Summary
Bu protokoller kortikal lens morfolojisi, sabit ve canlı lenslerde zebra balığı lens sütürler yapısal bütünlüğü analiz etmek ve anterior-posterior eksen boyunca zebra balığı lens çekirdeğinin konumunu ölçmek için geliştirilmiştir.
Abstract
Zebra balığı, genetik manipülasyon ve In vivo görüntüleme için benzersiz bir şekilde uygundur ve bu da ters genetik çalışmalar için ve in vivo görüntüleme için transgenics üretimi için giderek daha popüler bir model haline gelmiştir. Bu benzersiz yetenekleri zebra balığı oküler lens geliştirme ve Fizyoloji çalışma için ideal bir platform olun. Son bulgularımız bir Aquaporin-0, Aqp0a, anterior objektif sütür istikrar için gerekli olduğunu, hem de yaş ile objektif merkezi objektif çekirdeğinin kayması için bize özellikle zebra balığı lensler özelliklerini analiz etmek için uygun araçları geliştirmeye yol açtı. Burada hem larva hem de yetişkin lensler için uygulanabilir objektif diseksiyon için ayrıntılı Yöntemler özetlemektedir, histolojik analiz, immünhistokimya ve görüntüleme için hazırlamak. Objektif sütür bütünlüğü ve kortikal hücre morfolojisi analizine odaklanıyoruz ve objektif morfolojisinin In vivo görüntülemesinde elde edilen verilerle disseke lenslerden üretilen verileri, genetik olarak bir yeni transgenik zebra balığı hattı ile mümkün hale kodlanmış floresan Marker. Optik eksenine dik olan disseke lenslerin analizi, objektif çekirdeğinin anterior-posterior eksen boyunca göreli konumunun ölçülmesini sağlar. Bir ilk anterior konumdan merkeze objektif çekirdeğinin hareketi yetişkin zebrafish normal lens optik için gereklidir. Böylece, objektif nükleer pozisyon nicel bir ölçü doğrudan optik özellikleri ile ilişkilidir.
Introduction
Zebra balığı, memeliler lenslere anatomik benzerlik, genetik ve farmakolojik manipülasyon, embriyonik göz gelişimi hızı, küçük boyut ve şeffaflık nedeniyle objektif gelişimi ve fizyolojisinin incelenmesi için mükemmel bir modeldir. In vivo görüntüleme için izin erken aşamalarında. Burada açıklanan yöntemler, sütür bütünlüğü, kortikal membran morfoloji in vitro ve in vivove objektif nükleer pozisyonun konumu ile birlikte embriyonik ve yetişkin aşamalarında zebra balığı lens morfolojisi analiz etmek için geliştirilmiştir. anterior-posterior eksen ex vivo. Bu yöntemler, objektif gelişimi ve fizyolojisinin fonksiyonel çalışmaları için bir başlangıç noktası olarak ve zebrafish objektif fenotürleri için ters genetik ekranlar olarak hizmet vermektedir.
Görüntüleme zebra balığı objektif morfoloji
Aquaporin 0 (AQP0) en bol objektif membran proteindir ve memelilerde birden çok temel fonksiyon nedeniyle, objektif gelişimi ve netlik için kritik öneme sahiptir. Zebrafish iki Aqp0s (Aqp0a ve Aqp0b) ve biz hem embriyonik ve yetişkin lensler fonksiyonlarının kaybını analiz etmek için yöntemler geliştirdik. Çalışmalarımız, aqp0a-/-mutantların anterior sütür istikrarsızlığından dolayı anterior kutup opaklığı geliştirmesini ve aqp0a/b çift mutantların nükleer opaklık geliştirilmesi olduğunu ortaya koyuyor1. AQP0 su taşımacılığı2, yapışma3,4, sitorsel çapa5 ve Refraktif endeks gradyan6nesil roller oynamak için gösterilmiştir, ancak bu çalışmalar büyük ölçüde yapılmıştır vitro. Zebra balığı, fonksiyon kaybına veya Aqp0a veya Aqp0b 'in tedirgin fonksiyonunun yaşam merceğinin morfolojisi ve fonksiyonunu nasıl etkileyeceğini incelemek için benzersiz bir fırsat sağlar. Gelişme sırasında objektif hücre morfolojisi ve sümetik bütünlüğünü değerlendirmek için, embriyonik ve yetişkin lenslerde kullanılmak üzere mevcut in vitro immünohistokimyasal yöntemleri7 ' ye değiştirdik ve bu süreci izlemek için üretilen transgenikler içinde vivo .
Tüm sabit embriyolar ve yetişkin lenslerde plazma membranı yapısı ve sütür bütünlüğü immunhistokimyasal analizi yapıldı. Zebrafish lensleri son derece küçüktür (objektif çapı, embriyolarda ~ 100 μm ve yetişkinlerde 1 mm 'ye kadar), memeli meslektaşları ile karşılaştırıldığında Böylece, tüm lensler dikiş bütünlüğü analiz etmek için gereklidir. Ön sütür oluşumunun In vivo Analizi ve hassas objektif hücre mimarisinin görüntülenmesi Için, Mapple 'ı özellikle objektif membranlarının etiketlemesi konusunda ifade eden transgenikler ürettik.
Objektif membran transgeniklerin canlı görüntülemenin avantajları şunlardır: 1) zaman atlamalı filmlerde dinamik morfolojik değişiklikleri okuyan, 2) sabitleme eserler kaçınarak, ve 3) daha önceki olayların daha sonra korelasyon olabilir uzunlamasına çalışmalar sağlayan fenotipleri. İris pigmentasyon normalde objektif çevre net görüntüleme önler. Primordia-5 (prim-5) aşamasından önce 1-fenil 2-Thiourea (PTU) eklenmesi, melanogenesis ve göz pigmentasyonunu yaklaşık 4 gün postfertilizasyon (DPF) olarak önler. Ancak 4 DPF 'den sonra lens çevresi özellikle eski aşamalarda in vivoolarak gizlenir. Ayrıca, objektifin yoğunluğu kendisi arka kutup görüntüleme gizler. Bu nedenle, lens çevre veya posterior sütür morfoloji çalışma, 4 DPF sonra, lensler eksize ve sabit olması gerekir.
Zojenik zebrafit hatları , vivo 10 ' daembriyonik objektif membran yapısını analiz etmek için kullanılmıştır. Q01 transjenik bir membran hedefleme dizisi için erimiş bir Camgöbeği floresan protein ifade, Gap43, EF1α organizatör ve bir hegzamer tarafından tahrik DF4 PAX6 artırıcı elemanı her yerde objektif fiber hücreler11. Q01 Retina içindeki amacrin hücreleri de dahil olmak üzere ekstra Lenticular ifade var, birincil faiz objektif ise arka plan sinyali ekler. Biz herhangi bir ekstra merceksi sinyal kaçınarak amacı ile özellikle objektif bir membran gergin mApple ifade eden bir roman transjenik çizgi geliştirdik.
Objektif çekirdeği lokalizasyonu
Biz objektif çekirdeğinin larva zebra balığı ilk anterior konumdan yetişkin lensler anterior-posterior ekseninde merkezi bir konuma hareket keşfetti. Yüksek refraktif indeks objektif çekirdeğinin pozisyonunda bu vardiya zebra balığı lens optik1normal gelişimi için bir şart olduğu düşünülmektedir. Yöntemlerimiz lens yarıçapı ile ilgili olarak objektif nükleer merkezileştirmenin ölçülmesine olanak sağlar. Bu yöntemi kullanarak, Aqp0a objektif nükleer merkezileştirme1için gerekli olduğunu gösterdi ve bu basit yöntem objektif geliştirme ve fizyolojisi ve zebra balığı modelinde optik özellikleri diğer çalışmalara uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan hayvan protokolleri, oftalmik ve vizyon araştırmalarında hayvanların kullanımı için ARVO Ifadesine uyarak California Üniversitesi Irvine 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıASUC) tarafından onaylanmıştır.
1. zebrafish yetiştiriciliği ve ötenazi
- Standart Laboratuar koşulları altında zebra balığı (AB strain) yükseltmek ve korumak12. Embriyo Orta (EM)12embriyoları yükseltin. Ekle 0,003% PTU EM için 20-24 h sonrası (prim-5 aşaması önce) embriyolar pigment oluşumu önlemek için12 embryonik aşamalarında görüntüleme için kullanılan9. 6-30 gün sonrası (DPF) 14 DPF kadar canlı rotiferler bir diyet ve 14 DPF12sonra canlı Artemia dan larva yükseltmek.
Dikkat: PTU çok zehirli -
Dokunmaya duyarlı olmayan kadar tricaine kullanarak balık anestezize.
- 3-amino Benzoik acidethylester 400 mg birleştirerek tricaine stok hazırlayın, 2,1 mL 1 M Tris (pH 9), içinde 100 mL ddH2O. pH 7,0 olarak ayarlayın ve-20 °c ' de saklayın.
Dikkat: Tricaine zehirli. - Seyreltmeli 4,2 mL trikül stokta 100 mL tank suyunda larvaları/yetişkinleri veya EM 'de embriyoları anestezize etmek için (% 0,0165 w/v 'de tricain son konsantrasyonu).
- 3-amino Benzoik acidethylester 400 mg birleştirerek tricaine stok hazırlayın, 2,1 mL 1 M Tris (pH 9), içinde 100 mL ddH2O. pH 7,0 olarak ayarlayın ve-20 °c ' de saklayın.
2. embriyo ve larvaları sabitleme
Not: İmmünohistokimyasal protokoller daha önce yayınlanan materyallerden7' ye uyarlanmıştır.
- Dechorionated embriyo veya larvaları 2 hafta sonrası% 4 (v/v) paraformaldehit (PFA) fosfat tamponlu tuzlu (PBS) bir rocker üzerinde 4 °C ' de bir gecede düzeltin.
Dikkat: PFA yanıcı ve kanserojen. - Embriyoları PBS 'de 10 dakika boyunca üç kez yıkayın ve 4 °C ' de gece% 10 Triton ve% 1 DMSO (PBS-T) ile PBS 'de geçirgen.
Dikkat: DMSO toksik, yutulması veya cilt emilimi ile zararlı, cilt yoluyla tehlikeli maddeler taşır, ve yanıcı. Triton zehirli, korozif ve su ortamları için tehlikelidir.
3. larval ve yetişkin zebrafish lensler diseksiyon
- 6 DPF larvaları ile yetişkinliğe kadar tricaine 'e dokunmayan, dokunmak için yanıt vermeyen ama hala güçlü bir kalp atışı gösteren balık anestezize edilir. 13. aşama için balık standart uzunluğunu Schilling (2002) uyarınca ölçün.
-
Hemen mikro Diseksiyon makas ve PBS (Şekil 2 yetişkin gözleri için gösterilen) bir diseksiyon çanak içine yer kullanarak gözleri eksizler.
- Objektif disikleri için silikon ile dolu özel bir 35 mm çanak olun. Silikon ayarlandıktan sonra, diseksiyon sırasında yetişkin gözleri/lensleri immobilize etmek için 2-3 mm çapında ve 0,5 mm derinlikte bir Divot dışarı çıkarın.
-
Yetişkin zebra balığı lensler diseksiyon
- PBS ile dolu çanak Divot posterior yan içine yetişkin bir göz yerleştirin. Optik disk üzerinden < 45 ° açı forseps ekleyerek göz immobilize. Nick veya objektif sıkıştırmak için dikkatli olun. Retina ve sklera aracılığıyla optik diskten Diseksiyon makas ile siliyer bölgeye iki veya üç radyal kesikler olun.
- Çiçek yaprakları gibi Retina ve sklera geri Peel ve göz ters, kornea tarafı yukarı. Retina ve forseps ile bağlı dokulara uzağa çekerek, makas düz tarafı ile sklera ve kornea manipülasyon yoluyla dolaylı objektif immobilize. Dikkatle objektif aşırı doku Trim.
