Summary
Les déacétylases histones de classe 1 (HDACs) comme RpdA ont gagné en importance en tant que cibles potentielles pour traiter les infections fongiques. Nous présentons ici un protocole pour l’enrichissement spécifique du RPDA TAP-Tagged combiné avec un essai d’activité HDAC qui permet le test d’efficacité in vitro des inhibiteurs de l’histone désacétylase.
Abstract
Les déacétylases histones de classe 1 (HDACs) comme RpdA ont gagné en importance en tant que cibles potentielles pour le traitement des infections fongiques et pour l’extraction génomique des métabolites secondaires fongiques. Cependant, le dépistage des inhibiteurs nécessite des activités enzymatiques purifiées. Comme les déacétylases de la classe 1 exercent leur fonction en tant que complexes multiprotéiques, elles ne sont généralement pas actives lorsqu’elles sont exprimées en polypeptides simples dans les bactéries. Par conséquent, les complexes endogènes doivent être isolés, ce qui, lorsque des techniques conventionnelles comme l’échange ionique et la chromatographie d’exclusion de taille sont appliquées, est laborieux et chronophage. La purification par affinité en tandem a été développée comme un outil pour enrichir les complexes multiprotéiques des cellules et s’est donc avérée idéale pour l’isolement des enzymes endogènes. Nous fournissons ici un protocole détaillé pour l’enrichissement en une seule étape des complexes RpdA actifs par l’intermédiaire de la première étape de purification du RpdA de C-Terminally TAP-Tagged de Aspergillus nidulans. Les complexes purifiés peuvent ensuite être utilisés pour le dépistage ultérieur des inhibiteurs appliquant un dosage de la déacétylase. L’enrichissement en protéines ainsi que le dosage enzymatique peuvent être complétés dans les deux jours.
Introduction
Les histones déacétylases (HDACs) sont des enzymes hydrolytiques dépendantes de Zn2 +capables d’éliminer les groupes acétyle des résidus de lysine des histone et d’autres protéines. En fonction de la similitude des séquences, les HDACs sont regroupés en plusieurs classes1. Récemment, la classe fongique 1 HDAC RpdA, un orthologues de levure de Boulanger (Saccharomyces cerevisiae) Rpd3p, s’est révélé être essentiel pour le champignon pathogène opportuniste Aspergillus fumigatus2. Par conséquent, RpdA a gagné en importance comme une cible potentielle pour traiter les infections fongiques2. L’évaluation de l’activité de la déacétylase in vitro est importante pour la caractérisation des propriétés enzymatiques et permet de déterminer l’efficacité de nouvelles substances pour le développement d’inhibiteurs. Bien que l’expression recombinante d’une version optimisée du codon de l’HDAC1 humain dans Escherichia coli ait été signalée récemment3, les tentatives d’exprimer le RPDA de longueur totale dans cet hôte ont échoué4. De plus, comme les HDACs de classe 1 fongiques tels que RpdA et HosA exercent leur fonction de complexes multiprotéiques, il est favorable d’utiliser des complexes endogènes natifs pour des études d’inhibiteurs enzymatiques. Cependant, en raison des facteurs inhibant et de la présence de différents HDACs dans les lysats fongiques, l’activité catalytique mesurée dans les extraits protéiques entiers est relativement faible et ne peut être affectée à des enzymes individuelles. De plus, des études antérieures sur le champignon filamenteux a. nidulans ont identifié un HDAC de classe 2, hdaa, comme la déacétylase prédominante dans les fractions chromatographiques des extraits fongiques. Ainsi, plusieurs étapes conventionnelles de purification chromatographique sont nécessaires pour séparer l’activité non-HdaA des souches fongiques4. L’introduction de la stratégie de purification par affinité en tandem (TAP) dans a. nidulans5 a considérablement atténué l’enrichissement des activités spécifiques de la déacétylase. La balise TAP d’origine est composée de deux domaines de protéine A et d’un peptide liant la calmoduline (CBP) séparé par un site de clivage de la protéase du virus etch (TEV)6. Cela permet la purification native et l’élution des protéines marquées, y compris leurs partenaires d’interaction7. Lors de l’utilisation des protéines enrichites pour les dosages d’activité, l’élution légère dans des conditions natives par clivage de la protéase est une caractéristique importante de la purification de balise TAP. Une protéine GFP-Tagged, par exemple, peut être enrichie par des anticorps immobilisés aussi bien, cependant, ne peut pas être élué dans des conditions natives.
Nous fournissons ici un protocole détaillé pour l’enrichissement en une seule étape des complexes RpdA actifs par l’intermédiaire de la première étape de purification du RpdA de a. nidulans (séparation d’IgG et clivage de TEV) pour le dépistage ultérieur d’inhibiteurs appliquant un dosage de l’histone déacétylylase. Comme cela s’est avéré suffisant, l’enrichissement d’affinité a été limité à une seule étape de purification aussi parce que l’activité enzymatique a été significativement réduite après la purification de TAP en deux étapes par rapport à la purification d’IgG seule.
Néanmoins, le protocole introduit devrait aussi bien être applicable pour l’enrichissement d’autres enzymes marquées impliquées dans la régulation de la chromatine comme les acétyltransférases, les méthyltransférases et les déméthylases. En ajoutant la deuxième étape de purification du protocole TAP, les protéines co-purifiées avec les appâts marqués peuvent être considérées comme des partenaires complexes de complexes enzymatiques (nouveaux).
Protocol
1. culture de A. nidulans
- Préparation de l’inoculum
Remarque: toutes les étapes en dehors de l’incubation doivent être effectuées sous une armoire à flux laminaire.- Filtrer la souche TAP (p. ex. , TIB 32.12) du stock de glycérol (-80 ° c) sur le milieu minimal glucose/xylose (gxmm; par litre: 10,0 g de glucose, 0,5 g de xylose, 10 ml de solution de tartrate di-ammonium 1 M, 20 ml de 50 × solution saline [par litre: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2po4, 1 ml de chloroforme], 1 ml de 1 000 × oligo-éléments Hutner8) dont 1,5% (p/v) de gélose et les suppléments requis décrits par Todd et coll. 20079. Incuber pendant 2 – 3 jours à 37 ° c.
NOTE: le TIB 32.1 contient une fusion RPDA:: Tap contrôlée par un promoteur inductible par xylose, xylp(p)10. C’est pourquoi le xylose est inclus dans la recette ci-dessus. Omettre le xylose lorsque des souches croissantes expriment des constructions qui ne sont pas sous le contrôle de xylp(p). - Préparer un tube de centrifugation stérile de 1,5 mL avec 1,5 mL de solution de suspension conidiale stérile (CSS; 0,9% (p/v) NaCl, 0,01% (v/v) Polysorbate 80).
- Mouiller une boucle d’inoculation jetable en CSS, gratter les conidies de la plaque de l’étape 1.1.1 et suspendre dans le tube de l’étape 1.1.2.
- Transférer 150 μL chacune de la suspension conidiale à 10 25 cm2 flacons de culture de cellules avec bouchon d’évent contenant gélose GXMM y compris les suppléments et 200 ΜL de CSS.
- Répartir la suspension conidiale dans les flacons à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile et incuber les flacons à 37 ° c pendant 2 à 3 jours.
- Pour récolter les conidies, utiliser 10 mL de CSS par flacon. Versez la solution dans un flacon, fermez fermement le flacon avec le bouchon à vis fourni et secouez vigoureusement le flacon.
- Après avoir mouillé la surface fongique, gratter complètement les conidies restantes avec une boucle d’inoculation stérile.
- Passer les conidies à travers des tamis à cellules de 40 μm placés sur un tube de centrifugation de 50 mL stérile et prélever la suspension de cinq flacons dans un tube.
- Centrifuger le tube à 1 000 × g pendant 10 min.
- Décanter le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL de CSS par tube.
- Recueillir les deux suspensions dans un tube, rincer le tube vide avec 40 mL de CSS, ajouter à la suspension, et centrifuger comme décrit dans l’étape 1.1.9.
- Décanter le surnageant et Resuspendre le culot conidies dans 4 ml de CSS.
- Préparer deux dilutions série 1:50 de la suspension conique et déterminer le nombre de conidies dans la suspension diluée de 1:2 500, avec une chambre de comptage, comme décrit11.
- Filtrer la souche TAP (p. ex. , TIB 32.12) du stock de glycérol (-80 ° c) sur le milieu minimal glucose/xylose (gxmm; par litre: 10,0 g de glucose, 0,5 g de xylose, 10 ml de solution de tartrate di-ammonium 1 M, 20 ml de 50 × solution saline [par litre: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2po4, 1 ml de chloroforme], 1 ml de 1 000 × oligo-éléments Hutner8) dont 1,5% (p/v) de gélose et les suppléments requis décrits par Todd et coll. 20079. Incuber pendant 2 – 3 jours à 37 ° c.
- Croissance et récolte des mycéliums
- Tout en travaillant sous une armoire à écoulement laminaire, ensemencez 4 à 6 flacons coniques d’un litre contenant chacun 250 mL de GXMM, y compris des suppléments appropriés à une densité de 5 × 106 conidies/ml et incuber à 180 tr/min à 37 ° c pendant 14 – 16 h.
- Placer le chiffon de fromage dans un entonnoir au-dessus d’une fiole et filtrer les mycéliums à travers le chiffon. Laver brièvement avec de l’eau désionisée.
- Enlevez le plus d’humidité possible en serrant les mycéliums piégés dans le chiffon de fromage entre les mains puis les essuie-tout.
- Transférer les mycéliums séchés sous forme de feuilles plates à un bécher en plastique avec un couvercle à vis et un gel éclair avec de l’azote liquide. Cela garantit un rapport surface/volume élevé pour le processus de lyophilisation suivant.
- Conserver le mycélium congelé à-80 ° c avant la lyophilisation.
Remarque: le protocole peut être suspendu ici. - Lyophiliser les mycéliums pendant la nuit.
- Arrêter le processus de lyophilisation lorsque la température du mycélium reste constante (18 – 24 h). Retirer les gobelets et sceller immédiatement avec les capuchons de vis fournis.
Remarque: lorsque les mycéliums lyophilisés sont hermétiquement scellés, ils peuvent être stockés pendant plusieurs semaines à RT.
2. enrichissement en une seule étape de HDAC à TAP-Tagged (adapté de bayram et al. 2012)12
- Préparation des tampons et des solutions
Remarque: ajouter 2-mercaptoethanol (EtSH) et des inhibiteurs de protéase aux tampons directement avant l’utilisation. Filtrer tous les tampons utilisés pour la chromatographie dans des membranes de nitrocellulose de 0,22 μM pour éviter l’introduction d’impuretés/contaminations dans la résine de chromatographie. Les instructions dans les étapes ci-dessous se rapportent à la préparation de 1 L de chaque tampon. Stocker les tampons à 4 ° c.- Tampon d’extraction (B250): 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Dissoudre 12,35 g de Tris-HCl, 2,62 g de tris (base libre) et 13,2 g de NaCl dans 800 mL d’eau désionisée et ajouter 10 mL d’une solution TX-100 à 10% (v/v).
- Vérifier le pH à RT et ajuster au pH 7,5 avec du NaOH ou du HCl [5 M], si nécessaire.
- Faire jusqu’à 1 L et filtrer à travers une membrane de nitrocellulose de 0,22 μM.
- Ajouter 35 μL de EtSH par 100 mL de tampon (concentration finale de 5 mM) directement avant l’utilisation.
- Tampon de lavage 250 (WB250): 250 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Préparer WB250 comme décrit pour B250 (2.1.1) mais avec 3,59 g de Tris-HCl, et 2,08 g de tris (base libre).
- Tampon de lavage 150 (WB150): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Préparer WB150 comme décrit pour B250 (2.1.1) mais avec 3,59 g de Tris-HCl, 2,08 g de tris (base libre) et 8,77 g de NaCl.
- Tampon d’équilibration TEV (TEB): 150 mm NaCl, 40 mm Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mm EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 5 mm etsh.
- Même que WB150 mais ajouter EDTA à 0,5 mM de concentration finale.
- Tampon de clivage TEV (TCB): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 10% (v/v) glycérol, 5 mM EtSH.
- Préparer comme décrit à l’étape 2.1.1 avec 3,59 g de Tris-HCl, 2,08 g de tris (base libre) et 8,77 g de NaCl et ajouter 100 mL de glycérol avant d’ajuster le volume à 1 L.
- 50 cocktail inhibiteur de protéase: dissoudre 1 comprimé d’un cocktail disponible dans le commerce d’inhibiteurs de protéase dans 1 mL d’eau et conserver à-20 ° c.
- TBS-T: 50 mM Tris-HCl pH 7,6 (RT), 0,9% (p/v) NaCl, 0,1% (v/v) Polysorbate 20.
- Préparez comme décrit à l’étape 2.1.1. Utiliser 6,06 g de Tris-HCl, 1,40 g de tris (base libre), 9 g de NaCl et 1 mL de polysorbate 20.
- 5 × LSB (tampon d’échantillon de Laemmli): 315 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 25% (v/v) EtSH, 50% (v/v) glycérol, 10% (p/v) SDS, 0,05% (w/v) bleu de bromophénol.
- Tampon d’extraction (B250): 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Préparation de l’extrait de protéine
- Ajouter 1,5 g de mycélium lyophilisé et une boule de broyage dans le pot de broyage d’un moulin à billes.
Remarque: des mycéliums frais peuvent également être utilisés. Lorsque vous le faites, séchez les mycéliums aussi soigneusement que possible avant de les congeler et assurez-vous de prérefroidir les pots de broyage dans de l’azote liquide pour le broyage de mycéliums frais. - Moudre le mycélium à la poudre à 25 Hz pendant 30 s.
Remarque: dans les cas où aucune rectifieuse n’est disponible, moudre les mycéliums à une poudre à l’aide d’un mortier et d’un pilon, tel que décrit par Bayram et al. le 12. - Transférer la poudre mycélienne dans un tube de centrifugation de 15 mL.
- Inclinez le tube de centrifugation, y compris le mycélium moulu, pour permettre le mélange ultérieur de mycélium avec tampon.
- Ajouter 6 mL de glace froide B250 y compris 1 × cocktail inhibiteur de protéase par gramme de poudre mycélienne et mélanger avec une petite spatule jusqu’à ce que l’homogénéisation complète de l’extrait brut soit obtenue. En cas d’utilisation de mycélium frais, voir Bayram et al. 12 pour obtenir la bonne biomasse au rapport de tampon d’extraction.
- Garder le tube sur la glace pendant 5 min.
- Placer le tube et le tube d’équilibrage dans une centrifugeuse et tourner à 40 000 × g pendant ≥ 20 min à 4 ° c. Effectuer l’équilibration de la résine IgG (étape 2,3) pendant la centrifugation.
- Après centrifugation, retirer 10 μL du surnageant pour l’analyse SDS-PAGE. Placer l’échantillon dans un tube de 1,5 mL contenant 40 μL d’eau et 12,5 μL de 5 × LSB; dénommé «ex» dans la figure 1.
- Retirez délicatement le surnageant (lysat dégagé) à l’aide d’une pipette sérologique et transférez-le sur la colonne contenant les billes d’IgG équilibrées (étape 2.3) et fermez-le fermement à l’aide du capuchon d’extrémité fourni.
- Ajouter 1,5 g de mycélium lyophilisé et une boule de broyage dans le pot de broyage d’un moulin à billes.
- Equilibration de la résine IgG (réalisée lors de l’étape
- Préparer une colonne de chromatographie jetable de 10 mL et pipetage 300 μL de résine IgG bien resuspendue (50% de lisier) dans la colonne. Remplissez la colonne à 10 mL avec B250 et laissez le tampon circuler par gravité.
- Ajouter 1 mL de B250 y compris 1 × cocktail inhibiteur de protéase et laisser couler à travers. Branchez le bas de la colonne.
- Purification par lots de HDAC avec TAP-Tagged
- Incuber la colonne de chromatographie contenant les billes équilibrées et le lysat dégagé de l’étape 2.2.9 sur un mélangeur rotatif à 10 tr/min à 4 ° c pendant 2 – 4 h.
- Après la liaison par lots, retirez le capuchon et ouvrez la colonne en bas pour collecter le flux.
- Prenez un échantillon pour l’analyse SDS-PAGE comme décrit à l’étape dénommé «FT» dans la figure 1.
- Laver les billes avec 10 mL de WB250. Premièrement, utiliser 1 mL de tampon pour enlever les billes piégées du capuchon de colonne à l’aide d’un pipetteur et transférer cette suspension en une seule fois sur la résine installée pour permettre la remise en suspension des billes. Ensuite, remplissez la colonne vers le haut, fermez à l’aide d’un capuchon de pile et connectez-vous à une pompe péristaltique. Réglez un débit d’environ 1 à 5 mL/min. empêcher la résine de fonctionner à sec.
- Répétez l’étape 2.4.4 trois fois pour un total de quatre lavages avec WB250.
- Laver les billes trois fois avec 10 mL de TEB comme décrit à l’étape 2.4.4.
- Fermez la colonne de chromatographie en bas, Resuspendez les billes d’IgG dans 1 mL de TCB, et ajoutez 20 μL de 50 × cocktail inhibiteur de protéase ainsi que 10 ΜL de TEV (~ 1 mg/ml de stock, variante mutant S219V produite en interne).
- Plafonner la colonne et incuber sur un mélangeur rotatif à 10 tr/min à 4 ° c pendant la nuit pour éluer les complexes protéiques reliés par le HDAC étiqueté.
Remarque: vous pouvez également effectuer un condensat de TEV à une température élevée (16 – 25 ° c), ce qui réduit le temps de réaction, mais soulève le risque de dégradation des protéines. - Le lendemain, ouvrez la colonne et récupérez l’éluat dans un tube de centrifugation de 2 mL. Utiliser 0,7 mL de TCB pour enlever les billes du capuchon et rincer le mur de la colonne.
- Placer la colonne sur le tube ouvert de 2 mL de l’étape précédente qui lui-même est placée dans un tube de centrifugation de 50 mL.
- Transférer cet assemblage dans une centrifugeuse supérieure de table et tourner à 300 × g pendant 2 min. C’est l’éluat de TEV.
Remarque: lorsque vous effectuez une purification par affinité en tandem, utilisez l’éluation TEV comme entrée pour l’étape d’affinité de la calmoduline. Vous pouvez également diviser le TEV éluer et utiliser une partie pour la détermination de l’activité HDAC et la deuxième partie pour compléter la purification TAP. - Retirer 50 μL de l’éluat de TEV et ajouter 12,5 μL de 5 × LSB pour SDS-PAGE (dénommé «TE» dans les figures 1 et 2) et conserver l’éluat restant sur la glace.
- Pour évaluer l’efficacité de l’élution de la protéase, ajouter 2 mL d’acide acétique à 5% (v/v) et incuber à RT pendant 5 min. Encore une fois, utilisez le premier mL pour resuspendre la résine.
- Prélever l’éluat d’acide et prendre de nouveau 50 μL d’échantillon et ajouter 12,5 μL de 5 × LSB (dénommé «AE» dans la figure 1). LSB s’allume en jaune lorsqu’il est ajouté à la solution acide. Pour neutraliser l’acide, ajouter 10 M de NaOH par incréments de 1 μL et bien mélanger jusqu’à ce que la couleur se transforme à nouveau en bleu.
- Rééquilibrez la résine d’IgG avec TBS-T pour neutraliser l’acide. Conserver la résine dans de l’éthanol TBS-T/20% (v/v) à 4 ° c pour la réutiliser avec la même protéine étiquetée.
- Stockage des fractions d’élution
- Aliquot l’éluate en fractions ~ 100 μL, pour éviter plusieurs cycles de gel-dégel.
- Congeler les aliquotes dans l’azote liquide et conserver à-80 ° c.
Remarque: les échantillons stockés de cette façon seront stables pendant des mois sans perdre l’activité enzymatique.
3. analyse de la purification par SDS-PAGE et Western Blot
- Utiliser des protocoles standard pour le moulage de gels de SDS-polyacrylamide ou utiliser des gels préfabriqués13. Dénaturer les échantillons de gel de la section précédente à 95 ° c pendant 5 min, centrifuger à ≥ 15 000 × g pendant 5 min, et charger sur 12% de gels. Les volumes de chargement recommandés sont donnés dans la légende de la figure 1. Électrophorèse les échantillons dans 1 × Tris-Glycine SDS-PAGE tampon en cours d’exécution à 180 V constante pendant 60 – 70 min, jusqu’à ce que le marqueur bleu de bromophénol du tampon de chargement SDS-PAGE commence à migrer hors du gel.
- Utilisez des protocoles standard pour la coloration argentée des gels. Par exemple, utilisez le protocole de Blum et coll. 198714 qui est également compatible avec l’analyse de la Sep.
- Utiliser des protocoles standard pour le buvard occidental15. Pour la génération de résultats représentatifs ci-dessous, un système de buvard disponible dans le commerce a été utilisé.
- Sonde les taches avec l’anti-calmoduline (anti-CBP) d’anticorps de la protéine liant dans le commerce dans le lait en poudre 5% (w/v) dans TBS-T à 4 ° c pendant la nuit.
Remarque: l’anticorps anti-CBP est dirigé contre la partie de l’étiquette TAP toujours présente après le clivage de TEV. - Utilisez des protocoles standard pour la détection et le développement de blots. Par exemple, on a utilisé le conjugué phosphatase alcaline-IgG anti-lapin et un substrat de développement des couleurs BCIP/NBT pour la génération de résultats représentatifs ci-dessous.
4. dosage de la déacétylase en utilisant des histones de réticulocytes de poulet étiquetés in vitro [3H] (adaptées de trojer et al. 2003)4
- Se référer au protocole de Kölle et al. 199816 pour la préparation des histones réticulocytes de poulet marquées à l’acétate [3H].
- Par condition de dosage, placer trois tubes à centrifugation de 1,5 mL sur la glace pour les mesures en triplicates. Préparez également trois tubes pour le contrôle de fond de tampon seulement.
- Mettre 25 μL de WB150 dans chaque tube et ajouter 25 μL de TEV éluer de l’étape 2.4.11 et conserver sur la glace.
- Préchauffer un incubateur de tubes à 25 ° c.
- Utiliser des intervalles de 15 s (montre d’arrêt) pour l’addition de 10 μL d’histones étiquetées [1,5 mg/mL] à chaque tube.
- Avant de commencer le dosage, prendre 10 μL des histones de poulet marquées à l’acétate [3H] et commencer la montre d’arrêt.
- Cinq secondes après le début, ajoutez les histones étiquetées, fermez le tube hermétiquement, Vortex, et mettez-le dans l’incubateur.
- Utiliser des intervalles de 15 s pour l’addition de 10 μL d’histones étiquetées et procéder comme décrit dans l’étape précédente.
- Après 60 min d’incubation, ajouter 50 μL de solution d’arrêt (1 M HCl/0,4 M d’acide acétique) à chaque tube en intervalles de 15 s; Vortex immédiatement. Après l’addition de la solution acide, la combinaison de dosage est stable et peut être maintenue à RT jusqu’à l’étape suivante.
- Ajouter 800 μL d’acétate d’éthyle à chaque tube pour extraire l’acide acétique [3H] libéré.
- Fermez hermétiquement les tubes et vortex chaque tube pendant 5 s.
- Placer le tube dans une microcentrifugeuse et tourner à 10 000 × g pendant 10 min à RT.
- Dans l’intervalle, préparez un flacon de scintillation par échantillon de dosage et ajoutez 3 mL de cocktail de scintillation pour les échantillons hydrophobes.
- Après centrifugation (étape 2,12), transférer soigneusement 600 μL de la phase organique supérieure dans les tubes de scintillation préparés et fermer les tubes hermétiquement.
- Mesurez la radioactivité correspondant à l’activité HDAC dans un compteur de scintillation liquide.
Representative Results
Un résultat typique de l’enrichissement en une seule étape présenté de RpdA est illustré à la figure 1 (appelée «IgG»). Par souci d’exhaustivité, nous avons également inclus des fractions de flux et d’élution («CFT» et «CE») illustrant la deuxième étape de purification par une résine de calmoduline («CaM») comme décrit12. Le gel teinté argenté (A) illustre clairement l’efficacité de la première étape d’affinité qui est encore augmentée lors de l’exécution de la purification en tandem. Les protéines les plus importantes présentes dans l’extrait de protéine et l’écoulement-à travers, cependant, sont déjà épuisées dans l’éluat de TEV (TE). Il est important de noter que les fractions d’élution TEV sont > 100 × concentrées par rapport à l’extrait et à l’écoulement. Les astérisques marquent les balises RpdA (comparer le panneau B). La MW calculée de RpdA, y compris le CBP (RpdA:: CBP) est 82 kDa, cependant, la protéine migse à un poids moléculaire apparent beaucoup plus élevé d’environ 120 kDa. Ce phénomène a été observé précédemment et peut être assigné aux propriétés spécifiques de son C-terminus4,17. L’immunoblot (B) montre des signaux forts qui migrent à environ 120 kDa, ce qui correspond au RPDA (RPDA:: CBP), étiqueté CBP, dans l’ÉLUAT de TEV («te»), dans les fractions de calmoduline («CFT») et d’éluat («CE»). Dans l’éluat acide («AE»), un deuxième signal avec une MW légèrement plus grande est visible. Cela représente la proportion de RpdA à TAP-Tagged lié à la résine d’IgG qui n’a pas été libéré par le clivage de TEV. La différence de taille correspond à 16 kDa de la protéine une répétition de RpdA:: TAP uncleaved. Comme prévu, aucune bande ne pourrait être détectée par l’anticorps anti-CBP dans les fractions de contrôle de type sauvage (Panel B, "Wild type").
Les résultats d’un dosage représentatif de l’activité de la déacétylase avec l’inhibiteur spécifique de la HDAC trichostatine a (TSA) sont affichés dans la figure 2. Ce dosage a été développé à l’origine pour les plantes18 et a également été utilisé pour le dépistage des inhibiteurs contre les déacétylases mammaliennes19,20. Les histones utilisées pour le dosage ont été étiquetées et préparées comme décrit16. On montre l’effet d’une augmentation des concentrations de TSA sur l’activité catalytique du complexe RpdA enrichi («TE ± TSA»). La sensibilité de l’activité confirme que les valeurs mesurées de CPM sont en effet dues au RpdA et non causées par une activité protéasique non spécifique. Il s’agit d’une observation importante car elle indique que TEV, qui est présent à une concentration assez élevée, n’interfère pas avec le dosage de l’activité HDAC. Afin d’assigner l’activité mesurée de HDAC au RpdA, une souche de type sauvage a été utilisée comme contrôle négatif («CO»). Comme prévu, seule l’activité marginale du HDAC (environ 5-10% des fractions enrichiées par le RpdA) a été détectée dans l’éluat de TEV du type sauvage. Fait intéressant, l’activité de HDAC est significativement réduite après la deuxième étape de purification d’affinité («CE») par rapport à l’éluat de TEV.
La figure 1. Purificationde l’affinité tandem du RpdA TAP-Tagged. Un gel SDS-polyacrylamide à 10% teinté d’argent (a) et une tache occidentale sondé avec l’anticorps anti-CBP (B) sont affichés. L’étiquetage des voies et les volumes chargés sont les suivants: "M": 2 μl de 1:10 marqueur protéiné non teinté dilué (tache argentée), 3,5 μl de marqueur protéique préteinté (tache occidentale); "Ex": échantillon d’extrait de protéine tel qu’il est préparé à l’étape 3, 2 μl de dilution 1:10, 5 μl; «FT»: échantillon d’écoulement de résine d’IgG tel que préparé à l’étape 2.4.3 (2 μl de dilution 1:10, 5 μl); "AE": éluat acide de l’étape 2.4.14 (10 μl, 10 μl); "TE": l’élution de TEV de la nuit par clivage TEV, pas 2.4.12 (10 μl, 10 μl); "CFT": débit la calmoduline (20 μL, 20 μL); "CE": Éluer la calmoduline (10 μL, 10 μL). La taille des protéines de marqueur sélectionnées est indiquée sur le côté gauche des panneaux. Les volumes donnés entre parenthèses correspondent respectivement à des chargements d’échantillons pour la tache argentée et l’Ouest. Des astérisques dans le gel teinté d’argent indiquent la protéine de fusion RpdA. L’immunoblot (B) a été détecté avec une phosphatase alcaline à l’aide du système de développement des couleurs BCIP/NBT. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 2. Dosage de l’activité HDAC en concentrations croissantes de Trichostatine A. L’efficacité de l’inhibition du RpdA a été testée avec 25 μL de RpdA recombinant purifié par affinité («TE») et 25 μL de 0, 10, 50 et 500 nM de l’inhibiteur de HDAC TSA dilué dans le milieu RPMI-1640. RPMI a été utilisé pour évaluer l’activité de fond («blank»). Les activités de l’éluat final après la deuxième étape d’affinité de calmoduline («CE») et d’une souche non marquée après la première étape de purification d’affinité (contrôle négatif, «co») sont affichées. Les activités sont indiquées en pourcentage du RpdA enrichi sans TSA (100%, «TE»). Les barres d’erreur indiquent l’écart type de trois répétitions. Ce chiffre a été modifié de Bauer et al. 20162. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Ce protocole décrit un enrichissement en une seule étape d’une HDAC de classe 1 marquée TAP à partir du champignon filamenteux a. nidulans pour l’évaluation de l’activité de la déacétylase in vitro. L’étiquette TAP a été initialement introduite dans la levure de boulanger pour l’identification des partenaires d’interaction protéine-protéine de la protéine marquée6. Par la suite, l’étiquette a été codon-optimisé pour son utilisation dans a. nidulans5. Ici, nous fournissons un protocole étape par étape simple pour l’application de la première étape de purification d’affinité de la stratégie TAP pour l’enrichissement en une seule étape de la classe 1 HDAC RpdA. La deuxième étape de purification d’affinité augmente nettement le niveau de purification, ce qui est particulièrement important pour l’identification des protéines qui interagissent avec les appâts. Néanmoins, la première étape est recommandée pour les essais d’activité ultérieurs, car l’absence de contamination significative après la première étape a été confirmée par une expérience de contrôle utilisant une souche de type sauvage. En outre, l’activité éluée est considérablement plus élevée après un enrichissement en une seule étape par rapport à celle du TAP complet. En plus du RpdA2, ce protocole a également été utilisé avec succès pour purifier les complexes a. nidulans de la deuxième classe 1 HDAC hosa21.
En raison de nos observations que les HDACs de classe 1 fongique construisent des complexes stables4, nous avons réussi à modifier le protocole par Bayram et al. 201212 qui représente la base de cette méthode. Néanmoins, certaines étapes critiques doivent être mentionnées. La préparation d’extraits protéiques hautement concentrés pour assurer des conditions quasi physiologiques est cruciale pour une stabilité complexe. Par conséquent, il est important à l’esprit les recommandations données concernant le ratio de la biomasse/tampon d’extraction. À cet égard, il est également essentiel d’utiliser des poudres mycéliennes fines bien broyés pour assurer une extraction correcte. Ici, l’utilisation d’une rectifieuse est clairement avantageuse. Comme mentionné dans la section de protocole, il vaut la peine d’essayer l’étape de TEV-clivage pour 1-2 h à la température ambiante afin d’accélérer la purification. Ceci a été testé pour le RpdA sans observer aucun effet néfaste sur la stabilité (observation non publiée, Bauer I, 2018). De plus, le remplacement du NP40 (utilisé dans le protocole original) par le TX-100 pourrait ne pas convenir à d’autres complexes protéiques. Lors de l’utilisation de cette méthode pour la purification d’autres protéines TAP-Tagged, on devrait également se référer au protocole Bayram, qui contient un certain nombre d’indices précieux qui pourraient être utiles pour une purification suffisante d’autres complexes protéiques12.
En plus de la méthode TAP décrite ici, d’autres balises et techniques d’affinité sont couramment utilisées pour l’enrichissement en une seule étape de la protéine des champignons filamenteux, y compris les Tags his et GFP. Cependant, comme les HDACs de classe 1 sont généralement fonctionnels en tant que complexes de poids moléculaire élevé, les conditions d’élution Native sont une condition préalable à l’enrichissement des HDACs catalytiquement actifs. Il est important de noter que de nombreuses autres purifications d’affinité sont effectuées dans des conditions défavorables. Par exemple, l’enrichissement des HDACs par GFP-Trap, qui est basé sur l’interaction antigène-anticorps, n’est pas approprié en raison des conditions d’élution acide interférant avec l’interaction protéine-protéine des complexes HDAC liés aux résines. En outre, les tentatives de purifier le RpdA étiqueté par la chromatographie d’affinité de chélate de métal22, ont entraîné une perte significative d’activité catalytique pendant la procédure de purification bien que l’imidazole au lieu des conditions de faible pH ait été utilisé pour l’élution ( données inédites, Bauer, I, 2010).
Une des limitations du protocole d’analyse enzymatique décrit est l’utilisation du substrat radioactif. Cependant, les essais sur une base fluorescente ont été développés aussi bien23,24 et sont disponibles dans le commerce. Ces dosages sont réalisés dans des plaques de puits et conviennent également pour le criblage à haut débit des inhibiteurs de HDAC. Dans ce cas, un haut de gamme de la procédure présentée serait nécessaire.
Les applications potentielles à venir de ce protocole incluent l’enrichissement de sous-complexes spécifiques des HDACs de classe 1 pour évaluer leurs rôles physiologiques spécifiques et/ou différences dans leur susceptibilité aux inhibiteurs de HDAC. Lors de l’établissement de la méthode décrite pour d’autres enzymes, il est fortement recommandé d’effectuer une expérience de contrôle négatif avec une souche non marquée. Cela assure la spécificité des activités enzymatiques mesurées et révélerait la contamination par des enzymes non spécifiquement liées.
Le dosage de purification et d’activité décrit ici peut être effectué dans les deux jours et les enzymes enrichies sont stables pendant au moins plusieurs mois, lorsqu’ils sont stockés dans des aliquotes à-80 ° c. En conclusion, ce protocole fournit un moyen relativement simple et rentable de réaliser des complexes HDAC de classe 1 pour la mesure de l’activité et la détermination de l’efficacité de l’inhibiteur.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous aimerions remercier Petra Merschak, Division de biologie moléculaire (Biocenter, Université médicale d’Innsbruck), pour son aide et son soutien au sujet de ce manuscrit. En outre, nous aimerions remercier les examinateurs pour leurs commentaires précieux.
Ce travail a été financé par le fonds autrichien de la science (P24803 à SG et P21087 à GB) et par le financement intra-muros (MUI Start, ST201405031 à IB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x SDS-PAGE running buffer | Novex | ||
| 2-mercaptoethanol (EtSH) | Roth | 4227 | |
| 25 cm2 cell culture flasks with vent cap | Sarstedt | 833910002 | For spore production |
| 47 mm vacuum filtration unit | Roth | EYA7.1 | |
| AccuFLEX LSC-8000 | HITACHI | – | Scintillation counter |
| Acetic acid | Roth | 7332 | |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody | Millipore | 07-482 | Used at 1:1333 dilution |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody | Sigma-Aldrich | A3687 | |
| Ball mill | Retsch | 207450001 | Mixer Mill MM 400 |
| BCIP/NBT | Promega | S3771 | Color development substrate for AP |
| Cell strainer | Greiner | 542040 | |
| Cheese cloth for harvesting mycelia | BioRen | H0028 | Topfentuch |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Roth | 4720 | |
| EDTA | Prolabo | 20309.296 | |
| Ethyl acetate | Scharlau | Ac0155 | |
| Freeze Dryer | LABCONCO | 7400030 | FreeZone Triad |
| Glycerol | Roth | 3783 | |
| HCl | Roth | 4625 | |
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | IgG Sepharose 6 Fast Flow |
| Inoculation loops | VWR | 612-2498 | |
| KOH | Merck | 5033 | |
| Laminar flow cabinet | Thermo Scientific | – | Hera Safe KS |
| Mixed Cellulose Esters Membrane Filters | Millipore | GSWP04700 | |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NaOH | Roth | 6771 | |
| Neubauer counting chamber improved | Roth | T728 | |
| Novex gel system | Thermo Scientific | For SDS-PAGE | |
| Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) | Thermo Scientific | LC2675 | Running buffer for SDS-PAGE |
| peqGold protein-marker II | VWR | 27-2010P | Protein ladder used for silver stain |
| Peristaltic Pump P-1 | GE Healthcare | 18111091 | |
| Pipette controller | Brand | 26302 | accu-jet pro |
| Poly-Prep chromatography columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProSieve QuadColor protein marker | Biozym | 193837 | Prestained protein ladder used for western blot |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free |
| Rotary mixer | ELMI | – | Intelli-Mixer RM-2 S |
| Rotiszint eco plus | Roth | 0016 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Scintillation vials | Greiner | 619080 | |
| Sorvall Lynx 4000 | Thermo Scientific | ||
| Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| TIB32.1 | A. nidulans rpdA::TAP strain. Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1; argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+ |
||
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 1704271 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | 1704150 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma-Aldrich | T8552 | 5 mM stock in DMSO |
| Tris (free base) | Serva | 37190 | |
| Tris-HCl | Roth | 9090 | |
| Polysorbate 20 | Roth | 9127 | Tween 20 |
| Polysorbate 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | Tween 80 |
| TX-100 | Acros Organics | 215682500 | Triton X-100, Octoxynol-9 detergent |
References
- Gregoretti, I. V., Lee, Y. -M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. Journal of Molecular Biology. 338 (1), 17-31 (2004).
- Bauer, I., et al. A Class 1 Histone Deacetylase with Potential as an Antifungal Target. mBio. 7 (6), (2016).
- Stefan, A., et al. Purification of active recombinant human histone deacetylase 1 (HDAC1) overexpressed in Escherichia coli. Biotechnology Letters. 40 (9-10), 1355-1363 (2018).
- Trojer, P., et al. Histone deacetylases in fungi: novel members, new facts. Nucleic Acids Research. 31 (14), 3971-3981 (2003).
- Bayram, Ö, et al. VelB/VeA/LaeA complex coordinates light signal with fungal development and secondary metabolism. Science. 320 (5882), 1504-1506 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48, (2001).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Zadra, I., Abt, B., Parson, W., Haas, H. xylP promoter-based expression system and its use for antisense downregulation of the Penicillium chrysogenum nitrogen regulator NRE. Applied and Environmental Microbiology. 66 (11), 4810-4816 (2000).
- Stolz, D. J., et al. Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Bayram, Ö, et al. Identification of protein complexes from filamentous fungi with tandem affinity purification. Methods in Molecular Biology. 944, 191-205 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Kölle, D., et al. Biochemical methods for analysis of histone deacetylases. Methods. 15 (4), 323-331 (1998).
- Tribus, M., et al. A novel motif in fungal class 1 histone deacetylases is essential for growth and development of Aspergillus. Molecular Biology of the Cell. 21 (2), 345-353 (2010).
- Sendra, R., Rodrigo, I., Salvador, M. L., Franco, L. Characterization of pea histone deacetylases. Plant Molecular Biology. 11 (6), 857-866 (1988).
- Valente, S., et al. 1,3,4-Oxadiazole-containing histone deacetylase inhibitors: anticancer activities in cancer cells. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (14), 6259-6265 (2014).
- Mai, A., et al. Synthesis and biological properties of novel, uracil-containing histone deacetylase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (20), 6046-6056 (2006).
- Pidroni, A., et al. A Class 1 Histone Deacetylase as Major Regulator of Secondary Metabolite Production in Aspergillus nidulans. Frontiers in Microbiology. 9, 2212 (2018).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Wegener, D., Wirsching, F., Riester, D., Schwienhorst, A. A fluorogenic histone deacetylase assay well suited for high-throughput activity screening. Chemistry & Biology. 10 (1), 61-68 (2003).
- Peng, L., Yuan, Z., Seto, E. Histone deacetylase activity assay. Methods in Molecular Biology. 1288, 95-108 (2015).
