Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تقييم التعريب الخاص بنواه عدسه Zebrafish والنزاهة التكوينية

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59528
Automatic Translation
1,2, 1, 2
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

وقد تم تطوير هذه البروتوكولات لتحليل شكل العدسة القشرية ، والسلامة الهيكلية لغرز العدسة الزبرافيه في العدسات الثابتة والحية ، ولقياس وضعيه نواه العدسة الزبرافيه علي طول المحور الامامي الخلفي.

Abstract

و الزرد هو مناسبه فريدة من نوعها للتلاعب الوراثية والتصوير في الجسم الخارجي ، مما يجعلها نموذجا شعبيه متزايدة للدراسات الوراثية العكسية ولتوليد العابرة للتصوير في الجسم الخارجي. هذه القدرات فريدة من نوعها جعل الزرد منصة مثاليه لدراسة تطوير عدسه العين وعلم وظائف العيون. النتائج التي توصلنا اليها مؤخرا ان اكوابورين-0 ، Aqp0a ، مطلوب لاستقرار خياطه العدسة الاماميه ، وكذلك للتحول من نواه العدسة إلى مركز العدسة مع العمر ادي بنا إلى تطوير أدوات مناسبه بشكل خاص لتحليل خصائص العدسات الزرد. هنا نحن الخطوط العريضة طرق مفصله لتشريح العدسة التي يمكن تطبيقها علي كل من العدسات اليرقة والكبار ، لاعدادهم للتحليل النسيجي ، والمناعي والتصوير. ونحن نركز علي تحليل سلامه خياطه العدسة والمورفولوجية الخلية القشرية ومقارنه البيانات المتولدة من العدسات تشريح مع البيانات التي تم الحصول عليها من التصوير في الجسم المجري من الشكل العدسة التي جعلت ممكنا من قبل خط الزرد الوراثية الجديدة مع وراثيا ترميز الفلورسنت علامة. تحليل العدسات التي تم تشريحها عموديا علي محورها البصري يسمح بالتحديد الكمي للوضع النسبي لنواه العدسة علي طول المحور الامامي الخلفي. مطلوب حركه نواه العدسة من الوضع الامامي الاولي إلى المركز لبصريات العدسة العادية في zebrafish الكبار. التالي ، فان القياس الكمي للموقف النووي للعدسة يرتبط ارتباطا مباشرا بخواصه البصرية.

Introduction

و الزرد هو نموذج ممتاز لدراسة تطور العدسة وعلم وظائف العيون بسبب أوجه التشابه التشريحية لعدسات الثدييات, سهوله نسبيه للتلاعب الوراثي والدوائي, سرعه نمو العين الجنينية, حجم صغير والشفافية في المراحل المبكرة السماح للتصوير في الجسم الفيفو . وقد وضعت الأساليب الموصوفة هنا لتحليل الشكل عدسه الزرد في مراحل الجنينية والكبار مع التركيز علي السلامة التكوينية ، والمورفولوجية غشاء القشرية في المختبر والجسم المجري ، وموقع عدسه الموقف النووي علي طول المحور الامامي الخلفي السابق فيفو. هذه الأساليب بمثابه نقطه انطلاق للدراسات الوظيفية لتطوير العدسة وعلم وظائف القلب ، فضلا عن الشاشات الجينية العكسية لأنماط العدسات في zebrafish.

التصوير المورفولوجية عدسه الزرد

اكوابورين 0 (AQP0) هو البروتين الأكثر وفره في غشاء العدسة ، وهو ضروري لكل من تطوير العدسات والوضوح ، وذلك بسبب الوظائف الاساسيه المتعددة في الثدييات. Zebrafish لديها اثنين من Aqp0s (Aqp0a و Aqp0b) وقامنا بتطوير أساليب لتحليل فقدان وظائفهم في كل من العدسات الجنينية والبالغين. وتكشف دراساتنا ان aqp0a-/-المسوختتطور التعتيم القطبية الاماميه بسبب عدم استقرار الخياطة الاماميه ، و aqp0a/b المسوخ مزدوجة تطوير التعتيم النووي1. وقد ثبت AQP0 للعب ادوار في النقل المائي2، التصاق3،4، خلوي رسو5 وتوليد الانحدار مؤشر الانكسار6، ولكن تم اجراء هذه الدراسات إلى حد كبير في المختبر. يوفر الزرد فرصه فريدة لدراسة كيفيه فقدان وظيفة ، أو وظيفة مضطربة من Aqp0a أو Aqp0b سيؤثر علي التشكل ووظيفة في عدسه حيه. لتقييم شكل خليه العدسة والسلامة التكوينية اثناء التطوير ، قمنا بتعديل الأساليب الموجودة في المختبر مناعي7 للاستخدام في العدسات الجنينية والبالغة ، والمحولات المتولدة لمراقبه هذه العملية في الجسم المجري .

تم اجراء تحليل مناعي لهيكل غشاء البلازما والسلامة التكوينية في الاجنه الثابتة بالبالكامل والعدسات البالغة. عدسات zebrafish هي صغيره للغاية (قطر العدسة هو ~ 100 μm في الاجنه وتصل إلى 1 ملم في البالغين) مقارنه مع نظرائهم الثدييات ولها نقطه الغرز8، والتي يتم القبض عليها نادرا في الحلويات. التالي ، فان العدسات كلها ضرورية لتحليل السلامة التكوينية. لتحليل الجسم المجري لتشكيل الخياطة الاماميه ، وتصوير هندسه خلايا العدسات الدقيقة ، قمنا بتوليد المحولات عبر التعبير عن mapple التي وضعت علي وجه التحديد ملصقات لاغشيه العدسات.

مزايا التصوير الحي لغشاء العدسة المتحولة تشمل: 1) تجنب التحف التثبيت ، 2) دراسة التغيرات المورفولوجية الديناميكية في الأفلام الفاصلة الزمنيه ، و 3) تمكين الدراسات الطولية التي يمكن ان تكون مرتبطة الاحداث السابقة مع في وقت لاحق ظواهر. وعاده ما يمنع تصبغ القزحية التصوير الواضح لمحيط العدسة. أضافه 1-فينيل 2-ثيوريا (PTU) قبل المرحلة بريبريديا-5 (بريم-5)9 يمنع الخلايا الصباغية وتصبغ العين تصل إلى حوالي 4 أيام بعد الإخصاب (dpf). ومع ذلك ، بعد 4 dpf ، يتم حجب محيط العدسة في الجسم المجري، وخاصه في المراحل القديمة. وعلاوة علي ذلك ، فان كثافة العدسة نفسها تحجب التصوير من القطب الخلفي لها. ولذلك ، لدراسة المورفولوجية من محيط العدسة ، أو خياطه الخلفي ، بعد 4 dpf ، العدسات تحتاج إلى ان تكون مثيره وثابته.