Not: Sürekli sağlıklı lensler elde etmek için dikkatle incelemek için hayati önem taşımaktadır.
-
Larva zebra balığı lenslerin diseksiyonu
- PBS ile dolu silikon çanak düz parçası üzerine bir larva göz arka tarafı yukarı yerleştirin ve başka bir tungsten iğne veya forseps ile göz immobilizing ederken Retina ve sklera üzerinden radyal kesikler yapmak için bir keskinleştirilmiş tungsten iğne kullanın.
Not: Objektif zarar vermemek için dikkatli olun.- % 10 (w/v) NaOH içine tel ucu askıya alarak elektron 0,1 mm Tungsten Tel 2 cm uzunluğunun ucunu keskinleştirmek ve düşük voltaj alternatif akım14uygulama. İğne, bir Bunsen brülörü kullanarak cam ucunu erime ile Pasteur pipet içine sabitleyin.
Not: Alternatif ince diseksiyon araçları da kullanılabilir.
Dikkat: NaOH korozif.
- % 10 (w/v) NaOH içine tel ucu askıya alarak elektron 0,1 mm Tungsten Tel 2 cm uzunluğunun ucunu keskinleştirmek ve düşük voltaj alternatif akım14uygulama. İğne, bir Bunsen brülörü kullanarak cam ucunu erime ile Pasteur pipet içine sabitleyin.
- Hafifçe iğne künt bir tarafı ile kesildiği göz objektif dışarı kepçe ve dikkatle bağlı doku çekin.
- PBS ile dolu silikon çanak düz parçası üzerine bir larva göz arka tarafı yukarı yerleştirin ve başka bir tungsten iğne veya forseps ile göz immobilizing ederken Retina ve sklera üzerinden radyal kesikler yapmak için bir keskinleştirilmiş tungsten iğne kullanın.
4. dissected lensler sabitleme
- Oda sıcaklığında (RT) 24 saat boyunca PBS 'de% 1,5 (v/v) PFA 'da disseke lensler hemen düzeltin. PBS 'de üç kez her biri 10 dakika yıkayın lensler.
- Tüm montaj analizi veya kriyobölümleme için kriyokoruma için lensler geçirgen (bkz. Bölüm 8).
- 4 °C ' de bir gecede PBS-T lensler geçirgen.
5. objektif Immünhistokimya
- Phalloidin-Alexa Fluor 546 (1:200) ve PBS-T ' d a k i 4 °c ' de DAPI (1:1000 of 5 mg/ml stokta) ile hücre çekirdekleri ile sabit embriyo/larval veya yetişkin lenslerin etiket membranları.
Dikkat: DAPı bir cilt ve göz tahriş edici. - Her biri 10 dakika boyunca PBS-T ile üç kez yıkayın. % 30,% 50 ve% 70 gliserol PBS-T (v/v) içinde inkübasyon ile net doku her biri en az 1 saat veya 4 °C ' de bir gecede.
- PBS-T ' d a (v/v) 70% rogliserin içinde cam alt 35 mm 'lik mikrowell yemeklere, düz ve direkt olarak kapak kayma karşı mümkün olduğunca Mount balık. Küçük balık için, hafif bir anterior-lateral Tilt coverslip paralel olmak için objektif sütür yönlendirmek için yardımcı olabilir.
6. bir transjenik Line In vivo kullanarak zebrafish anterior lens sütürler Analizi
- Tol2 kiti15kullanarak TG (βB1cry: mAppleCAAX) hatları oluşturun. Tol2 transpoze eleman sistemi15 Mapple insan βb1300 BP tarafından tahrik olduğu yapının istikrarlı entegrasyonu sağlar-kristalin promotör16 ifade sonuçlanan caax sırası ile membran gergin Özellikle lens fiber hücreli membranlarda.
Not: Bu yapı (ID: 122451) satın alınabilir.- Enjeksiyon sabahı, enjeksiyon karışımı hazırlamak ve buz üzerinde tutun. RNase-ve DNase-Free H2O içeren son 10 μL hacmine ulaşmak için, ekle: 1,5 μL huβb1Cry: 50 ng/μL-[0.375-0.75 pg/final enjeksiyon] de mAppleCAAX DNA yapısı, 1,5 μL Tol2 Transposase mRNA Içinde 300 ng/μL (Tol2 kit)15 [15-30 pg/ Son enjeksiyon] ve 1 μL fenol kırmızı göstergesi% 1 w/v [1 x10-5% (w/v)/final enjeksiyon].
- Enjekte 50-100 pL enjeksiyon karışımı 1 hücreli aşama embriyo12.
- 3 DPF 'de Mapple pozitif lensler ile embriyo sıklığını ölçerek F0 enjekte embriyolar nakliyle verimliliği ölçmek.
Not: Bu yöntemi kullanarak >% 80 nakliyle verimliliği bekliyoruz. F0 mozaikler, bireysel hücrelerin membran morfolojilerinin ayrıntılı analizine izin verir. Farklı seviyede mozaikçilik, tek veya küçük hücre gruplarının morfolojilerini görüntülere sağlar, daha küresel objektif ifadesi ise lens sütürler in vivogibi çok hücreli yapıların analizine olanak sağlar. - Outcross F0 mozaik balık tüm fiber hücre membranların etiket kararlı hatları, oluşturmak için. F0 kurucu transgeni ile germline entegre transgenik hatları olarak muhafaza edilebilir istikrarlı entegrasyonları ile yavru üretecek.
7. bir transjenik Line In vivo kullanarak zebrafish anterior lens sütürler Analizi
- Anestezize 3 DPF veya yetişkin mozaik veya istikrarlı transjenik balık ve Mount 1% düşük Melt agaroz (lma) ile tricaine göz düz cam alt mikrokuyu yemekleri kapak kayma karşı.
