Summary
Las histona de clase 1 (HDACs) como la RpdA han cobrado importancia como posibles objetivos para tratar las infecciones fúngicas. Aquí presentamos un protocolo para el enriquecimiento específico de RpdA con etiqueta TAP combinado con un ensayo de actividad HDAC que permite la prueba in vitro de la eficacia de los inhibidores de la histona deacetilasa.
Abstract
Las histona de clase 1 (HDACs) como la RpdA han cobrado importancia como posibles objetivos para el tratamiento de las infecciones fúngicas y para la extracción genómica de metabolitos secundarios fúngicos. Sin embargo, la detección de inhibidores requiere actividades enzimáticas purificadas. Desde la clase 1 deacetilasas ejercen su función como complejos multiproteicos, por lo general no son activos cuando se expresan como polipéptidos individuales en las bacterias. Por lo tanto, los complejos endógenos necesitan ser aislados, que, cuando se aplican técnicas convencionales como el intercambio iónico y la cromatografía de exclusión de tamaño, es laborioso y consume tiempo. La purificación de afinidad tándem se ha desarrollado como una herramienta para enriquecer complejos multiproteicos de las células y por lo tanto resultó ser ideal para el aislamiento de enzimas endógenas. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para el enriquecimiento de un solo paso de los complejos RpdA activos a través del primer paso de purificación de la RpdA etiquetada con TAP C-terminally de Aspergillus nidulans. Los complejos purificados pueden utilizarse para la posterior detección de inhibidores aplicando un ensayo de deacetilasa. El enriquecimiento de proteínas junto con el ensayo de actividad enzimática se puede completar en un plazo de dos días.
Introduction
Las histonas deacetilasas (HDACs) son enzimas hidrolíticas dependientes de Zn2 +capaces de eliminar grupos acetilo de los residuos de lisina de las histinas y otras proteínas. En función de la similitud de la secuencia, las HDACs se agrupan en varias clases1. Recientemente, la clase de hongos 1 HDAC RpdA, un ortolog de levadura de panadero (Saccharomyces cerevisiae) Rpd3p, demostró ser esencial para el patógeno fúngico oportunista Aspergillus fumigatus2. Por lo tanto, el RpdA ha ganado importancia como objetivo potencial para tratar las infecciones fúngicas2. La evaluación de la actividad de deacetilasa in vitro es importante para la caracterización de propiedades enzimáticas y permite determinar la eficacia de nuevas sustancias para el desarrollo de inhibidores. Aunque la expresión recombinante de una versión de HDAC1 humana optimizada para codón en Escherichia coli se ha reportado recientemente3, intentos de expresar rpda de longitud completa en este host falló4. Además, desde la clase de hongos 1 los HDACs como el RpdA y el HosA ejercen su función como complejos multiproteicos, es favorable el uso de complejos endógenos nativos para estudios de inhibidores enzimáticos. Sin embargo, debido a factores inhibidores y a la presencia de diferentes HDACs en los lisatos fúngicos, la actividad catalítica medida en extractos de proteínas enteras es relativamente baja y no se puede asignar a enzimas individuales. Por otra parte, estudios previos en el hongo filamentoso a. nidulans identificaron una clase 2 HDAC, HDAA, como predominante deacetilasa en fracciones cromatográficas de extractos fúngicos. Por lo tanto, se necesitan múltiples pasos de purificación cromatográfica convencional para separar la actividad no HdaA de las cepas de hongos4. La introducción de la estrategia de purificación de afinidad tándem (TAP) en A. nidulans5 ha aliviado significativamente el enriquecimiento de actividades específicas de deacetilasa. La etiqueta TAP original se compone de dos dominios de proteína A y un péptido de unión a calmodulina (CBP) separado por un sitio de hendición de la proteasa del virus del Etch del tabaco (TEV)6. Esto permite la purificación nativa y la elución de proteínas etiquetadas, incluyendo sus socios de interacción7. Cuando se utilizan las proteínas enriquecidas para los ensayos de actividad, la elución leve en condiciones nativas por la escisión de la proteasa es una característica importante de la purificación de la etiqueta TAP. Una proteína con la etiqueta GFP, por ejemplo, puede ser enriquecida por anticuerpos inmovilizados, sin embargo, no se puede eludir bajo condiciones nativas.
Aquí proporcionamos un protocolo detallado para el enriquecimiento de un solo paso de los complejos RpdA activos a través del primer paso de purificación de RpdA etiquetado con TAP C-terminal de a . nidulans (separación IgG y escote TEV) para la detección posterior de inhibidores aplicando un ensayo de histona deacetilasa. Como se demostró que era suficiente, el enriquecimiento de afinidad se limitó a un solo paso de purificación también porque la actividad enzimática se redujo significativamente después de la purificación de TAP de dos pasos en comparación con la purificación de IgG por sí sola.
Sin embargo, el protocolo introducido debe ser también aplicable para el enriquecimiento de otras enzimas etiquetadas que intervienen en la regulación de la cromatina, tales como acetiltransferasas, metiltransferasas y demetilasas. Al anexar el segundo paso de purificación del protocolo TAP, las proteínas copurificadas con los ceits etiquetados pueden considerarse como socios complejos de complejos enzimáticos (novedosos).
Protocol
1. el cultivo de A. nidulans
- La preparación del inóbulo
Nota: todos los pasos aparte de la incubación deben realizarse bajo un gabinete de flujo laminar.- Racha de cepa TAP (p. ej. TIB 32.12) del caldo de glicerol (-80 ° c) en el medio mínimo de glucosa/XILOSA (gxmm; por litro: 10,0 g de glucosa, 0,5 g de xilosa, 10 ml de 1 M de solución de tartrato de di-amonio, 20 ml de solución de sal de 50 × [por 26,0 litro KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2po4, 1 ml de cloroformo], 1 ml de 1.000 × oligoelementos8de hutner, incluyendo el agar al 1,5% (p/v) y los suplementos requeridos descritos por Todd et al. 20079. Incubar durante 2 – 3 días a 37 ° c.
Nota: TIB 32.1 contiene una fusión Rpda:: TAP controlada por un promotor inducible por xilosa, xylp(p)10. Esta es la razón por la que xilosa está incluido en la receta anterior. Omita la xilosa al cultivar cepas que expresan construcciones que no están bajo control Xylp(p). - Prepare un tubo de centrifugación estéril de 1,5 mL con 1,5 mL de solución de suspensión de conidial estéril (CSS; 0,9% (p/v) NaCl, 0,01% (v/v) polisorbato 80).
- Humedecer un lazo de inoculación desechable en CSS, raspar los conidios de la placa del paso 1.1.1 y suspender en el tubo desde el paso 1.1.2.
- Transferir 150 μL cada una de la suspensión de conidial a 10 25 cm2 matraces de cultivo celular con tapón de ventilación que contiene agar GXMM incluyendo suplementos y 200 ΜL de CSS.
- Esparcir la suspensión de conidial dentro de los frascos utilizando un lazo de inoculación estéril e incubar los frascos a 37 ° c durante 2 – 3 días.
- Para cosechar los conidios, utilizar 10 mL de CSS por matraz. Verter la solución en un matraz, cerrar firmemente el matraz con el tapón de rosca suministrado y agitar vigorosamente el matraz.
- Después de humedecer la superficie fúngica, raspe completamente los conidios restantes con un bucle de inoculación estéril.
- Pasar conidios a través de Coladores celulares de 40 μm colocados en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL y recoger la suspensión de cinco matraces en un tubo.
- Centrifugar el tubo a 1.000 × g durante 10 min.
- Decante el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 mL de CSS por tubo.
- Recoger ambas suspensiones en un tubo, enjuagar el tubo vacío con 40 mL de CSS, añadir a la suspensión, y centrifugar como se describe en el paso 1.1.9.
- Decante el sobrenadante y resuspender el pellet de conidial en 4 mL de CSS.
- Preparar dos diluciones serie 1:50 de la suspensión de conidial y determinar el número de conidios en la suspensión 1:2.500-diluida resultante con una cámara de conteo como se describe11.
- Racha de cepa TAP (p. ej. TIB 32.12) del caldo de glicerol (-80 ° c) en el medio mínimo de glucosa/XILOSA (gxmm; por litro: 10,0 g de glucosa, 0,5 g de xilosa, 10 ml de 1 M de solución de tartrato de di-amonio, 20 ml de solución de sal de 50 × [por 26,0 litro KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2po4, 1 ml de cloroformo], 1 ml de 1.000 × oligoelementos8de hutner, incluyendo el agar al 1,5% (p/v) y los suplementos requeridos descritos por Todd et al. 20079. Incubar durante 2 – 3 días a 37 ° c.
- El crecimiento y la cosecha de micelio
- Mientras trabajaba bajo un gabinete de flujo laminar, inocular 4 – 6 matraces cónicos de un litro cada uno conteniendo 250 mL de GXMM incluyendo suplementos apropiados a una densidad de 5 × 106 conidia/ml e incubar a 180 rpm a 37 ° c para 14 – 16 h.
- Coloque el paño de queso en un embudo encima de un matraz y filtre el micelio a través de la tela. Lavar brevemente con agua desionizada.
- Retire la mayor cantidad de humedad posible apretando el micelio atrapado en el paño de queso entre las primeras manos y luego las toallas de papel.
- Transfiera el micelio seco como láminas planas a un vaso de precipitados de plástico con una tapa de tornillo y congele el flash con nitrógeno líquido. Esto garantiza una alta relación de área/volumen para el siguiente proceso de liofilización.
- Almacene el micelio congelado a-80 ° c antes de la liofilización.
Nota: el protocolo se puede pausar aquí. - Liofilizar el micelio durante la noche.
- Detenga el proceso de liofilización cuando la temperatura del micelio permanezca constante (18 – 24 h). Retire los vasos de precipitados y sellar inmediatamente con las tapas de tornillo proporcionadas.
Nota: cuando se sella herméticamente, el micelio liofilizado se puede almacenar durante varias semanas en RT.
2. enriquecimiento en un solo paso de HDAC con etiqueta TAP (adaptado de Bayram et al. 2012)12
- Preparación de buffers y soluciones
Nota: Añadir 2-Mercaptoetanol (EtSH) y los inhibidores de la proteasa a los buffers directamente antes de su uso. Filtre todos los buffers utilizados para cromatografía a través de membranas de nitrocelulosa de 0,22 μm para evitar la introducción de impurezas/contaminaciones a la resina de cromatografía. Las instrucciones en los pasos a continuación se refieren a la preparación de 1 L de cada buffer. Almacene los búferes a 4 ° c.- Tampón de extracción (B250): 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Disolver 12,35 g de Tris-HCl, 2,62 g de Tris (base libre) y 13,2 g de NaCl en 800 mL de agua desionizada y añadir 10 mL de una solución de TX-100 al 10% (v/v).
- Compruebe el pH en RT y ajuste a pH 7,5 con NaOH o HCl [5 M], si es necesario.
- Haga hasta 1 L y filtre a través de una membrana de nitrocelulosa de 0,22 μm.
- Añadir 35 μL de EtSH por 100 mL de tampón (concentración final de 5 mM) directamente antes de su uso.
- Tampón de lavado 250 (WB250): 250 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Preparar WB250 como se describe para B250 (2.1.1) pero con 3,59 g de Tris-HCl, y 2,08 g de Tris (base libre).
- Tampón de lavado 150 (WB150): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Preparar WB150 como se describe para B250 (2.1.1) pero con 3,59 g de Tris-HCl, 2,08 g de Tris (base libre), y 8,77 g de NaCl.
- Tampón de equilibrado TEV (TEB): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Igual que WB150 pero agregue EDTA a la concentración final de 0,5 mM.
- Amortiguador TEV escote (TCB): 150 mm NaCl, 40 mm Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mm EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 10% (v/v) glicerol, 5 mm etsh.
- Preparar como se describe en el paso 2.1.1 con 3,59 g de Tris-HCl, 2,08 g de Tris (base libre), y 8,77 g de NaCl y añadir 100 mL de glicerol antes de ajustar el volumen a 1 L.
- Cóctel inhibidor de la proteasa 50 ×: disolver 1 comprimido de un cóctel disponible comercialmente de inhibidores de la proteasa en 1 mL de agua y almacenar a-20 ° c.
- TBS-T: 50 mM Tris-HCl pH 7,6 (RT), 0,9% (p/v) NaCl, 0,1% (v/v) polisorbato 20.
- Prepárese como se describe en el paso 2.1.1. Utilizar 6,06 g de Tris-HCl, 1,40 g de Tris (base libre), 9 g de NaCl y 1 mL de polisorbato 20.
- 5 × LSB (tampón de muestra de Laemmli): 315 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 25% (v/v) EtSH, 50% (v/v) glicerol, 10% (p/v) SDS, 0,05% (p/v) azul de bromofenol.
- Tampón de extracción (B250): 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Preparación de extracto proteico
- Añadir 1,5 g de micelio liofilizado y una bola de molienda en el frasco de molienda de un molino de bolas.
Nota: también se puede utilizar micelio fresco. Al hacerlo, seque el micelio lo más minuciosamente posible antes de congelar y asegúrese de preenfriar los frascos de molienda en nitrógeno líquido para moler el micelio fresco. - Triturar micelio a polvo a 25 Hz durante 30 s.
Nota: en los casos en que no hay máquina de molienda está disponible, moler micelio a un polvo utilizando un mortero y Pestle, como se describe por Bayram et al. 12. - Transfiera el polvo de micelial a un tubo de centrifugación de 15 mL.
- Incline el tubo de centrifugación incluyendo micelio terrestre para permitir la posterior mezcla de micelio con tampón.
- Añadir 6 mL de hielo-frío B250 incluyendo 1 × cóctel inhibidor de la proteasa por gramo de polvo de micelial y mezclar con una pequeña espátula hasta que se logre la homogeneización completa del extracto crudo. Cuando utilice micelio fresco, consulte Bayram et al. 12 para lograr la biomasa adecuada para la relación de tampón de extracción.
- Mantenga el tubo sobre hielo durante 5 min.
- Coloque el tubo y un tubo de equilibrio en una centrífuga y gire a 40.000 × g durante ≥ 20 min a 4 ° c. Realizar la equilibración de la resina IgG (paso 2,3) durante la centrifugación.
- Después de la centrifugación, extraiga 10 μL del sobrenadante para el análisis de SDS-PAGE. Colocar la muestra en un tubo de 1,5 mL que contenga 40 μL de agua y 12,5 μL de 5 × LSB; denominan "ex" en la figura 1.
- Retire con cuidado el sobrenadante (lisado despejado) utilizando una Pilea serológica y transfiera a la columna que contiene las perlas de IgG (paso 2.3) y cierre firmemente con la tapa final suministrada.
- Añadir 1,5 g de micelio liofilizado y una bola de molienda en el frasco de molienda de un molino de bolas.
- Equilibrado de la resina IgG (realizada durante el paso 2.2.7)
- Prepare una columna de cromatografía desechable de 10 mL y Pipet 300 μL de resina IgG bien resuspendido (50% de purines) en la columna. Llene la columna a 10 mL con B250 y deje que el búfer fluya por gravedad.
- Añadir 1 mL de B250 incluyendo 1 × cóctel inhibidor de la proteasa y dejar fluir a través de. Enchufe la parte inferior de la columna.
- Purificación por lotes de HDAC con etiqueta TAP
- Incubar la columna cromatográfica que contiene los cordones equilibrados y el lisado despejado del paso 2.2.9 en una batidora rotativa a 10 rpm a 4 ° c durante 2 – 4 h.
- Después del enlace por lotes, quite la tapa y abra la columna en la parte inferior para recopilar el flujo.
- Tome una muestra para el análisis de SDS-PAGE como se describe en el paso 2.2.8; denomina "FT" en la figura 1.
- Lavar las perlas con 10 mL de WB250. En primer lugar, utilice 1 mL de tampón para eliminar las perlas atrapadas de la tapa de la columna utilizando un pipeteador y transfiera esta suspensión en una sola sobre la resina liquidada para permitir la resuspensión de las perlas. A continuación, llene la columna hasta la parte superior, cierre con un tapón de pila y conéctelo a una bomba peristótica. Ajuste un caudal de aprox. 1 – 5 mL/min. Evite que la resina se seque.
- Repite el paso 2.4.4 tres veces para un total de cuatro lavados con WB250.
- Lavar las perlas tres veces con 10 mL de TEB como se describe en el paso 2.4.4.
- Cerrar la columna de cromatografía en la parte inferior, resuspender granos de IgG en 1 mL de TCB, y añadir 20 μL de 50 × cóctel inhibidor de la proteasa, así como 10 ΜL de TEV (~ 1 mg/ml de acción, S219V variante mutante producida en la casa).
- Tapa la columna e incubar en una batidora rotativa a 10 rpm a 4 ° c durante la noche para eluir los complejos proteicos enlazados a través de la HDAC etiquetada.
Nota: alternativamente realizar la síntesis de TEV a temperatura elevada (16 – 25 ° c), lo que reduce el tiempo de reacción, sin embargo, está elevando el riesgo de degradación de las proteínas. - Al día siguiente, abra la columna y recoja el eluato en un tubo de centrifugación de 2 mL. Utilice 0,7 mL de TCB para retirar las perlas de la tapa y enjuagar la pared de la columna.
- Coloque la columna en el tubo abierto de 2 mL del paso anterior, que se coloca en un tubo de centrifugación de 50 mL.
- Transfiera este ensamblaje a una centrífuga superior de mesa y gire a 300 × g durante 2 min. Este es el eluato del TEV.
Nota: al realizar la purificación de afinidad en tándem, utilice el eluato de TEV como entrada para el paso de afinidad de calmodulina. También puede dividir el eluato de TEV y utilizar una parte para la determinación de actividad de HDAC y la segunda parte para completar la purificación de TAP. - Retire 50 μL del eluto del TEV y añada 12,5 μL de 5 × LSB para SDS-PAGE (denominado "TE" en las figuras 1 y 2) y mantenga el eluato restante sobre el hielo.
- Para evaluar la eficacia de la elución de la proteasa, añadir 2 mL de ácido acético al 5% (v/v) e incubar en RT durante 5 min. Una vez más, utilice el primer mL para Resuspender la resina.
- Recoger el ácido eluato y de nuevo tomar 50 μL de muestra y añadir 12,5 μL de 5 × LSB (denominado "AE" en la figura 1). LSB se pondrá de color amarillo cuando se añade a la solución ácida. Para neutralizar el ácido, añadir 10 M NaOH en pasos de 1 μL y mezclar bien hasta que el color cambie a azul de nuevo.
- Vuelva a equilibrar la resina de IgG con TBS-T para neutralizar el ácido. Almacenar la resina en etanol TBS-T/20% (v/v) a 4 ° c para su reutilización con la misma proteína etiquetada.
- Almacenamiento de fracciones de elución
- Alícuota el eluato en ~ 100 μL fracciones, para evitar múltiples ciclos de congelación-deshielo.
- Congelar alícullitas en nitrógeno líquido y mantener a-80 ° c.
Nota: las muestras almacenadas de esta manera serán estables durante meses sin perder actividad enzimática.
3. Análisis de la purificación por SDS-PAGE y Western secante
- Utilice protocolos estándar para la fundición de geles de poliacrilamida SDS o utilice geles prefabricados13. Muestras de gel denature de la sección anterior a 95 ° c durante 5 min, centrifugar a ≥ 15.000 × g durante 5 min, y cargar en geles de 12%. Los volúmenes de carga recomendados se dan en la leyenda de la figura 1. Electroforese las muestras en 1 × Tris-Glycine SDS-PAGE buffer de funcionamiento a 180 V constante para 60 – 70 min, hasta que el marcador azul de bromofenol del búfer de carga SDS-PAGE comienza a migrar fuera del gel.
- Utilice protocolos estándar para la tinción de plata de los geles. Por ejemplo, utilice el protocolo de Blum et al. 198714 que también es compatible con el análisis de MS.
- Utilice protocolos estándar para Western secante15. Para la generación de resultados representativos a continuación, se utilizó un sistema de secante disponible comercialmente.
- La sonda se hinchas con anticuerpos anticalmodulin (anti-CBP) de proteína de Unión disponible comercialmente en polvo de leche al 5% (p/v) en TBS-T a 4 ° c durante la noche.
Nota: el anticuerpo anti-CBP se dirige contra la parte de la etiqueta TAP que todavía está presente después de la hendiedad del TEV. - Utilice protocolos estándar para la detección y el desarrollo de blots. Por ejemplo, el conjugada de fosfatasa alcalina IgG-conejo y un sustrato de desarrollo de color BCIP/NBT se utilizaron para la generación de resultados representativos a continuación.
4. ensayo de deacetilasa utilizando in vitro [3H] histonas con etiquetado de acetato de reticulocitos (adaptado de trojer et al. 2003)4
- Consulte el protocolo de Kölle et al. 199816 para la preparación de las histonas de reticulocitos de pollo etiquetadas con acetato de [3H].
- Por condición de ensayo coloque tres tubos de centrifugación de 1,5 mL sobre hielo para mediciones en triplicados. Prepare también tres tubos para el control de fondo solo de búfer.
- Poner 25 μL de WB150 en cada tubo y añadir 25 μL del TEV eluado del paso 2.4.11 y mantener en hielo.
- Precalentar una incubadora de tubos a 25 ° c.
- Utilice intervalos de 15 s (reloj de parada) para la adición de 10 μL de histonas etiquetadas [1,5 mg/mL] a cada tubo.
- Antes de iniciar el ensayo, tomar 10 μL de las histonas de pollo etiquetadas con acetato de [3H] e iniciar el reloj de parada.
- Cinco segundos después del inicio, añadir las histonas etiquetadas, cerrar el tubo firmemente, vórtice, y ponerlo en la incubadora.
- Utilice intervalos de 15 s para la adición de 10 μL de histonas etiquetadas y proceda como se describe en el paso anterior.
- Después de 60 min de incubación añadir 50 μL de solución de parada (1 M HCl/0,4 M ácido acético) a cada tubo en intervalos de 15 s; vórtice inmediatamente. Después de la adición de la solución ácida, la mezcla de ensayo es estable y se puede mantener en RT hasta el siguiente paso.
- Añadir 800 μL de acetato de etilo a cada tubo para extraer el ácido acético liberado [3H].
- Cierre firmemente los tubos y vórtice cada tubo durante 5 s.
- Coloque el tubo en una microcentrífuga y gire a 10.000 × g durante 10 min a RT.
- Mientras tanto, preparar un vial de centelleo por muestra de ensayo y añadir 3 mL de Cóctel de centelleo para muestras hidrófobas.
- Después de la centrifugación (paso 2,12), transferir con cuidado 600 μL de la fase orgánica superior a los tubos de centelleo preparados y cerrar los tubos firmemente.
- Mida la radioactividad correspondiente a la actividad HDAC en un contador de centelleo líquido.
Representative Results
Un resultado típico del enriquecimiento de un solo paso presentado de RpdA se muestra en la figura 1 (denominada "IgG"). En aras de la exhaustividad, también hemos incluido fracciones de flujo y elución ("CFT" y "CE") que ilustran el segundo paso de purificación por una resina de calmodulina ("CaM") según lo descrito12. El gel manchado de plata (A) muestra claramente la eficacia del primer paso de afinidad que se incrementa aún más al realizar la purificación en tándem. Las proteínas más prominentes presentes en el extracto de proteína y el flujo, sin embargo, ya se agotan en el eluato de TEV (TE). Es importante notar que las fracciones de elución del TEV son > 100 × concentrados en comparación con el extracto y el flujo. La marca de asteriscos etiquetada como RpdA (Compare el panel B). El MW calculado de RpdA incluyendo el CBP (RpdA:: CBP) es 82 kDa, sin embargo, la proteína migra a un peso molecular aparente mucho más alto de aprox. 120 kDa. Este fenómeno se ha observado previamente y se puede asignar a las propiedades específicas de su C-Terminus4,17. El inmunoblot (B) muestra señales fuertes que migran a aprox. 120 kDa correspondientes a la rpda de longitud completa con etiqueta de CBP (rpda:: CBP) en el eluato de TEV ("te"), las fracciones de flujo a través de calmodulina ("CFT") y eluar ("CE"). En el eluato ácido ("AE") una segunda señal con un MW ligeramente más grande es visible. Esto representa la proporción de la RpdA etiquetada con TAP ligada a la resina IgG que no fue liberada por el escisión del TEV. La diferencia de tamaño corresponde a 16 kDa de la proteína una repetición de uncleaved RpdA:: TAP. Como era de esperar, no se podían detectar bandas por el anticuerpo anti-CBP en las fracciones de control de tipo silvestre (panel B, "tipo salvaje").
En la figura 2se muestran los resultados de un ensayo representativo de la actividad de deacetilasa con la Tristatina a (TSA) del inhibidor HDAC específico. Este ensayo fue desarrollado originalmente para plantas18 y también se ha utilizado para la detección de inhibidores contra la deacetilasas de mamíferos19,20. Las histonas utilizadas para el ensayo fueron etiquetadas y preparadas como se describe16. Se muestra el efecto de aumentar las concentraciones de TSA en la actividad catalítica del complejo RpdA enriquecido ("TE ± TSA"). La sensibilidad de la actividad confirma que los valores de CPM medidos se deben en realidad a la RpdA y no son causados por una actividad de proteasa no específica. Esta es una observación importante, ya que indica que el TEV, que está presente en una concentración bastante alta, no interfiere con el ensayo de actividad de HDAC. Con el fin de asignar la actividad HDAC medida a RpdA, se usó una cepa de tipo salvaje como control negativo ("co"). Como era de esperar, sólo se detectó actividad marginal de HDAC (aprox. 5-10% de las fracciones enriquecidas con RpdA) en el eluato del TEV del tipo silvestre. Curiosamente, la actividad de HDAC se reduce significativamente después del segundo paso de purificación de afinidad ("CE") en comparación con el eluato de TEV.
