Summary

인간 탯 줄 혈액 파생 CD34에서 조 혈 줄기 세포의 생체 내 확장 전+ 세포 Valproic 산 사용 하 여

Published: April 11, 2019
doi:

Summary

여기, 우리는 전 설명 CD34에서 조 혈 줄기 세포의 생체 내 확장+ 세포 탯 줄 혈액에서 파생 된 칵테일 cytokine VPA의 조합으로 치료. 이 메서드 중 하나에 대 한 기본 HSCs의 비보 확장 전의 상당한 정도로 리드 임상 또는 실험실 응용 프로그램.

Abstract

탯 줄 혈액 (UCB) 단위 수용자 골 수 이식 필요한 환자에 대 한 인간의 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 대체 소스를 제공 합니다. UCB는 몇 가지 고유한 장점, 재생 의학에 그들의 사용 및 성인 HSC 이식 각 UCB 단위 내의 HSCs의 제한 된 숫자 제한 합니다. 기능 인간의 HSCs의 효율적인 확장 ex vivo CD34의 경작에 의해 달성 될 수 있다+ 세포 UCBs에서 고립과 deacetylase 억제 물, valproic 산 (VPA)와 치료. 여기서 설명 하는 프로토콜에 설명 합니다 문화 조건 및 방법론을 빠르게 CD34+ 세포 높은 정도로 원시적인 HSCs의 수영장을 확장 하 고. 확장된 HSCs 모두 단기 및 장기 engraftment를 설정 할 수 있으며 모든 종류의 차별화 된 조 혈 모 세포를 야기할 수 있습니다. 이 메서드는 또한 헌 HSC 유전자 치료에서 임상 응용 프로그램에 대 한 잠재적인 보유 하 고 편집 하는 유전자와 관련 된 기능 HSCs의 손실을 극복 하는 매력적인 접근을 제공 합니다.

Introduction

탯 줄 혈액에서 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 비보 확장 전 (UCB) 단위 재생 의학 및 이식 치료에 HSC 응용 프로그램에 대 한 위대한 약속을 보유 하고있다. UCB 단위 이식 쉽게 컬렉션, 높은 가용성, 감염의 최소한의 위험, 저위험 질병 재발, 그리고 접목 대 주인 질병 (GVHD)의 낮은 주파수 몇 가지 독특한 장점이 있습니다. 그러나, 임상 설정에 그들의 사용의 주요 단점은 HSCs 각 UCB 단위1내 존재의 제한 된 수 있습니다. HSCs의 부족 수 지연된 engraftment 및 조 혈 복구, 이식 거부, 정도 벗어난 면역 재구성의 위험이 발생합니다.

현재, 다양 한 방법과 전략 비보 전 UCBs에서 HSCs의 제한 된 수 확장 개발 되었습니다. 작은 분자 또는 화합물에서 ex vivo 문화 결과 HSC 숫자2,3,,45,6, 확장의 다양 한 각도 다른 cytokine 칵테일의 조합 7,8. 중요 한 것은, ex vivo 문화 조건 유도 스트레스, 급속 한 세포 증식, 대사 활동 증가 주 HSCs를 정의 하는 기본 특성의 손실에 지도. 따라서, 개발 프로토콜을 기본 기본 HSCs 유사한 특성을 가진 기능 HSCs의 큰 숫자의 확장으로 이어질 필요 합니다.

혈 청 무료 문화 CD34의+ 셀 UCBs에서 고립 되 고 원시적인 HSCs4,,910의 다 수의 확장에 valproic 산 (VPA) 결과와 치료. HSC 확장 UCBs에서 파생 된 기존 HSCs의 확산 때문만 아니다. 대신,이 확장은 제한 된 수의 세포 분열과 증식9. 와 함께 기본 표현 형의 인수 때문 Cytokines 및 VPA, CD34의 조합 가진 외피의 초기 24-48 h 내+ 세포 transcriptomic 및 phenotypic 프로필 장기 HSCs 특성을 취득. HSCs의 비율이 크게 증가 HSCs (VPA 치료의 24 시간 이내 63 배 증가)9의 수에 있는 신속한 증가 동반 된다. 특히, VPA ex vivo 확장 전략 낮은 신진 대사 활동을 더 그들의 기본 특성을 강조 HSCs를 확장 합니다.

여기 설명 하는 방법을 제공 조건 및 트리 트 먼 트 중 하나에 대 한 기본 HSCs의 비보 확장 전 상당한 정도의 이어질 임상 또는 실험실 응용 프로그램. Ex vivo 확장 전략 cytokine 칵테일 VPA 치료와 함께 사용 합니다. VPA는 양극성 장애 및 다른 신경 질환의 치료에 대 한 FDA의 승인을 마약입니다. VPA HSC 확대 프롬프트 이며 조작의 시간와 오염 위험을 최소화 하는 7 일 이내 발생. 중요 한 것은,이 프로토콜은 마커의 장기 HSC phenotypic CD90 등 CD49f VPA9와 치료 다음과 24-48 시간 이내 수집에 대 한 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 만든 확장된 HSC 이식 이후 그들은 모든 조 혈 세포 계보에 분화 하 고 장기 engraftment myeloablated NSG 쥐로 이식 다음을 설정할 수 조 혈 시스템을 재생성 하기 위해 용량을가지고 모델4. 또한,이 프로토콜 매우 재현할 수 이며 수 가능한 CD34의 효율적이 고 신속한 격리에 대 한+ UCBs에서 세포는이 절차의 산업화에 대 한 중요 한.

Ex vivo 확장 프로토콜 VPA는 또한 유전자11편집 하는 동안 발생 HSCs의 중요 한 손실을 극복 하기 위해 잠재력이 있다. 편집 진 순환 세포와 DNA 수리 메커니즘의 활성화에 필요한 cytokines에 노출을 해야 합니다. 현재 관련 된 시간의 기간 내 유전자 변형된 세포의 더 높은 번호의 세대 활용 유전자 수정 프로토콜에 대 한 VPA 치료의 신속한 효과 인해이 메서드는 도움이 될 수 있습니다.

Protocol

Ex vivo 확장 프로토콜 HSC 마운트 시 나이의 대학에 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 1. 버퍼 및 미디어 준비 분리 버퍼 절연 CD34의 이전 24 시간 준비+ 세포 Ubc에서 0.5 M 에틸렌 Diamine Tetra-아세트산 (EDTA)의 그리고 7.5%의 33 mL 2 mL를 추가 하 여 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 버퍼링 465 mL 식 염 수 (1 x PBS)를. 부드럽게 혼합 하 고 하룻밤 4 ° c.에 버퍼를 유지 정화의…

Representative Results

비보 전 여기에 설명 된 프로토콜 기본 HSCs CD34에서 생성의 수를 증가+ UCBs (그림 1)에서 분리 하는 세포. CD34의 못쓰게+ 칵테일, cytokine로 16 h에 대 한 셀 뒤 VPA 치료 HSC 확장의 훌륭한 정도를 추가 7 일 리드에 대 한. 확장된 셀의 수영장 HSCs phenotypically CD34에 의해 정의 되는 대 한 높은 농축 놀랍게도,+CD90+ 마커. Cytokine 칵?…

Discussion

여기, 우리는 빠르게 확장 하는 상당한 정도로 기능 인간의 HSCs의 수 UCBs에서 프로토콜을 제시. 이 프로토콜을 사용 하 여 파일럿 및 키네틱 연구 나타냅니다는 비보 전 확장된 셀 즉시 획득 및 여러 HSC phenotypic 마커 CD90 원시 HSC 대사 특성9등의 식을 유지.

Ex vivo 확장 프로토콜 이것은 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는입니다. CD34의 정화+ 셀 셀 구분 장…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 NYSTEM에 의해 지원 되었다 상대습도를 C030136 부여 우리는 그의 의견 및 원고 수정에 대 한 Bartek 피부색을 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Expansion Media Sigma-Aldrich Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML
AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. Nexcelom CS2-0106-25mL
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 BD BIOSCIENCE 555824
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 BD BIOSCIENCE 555751
autoMACS Rinsing Solution MACS Miltenyi Biotec 130-091-222
BD Falcon 15 ml Tube BD Biosciences 352097
BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube BD Biosciences 352063
BD Falcon 50 ml Tube BD Biosciences 352098
Bovine serum albumine solution Sigma-Aldrich A8412
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human Miltenyi Biotec 130-046-703
Cell analyzer BD Biosciences FACS Canto II
Cell analyzer and sorter BD Biosciences FACS Aria II
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter
Cell separator device autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec
Counting Chambers Nexcelom CHT4-PD100-002
Density gradient media GE Healthcare Bio-Sciences AB 17-1440-03
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E8008-100ML
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 BIOLEGEND 328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody BIOLEGEND 400109
Inverted microscope
PBS Corning cellgro 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein R&D Systems 308FKN
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) R&D Systems 203-IL
Recombinant Human SCF Protein R&D Systems 255-SC
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) R&D Systems 288-TP
Total Antibody Compensation Bead Kit thermofisher A10497
Umbilical Cord-blood Placental Blood Program at the New York Blood Center http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/
Valproic acid sodium salt Sigma-Aldrich P4543

References

  1. Broxmeyer, H. E. Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation. Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).
  2. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  3. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  4. Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D'Souza, S., Hoffman, R. Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells. Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).
  5. Wagner, J. E., et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
  6. Peled, T., et al. Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment. Experimental Hematology. 40 (4), (2012).
  7. Nikiforow, S., Ritz, J. Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?. Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).
  8. Mehta, R. S., et al. Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials. Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).
  9. Papa, L., et al. Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation. Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).
  10. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. , (2019).
  11. Genovese, P., et al. Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells. Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).
  12. Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
  13. Fares, I., et al. EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells. Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).

Play Video

Cite This Article
Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid. J. Vis. Exp. (146), e59532, doi:10.3791/59532 (2019).

View Video