- 1% LMA yapmak için 100 mL EM (metilen mavi olmadan) içinde LMA 1 g çözülür. 4 °C ' de 15 mL stoklar olarak uzun süreli saklayın. Mikrodalga her tüp kullanılıncaya kadar 42 °C ' de stok ve mağaza çözülür.
- Trigren ile EM ile 6 DPF kadar kapak balık, veya LMA ayarlandığında yetişkinler için tricaine ile tank suyu ile.
- Metilen mavi veya tank suyu olmadan 5 mL EM Mix ile 250 μL tricaine stok ve 7 μL PTU görüntü PTU tedavi balık.
8. objektif Kriyobölümleme ve Immünhistokimya
- PBS (w/v) içinde% 10 sakaroz, RT 'de 1 saat için% 20 sakaroz (ya da 4 °c ' de bir gecede) ve 4 °c ' de% 30 sakaroz içinde bir gecede, sabit embriyolar veya yetişkin lensleri koruyun.
- Taban kalıplar Oct doku embed, ve sonra Ekim ile Aynalar üzerinde dondurmak. 12-14 μm de cryosection ve bir SuperFrost/Plus mikroskop slaytlar üzerine toplamak. 10 dakika boyunca slayt üzerine sıcak bölümler ~ 35 °C ' ye prewarmed.
- Her biri 10 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkama bölümleri. Phalloidin-Alexa un 546 (1:200) ile DAPı (1:1000) veya WGA-Alexa un 594 (1:200) ile etiket bölümleri, ardından üç PBS yıkanıyor. Anti-Fade montaj orta ve tırnak cilası ile mühür lamel magazini ile Mount.
9. görüntüleme
- Konfokal mikroskop ile görüntü kazanın. Z-yığınları veya optik dilimleri 60x N/A 1,2 su daldırma amacı veya benzer kullanarak, belirli bölgelerde posterior objektif kutup anterior elde. Aşağıdaki edinme ayarlarını kullanın: 1,2, 561 nm lazer, phalloidin-Alexa un 546 veya mApple için Texas kırmızı filtre veya DAPı için UV filtresi ile 405 lazer kullanarak havadar disk.
- Objektif derinliği ile sinyal kaybını karşı koymak için doğru z yoğunluklu lazer gücü. Bu sabit ve canlı 3 DPF embriyo posterior kutup güçlü bir sinyal ve yetişkin balık lensler Ekvator optik dilimleri güçlü sinyal sağlar.
- Resim işleme yazılımını kullanarak görüntüleri derleyin ve görüntüleyin.
10. anterior-posterior eksen objektif Nucleus yerelleştirme ölçümü
- Odak düzlemine paralel olarak direkler ve dikişler ile bir coverglass alt ile 35 mm tabak içinde PBS eksenel olarak taze eksiz lensler Orient. Genellikle objektif çekirdeğini tanımlamak için lens korteks ve objektif çekirdeğinin arayüzünde meydana gelen kırılma indeksinde bir fark arayın.
Not: Sağlıklı vahşi tip yetişkin lensler çok zor objektif sütürler ve çekirdek görmek, ya da objektif yönünü belirlemek için yapım şeffaftır. Bu durumda, lens kapsülü için forseps ile hafif bir Nick küçük hasar neden olur, bu ölçüm için objektif yönlendirmek için yardım yaklaşık 10 dakika içinde sütürler ve objektif çekirdeği belirgin hale getirir. Ancak, lensler artık hasar gördüğü için aşağı akış uygulamaları için kullanılamaz hale gelir. - Lens çekirdeği ile parlak alan aydınlatması altında veya DıC optik olmadan bir kamera bağlı bir diseksiyon mikroskop kullanarak objektif görüntüleri alın. Kalibrasyon için aynı büyütme altında bir mikrometre görüntü.
- Canlı Görünüm düğmesine tıklayın, objektif çekirdeği ve objektif çevre görselleştirmek için pozlama ayarlarını ayarlamak ve snap shot butonuna tıklayarak bir görüntü almak. Bir tif dosyası olarak kaydedin.
- Elde edilen lens görüntülerini kalibre etmek için görüntü işleme yazılımını kullanın. Düz çizgi aracını seçin ve mikrometre görüntüsünde bilinen uzunlukta bir çizgi çizin, analiz et | ölçek ayarlayın. Bilinen mesafeyi, birimleri girin ve ' Global ' kalibrasyonunu seçin ve Tamam 'ı tıklatın.
- Objektif çekirdeğinin merkezinin ön kutuplu (a-r) mesafesini ölçün.
- Objektif çekirdeğinin görselli merkezinde eksenel yönde bir çizgi çizmek için görüntü işleme yazılımındaki düz çizgi aracını kullanın. Objektif çekirdeğinin merkezi olarak bu satırın merkezini alın.
- Objektif anterior Pole bu noktadan başka bir çizgi çizin ve seçin ' ölçmek ' ' analiz ' menüsünde uzaklığı ölçmek için (a-r), burada bir objektif yarıçapı ve r merkezine objektif merkezinden uzaklığı olduğunu Çekirdeği.
- Arka kutuplara anterior başka bir çizgi çizin ve objektif çapı (2A) olarak bu mesafeyi ölçmek. Bu uzunlukları ' sonuçlar ' penceresinden kopyalayın ve bir elektronik tabloya veya istatistik programına aktarın.
Not: Merceğin merkezine objektif çekirdeğinin merkezinden ölçme daha, tam olarak ön kutup çekirdeğinin merkezinden ölçmek daha kolaydır. Bu ölçüm, lens çekirdeğinin merkezinin lensin merkezine uzaklığını bildirmek için 10.3.5 adımda formüle göre dönüştürülür. Embriyonik çekirdeğin belirgin olmasına rağmen her zaman ölçümler için yetişkin çekirdeğini kullanın. - Objektif yarıçapını hesaplamak için çapı 2 ' ye bölün .
- Objektif yarıçapına göre objektif
çekirdeğinin normalleştirilmiş lokalizasyonu olan r/adeğerini hesaplayın.
Not: ön kutup daha yakın yerleştirilen bir kernel Için, r/a > 0.0 olacak, merkezi lokalize bir çekirdeğin 0,0 bir r/a olacak iken.
- Zebra balığı gelişimi sırasında objektif çekirdeği lokalizasyonunda yapılan değişiklikleri belirlemek için normalleştirilmiş eksenel çekirdeği ölçümünün günlük olarak standart uzunluğun bir işlevi olarak grafiğini yapın.
çekirdeğinin normalleştirilmiş lokalizasyonu olan r/adeğerini hesaplayın.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yetişkin zebra balığı göz anatomisi memelilerin yakından benzerdir (Şekil 1a). Zebrafit ve memelinin gözleri arasında bazı farklılıklar olmasına rağmen, örneğin bir siliyer vücudu yerine bir siliyer bölgesi olmak gibi17, optik özelliklerde farklar18, ve embriyonik gelişim sırasında morfojenin farklılıkları19, zebra balığı göz göz gelişimi ve anlayış oftalmik hastalık okuyan için mükemmel bir model20,21,22. Basit bir epitel hatları lensin ön kutup, hangi Ekvator proliferasyon, uzama bir yaşam boyu süreci uğrar ve fiber hücrelere farklılaşma, objektif toplu oluşturan. Olgun fiber hücreler (Şekil 1B, açık mavi) ilk embriyo ayırt, organellerin yoksun ve hiçbir zaman değiştirilir. Farklılaşan fiber hücre ipuçları anterior ve posterior sütürler oluşturmak için kutuplarda buluşuyor. Bu hücreler daha sonra yeni farklılaştırılmış fiber hücreler tarafından aşılaştırılır. Tüm omurga lensler gibi, zebra balığı lens böylece objektif çekirdeğinin merkezinde bulunan en eski hücreler ile gelişme bir gradyan vardır. 18 HPF 'de primer lens liflerini oluşturmak için uzayan 16 h postfertilizasyon (HPF) ' da zebra balığı lens epibranchial formları ve ikincil lifler 28-36 HPF 'de geçiş bölgesini oluşturur. Posterior dikiş görünür 48 HPF, ön sütür görünür hale gelmeden önce10.
Normal objektif mimarisinin hassas gelişimi ve bakımı, optik için önemlidir. Burada, iki zebra balığı Aqp0s fonksiyonlarının kaybına neden olan fenotipleri analiz etmek için geliştirilen hem avantajlar hem de sınırlamalar da dahil olmak üzere zebra balığı lens hücresi morfolojisi içinde vitro ve in vivoanalizi için yöntemler açıklanmaktadır, Aqp0a ve Aqp0b1. İn vitroyetişkin objektif morfoloji değerlendirilmesi için, lensler disseke (Şekil 2) ve hemen sabit. Embriyonik değerlendirme tüm sabit embriyolar (Şekil 3) ve canlı transjenik embriyolar ile karşılaştırıldığında yapılmıştır (Şekil 4). Dissected ve sabit yetişkin lensler (Şekil 5) canlı görüntülenmiş transgenik yetişkin lensler ile karşılaştırıldığında (Şekil 6). Bu yöntemleri kullanarak objektifin belirli bölümlerinin algılanması ve görselleştirilmesi farklılıkları özetlenmiştir (Tablo 1).
Phalloidin Buğday Germ aglutinini (WGA) karşılaştırıldığında zebra balığı objektif fiber hücre membranlarının etiketleme için üstün olduğu bulunmuştur. WGA, N-asetil-D-glukozamin ve sialik asit bağlayan bir ipliktir, ve WGA fluorophores için genellikle insan23, sığır24, koyun25, fare26, sıçan27 ve lens fiber hücre membranlar etiket için kullanılır konjuere zebra balığı28,29. Burada tüm zebra balığı lensler (Şekil 3, Şekil 5) üzerinde phalloidin kullanın.
7 DPF kadar embriyonik ve larva zebra balığı larvaları küçük ve phalloidin objektif dış korteks içine penetrasyon sağlamak için yeterli geçirgen. 3 DPF tarafından lens çekirdeği kompakt ve organellerin yoksun, ön Kutbu anterior sütürler formu (Şekil 3A,B), ve phalloidin bir Ekvator optik düzlemde lens çekirdeği hariç tutulur (Şekil 3c,D). Phalloidin büyük olasılıkla çekirdeğin fiber hücre membranlarının yüksek sıkıştırma nedeniyle hariç, önceki çalışmalar ile tutarlı28. Ancak, dış korteks Bu boyama ile büyük ayrıntılı olarak görselleştirildi (Şekil 3c-F). Çapraz bölümde, fiber hücreler daha uzun geniş kenarları ve daha kısa dar kenarları ile Yassılaştırılmış altıgen şekli alır. Phalloidin güçlü hem dar hem de geniş fiber hücre membranlarını Etiketler (Şekil 3E-F) geniş kenarları arasında kortikal fiber hücrelerin sıkıştırma vurgulayarak. Bu organizasyon aqp0a/b çift mutantlar (Şekil 3B, D, F ve H) büyük ölçüde etkilenmez.
Transgenin mozaik ifadesi (Mapple, insan βb1 kristalin organizatörü 300 BP Organizatör bölgesi tarafından yönlendirilen caax motif tarafından Hücre zarına bağlanmış) 2 DPF 'den başlayarak lenslerde şiddetle ifade eder. Transgene, mApple 'ın heterojen ifadesiyle sonuçlanan GENOMA rasgele entegre edilmiştir. Biz korteks güçlü ifade ile 3 DPF lens örnekleri (Şekil 4) ve çekirdeğin kısımlarında Ifade (Şekil 4d). Membran Marker phalloidin gibi geçirgenlik ile sınırlı değildir, böylece objektif çekirdeği Etiketler. Sadece küçük bir hücre alt kümesiyle ifade edilen DNA enjeksiyonları ile üretilen mozaikler (Şekil 4), βB1 kristalini ifade eden her hücreyi etiketlemek için istikrarlı hatlara kıyasla tek hücreli morfolojileri analiz etmek için yararlıdır (Şekil 6). TG (βB1cry: mAppleCAAX) mozaikleri anterior sütür morfolojisi ön kutup (Şekil 4A,B) alınan z-projeksiyonları görselleştirilebilir. Hücre membranlarının morfolojisi, phalloidin (Şekil 3A,B) ile etiketlenmiş sabit lenslerden ve geniş hücreli membranlarda (Şekil 4A' beyaz oklar) daha önce diğer lenslerde tespit edilen alt alanların varlığı ile farklıdır. türler30 görülebilir. Ancak, dar fiber hücre membranlarının zayıf etiketlenmesi, phalloidin ile etiketli sabit lenslerde görülen anterior sütür (Şekil 4A,b ok) hücrelerin çarpıcı yakınsama görmek için bir yetersizlik sonuçları (Şekil 3A,b oklar).
İlginç bir şekilde, objektif Ekvator 'da çekilen optik dilimleri, WT (Figure 4c-F) ile karşılaştırıldığında aqp0a/b çift mutantların hücre hacmine belirgin kesintiler ile farklı bir etiketleme deseni ortaya çıkarır. Bu büyük olasılıkla çünkü transgenik Etiketler geniş fiber hücre membranları daha etkili phalloidin daha. Biz z-projeksiyonları elde edebildi posterior sütür bütünlüğü ile analiz etmek için arka kutup ile l-düzeltme, doku içine derinlik ile lazer gücü arttı. Posterior sütür net Analizi (Şekil 4g,H) bozulmamış balık ilk 5 DPF ile sınırlıdır, ve sonra objektif çok yoğun, objektif posterior kısmında sinyal kaybına neden oldu.
Phalloidin ile etiketlenmiş sabit disseke yetişkin lensler ön sütürler (Şekil 5A, ok) ve korteks morfoloji (Şekil 5c-H) oluşturmak için yakınma fiber hücre satırlarının yüksek sipariş mimarisi çarpıcı detay ortaya phalloidin tarafından dar fiber hücre membranlarının çok güçlü etiketleme nedeniyle. Ön kutup maksimum Z-projeksiyonları aqp0a/b çift mutant lensler (Şekil 5B, ok), bir membran ve optik hücre çekirdekleri kütlesi olarak belirgin WT (Şekil 5A, ok), göre sıkı bir anterior sütür kaybı ortaya ön kutuplu 30 μm dilimleri (Şekil 5D). Daha derin optik dilimlerde, phalloidin etiketleme daha derin objektif korteks ve çekirdeğinden dışlandı (Şekil 5E,F). Dış korteks fiber hücre satırlarının genel organizasyonu biraz aqp0a/b çift mutant lensler sıkı bir anterior sütür eksikliği etkilenmiştir, imkansız görüntü düzlemine tam dik lensler konumlandırmak için yapma (Şekil 5F ) WT lenslere kıyasla (Şekil 5e). Bununla birlikte, ekvator düzleminde alınan fiber hücre satırlarının yüksek güç görüntüleri, dış korteks hücrelerinde hala düzenli satırlar oluşturmuştur, güçlü dar fiber hücre etiketleme nedeniyle görülebilir (Şekil 5g,H). Kendi sıkı sıkıştırma ve zayıf sinyal kombinasyonu nedeniyle bireysel fiber hücre geniş membranların ayırt etmek imkansızdı. Bu lensler dissected olduğu için, arka tarafı objektif bakan ile monte edilebilir, arka dikiş z-projeksiyonları izin, posterior fiber hücre ipuçları gibi genotürler arasında hiçbir fark gösterdi sıkı sütürler oluşturuldu (Şekil 5I,J oklar).
Z-canlı anestezik yetişkin istikrarlı TG (βB1cry: mAppleCAAX) balık lenslerin projeksiyon anterior korteks içinde kortikal membran morfoloji ortaya (Şekil 6a,a '), yanı sıra anterior Pole hücre yakınsama ölçüde ( Şekil 6B). Sabit disseke lensler ile karşılaştırıldığında, görüntüleme düzlemine dik objektif sütürler ile balık monte etmek daha zordu. Transgen ekspres mApple 'ı objektif çekirdeğinde taşıyan istikrarlı çizgiler (Şekil 6C,D). Ekvator 'daki optik dilimleri, anterior korteks olarak aynı lazer gücüne sahip olduğunda çekirdeğin geniş sıkıştırma işlemini gösteren güçlü bir sinyal gösterdi (Şekil 6C). İlginçtir, dış korteks hiçbir hücresel çözünürlük yetişkinlerde belirgindi, embriyo aksine. Bu objektif çevre net bir sinyal engelleme iris nedeniyle muhtemeldir. Görüntüleme öncesinde öğrencilerin genişlemesinde daha güçlü bir objektif kortikal sinyal elde etmek mümkün olabilir. Azaltılmış lazer gücü ile, objektif çekirdeğinde bazı hücre katmanlarını ayırt etmek mümkün (Şekil 6D). Yetişkin zebra balığı lens çok yoğundur ve arka kutup in vivosinyal elde etmek imkansızdı.
Zebra balığı objektif çekirdeğinin, larva lenslerde ilk ön pozisyondan, Yetişkin1' de merkezi bir konuma kadar optik ekseninde hareket ettiğini göstermiştir. Bu hareketler Aksiyel objektif bölümlerde vurgulanır, phalloidin ve WGA objektif çekirdeğinden hariç tutulur (Şekil 7A-C). Bu merkezileştirme süreci1için Aqp0a gerekli olduğunu göstermiştir, ancak bu mekanizma diğer proteinlerin etkilenmesi muhtemeldir. Anterior-posterior eksen boyunca pozisyonuna bağlı olarak objektif çekirdeğinin merkezinin lokalizasyonu, DIC aydınlatma altında eksenel Oryantasyon ve görüntülemede disseke tüm lensler yerleştirerek, böylece hafif farklılıklar vurgulayarak ölçülmüştür Refraktif Özellikler (Şekil 7E). Dikişler genellikle çevreleyen korteks daha farklı bir refraktif endeks var, bu nedenle oryantasyon için bir kılavuz olarak kullanılabilir. Genç larva lensler daha bariz sütürler var (çok genç lensler posterior sütürler), ve farklı bir refraktif indeksi olan objektif çekirdekleri, açıkça asimetrik, bu aşamada lensler yönlendirmek için daha kolay hale. Objektif çekirdeğinin merkezinin bağıl mesafesi objektif (r) merkezinden objektif yarıçapına (a) normalleştirilir. Daha sonra, Standart uzunluk ölçümü13kullanılan zebra balığı gelişimi ile ilgili olarak grafikli. WT 'de lens çekirdeği ön lens direğine 
daha yakın başlar ve sonra yetişkinlikte merkezileştirir 
(Şekil 7F).
Şekil 1 : Zebrafish yetişkin göz ve objektif diyagramı. Anterior ışık göz girer gibi alınır, hangi zebra balığı aslında lateral olduğunu. (A) kornea ile birlikte zebra balığı lens retina üzerine ışık odak. Su hayvanlarında, kornea hafif kırılma içinde küçük bir rol oynar, ancak bunun yerine, objektif daha yüksek bir refraktif indeksi18vardır. Lens, sulu mizah ve vitreus mizah dolu posterior odası ile dolu ön odası ayırır. (B) zebra balığı lens, memelinin lenslerden daha küresel. Fiber hücreli ipuçları, anterior ve posterior kutuplarda nokta veya göbek sütürler8 ile buluşuyor. Objektif kortekste lif hücrelerinin farklılaşılması çekirdekler ve organeliler vardır, objektif çekirdeğinde (açık mavi) olgun fiber hücreler organizlerin ve çekirdeğin yoksun iken. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Zebrafish lens diseksiyon. (A) gözler anestezileştirilmiş balıklardan disseke ve arka tarafı yukarı yerleştirilir (B). (C) gözler optik disk (OD) ile forseps tarafından immobilize ve iki ila üç radyal kesikler Retina ve sklera optik diskten zonules için yapılır. (D) lens ortaya çıkarmak için flep katlayın. (E) yukarı kornea yüz göz döndürmek, dolaylı kornea üzerinden objektif hareketsiz ve Sclera-Retina uzağa çekin. (F) objektif kalan Retina ve siliyer bölge/zonules uzakta Trim. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Embriyonik objektif morfoloji in vitro. DAPı (mavi) ile phalloidin (kırmızı) ve hücre çekirdekleri ile etiketlenmiş sabit ve geçirgen embriyo, kutuplarda membran morfolojisi ve sütür bütünlüğünü ortaya çıkarır. Z-projeksiyonlar WT ve aqp0/b çift mutant lensler çok sıkı anterior sütür (oklar) 3 DPF (a, b) de karşılayan çok düzenli fiber hücre düzenlemesi sergiler ortaya. Ekvator 'da alınan optik dilimleri, hem genotiplerde (C-F) dış korteks içinde paketlenmiş altıgen fiber hücrelerin sıkı satırlarını ortaya çıkarır. Fiber hücre membranlarının her ikisi de, dar ve geniş kenarları (E) olarak gösterildiği gibi etiketlenmiş. Posterior sütürler (oklar) her iki genotipte (G, H) oluşur ve dar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Embriyonik objektif morfoloji in vivo. Anestezi 3 DPF mozaik F0 enjekte TG (βB1cry: mAppleCAAX) lensler canlı görüntüleme z-projeksiyon (A, B) anterior sütürler (oklar) ortaya. (a ') Membran alt etki alanları geniş fiber hücreli membranlarda puan (beyaz oklar) olarak belirgindir. Dar fiber hücreli membranlar da belirgindir (siyah oklar). WT lensler sıkıca paketlenmiş objektif kortikal Fiber hücreleri ortaya (C, E), aqp0a/b çift mutantların bozulmuş korteks kıyasla- belirgin şişmiş hücreler (D, F). Posterior (g, h) sütürler (oklar) üzerinde odaklama genotipler (g, h) arasında hiçbir fark ortaya çıkarır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Yetişkin lens morfoloji in vitro. 23 mm 'lik standart uzunlukta balıklardan gelen eksiz, sabit ve geçirgen lensler phalloidin (kırmızı) ve DAPı (mavi) ile etiketlenmiştir. 150 μm Z-projeksiyon ön kutuplu fiber hücre ipuçları sıkı bir dikiş (ok) WT (a), ancak aqp0a/b çift mutantlar (ok), bunun yerine membranlar ve çekirdekler (b) bir kitle var yakınsak sıkı düzenlemeyi ortaya çıkarır. Ön kutup 42 μm alınan bir optik dilim WT (C), ama sütür mutant lensler (D) olmalıdır çekirdeklerin bir kütle merkezinde kesişen sipariş hücreleri ortaya çıkarır. Objektif Ekvator aracılığıyla optik dilimleri, ön kutuplu 130 μm de WT (E, G) ve mutantlar (F, H) fiber hücrelerin sıkıca paketlenmiş satırları ortaya çıkarır. Posterior sütürler (oklar) her iki genotipte (ı, J) oluşur ve dar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6 Yetişkin lens morfoloji in vivo. Anestezize yetişkin istikrarlı TG (βB1cry: mAppleCAAX) WT lensler canlı görüntüleme. Anterior korteks Z-projeksiyonlar kortikal morfoloji ortaya (a, a '), ve anterior sütür (ok), hücreleri tek bir optik dilim (B, ok) bir noktaya yakınma ile. Korteks, objektif çekirdeğinin (D) güçlü sinyaline kıyasla, Ekvator (C) aracılığıyla optik bir dilimde yüksek lazer gücüyle görselleştirilebilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 7: Zebrafish lens çekirdeği merkezileştirme. Sabit ve kriyokorumalı embriyo (a) ve lensler (B, c) eksenel Cryo-kesitli ve phalloidin-546 (kırmızı a, b), DAPI (mavı a, b) veya WGA-594 (kırmızı C) ile etiketlenmiştir. Objektif çekirdeği hücre çekirdekleri yoksun ve anterior (a) lens 3 DPF (a), ve 1 ay eski lensler (B), merkezi yetişkin lensler (C) yerleştirilir kıyasla daha yakın yerleştirilir. 4,1 mm 'lik standart uzunluğun 1 aylık zebrafısından oluşan dissected lensler Cassegrain (D) veya eksenel (E) odaklıdır. Eksendeki objektif çekirdeğinin göreli lokalizasyonu aşağıdaki strateji kullanılarak hesaplanmıştır: (E) objektif çekirdeğinin (*) Merkezi (*) mesafesi, ön kutup ile ölçülmüştür, bu da ölçüm daha pratik olarak Uzaklık (r) lensin merkezine (artı). Bu, Aksiyel (ant.-POS.) objektif çapı olarak ölçülmüş objektif yarıçapı (a) için normale döndü. Normalleştirilmiş Aksiyel çekirdeğin lokalizasyonu, zebra balığı gelişiminin bir işlevi olarak grafiklenmiş, Standart uzunluk (F) ile ölçülür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Özelliği | IHC embriyo | Yavuz döli | Tüm ıHC yetişkin lens | TG Adult |
| Canlı | N | Y | N | Y |
| Anterior sütür | Y | Biraz | Y | Biraz |
| Posterior sütür | Y | Y | Y | N |
| Kortikal hücresel detay | Biraz | Y | Y | Anterior biraz |
| Objektif çekirdeği detay | N | Y (istikrarlı) | N | Y (istikrarlı) |
| İkincil etiket | Y-antikorlar | Sadece TG ile canlı | Y-antikorlar | Sadece TG ile canlı |
| Geniş/dar fiber etiket | Hem | Geniş | Çoğunlukla dar | Geniş |
Tablo 1: zebrafish objektif morfoloji analizi için ın vitro vs in-vitro yöntemlerinin karşılaştırılması Özeti. Y = Evet, N = Hayır
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebra balığı objektif morfoloji Analizi mutantlar fenotipleri anlamada ilk adımdır, ya da oküler objektif biyoloji okumaya yönelik farmakolojik müdahalelerin etkileri. Objektif sütürler, kortikal fiber hücre morfolojisi ve objektif çekirdeğinin yönlerini analiz etmek için yöntemleri özetlemektedir. Bu yaklaşımlar in vitro ve In vivo ( tablo 1 ' de karşılaştırıldığında) bir kombinasyonudur. In vitro yöntemleri dış kortikal hücre morfolojisi daha fazla ayrıntı için, yanı sıra yetişkin lensler posterior sütür erişim sağlar.
In vivo analiz transgenik belirteçleri kullanımı ile mümkündür. Biz burada tanıtmak transgene lens membranı özel, mevcut Q01 zebra balığı hattı ile karşılaştırıldığında, hangi objektif membranların etiketleme aynı zamanda göz diğer hücre türlerini etiketler, amacrine hücreleri de dahil olmak üzere, yorum karmaşıklık11 . In vivo sinyal, embriyogenyonun ikinci gününde oluşan göz pigmentli epitelyum ile sınırlıdır, bu nedenle embriyoların bu ve sonraki aşamalarında analiz için tedavi edilmesi gerekir. Yetişkinlerde, İris objektif korteks net analiz gizler, ama ön lens korteks in vivo analiz sağlar. Balık lenslerin canlı görüntüleme aynı hayvan objektif morfoloji boyuna çalışmalar için izin verir. Bu, dinamik süreçler üzerindeki etkileri incelemek için son derece yararlı bir araçtır, örneğin osrotik veya farmakolojik pertürasyonlar yanıt olarak hücre hacmi bozulması gibi. Beklenmeyen bir bulgu, canlı larva transgenikleri içinde geniş fiber hücreli membranlarda membran alt alanlarını açıkça görselleştirebiliriz, ancak sabit lenslerde değil. Bu, transgene ve phalloidin tarafından etiketlenme farkını ve bu alt alanların sabitleme işleminden etkilenme gerçeğini vurgulamaktadır.
Objektif çekirdeği merkezileştirmenin moleküler mekanizmalarının analizinde yaptığımız yöntemleri kullanarak objektif optik özelliklerinin gelişmesi için gerekli mekanizmaları ortaya çıkarabilir. Rağmen, bugüne kadar, Aksiyel lens çekirdeği asimetri sadece zebrafish bildirilmiştir, bu süreci inceleyerek diğer türlerin objektif optik gelişimi için gerekli mekanizmalar içine anlayışlar elde etmek muhtemeldir. Gelecekte, transgenik hayvanlar diğer uygulamalarla birlikte kullanılabilir-ekspresyonu çalışmaları gibi, yeşil nakliyle Marker kullanımı ile. Bu objektif belirli bir protein aşırı ifade etkilerini incelemek için kullanılabilir, ya da mevcut mutantlar fenotürleri kurtarmak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir açıklama yok.
Acknowledgments
Biz finansman kaynağı kabul etmek istiyorum: NIH R01 EY05661 J. E. H için, Ines Gehring aqp0a/b çift mutantlar ve zebra balığı yetiştiriciliği üreten ile yardımcı olmak için, Dr Daniel dranow tartışmalar için transgenics nesil lider, Dr Bruce Blumberg ve Dr Ken Cho 's Labs onların diseksiyon microscopes kullanımı için, ve Dr Megan Smith istatistiksel analiz yardım için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21 °C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont #5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION - toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
References
- Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
- Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
- Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
- Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
- Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
- Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
- Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
- Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
- Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
- Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
- Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
- Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
- Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
- Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
- Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
- Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
- Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
- Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