Figura 1. La purificaciónde afinidad tándem de la RpdA etiquetada con TAP. Se visualiza un gel de poliacrilamida (a) de 10% con manchas de plata y una mancha occidental con el anticuerpo anti-CBP (B). El etiquetado de carril y los volúmenes cargados son los siguientes: "M": 2 μl de 1:10 marcador de proteína sin teñir diluido (mancha de plata), 3,5 μl de marcador de proteína prestained (Western blot); "Ex": muestra de extracto de proteína como se preparó en el paso 2.2.8 (2 μl de dilución 1:10, 5 μl); "FT": muestra de flujo de resina IgG como se preparó en el paso 2.4.3 (2 μl de dilución 1:10, 5 μl); "AE": eluato ácido del paso 2.4.14 (10 μl, 10 μl); "TE": el TEV elude la elución durante la noche por el escote TEV, paso 2.4.12 (10 μl, 10 μl); "CFT": flujo de calmodulina (20 μL, 20 μL); "CE": eluato de calmodulina (10 μL, 10 μL). El tamaño de las proteínas de marcador seleccionadas se indica en el lado izquierdo de los paneles. Los volúmenes que se dan entre paréntesis corresponden a cargas de muestra para manchas de plata y Western Blot, respectivamente. Los asteriscos en el gel teñido de plata indican la proteína de fusión RpdA. El inmunoblot (B) se detectó con fosfatasa alcalina utilizando el sistema de desarrollo de color BCIP/NBT. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ensayo de actividad HDAC bajo concentraciones crecientes de tristatina A. Se probó la eficacia de la inhibición de la RpdA con 25 μL de RpdA recombinante purificado por afinidad ("TE") y 25 μL de 0, 10, 50 y 500 nM del inhibidor de HDAC TSA diluido en Medio RPMI-1640. RPMI se utilizó para evaluar la actividad en segundo plano ("en blanco"). Las actividades del eluato final después de la segunda etapa de afinidad de calmodulina ("CE") y de una cepa sin etiquetar después del primer paso de purificación de afinidad (control negativo, "co") se muestran. Las actividades se muestran como porcentaje de RpdA enriquecido sin TSA (100%, "TE"). Las barras de error indican la desviación estándar de tres réplicas. Esta cifra ha sido modificada de Bauer et al. 20162. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este protocolo describe un enriquecimiento en un solo paso de un HDAC de clase 1 con etiqueta TAP del hongo filamentoso a. nidulans para la evaluación de la actividad de deacetilasa in vitro. La etiqueta TAP se introdujo originalmente en la levadura de panadería para la identificación de los socios de interacción proteína-proteína de la proteína6etiquetada. Posteriormente, la etiqueta estaba optimizada para su uso en A. nidulans5. Aquí proporcionamos un protocolo paso a paso directo para la aplicación del primer paso de purificación de afinidad de la estrategia TAP para el enriquecimiento de un solo paso de la clase 1 HDAC RpdA. El segundo paso de purificación de afinidad aumenta claramente el nivel de purificación, que es particularmente importante para la identificación de las proteínas que interactúan con el cebo. Sin embargo, sólo el primer paso se recomienda para las pruebas de actividad subsiguientes, ya que la falta de contaminación significativa después del primer paso fue confirmada por un experimento de control utilizando una cepa de tipo salvaje. Además, la actividad elutida es considerablemente más alta después del enriquecimiento en un solo paso en comparación con la del TAP completo. Además de RpdA2, este protocolo también fue utilizado con éxito para purificar los complejos A. nidulans de la segunda clase 1 HDAC Hosa21.
Debido a nuestras observaciones que la clase de hongos 1 HDACs acumulan complejos estables4, hemos logrado modificar el Protocolo por Bayram et al. 201212 que representa la base de este método. Sin embargo, hay que mencionar algunos pasos críticos. La preparación de extractos proteicos altamente concentrados para asegurar condiciones casi fisiológicas es fundamental para una estabilidad compleja. Por lo tanto, es importante tener en cuenta las recomendaciones dadas con respecto a la relación de búfer de biomasa/extracción. En este sentido, también es fundamental utilizar polvos miceliales bien molido para garantizar una extracción adecuada. Aquí, el uso de una máquina de molienda es claramente ventajoso. Como se menciona en la sección de protocolo, vale la pena probar el paso TEV-cleavage para 1-2 h a temperatura ambiente con el fin de acelerar la purificación. Esto fue probado para el RpdA sin observar ningún efecto perjudicial sobre la estabilidad (observación inédita, Bauer I, 2018). Además, el reemplazo de NP40 (utilizado en el protocolo original) con TX-100 podría no ser adecuado para otros complejos proteicos. Cuando se utiliza este método para la purificación de otras proteínas con etiqueta TAP, también se debe referirse al protocolo Bayram, que contiene una serie de valiosas sugerencias que podrían ser útiles para una purificación suficiente de otros complejos proteicos12.
Además del método TAP descrito anteriormente, otras etiquetas y técnicas de afinidad se utilizan comúnmente para el enriquecimiento en un solo paso de la proteína de los hongos filamentosos, incluidas las etiquetas his y GFP. Sin embargo, como las HDACs de clase 1 son generalmente funcionales como complejos de alto peso molecular, las condiciones de elución nativas son un prerrequisito para el enriquecimiento de las HDACs activas catalíticamente. Es importante destacar que muchas otras purificaciones de afinidad se realizan en condiciones desfavorables. Por ejemplo, el enriquecimiento de las HDACs a través de GFP-Trap, que se basa en la interacción antígeno-anticuerpo, no es adecuado debido a las condiciones de elución ácida que interfieren con la interacción proteína-proteína de los complejos HDAC ligados a las resinas. Por otra parte, los intentos de purificar la RpdA etiquetada por la cromatografía de afinidad de quelato metálico22, resultaron en una pérdida significativa de actividad catalítica durante el procedimiento de purificación, aunque el imidazol en lugar de condiciones de pH bajo se utilizó para la elución ( datos inéditos, Bauer, I, 2010).
Una limitación del Protocolo de ensayo enzimático descrito es el uso del sustrato radioactivo. Sin embargo, los ensayos sobre una base fluorescente se han desarrollado también23,24 y están disponibles comercialmente. Estos ensayos se realizan en placas de pozo y por lo tanto son adecuados también para el cribado de alto rendimiento de los inhibidores de HDAC. En ese caso, sería necesario un exclusivo procedimiento presentado.
Las próximas aplicaciones potenciales de este protocolo incluyen el enriquecimiento de Subcomplejos específicos de HDACs de clase 1 para evaluar sus funciones fisiológicas específicas y/o diferencias en su susceptibilidad a los inhibidores de la HDAC. Al establecer el método descrito para otras enzimas, se recomienda encarecidamente realizar un experimento de control negativo con una cepa sin etiquetar. Esto asegura la especificidad de las actividades enzimáticas medidas y revelaría la contaminación por enzimas no específicamente enlazadas.
El ensayo de purificación y actividad descrito aquí se puede realizar dentro de dos días y las enzimas enriquecidas son estables durante al menos varios meses, cuando se almacenan en alícuas a-80 ° c. En conclusión, este protocolo proporciona una forma relativamente sencilla y rentable de lograr complejos HDAC de clase 1 para la medición de la actividad y la determinación de la eficacia de los inhibidores.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Petra Merschak, División de biología molecular (Biocenter, Universidad médica de Innsbruck), por su ayuda y apoyo con respecto a este manuscrito. Además, nos gustaría agradecer a los revisores por sus valiosos comentarios.
Este trabajo fue financiado por el fondo científico austriaco (P24803 a SG y P21087 a GB) y por financiamiento intramuros (MUI Start, ST201405031 a IB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x SDS-PAGE running buffer | Novex | ||
| 2-mercaptoethanol (EtSH) | Roth | 4227 | |
| 25 cm2 cell culture flasks with vent cap | Sarstedt | 833910002 | For spore production |
| 47 mm vacuum filtration unit | Roth | EYA7.1 | |
| AccuFLEX LSC-8000 | HITACHI | – | Scintillation counter |
| Acetic acid | Roth | 7332 | |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody | Millipore | 07-482 | Used at 1:1333 dilution |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody | Sigma-Aldrich | A3687 | |
| Ball mill | Retsch | 207450001 | Mixer Mill MM 400 |
| BCIP/NBT | Promega | S3771 | Color development substrate for AP |
| Cell strainer | Greiner | 542040 | |
| Cheese cloth for harvesting mycelia | BioRen | H0028 | Topfentuch |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Roth | 4720 | |
| EDTA | Prolabo | 20309.296 | |
| Ethyl acetate | Scharlau | Ac0155 | |
| Freeze Dryer | LABCONCO | 7400030 | FreeZone Triad |
| Glycerol | Roth | 3783 | |
| HCl | Roth | 4625 | |
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | IgG Sepharose 6 Fast Flow |
| Inoculation loops | VWR | 612-2498 | |
| KOH | Merck | 5033 | |
| Laminar flow cabinet | Thermo Scientific | – | Hera Safe KS |
| Mixed Cellulose Esters Membrane Filters | Millipore | GSWP04700 | |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NaOH | Roth | 6771 | |
| Neubauer counting chamber improved | Roth | T728 | |
| Novex gel system | Thermo Scientific | For SDS-PAGE | |
| Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) | Thermo Scientific | LC2675 | Running buffer for SDS-PAGE |
| peqGold protein-marker II | VWR | 27-2010P | Protein ladder used for silver stain |
| Peristaltic Pump P-1 | GE Healthcare | 18111091 | |
| Pipette controller | Brand | 26302 | accu-jet pro |
| Poly-Prep chromatography columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProSieve QuadColor protein marker | Biozym | 193837 | Prestained protein ladder used for western blot |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free |
| Rotary mixer | ELMI | – | Intelli-Mixer RM-2 S |
| Rotiszint eco plus | Roth | 0016 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Scintillation vials | Greiner | 619080 | |
| Sorvall Lynx 4000 | Thermo Scientific | ||
| Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| TIB32.1 | A. nidulans rpdA::TAP strain. Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1; argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+ |
||
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 1704271 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | 1704150 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma-Aldrich | T8552 | 5 mM stock in DMSO |
| Tris (free base) | Serva | 37190 | |
| Tris-HCl | Roth | 9090 | |
| Polysorbate 20 | Roth | 9127 | Tween 20 |
| Polysorbate 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | Tween 80 |
| TX-100 | Acros Organics | 215682500 | Triton X-100, Octoxynol-9 detergent |
References
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