وقد استخدمت خطوط الزرد المحورة وراثيا لتحليل بنيه غشاء العدسة الجنينية في الجسم المجري10. الQ01 المحورة وراثيا يعبر عن البروتين الفلوري السماوي تنصهر فيه تسلسل استهداف الغشاء ، Gap43 ، مدفوعا بمروج EF1α و HEXAMER من عنصر DF4 pax6 محسن بشكل مطلق في خلايا ألياف العدسة11. Q01 لديها التعبير خارج عدسي ، بما في ذلك الخلايا الاماكيني في شبكيه العين ، والذي يضيف اشاره الخلفية إذا كان الاهتمام الرئيسي هو العدسة. وضعنا خطا جديدا المحورة وراثيا الذي يعبر عن mApple غشاء المربوطة علي وجه التحديد في العدسة ، وذلك بهدف تجنب اي اشاره خارج عدسي.

توطين نواه العدسة

اكتشفنا ان نواه العدسة تتحرك من الموقع الامامي الاولي في اليرقات الزرد إلى موقع مركزي في المحور الامامي الخلفي في العدسات البالغين. ويعتقد ان هذا التحول في موقف نواه عدسه الانكسار عاليه لتكون شرطا للتطوير الطبيعي للبصريات عدسه الزرد1. تسمح أساليبنا بالقياس الكمي للمركزية النووية للعدسة فيما يتعلق بنصف قطر العدسة. باستخدام هذه الطريقة ، أظهرنا ان Aqp0a مطلوب للمركزية النووية للعدسة1، ويمكن تطبيق هذه الطريقة البسيطة علي دراسات أخرى لتطوير وفسيولوجيا العدسة وخصائصها البصرية في نموذج الزرد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

البروتوكولات الحيوانية المستخدمة في هذه الدراسة تلتزم البيان ARVO لاستخدام الحيوانية في بحوث العيون والبصر وتمت الموافقة عليها من قبل المؤسسة المؤسسية للعناية بالماشية والاستخدام (IACUC) من جامعه كاليفورنيا ، ايرفين.

1. التربية الوحشية والقتل الرحيم

  1. رفع والحفاظ علي الزرد (AB سلاله) في اطار الظروف المختبرية القياسية12. رفع الاجنه في وسط الجنين (EM)12. أضافه 0.003 ٪ PTU إلى EM من 20-24 h بعد الإخصاب (قبل المرحلة بريم 5) لمنع تشكيل الصباغ في الاجنه12 المستخدمة للتصوير في المراحل الجنينية9. رفع اليرقات من 6-30 يوما بعد الإخصاب (dpf) علي نظام غذائي من الروتيفرز الحية حتى 14 dpf ، ويعيش artemia بعد 14 dpf12.
    تحذير: PTU هو سام جدا
  2. تخدير الأسماك باستخدام tricaine حتى غير مستجيبة للمس.
    1. اعداد الأسهم tricaine من خلال الجمع بين 400 ملغ من 3-امينو البنزويك اكيدثيستر ، مع 2.1 مل من تريس 1 م (pH 9) ، في 100 mL من ddH2س. ضبط إلى الأس الهيدروجيني 7.0 وتخزين في-20 درجه مئوية.
      تحذير: Tricaine سامه.
    2. تمييع 4.2 مل من الأسهم tricaine في 100 mL من خزان المياه لتخدير اليرقات/البالغين أو في EM لتخدير الاجنه (التركيز النهائي من tricaine في 0.0165 ٪ ث/الخامس).

2. تثبيت الاجنه واليرقات

ملاحظه: مناعيت بروتوكولات كان من سابقا ينشر مواد7.

  1. إصلاح الاجنه المكررة أو اليرقات حتى 2 أسابيع بعد الإخصاب في 4 ٪ (v/v) بارافورمالدهيد (PFA) في الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية علي الروك.
    تحذير: PFA قابله للاحتراق ومسرطنه.
  2. يغسل الاجنه ثلاث مرات لمده 10 دقيقه في الاذاعه التلفزيونية ، ويتخلل في الاذاعه التلفزيونية مع 10 ٪ تريتون و 1 ٪ DMSO (تلفزيوني-T) بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
    تحذير: DMSO سامه ، ضاره بابتلاع أو امتصاص الجلد ، يحمل المواد الخطرة من خلال الجلد ، وقابله للاحتراق. تريتون هو سامه ، وتاكل وخطره علي البيئات المائية.

3. تشريح العدسات الكبيرة والكبار Zebrafish

  1. تخدير الأسماك من 6 يرقات dpf إلى مرحله البلوغ مع tricaine حتى غير مستجيبة للمس ولكن لا تزال تظهر نبضات قويه. قياس طول السمك القياسية وفقا شيلينغ (2002) لتجهيز13.
  2. علي الفور المكوس باستخدام مقص الصغرى تشريح ومكان في طبق تشريح في تلفزيوني (الشكل 2 أظهرت للعيون الكبار).
    1. جعل طبق 35 mm مخصصه مليئه سيليكون لفصل العدسة. مره واحده وقد وضعت سيليكون ، والمكوس ديفوت حول 2-3 مم في القطر و 0.5 مم عميق لتعبئة عيون الكبار/العدسات اثناء تشريح.
  3. تشريح العدسات البالغة الزرد
    1. وضع العين البالغين في صحن ديفوت الجانب الخلفي حتى مليئه بالتلفزيونية. تحريك العين عن طريق إدخال ملقط في < زاوية 45 ° من خلال القرص البصري. يجب الحرص علي عدم نك أو ضغط العدسة. اجراء اثنين أو ثلاثه شقوق شعاعي من خلال شبكيه العين والصلبة من القرص البصري إلى منطقه الهدبيه مع مقص تشريح.
    2. قشر الظهر الشبكية والصلبة مثل بتلات الزهور وعكس العين ، والجانب القرنية حتى. التعبئة العدسة بشكل غير مباشر عن طريق التلاعب في الصلبة والقرنية مع الجانب المسطح من المقص ، في حين سحب بعيدا الشبكية والانسجه المرفقة مع ملقط. تقليم الانسجه الزائدة بعناية من العدسة.
      ملاحظه: من الضروري تشريح بعناية للحصول علي عدسات صحية باستمرار.
  4. تشريح عدسات اليرقات الزبرافيش
    1. وضع الجانب الخلفي العين يرقات حتى علي الجزء المسطح من صحن السيليكون مليئه بالتلفزيون واستخدام ابره التنغستن شحذ لجعل التخفيضات شعاعي من خلال شبكيه العين والصلبة في حين التعبئة للعين مع ابره التنغستن أخرى أو ملقط.
      ملاحظه: احرص علي عدم اتلاف العدسة.
      1. شحذ غيض من طول 2 سم من 0.1 مم التنغستن الأسلاك اليكتروليتيا عن طريق تعليق غيض الأسلاك إلى 10 ٪ (ث/ف) NaOH وتطبيق الجهد المنخفض بالتناوب الحالي14. تامين الابره في ماصه باستور عن طريق ذوبان نهاية الزجاج باستخدام موقد Bunsen.
        ملاحظه: ويمكن أيضا استخدام أدوات التشريح الدقيقة البديلة.
        تحذير: NaOH هو تاكل.
    2. اسكب العدسة برفق من العين المنفصلة بجانب حاد من الابره ، واسحب الانسجه المرفقة بعيدا بعناية.

4. تثبيت عدسات التشريح

  1. علي الفور إصلاح العدسات تشريح في 1.5 ٪ (v/v) PFA في الخدمات التلفزيونية لمده 24 ساعة في درجه حرارة الغرفة (RT). غسل العدسات ثلاث مرات في الاذاعه التلفزيونية لمده 10 دقيقه لكل منهما.
  2. العدسات التي تتخلل التحليل الكامل لجبل أو كريوبروتيكت للحصول علي التجميد (انظر القسم 8).
    1. العدسات التي تتخلل الليل في الساعة 4 درجه مئوية.

5. عدسه مناعي

  1. اغشيه التسمية من الاجنه الثابتة/اليرقات أو البالغين العدسات عن طريق الحضانة في Phسبائك-اليكسا فلور 546 (1:200) ونواه الخلية مع dapi (1:1000 من 5 ملغ/مل الأسهم) في الليلة الواحدة في الاذاعه التلفزيونية-T في 4 ° c.
    تحذير: DAPI هو مهيج الجلد والعين.
  2. يغسل ثلاث مرات مع تلفزيوني-T لمده 10 دقيقه لكل منهما. مسح الانسجه عن طريق الحضانة في 30 ٪ ، 50 ٪ و 70 ٪ الجلسرين في تلفزيوني-T (v/v) لمده 1 ساعة علي الأقل في RT لكل منهما ، أو بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
  3. جبل الأسماك في 70 ٪ الجلسرين في تلفزيون-T (v/v) علي الزجاج السفلي 35 مم الاطباق microwell مع عيون مسطحه ومباشره ضد زلة الغطاء ممكن. بالنسبة للأسماك الأصغر سنا ، قد يساعد الميل الامامي الجانبي الخفيف علي توجيه خيط العدسة ليكون موازيا للكوفرشفه.

6. تحليل الغرز العدسة الاماميه Zebrafish باستخدام خط المحورة وراثيا في فيفو

  1. توليد Tg (الخط الأول: mAppleCAAX) خطوط باستخدام Tol2 kit15. Tol2 العنصر تسري النظام15 تمكن التكامل مستقره من البناء حيث هو مدفوعة mapple بواسطة 300 bp من الإنسان البشرية-بلورات المروج16 المربوطة إلى الغشاء من قبل تسلسل caax مما ادي إلى التعبير علي وجه التحديد في اغشيه الخلايا ألياف العدسة.
    ملاحظه: هذا البناء (ID: 122451) متاح للشراء.
    1. في صباح الحقن ، واعداد خليط الحقن والحفاظ علي الجليد. للوصول إلى الحجم النهائي من 10 μl التي تحتوي علي rnase-وخاليه من dnase H2س ، أضافه:1.5 μl من هو البكاء: mapplecaax الحمض النووي بناء في 50 ng/μl-[0.375-0.75 pg/الحقن النهائي] ، 1.5 μl من Tol2 للترانسبوزاز mrna في 300 ng/μl (Tol2 kit)15 [15-30 pg/ الحقن النهائي] ، و 1 μL من مؤشر الفينول الأحمر في 1 ٪ ث/ف [1 x10-5٪ (ث/ف)/الحقن النهائي].
    2. حقن 50-100 pL من خليط الحقن في 1 خليه الاجنه المرحلة12.
  2. قياس الكفاءة عبر التكوين في F0 حقن الاجنه عن طريق قياس تواتر الاجنه مع العدسات الايجابيه mApple في 3 dpf.
    ملاحظه: نتوقع ان يكون > 80% الكفاءة عبر التكوين باستخدام هذا الأسلوب. F0 الفسيفساء تسمح بتحليل مفصل من مورفولوجيس غشاء الخلايا الفردية. مستويات مختلفه من الفسيفساء يسمح للمرء ان الصورة المتحولة من مجموعات واحده أو صغيره من الخلايا ، في حين ان التعبير عن عدسه أكثر العالمية يسمح تحليل الهياكل متعدد الخلايا مثل الغرز عدسه في الجسم المجري.
  3. Outcross F0 الأسماك الفسيفساء لتوليد خطوط مستقره ، والتي تسميه جميع اغشيه الخلايا ألياف. F0 مؤسسي مع الجينات المدمجة في جرثومي سوف تولد ذريه مع التكامل مستقره التي يمكن الحفاظ عليها كخطوط المحورة وراثيا.

7. تحليل الغرز العدسة الاماميه Zebrafish باستخدام خط المحورة وراثيا في فيفو

  1. تخدير 3 dpf أو الكبار الفسيفساء أو الأسماك المعدلة وراثيا مستقره وجبل في 1 ٪ ذوبان منخفضه اجنشا (LMA) مع tricaine مع العين شقه ضد زلة غطاء من الزجاج الاطباق microwell القاع.
    1. تذوب 1 غرام من LMA في 100 مل من EM (بدون الميثيلين الأزرق) لجعل 1 ٪ LMA. تخزين علي المدى الطويل كما 15 مل الأسهم في 4 ° c. الميكروويف لأذابه الأوراق المالية وتخزينها عند 42 درجه مئوية حتى يتم استخدام كل أنبوب.
  2. تغطيه الأسماك تصل إلى 6 dpf مع EM مع tricaine ، أو مع خزان المياه مع tricaine للبالغين عندما يتم تعيين LMA.
    1. مزيج 5 مل من EM دون الميثيلين الأزرق أو خزان المياه مع 250 μL من الأسهم tricaine و 7 μL من PTU إذا التصوير PTU الأسماك المعالجة.

8. العدسات والمناعي

  1. كريوبروتيكت الاجنه الثابتة أو العدسات الكبار عن طريق وضع إلى 10 ٪ السكروز في التليفزيون (w/v) ، السكروز 20 ٪ ل 1 ح في RT كل (أو بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية) وبين عشيه وضحيها في 30 ٪ السكروز في 4 درجه مئوية.
  2. تضمين الانسجه في أكتوبر في قوالب قاعده ، ومن ثم تجميد علي البقع مع OCT. الحصول علي 12-14 μm وجمع علي الشرائح المجهر Superfrost/زائد. المقاطع الدافئة علي الشريحة لمده 10 دقيقه علي الشريحة دفئا يسخن إلى ~ 35 درجه مئوية.
  3. غسل المقاطع ثلاث مرات مع تلفزيوني لمده 10 دقيقه لكل منهما. أقسام التسمية مع الفوليدين-اليكسا الطحين 546 (1:200) مع DAPI (1:1000) أو WGA-اليكسا الطحين 594 (1:200) ، تليها ثلاثه يغسل التلفزيونية. جبل مع المضادة--تتلاشي تصاعد المتوسطة ، وختم كوفيرسليب مع طلاء الأظافر.

9-التصوير

  1. الحصول علي الصور مع المجهر البؤري. الحصول علي أكوام z أو شرائح بصريه باستخدام 60x N/A 1.2 المياه الغمر الهدف ، أو ما شابه ذلك ، في مناطق معينه من العمود الامامي للعدسة الخلفية. استخدام إعدادات الاكتساب التالية: 1.2 القرص مهواه باستخدام الليزر 561 nm ، تكساس الحمراء فلتر ل phمسبوكه-اليكسا الطحين 546 أو mApple ، أو الليزر 405 مع فلتر الاشعه فوق البنفسجية ل DAPI.
  2. تصحيح قوه الليزر z-الكثافة لمواجهه فقدان الاشاره مع عمق في العدسة. وهذا يسمح لاشاره قويه في القطب الخلفي من الاجنه الثابتة والحية 3 dpf ، واشاره قويه في الشرائح البصرية الاستوائية في عدسات الأسماك الكبار.
  3. تجميع الصور وعرضها باستخدام برامج معالجه الصور.

10. قياس توطين نواه العدسة في المحور الامامي الخلفي

  1. توجيه العدسات المثيرة الطازجة في الاذاعه التلفزيونية في صحن 35 مم مع أسفل الغطاء الزجاجي ، مع أقطاب والغرز المنحى موازيه لمستوي التركيز. ابحث عن فرق في مؤشر الانكسار ، والذي يحدث عاده في واجهه قشره العدسة ونواه العدسة للتعرف علي نواه العدسة.
    ملاحظه: العدسات البرية الصحية البالغة النوعية شفافة للغاية مما يجعل من الصعب رؤية غرز العدسات والنواة ، أو لتحديد اتجاه العدسة. في هذه الحالة ، فان الشق البسيط مع الملقط إلى كبسوله العدسة يسبب ضررا طفيفا ، مما يجعل الغرز ونواه العدسة واضحة في حوالي 10 دقائق مما يساعد علي توجيه العدسة لهذا القياس. ومع ذلك ، تصبح العدسات غير قابله للاستخدام للتطبيقات المصب كما انها معطوبة الآن.
  2. التقاط صور من العدسات مع نواه العدسة في التركيز تحت أضاءه الحقل الساطع مع أو بدون البصريات DIC باستخدام مجهر تشريح مع كاميرا المرفقة. صوره ميكرومتر تحت نفس التكبير للمعايرة.
    1. انقر علي زر العرض المباشر ، واضبط إعدادات التعريض لتصور نواه العدسة ومحيط العدسة ، والتقط صوره بالنقر علي زر التقاط المفاجئ. حفظ كملف tif.
    2. استخدام برامج معالجه الصور لمعايره صور العدسات المكتسبة. حدد أداه الخط المستقيم وارسم خطا من الطول المعروف علي صوره الميكرومتر ، انقر فوق تحليل | تعيين المقياس. ادخل المسافة المعروفة والوحدات وحدد المعايرة "العمومية" ، وانقر موافق.
  3. قياس المسافة من مركز نواه العدسة إلى القطب الامامي (a-r).
    1. استخدم أداه الخط المستقيم في برنامج معالجه الصور لرسم خط عبر مركز نواه العدسة في الاتجاه المحوري. خذ مركز هذا الخط كمركز لنواه العدسة.
    2. رسم خط آخر من هذه النقطة إلى القطب الامامي من العدسة وحدد "قياس" في القائمة ' تحليل ' لقياس المسافة (ا-r) ، حيث هو نصف قطر العدسة و r هو المسافة من مركز العدسة إلى مركز نواه.
    3. رسم خط آخر من الامامي إلى القطبين الخلفي وقياس هذه المسافة كما قطر العدسة (2a). انسخ هذه الأطوال من نافذه "النتائج" وانقلها إلى جدول بيانات أو برنامج إحصائيات.
      ملاحظه: فمن الأسهل لقياس بدقه من وسط النواة إلى القطب الامامي ، من قياس من مركز نواه العدسة إلى مركز العدسة. يتم تحويل هذا القياس بواسطة الصيغة في الخطوة 10.3.5 للإبلاغ عن المسافة من مركز نواه العدسة إلى مركز العدسة. دائما استخدام نواه الكبار للقياسات ، حتى لو كانت النواة الجنينية واضحة.
    4. تقسيم القطر بمقدار 2 ، لحساب نصف قطر العدسة ، ا.
    5. احسب r/a، Equation 1 وهو التوطين الطبيعي لنواه العدسة فيما يتعلق بنصف قطر العدسة.
      ملاحظه: بالنسبة لنواه وضعت أقرب إلى القطب الامامي ، r/a سيكون > 0.0 ، في حين سيكون نواه مترجمه مركزيا r/a من 0.0.
  4. رسم بياني لقياس النواة المحورية التي تم تطبيعها كداله للطول القياسي لتحديد التغييرات في توطين نواه العدسة اثناء التطوير الإشعاعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الكبار التشريح العين الزرد يشبه عن كثب ان من الثدييات (الشكل 1a). علي الرغم من بعض الاختلافات بين العيون الزبرده والثدييات ، مثل وجود منطقه الهالهاري بدلا من الجسم الهالهاري17، والاختلافات في الخصائص البصرية18، والاختلافات في التكوين الجنيني خلال النمو في الجنين19، و العين الزرد هو نموذج ممتاز لدراسة تطور العين وفهم امراض العيون20،21،22. خطوط ظهاره بسيطه القطب الامامي من العدسة ، والتي في خط الاستواء يخضع لعمليه مدي الحياة من الانتشار ، والاستطالة ، والتمايز في خلايا ألياف ، والتي تشكل الجزء الأكبر من العدسة. خلايا ألياف ناضجه (الشكل 1b، الضوء الأزرق) التفريق أولا في الجنين ، تخلو من العضيات ويتم استبدال أبدا. التفريق بين نصائح خليه ألياف يجتمع في القطبين لتشكيل الغرز الاماميه والخلفية. ثم يتم استيعاب هذه الخلايا من قبل خلايا ألياف المتمايزة حديثا. مثل جميع العدسات فقاري ، التالي فان عدسه الزرد لديها التدرج من التنمية مع أقدم الخلايا الموجودة في وسط نواه العدسة. العدسات اللاصقة الاشكال في 16 ح بعد الإخصاب (hpf) ، والتي يستطيل لتشكيل ألياف العدسة الاساسيه في 18 hpf ، وألياف الثانوية تشكل المنطقة الانتقالية في 28-36 hpf. الخياطة الخلفية مرئية في 48 hpf ، والذي هو قبل الخياطة الاماميه يصبح مرئيا10.

ان التطوير والصيانة الدقيقين لهندسه العدسات العادية أمر ضروري لبصرياتها. هنا نقوم بوصف طرق تحليل الشكل الخلوي للعدسة الزبرافيش في المختبر وفي فيفو، بما في ذلك كل من المزايا والقيود ، والتي وضعناها لتحليل الأنماط الظاهرية الناتجة عن فقدان الدالة المسوخ من اثنين من Aqp0s الزرد ، Aqp0a و Aqp0b1. لتقييم التشكل عدسه الكبار في المختبر، تم تشريح العدسات (الشكل 2) وثابته علي الفور. واجري التقييم الجنيني في أجنه ثابته كامله (الشكل 3) ومقارنه بالاجنه الحية المحورة وراثيا (الشكل 4). وقورنت العدسات البالغة التشريح والثابتة (الشكل 5) بالعدسات البالغة المعدلة وراثيا التي تعيش في العمر (الشكل 6). يتم تلخيص الاختلافات في الكشف والتصور لأجزاء معينه من العدسة باستخدام هذه الطرق (الجدول 1).

تم العثور علي phسبائك لتكون متفوقة لتسميه اغشيه الخلايا ألياف عدسه في الزرد بالمقارنة مع راصات القمح الجرثومية (wga). Wga هو يكتين الذي يربط إلى N-اسيتيل-د-الجلوكوزامين وحمض السياليك ، و wga مترافق إلى فلوبيدورس يستخدم عاده لتسميه عدسه ألياف الاغشيه الخلية في الإنسان23، البقري24، غنميه25، الماوس26،27 الفئران و [زبرفيش]28,29. هنا نستخدم phسبائك علي العدسات الكاملة الزرد (الشكل 3، الشكل 5).

الجنينية واليرقات الزرد التي تصل إلى 7 dpf صغيره ومنفذه بما فيه الكفاية للسماح لاختراق phسبائك في القشرة الخارجية للعدسة. بواسطة 3 dpf نواه العدسة هو المدمجة وخاليه من organelles ، شكل الغرز الاماميه في القطب الامامي (الشكل 3A،B) ، ويتم استبعاد phمسبوكه من نواه العدسة في الطائرة البصرية الاستوائية (الشكل 3a،D). من المرجح ان يتم استبعاد الفيفيبين من النواة بسبب الضغط العالي لاغشيه الخلايا الليفية ، بما يتفق مع الدراسات السابقة28. ومع ذلك ، يتم تصور القشرة الخارجية بقدر كبير من التفصيل مع هذا تلطيخ (الشكل 3C-F). في المقطع العرضي ، تاخذ خلايا ألياف شكلا سداسيا مسطحا ، مع جوانب واسعه أطول ، وجوانب ضيقه أقصر. Phسبائك بقوة تسمي كل من اغشيه الخلايا ألياف الضيقة والواسعة (الشكل 3E-F) تسليط الضوء علي الضغط من خلايا ألياف القشرية بين الجانبين واسعه. هذه المنظمة لا تتاثر إلى حد كبير في aqp0a/b المسوخ مزدوجة (الشكل 3b، D ، F و H).

التعبير عن الفسيفساء من الجينات (mApple المربوطة إلى غشاء الخلية بواسطة عزر CAAX مدفوعا بالمنطقة المروج 300 bp من الإنسان البلورية في المروج) يعبر بقوة في العدسات ابتداء من 2 dpf. يتم دمج الجينات المتحولة بشكل عشوائي في الجينوم مما يؤدي إلى التعبير الغير متجانس عن mApple. نعرض أمثله لعدسه dpf 3 مع تعبير قوي في القشرة (الشكل4) والتعبير في أجزاء من النواة (الشكل 4d). علامة الغشاء ليست محدوده من قبل نفاذيه مثل phمسبوكه ، التالي فانه التسميات نواه العدسة. الفسيفساء (الشكل 4) المتولدة عن حقن الحمض النووي التي يتم التعبير عنها فقط في مجموعه فرعيه صغيره من الخلايا مفيده لتحليل مورفولوجيس الخلية الفردية بالمقارنة مع خطوط مستقره ، والتي تسميه كل خليه التي تعبر عن البلورات البلورية (الشكل 6). في Tg (الرسم البياني : mAppleCAAX) الفسيفساء ويمكن تصور تشكل الخياطة الاماميه في z-الإسقاطات المتخذة في القطب الامامي (الشكل4a،B). لاحظ ان تشكل اغشيه الخلايا يختلف عن العدسات الثابتة الموسومة ب phمسبوك idin (الشكل 3a،B) ، ووجود النطاقات الفرعية في اغشيه الخلايا العريضة (الأسهم البيضاءالشكل 4a) التي تم تحديدها سابقا في العدسات من الأخرى الأنواع30 مرئية. ومع ذلك ، أضعف وضع العلامات من اغشيه الخلايا ألياف الضيقة يؤدي إلى عدم القدرة علي رؤية تقارب ضرب من الخلايا في الخياطة الاماميه (الشكل 4a،b السهم) ينظر في العدسات الثابتة المسمية phخلائط Idin (الشكل 3a،b سهام).

ومن المثير للاهتمام ، والشرائح البصرية التي اتخذت في خط الاستواء عدسه تكشف أيضا عن نمط الوسم مختلفه ، مع اضطرابات واضحة لحجم الخلية في aqp0a/b المسوخ مزدوجة مقارنه مع WT (الشكل 4c-F). وهذا هو المرجح لان تسميات المحورة وراثيا ألياف الخلوية الاغشيه العريضة أكثر فعاليه من phسبائك. تمكنا من الحصول علي z-الإسقاطات من خلال القطب الخلفي لتحليل سلامه الخياطة الخلفية مع استخدام Z-تصحيح ، والتي زادت قوه الليزر مع عمق في الانسجه. وكان التحليل الواضح للخياطة الخلفية (الشكل 4G،H) في الأسماك السليمة محدوده لأول 5 dpf ، وبعد ان العدسة كانت كثيفه جدا ، مما ادي إلى فقدان الاشاره في الجزء الخلفي من العدسة.

الثابتة تشريح العدسات البالغين المسمية مع phسبائك كشفت تفاصيل ملفتة للنظر في العمارة أمرت للغاية من الصفوف الخلية ألياف تتلاقي لتشكيل الغرز الاماميه (الشكل 5A، السهم) والمورفولوجية من القشرة (الشكل5a-H) ، بسبب وضع العلامات قويه جدا من اغشيه الخلايا ألياف الضيقة التي phخلائط idin. الحد الأقصى Z-الإسقاطات من القطب الامامي كشفت عن فقدان خياطه الامامي ضيق في aqp0a/b العدسات متحولة مزدوجة (الشكل 5b، السهم) ، بالمقارنة مع WT (الشكل5b، السهم) ، والتي واضحة ككتله من الاغشيه ونوى الخلية في البصرية شرائح 30 ميكرومتر من القطب الامامي (الشكل 5D). في الشرائح البصرية أعمق ، تم استبعاد الوسم phمسبوكه من القشرة عدسه أعمق ونواه (الشكل 5E،F). التنظيم العام لصفوف خلايا ألياف في القشرة الخارجية تاثرت إلى حد ما بسبب عدم وجود خياطه الامامي ضيق في aqp0a/b العدسات المزدوجة متحولة ، مما يجعل من المستحيل لوضع العدسات عمودي بالبالضبط علي الطائرة التصوير (الشكل 5f ) بالمقارنة مع عدسات WT (الشكل 5 ه). ومع ذلك ، كشفت الصور عاليه الطاقة من الخلايا ألياف الصفوف التي اتخذت في الطائرة الاستوائية ان الخلايا في القشرة الخارجية لا تزال تشكل الصفوف منظم ، مرئية بسبب قويه ألياف الضيقة وسم الخلية (الشكل 5G،H). كان من المستحيل ان نميز ألياف الفردية خليه الاغشيه واسعه بسبب مزيج من الضغط الضيق ، واشاره ضعيفه. منذ تشريح هذه العدسات ، يمكن تركيبها مع الجانب الخلفي الذي يواجه الهدف ، مما يسمح z-الإسقاطات من الغرز الخلفية ، والتي أظهرت اي اختلافات بين الأنماط الجينية كما نصائح خليه ألياف الخلفية شكلت الغرز الضيقة (الشكل 5I،J السهام).

Z-الإسقاطات من العدسات الحية تخدير الكبار Tg مستقره (الصرخة: mAppleCAAX) الأسماك تكشف المورفولوجية غشاء القشرية في القشرة الاماميه (الشكل 6a،a ') ، فضلا عن مدي تقارب الخلية في القطب الامامي ( الشكل 6 باء). كان أكثر صعوبة لتركيب الأسماك مع الغرز عدسه عمودي علي الطائرة التصوير ، بالمقارنة مع العدسات تشريح الثابتة. خطوط مستقره تحمل التعبير عبر الجينات mApple في نواه العدسة (الشكل 6C،D). وكشفت الشرائح البصرية عند خط الاستواء اشاره قويه تشير إلى الضغط المكثف للنواة عند التصوير بنفس قوه الليزر مثل القشرة الاماميه (الشكل 6C). ومن المثير للاهتمام ، لم يكن القرار الخلوية من القشرة الخارجية واضحة في البالغين ، علي عكس في الاجنه. وهذا من المرجح بسبب قزحية حجب اشاره واضحة من محيط العدسة. قد يكون من الممكن الحصول علي اشاره عدسه اقوي القشرية عن طريق تمدد التلميذ قبل التصوير. مع انخفاض طاقة الليزر ، كان من الممكن التمييز بين بعض طبقات الخلايا في نواه العدسة (الشكل 6D). عدسه الزرد الكبار كثيفه جدا ، وكان من المستحيل الحصول علي اشاره من القطب الخلفي في الجسم المجري.

لقد أظهرنا ان نواه عدسه الزرد يتحرك في المحور البصري من الوضع الامامي الاولي في العدسات يرقات إلى وضع مركزي في البالغين1. ويتم تسليط الضوء علي هذه الحركات في أقسام العدسات المحورية ، حيث يتم استبعاد phمسبوكه و WGA من نواه العدسة (الشكل 7ا-ج). لقد أظهرنا ان Aqp0a مطلوب لهذه العملية المركزية1، ولكن هذه اليه من المرجح ان تتاثر بالبروتينات الأخرى. تم قياس توطين مركز نواه العدسة فيما يتعلق بموقعه علي طول المحور الامامي الخلفي بوضع عدسات كامله في الاتجاه المحوري والتصوير تحت أضاءه DIC ، التالي تسليط الضوء علي الاختلافات الطفيفة في خصائص الانكسار (الشكل 7E). الغرز عاده ما يكون لها مؤشر الانكسار مختلفه من القشرة المحيطة بها ، لذلك يمكن استخدامها كدليل للتوجيه. عدسات اليرقات الصغيرة لديها خيوط أكثر وضوحا (الغرز الخلفية في العدسات الصغيرة جدا) ، ونوى العدسة ، التي لها مؤشر انكسار مختلف ، من الواضح انها غير متناظرة ، مما يجعل من السهل توجيه العدسات في هذه المراحل. يتم تطبيع المسافة النسبية لمركز نواه العدسة من مركز العدسة (r) إلى نصف قطر العدسة (ا). هذا بعد ذلك بياني مع علاقة إلى تطوير [زبرفيش], ل اي معياريه طول قياس يكون استعملت13. في WT ، تبدا نواه العدسة بالاقتراب من عمود Equation 2 العدسة الاماميه ، ثم تمركزها Equation 3 في مرحله البلوغ (الشكل7f).

Figure 1
الشكل 1 : Zebrafish الكبار العين والرسم البياني عدسه. يؤخذ الامامي كما هو الحال في الضوء يدخل العين ، والتي في الزرد هو في الواقع الجانبي. (ا) عدسه الزيبرافيش مع ضوء تركيز القرنية علي شبكيه العين. في الكائنات المائية ، تلعب القرنية دورا ثانويا في الانكسار الضوئي ، ولكن بدلا من ذلك ، فان العدسة لديها مؤشر انكسار اعلي18. تفصل العدسة الغرفة الاماميه المليءه بالفكاهة المائية والغرفة الخلفية المليءه بالفكاهة الزجاجية. (ب) عدسه الزيبرافيش أكثر كرويه من العدسات الثديية. ألياف الخلية نصائح التقاء عند نقطه أو الخيوط السرية8 في القطبين الامامي والخلفي. تميز خلايا ألياف في قشره العدسة بالنوى والأرغن ، في حين ان خلايا ألياف الناضجة في نواه العدسة (الأزرق الفاتح) تخلو من الأرغن والنوى. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.    

Figure 2
الشكل 2 : التشريح عدسه Zebrafish. (ا) يتم تشريح العينين من الأسماك التخدير ووضع الجانب الخلفي حتى (ب). (ج) يتم تعبئة العينين عن طريق الملقط عن طريق القرص البصري (od) ويتم اجراء اثنين إلى ثلاثه شقوق شعاعي في شبكيه العين والصلبة من القرص البصري إلى زوصيصات. (د) اضعاف اللوحات للكشف عن العدسة. (ه) تدوير العين لمواجهه القرنية ، وشل العدسة بشكل غير مباشر عن طريق القرنية وسحب بعيدا الصلبة-الشبكية. (و) تقليم الشبكية المتبقية ومنطقه الهالهاري/زوصيصات من العدسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 : الشكل الجنيني للعدسة في المختبر. الاجنه الثابتة والمصابة بالتخلل الموسومة باللون الأحمر ونواه الخلية مع DAPI (الأزرق) تكشف عن الشكل الغشائي وسلامه الغرز في القطبين. Z-الإسقاطات تكشف عن ان WT و aqp0/b العدسات المزدوجة متحولة يحمل ترتيب خليه ألياف العادية جدا التي تجتمع في خياطه الامامي ضيق جدا (السهام) في 3 Dpf (a ، b). الشرائح البصرية التي اتخذت في خط الاستواء تكشف الصفوف الضيقة من خلايا ألياف سداسية معباه في القشرة الخارجية في كل من الأنماط الجينية (C-F). يتم وصف كل من الجانبين الضيق والعريض لاغشيه الخلايا الليفية كما هو موضح في (E). يتم تشكيل الغرز الخلفية (السهام) وضيق في كل من الأنماط الجينية (G, H). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 : الشكل الجنيني للعدسة في الجسم المجري. التصوير الحي لتخدير 3 dpf فسيفساء F0 حقن Tg (الشكل الأول: mAppleCAAX) العدسات تكشف عن الغرز الاماميه (السهام) في z-الإسقاطات (ا ، ب). (ا ') النطاقات الفرعية غشاء واضحة كما ثقوب (السهام البيضاء) في اغشيه الخلايا ألياف واسعه. اغشيه الخلايا ألياف الضيقة هي أيضا واضحة (السهام السوداء). عدسات WT تكشف باحكام معباه الخلايا ألياف القشرية عدسه (C ، E) ، بالمقارنة مع القشرة المعطلة من aqp0a/b المسوخمزدوجة- مع خلايا منتفخة واضحة (د ، و). التركيز علي الغرز الخلفية (g, h) (الأسهم) لا يكشف عن اي فرق بين الأنماط الجينية (g, h). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 : البالغين الشكل عدسه في المختبر. تم تصنيف العدسات اللاصقة والثابتة والمحفورة من الأسماك التي يزيد طولها عن 23 ملم باللون الأحمر و DAPI (الأزرق). 150 μm Z-الإسقاط في القطب الامامي تكشف الترتيب الصارم لنصائح خليه ألياف تتلاقي في خياطه ضيقه (السهم) في WT (a) ، ولكن ليس aqp0a/b المسوخ مزدوجة (السهم) ، والتي لديها بدلا من ذلك كتله من الاغشيه ونوى (b). شريحة البصرية التي اتخذت 42 μm من القطب الامامي تكشف الخلايا المطلوبة تتلاقي في المركز في WT (C) ، ولكن كتله من نوى حيث يجب ان يكون خياطه في العدسات متحولة (D). الشرائح البصرية من خلال خط الاستواء من العدسة ، في 130 μm من القطب الامامي تكشف الصفوف معباه باحكام من خلايا ألياف في WT (E ، G) والمسوخ (F ، H). يتم تشكيل الغرز الخلفية (السهام) وضيق في كل من الأنماط الجينية (I, J). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 الكبار عدسه المورفولوجية في الجسم المجري. التصوير الحي لتخدير الكبار Tg مستقره (البكاء: mAppleCAAX) WT العدسات. Z-الإسقاطات في القشرة الاماميه تكشف عن المورفولوجية القشرية (a ، a ') ، والخياطة الاماميه (السهم) ، مع الخلايا تتلاقي إلى نقطه في شريحة بصريه واحده (B ، السهم ). القشرة يستطيع كنت تصورت في [هيغر] ليزر قوه في شريحة بصريه من خلال الخط استواء ([ك]), يقارن إلى القوية اشاره شكل العدسة نواه ([د]). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: عدسه Zebrafish مركزيه النواة. الاجنه الثابتة والكريوبروتيكتيده (ا) والعدسات (B, C) كانت المبردة بالتجميد والموسومة مع phمسبوكات-546 (الأحمر في a ، b) ، dapi (الأزرق في a ، b) أو wga-594 (الأحمر في C). نواه العدسة خاليه من نوى الخلية ، ويتم وضعها أقرب إلى العدسة الاماميه (ا) في 3 dpf (a) ، وفي 1 شهر العدسات القديمة (B) ، بالمقارنة مع وضعها مركزيا في العدسات الكبار (ج). العدسات التي تم تشريحها من الزرد القديمة 1 شهر من 4.1 مم القياسية الطول كانت موجهه بالتساوي (D) ، أو المحورية (E). تم حساب التوطين النسبي لنواه العدسة في المحور باستخدام الاستراتيجية التالية: (ه) تم قياس مسافة مركز (*) من نواه العدسة (الخط الأبيض المنقط) إلى القطب الامامي ، لان هذا أكثر عمليه من قياس المسافة (ص) إلى مركز العدسة (زائد). وقد تم تطبيع هذا الأمر إلى نصف قطر العدسة (ا) ، والذي تم قياسه بشكل خاص بقطر العدسة المحورية (النمل.-pos.). وكان سجل التوطين نواه محوريه تطبيع بياني كداله للتنمية الزرد ، تقاس بالطول القياسي (F). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

ميزه جنين IHC Tg جنين كامل IHC عدسه الكبار Tg الكبار
العيش ن Y ن Y
الخياطة الاماميه Y نوعا ما Y نوعا ما
الخياطة الخلفية Y Y Y ن
التفاصيل الخلوية القشرية نوعا ما Y Y الامامي إلى حد ما
عدسه التفاصيل النواة ن Y (مستقر) ن Y (مستقر)
التسمية الثانوية Y-الأجسام المضادة يعيش فقط مع Tg فقط Y-الأجسام المضادة يعيش فقط مع Tg فقط
واسعه/التسمية ألياف الضيقة كل واسعه ضيقه في الغالب واسعه

الجدول 1: ملخص مقارنه في المجرية مقابل في المختبر طرق لتحليل الشكل عدسه في zebrafish. Y = نعم ، N = لا

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحليل شكل العدسة الزبرافيش هو الخطوة الاولي في فهم الأنماط الظاهرية في المسوخ ، أو اثار التدخلات الدوائية التي تهدف إلى دراسة علم الاحياء من عدسه العين. ونحن الخطوط العريضة لتحليل الغرز عدسه ، والنسيج الخلية ألياف القشرية وجوانب من نواه العدسة. وهذه النهج هي مزيج من المختبرات والكائنات المجرية (مقارنه بالجدول 1). الأساليب في المختبر تسمح لمزيد من التفاصيل من الشكل الخارجي الخلايا القشرية ، فضلا عن الوصول إلى خياطه الخلفي في العدسات الكبار.

في المجري تحليل ممكن مع استخدام علامات المحورة وراثيا. الجينات التي نقدمها هنا هو غشاء عدسه محدده ، بالمقارنة مع خط Q01 الزرد القائمة ، والتي في حين وضع العلامات علي اغشيه العدسة تسمي أيضا أنواع الخلايا الأخرى في العين ، بما في ذلك الخلايا الاماكيني ، تعقيد التفسير11 . الاشاره في الجسم المجري محدوده بواسطة ظهاره العين المصطبغة ، والتي تشكل خلال اليوم الثاني من الاجنه ، لذلك تحتاج إلى ان تكون ptu معالجه للتحليل في هذه المراحل واللاحقة. في البالغين ، تحجب القزحية تحليلا واضحا لقشره العدسة ، ولكنها تسمح بالتحليل المجري لقشره العدسة الاماميه. التصوير الحي لعدسات السمك يسمح للدراسات الطولية لتشكل العدسة في نفس الحيوانية. وهذا يمكن ان يكون أداه مفيده للغاية لدراسة الآثار علي العمليات الحيوية ، مثل اضطراب حجم الخلية استجابه للاضطرابات اوموتيك أو الدوائية. والنتيجة غير المتوقعة هي اننا يمكن ان نتصور بوضوح المجالات الفرعية غشاء في اغشيه الخلايا ألياف واسعه في transgenics الحية ، ولكن ليس في العدسات الثابتة. وهذا يسلط الضوء علي الفرق في وضع العلامات من قبل الجينات العابرة و phسبائك ، فضلا عن حقيقة ان هذه المجالات الفرعية قد تتاثر بعمليه التثبيت.

تحليل أليات الجزيئية لنواه العدسة المركزية باستخدام الطرق التي تصفها قد تكشف عن أليات الضرورية لتطوير الخصائص البصرية للعدسة. علي الرغم من انه حتى الآن ، لم يتم الإبلاغ عن عدم تناسق العدسة المحورية الا في الzebrafish ، من خلال دراسة هذه العملية ونحن من المرجح ان اكتساب رؤى في أليات اللازمة لتطوير البصريات عدسه في الأنواع الأخرى. في المستقبل ، يمكن استخدام الكائنات المحورة وراثيا في تركيبه مع التطبيقات الأخرى-مثل دراسات التعبير الفوقي ، مع استخدام علامة التحول الأخضر. ويمكن استخدام هذه لدراسة اثار الإفراط في التعبير عن بروتين محدد في العدسة ، أو لإنقاذ الظواهر الظاهرية في المسوخ الموجودة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا إفصاحات

Acknowledgments

نود ان نعترف مصدر التمويل لدينا: المعاهد القومية للصحة R01 EY05661 إلى j. e. H ، Ines gehring للمساعدة في توليد aqp0a/b المسوخ مزدوجة وتربيه الزرد ، الدكتور دانيال dranow للمناقشات المؤدية إلى توليد العابرين ، الدكتور بروس مختبرات بلومبيرج والدكتور كين تشو لاستخدام المجاهر التشريح ، والدكتورة ميغان سميث للمساعدة في التحليل الإحصائي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P7629 CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 157-4 CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Cryostat Leica CM3050S Objective and chamber temperature set to -21 °C
DAPI Invitrogen D1306 CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128 CAUTION – combustible, penetrates skin 
Disposable base mold VWR Scientific 15154-631
Disposable Pasteur glass pipets Fisherbrand 13-678-20A
Dumont #5 forceps Dumont & Fils Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040 CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Glycerol Sigma G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct Addgene ID:122451
ImageJ Wayne Rasband, NIH v1.51n
Low Melt Agarose (LMA) Apex 902-36-6
NIS-Elements Nikon V 4.5
NIS-Elements AR software Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller Olympus Corp DP70
Olympus microscope  Olympus Corp SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546 Thermo Fisher A22283
Phenol Red indicator (1% w/v) Ricca Chemical Company 5725-16
Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399
Photoshop Adobe CS5 v12.0
Photoshop software Adobe CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective Nikon
Power source Wild Heerbrugg MTr 22 Or equivalent power source 
Slide warmer model No. 26020FS Fisher Scientific 12-594
Sodium Hydroxide beads Fisher Scientific S612-3 CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning World Prevision Instruments SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Triton X-100 BioXtra Sigma T9284 CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors Ted Pella Inc 1346 Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium Vector laboratories H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 Life Technologies W11262

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
  2. Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
  3. Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
  4. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
  5. Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
  6. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
  7. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
  8. Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
  9. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  10. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
  11. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
  13. Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
  14. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  15. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  16. Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
  17. Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
  18. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
  19. Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
  20. Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
  21. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
  22. Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
  23. Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
  24. Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
  25. Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
  26. Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
  27. Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
  28. Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
  29. Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
  30. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).

Tags

علم الاحياء إصدار 147 Zebrafish عدسه خياطه العدسة نواه العدسة AQP0 التصوير الحي تطوير العدسة المحورة وراثيا
تقييم التعريب الخاص بنواه عدسه Zebrafish والنزاهة التكوينية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vorontsova, I., Hall, J. E.,… More

Vorontsova, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity. J. Vis. Exp. (147), e59528, doi:10.3791/59528 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter