגים-RpdA. מוכתם בכסף 10% SDS-polyacrylamide ג'ל (A) ו כתם מערבי בנחקר עם נוגדן נגד Cbp (ב) מוצגים. תיוג ליין ואמצעי אחסון טעונים הם כדלקמן: "M": 2 μשל 1:10 מדולל בצבע חלבון בלתי מוכתם (כתם כסף), 3.5 μשל סמן חלבון מוכתם (כתם מערבי); "Ex": תמצית חלבון המדגם כפי שהוכן בשלב 2.2.8 (2 μ' של 1:10 דילול, 5 μ); "FT": הזרימה IgG שרף לדוגמה כפי שהוכן בשלב 2.4.3 (2 μof 1:10 דילול, 5 μ); "AE": משחרי חומצה מ2.4.14 שלב (10 μ, 10 μ); "TE": TEV הימנעות לילה על ידי מחשוף TEV, צעד 2.4.12 (10 μ, 10 μ); "CFT": כלמודולין תזרים-דרך (20 μL, 20 μL); "לסה נ": קלמודולין הללויה (10 μL, 10 μL). גודל של הסמן חלבונים שנבחרו מצוין בצד שמאל של הלוחות. אמצעי האחסון שניתנו בסוגריים מתאימים לטעינת דגימה עבור כתם כסף ואבן בצבע מערבית, בהתאמה. כוכביות בג המוכתמת כסף מציינות את החלבון היתוך RpdA. המערכת החיסונית (B) זוהתה עם פוספספטאז אלקליין באמצעות מערכת פיתוח הצבע BCIP/NBT. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. שיטת הפעילות HDAC תחת ריכוזים גוברת של trichostatin A. היעילות של עיכוב RpdA נבדק עם 25 μL של זיקה מטוהרים רקומביננטי RpdA ("TE") ו 25 μL של 0, 10, 50, ו 500 nM של מעכב HDAC מדולל בשנת RPMI-1640 בינונית. RPMI שימש להערכת פעילות רקע ("ריק"). פעילויות של משחרלי הסופי לאחר שלב האהדה השני של קלמודולין ("לסה נ") ומאמץ לא מתויג לאחר שלב טיהור הזיקה הראשון (שליטה שלילית, "Co") מוצגים. פעילויות מוצגות כאחוז של RpdA מועשר ללא מבצע (100%, "TE"). קווי שגיאה מציינים את סטיית התקן של שלוש משכפל. דמות זו השתנתה מבאוור et al. 20162. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר העשרה של צעד אחד של מחלקה המתויגים מסוג HDAC מתוך הפטריה הפילנטורית א. נידולנים להערכת פעילות מחוץ גופית. תג הברז הוצג במקור בשמרים של בייקר לזיהוי של שותפים לאינטראקציה חלבונים חלבון של חלבון מתויג6. לאחר מכן, התגית הייתה ממוטבת לשימוש ב -A. nidulans5. כאן אנו מספקים פרוטוקול הישר קדימה צעד אחר צעד ליישום של השלב הראשון טיהור האהדה של אסטרטגיית הקש על העשרה צעד אחד של הכיתה 1 HDAC RpdA. שלב הטיהור השני מגדיל באופן ברור את רמת הטיהור, החשובה במיוחד לזיהוי חלבונים בעלי אינטראקציה של פיתיון. עם זאת, רק את הצעד הראשון מומלץ עבור בדיקות הפעילות העוקבות, מאז חוסר זיהום משמעותי לאחר הצעד הראשון אושר על ידי ניסוי בקרה באמצעות זן פראי. יתרה מזאת, פעילות החומקת גבוהה במידה ניכרת לאחר העשרה בשלב אחד בהשוואה לזה של הברז המלא. בנוסף ל-RpdA2, פרוטוקול זה השמש גם בהצלחה לטיהור מתחמי nidulans של המחלקה השנייה 1 hdac21.
בשל התצפיות שלנו כי מעמד פטרייתי 1 HDACs לבנות מתחמי יציב4, הצלחנו לשנות את הפרוטוקול על ידי bayram et al. 201212 המייצג את הבסיס של שיטה זו. עם זאת, יש לציין כמה צעדים קריטיים. הכנת תמציות חלבונים מרוכזים ביותר כדי להבטיח מצבים כמעט פיזיולוגיים הוא קריטי ליציבות מורכבת. לכן, חשוב לזכור את ההמלצות נתון לגבי יחס ביומסה/מאגר החילוץ. במובן זה, הוא גם קריטי להשתמש היטב בקרקע אבקות mycelial להבטיח החילוץ הנכון. כאן, השימוש במכונת שחיקה הוא יתרון ברור. כפי שהוזכר בסעיף הפרוטוקול, כדאי לנסות את הצעד TEV-המחשוף עבור 1-2 h בטמפרטורת החדר כדי להאיץ את הטיהור. זה נבדק עבור RpdA מבלי לצפות בהשפעות מזיקות על יציבות (התבוננות שלא פורסמה, באואר I, 2018). בנוסף, החלפת NP40 (בשימוש בפרוטוקול המקורי) עם TX-100 לא יכול להיות מתאים למערכות חלבונים אחרים. בעת שימוש בשיטה זו לטיהור של חלבונים אחרים המתויגים, יש להתייחס גם לפרוטוקול Bayram, המכיל מספר רמזים יקרי ערך שעשויים להועיל לטיהור מספיק של מכלולי חלבון אחרים12.
מלבד לכאן תיאר ברז שיטה, תגי אהדה אחרים וטכניקות משמשות בדרך כלל עבור העשרה צעד אחד של חלבון של פטריות filamentous, כולל שלו-ו-GFP-tags. עם זאת, כמו מחלקה 1 HDACs בדרך כלל פונקציונליים כמו גבוהה מולקולרית מערכות משקל, התנאים מקומיים הם תנאי מוקדם להעשרת של HDACs פעיל מזרז. יתרה מזאת, מתבצעות הרבה מאוד אהדה כלפי תנאים שלילי. למשל, העשרה של HDACs באמצעות GFP-השמנה, אשר מבוססת על האינטראקציה אנטיגן-נוגדן, אינו מתאים בשל התנאים להתחמק חומצי הפרעה באינטראקציה חלבונים חלבון של מכלולי HDACS מאוגד שרפים. יתר על כן, מנסה לטהר את שלו-מתויג RpdA על ידי מתכת כרומטוגרפיה הזיקה כרומטותרפיה22, הביא לאובדן משמעותי של פעילות קטליטי במהלך תהליך הטיהור למרות במקום התנאים נמוכה pH שימש הימנעות ( נתונים שלא פורסמו, באואר, I, 2010).
מגבלה אחת של פרוטוקול התיקוד האנזימטי המתואר היא השימוש במצע רדיואקטיבי. עם זאת, בחני על בסיס פלורסנט פותחו גם23,24 והם מסחרית זמין. מספר זה מבוצעים בצלחות ובכך מתאימים גם להקרנה בתפוקה גבוהה של מעכבי HDAC. במקרה כזה, יהיה צורך ברמה גבוהה של ההליך המוצג.
יישומים פוטנציאליים עתידיים של פרוטוקול זה כוללים העשרת מתחמי משנה ספציפיים של מחלקה 1 HDACs כדי להעריך את התפקידים הפיזיולוגיים הספציפיים שלהם ו/או הבדלים הרגישות שלהם מעכבי HDACS. כאשר מקימים את השיטה המתוארת לאנזימים אחרים, מומלץ מאוד לבצע ניסוי בקרה שלילי עם זן לא מתויג. זה מבטיח ספציפיות של פעילויות האנזים נמדד ויגלה זיהום על ידי אנזימים בלתי מוגבל במיוחד.
ניתן לבצע שיטת טיהור ופעילות המתוארת כאן בתוך יומיים, והאנזימים המועשר יציבים למשך מספר חודשים לפחות, כאשר הם מאוחסנים ב-80 ° c. לסיכום, פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה יחסית וחסכונית כדי להשיג class 1 מתחמי HDAC למדידת פעילות וקביעת יעילות מעכב.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
היינו רוצים להודות לפטרה מרסאק, החטיבה לביולוגיה מולקולרית (Biocenter, האוניברסיטה הרפואית של אינסברוק), על עזרתה ותמיכתה בנושא כתב היד הזה. בנוסף, אנו רוצים להודות לסוקרים על הערותיהם היקרות.
עבודה זו ממומנת על ידי קרן המדע האוסטרי (P24803 ל-SG ו-P21087 ל-GB) ועל ידי מימון הפנים (MUI התחלה, ST201405031 ל-ליברות).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x SDS-PAGE running buffer | Novex | ||
| 2-mercaptoethanol (EtSH) | Roth | 4227 | |
| 25 cm2 cell culture flasks with vent cap | Sarstedt | 833910002 | For spore production |
| 47 mm vacuum filtration unit | Roth | EYA7.1 | |
| AccuFLEX LSC-8000 | HITACHI | – | Scintillation counter |
| Acetic acid | Roth | 7332 | |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody | Millipore | 07-482 | Used at 1:1333 dilution |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody | Sigma-Aldrich | A3687 | |
| Ball mill | Retsch | 207450001 | Mixer Mill MM 400 |
| BCIP/NBT | Promega | S3771 | Color development substrate for AP |
| Cell strainer | Greiner | 542040 | |
| Cheese cloth for harvesting mycelia | BioRen | H0028 | Topfentuch |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Roth | 4720 | |
| EDTA | Prolabo | 20309.296 | |
| Ethyl acetate | Scharlau | Ac0155 | |
| Freeze Dryer | LABCONCO | 7400030 | FreeZone Triad |
| Glycerol | Roth | 3783 | |
| HCl | Roth | 4625 | |
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | IgG Sepharose 6 Fast Flow |
| Inoculation loops | VWR | 612-2498 | |
| KOH | Merck | 5033 | |
| Laminar flow cabinet | Thermo Scientific | – | Hera Safe KS |
| Mixed Cellulose Esters Membrane Filters | Millipore | GSWP04700 | |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NaOH | Roth | 6771 | |
| Neubauer counting chamber improved | Roth | T728 | |
| Novex gel system | Thermo Scientific | For SDS-PAGE | |
| Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) | Thermo Scientific | LC2675 | Running buffer for SDS-PAGE |
| peqGold protein-marker II | VWR | 27-2010P | Protein ladder used for silver stain |
| Peristaltic Pump P-1 | GE Healthcare | 18111091 | |
| Pipette controller | Brand | 26302 | accu-jet pro |
| Poly-Prep chromatography columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProSieve QuadColor protein marker | Biozym | 193837 | Prestained protein ladder used for western blot |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free |
| Rotary mixer | ELMI | – | Intelli-Mixer RM-2 S |
| Rotiszint eco plus | Roth | 0016 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Scintillation vials | Greiner | 619080 | |
| Sorvall Lynx 4000 | Thermo Scientific | ||
| Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| TIB32.1 | A. nidulans rpdA::TAP strain. Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1; argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+ |
||
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 1704271 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | 1704150 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma-Aldrich | T8552 | 5 mM stock in DMSO |
| Tris (free base) | Serva | 37190 | |
| Tris-HCl | Roth | 9090 | |
| Polysorbate 20 | Roth | 9127 | Tween 20 |
| Polysorbate 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | Tween 80 |
| TX-100 | Acros Organics | 215682500 | Triton X-100, Octoxynol-9 detergent |
References
- Gregoretti, I. V., Lee, Y. -M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. Journal of Molecular Biology. 338 (1), 17-31 (2004).
- Bauer, I., et al. A Class 1 Histone Deacetylase with Potential as an Antifungal Target. mBio. 7 (6), (2016).
- Stefan, A., et al. Purification of active recombinant human histone deacetylase 1 (HDAC1) overexpressed in Escherichia coli. Biotechnology Letters. 40 (9-10), 1355-1363 (2018).
- Trojer, P., et al. Histone deacetylases in fungi: novel members, new facts. Nucleic Acids Research. 31 (14), 3971-3981 (2003).
- Bayram, Ö, et al. VelB/VeA/LaeA complex coordinates light signal with fungal development and secondary metabolism. Science. 320 (5882), 1504-1506 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48, (2001).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Zadra, I., Abt, B., Parson, W., Haas, H. xylP promoter-based expression system and its use for antisense downregulation of the Penicillium chrysogenum nitrogen regulator NRE. Applied and Environmental Microbiology. 66 (11), 4810-4816 (2000).
- Stolz, D. J., et al. Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Bayram, Ö, et al. Identification of protein complexes from filamentous fungi with tandem affinity purification. Methods in Molecular Biology. 944, 191-205 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Kölle, D., et al. Biochemical methods for analysis of histone deacetylases. Methods. 15 (4), 323-331 (1998).
- Tribus, M., et al. A novel motif in fungal class 1 histone deacetylases is essential for growth and development of Aspergillus. Molecular Biology of the Cell. 21 (2), 345-353 (2010).
- Sendra, R., Rodrigo, I., Salvador, M. L., Franco, L. Characterization of pea histone deacetylases. Plant Molecular Biology. 11 (6), 857-866 (1988).
- Valente, S., et al. 1,3,4-Oxadiazole-containing histone deacetylase inhibitors: anticancer activities in cancer cells. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (14), 6259-6265 (2014).
- Mai, A., et al. Synthesis and biological properties of novel, uracil-containing histone deacetylase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (20), 6046-6056 (2006).
- Pidroni, A., et al. A Class 1 Histone Deacetylase as Major Regulator of Secondary Metabolite Production in Aspergillus nidulans. Frontiers in Microbiology. 9, 2212 (2018).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Wegener, D., Wirsching, F., Riester, D., Schwienhorst, A. A fluorogenic histone deacetylase assay well suited for high-throughput activity screening. Chemistry & Biology. 10 (1), 61-68 (2003).
- Peng, L., Yuan, Z., Seto, E. Histone deacetylase activity assay. Methods in Molecular Biology. 1288, 95-108 (2015).
