여기, 우리는 전 설명 CD34에서 조 혈 줄기 세포의 생체 내 확장+ 세포 탯 줄 혈액에서 파생 된 칵테일 cytokine VPA의 조합으로 치료. 이 메서드 중 하나에 대 한 기본 HSCs의 비보 확장 전의 상당한 정도로 리드 임상 또는 실험실 응용 프로그램.
탯 줄 혈액 (UCB) 단위 수용자 골 수 이식 필요한 환자에 대 한 인간의 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 대체 소스를 제공 합니다. UCB는 몇 가지 고유한 장점, 재생 의학에 그들의 사용 및 성인 HSC 이식 각 UCB 단위 내의 HSCs의 제한 된 숫자 제한 합니다. 기능 인간의 HSCs의 효율적인 확장 ex vivo CD34의 경작에 의해 달성 될 수 있다+ 세포 UCBs에서 고립과 deacetylase 억제 물, valproic 산 (VPA)와 치료. 여기서 설명 하는 프로토콜에 설명 합니다 문화 조건 및 방법론을 빠르게 CD34+ 세포 높은 정도로 원시적인 HSCs의 수영장을 확장 하 고. 확장된 HSCs 모두 단기 및 장기 engraftment를 설정 할 수 있으며 모든 종류의 차별화 된 조 혈 모 세포를 야기할 수 있습니다. 이 메서드는 또한 헌 HSC 유전자 치료에서 임상 응용 프로그램에 대 한 잠재적인 보유 하 고 편집 하는 유전자와 관련 된 기능 HSCs의 손실을 극복 하는 매력적인 접근을 제공 합니다.
탯 줄 혈액에서 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 비보 확장 전 (UCB) 단위 재생 의학 및 이식 치료에 HSC 응용 프로그램에 대 한 위대한 약속을 보유 하고있다. UCB 단위 이식 쉽게 컬렉션, 높은 가용성, 감염의 최소한의 위험, 저위험 질병 재발, 그리고 접목 대 주인 질병 (GVHD)의 낮은 주파수 몇 가지 독특한 장점이 있습니다. 그러나, 임상 설정에 그들의 사용의 주요 단점은 HSCs 각 UCB 단위1내 존재의 제한 된 수 있습니다. HSCs의 부족 수 지연된 engraftment 및 조 혈 복구, 이식 거부, 정도 벗어난 면역 재구성의 위험이 발생합니다.
현재, 다양 한 방법과 전략 비보 전 UCBs에서 HSCs의 제한 된 수 확장 개발 되었습니다. 작은 분자 또는 화합물에서 ex vivo 문화 결과 HSC 숫자2,3,,45,6, 확장의 다양 한 각도 다른 cytokine 칵테일의 조합 7,8. 중요 한 것은, ex vivo 문화 조건 유도 스트레스, 급속 한 세포 증식, 대사 활동 증가 주 HSCs를 정의 하는 기본 특성의 손실에 지도. 따라서, 개발 프로토콜을 기본 기본 HSCs 유사한 특성을 가진 기능 HSCs의 큰 숫자의 확장으로 이어질 필요 합니다.
혈 청 무료 문화 CD34의+ 셀 UCBs에서 고립 되 고 원시적인 HSCs4,,910의 다 수의 확장에 valproic 산 (VPA) 결과와 치료. HSC 확장 UCBs에서 파생 된 기존 HSCs의 확산 때문만 아니다. 대신,이 확장은 제한 된 수의 세포 분열과 증식9. 와 함께 기본 표현 형의 인수 때문 Cytokines 및 VPA, CD34의 조합 가진 외피의 초기 24-48 h 내+ 세포 transcriptomic 및 phenotypic 프로필 장기 HSCs 특성을 취득. HSCs의 비율이 크게 증가 HSCs (VPA 치료의 24 시간 이내 63 배 증가)9의 수에 있는 신속한 증가 동반 된다. 특히, VPA ex vivo 확장 전략 낮은 신진 대사 활동을 더 그들의 기본 특성을 강조 HSCs를 확장 합니다.
여기 설명 하는 방법을 제공 조건 및 트리 트 먼 트 중 하나에 대 한 기본 HSCs의 비보 확장 전 상당한 정도의 이어질 임상 또는 실험실 응용 프로그램. Ex vivo 확장 전략 cytokine 칵테일 VPA 치료와 함께 사용 합니다. VPA는 양극성 장애 및 다른 신경 질환의 치료에 대 한 FDA의 승인을 마약입니다. VPA HSC 확대 프롬프트 이며 조작의 시간와 오염 위험을 최소화 하는 7 일 이내 발생. 중요 한 것은,이 프로토콜은 마커의 장기 HSC phenotypic CD90 등 CD49f VPA9와 치료 다음과 24-48 시간 이내 수집에 대 한 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 만든 확장된 HSC 이식 이후 그들은 모든 조 혈 세포 계보에 분화 하 고 장기 engraftment myeloablated NSG 쥐로 이식 다음을 설정할 수 조 혈 시스템을 재생성 하기 위해 용량을가지고 모델4. 또한,이 프로토콜 매우 재현할 수 이며 수 가능한 CD34의 효율적이 고 신속한 격리에 대 한+ UCBs에서 세포는이 절차의 산업화에 대 한 중요 한.
Ex vivo 확장 프로토콜 VPA는 또한 유전자11편집 하는 동안 발생 HSCs의 중요 한 손실을 극복 하기 위해 잠재력이 있다. 편집 진 순환 세포와 DNA 수리 메커니즘의 활성화에 필요한 cytokines에 노출을 해야 합니다. 현재 관련 된 시간의 기간 내 유전자 변형된 세포의 더 높은 번호의 세대 활용 유전자 수정 프로토콜에 대 한 VPA 치료의 신속한 효과 인해이 메서드는 도움이 될 수 있습니다.
여기, 우리는 빠르게 확장 하는 상당한 정도로 기능 인간의 HSCs의 수 UCBs에서 프로토콜을 제시. 이 프로토콜을 사용 하 여 파일럿 및 키네틱 연구 나타냅니다는 비보 전 확장된 셀 즉시 획득 및 여러 HSC phenotypic 마커 CD90 원시 HSC 대사 특성9등의 식을 유지.
Ex vivo 확장 프로토콜 이것은 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는입니다. CD34의 정화+ 셀 셀 구분 장…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NYSTEM에 의해 지원 되었다 상대습도를 C030136 부여 우리는 그의 의견 및 원고 수정에 대 한 Bartek 피부색을 감사 하 고 싶습니다.
Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
BD Falcon 15 ml Tube | BD Biosciences | 352097 | |
BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
Inverted microscope | |||
PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |