Summary
Этот протокол описывает набор методов для определения клеточного типа специфического функционального подключения долгосрочных входов из отдаленных областей мозга с помощью оптогенетических стимуляций в ломтиках мозга ex vivo.
Abstract
Знание клеточного типа специфических синаптических связей является важнейшей предпосылкой для понимания нейронных цепей в масштабах всего мозга. Функциональное исследование соединений дальнего радиуса действия требует целевых записей одиночных нейронов в сочетании с специфической стимуляцией выявленных удаленных входов. Это часто трудно достичь с помощью обычных и электрических методов стимуляции, потому что аксоны от сходящихся вверх по течению областей мозга может смешение в целевой области. Стереотаксическая ориентация на конкретную область мозга для опосредованного вирусом выражения светочувствительных ионных каналов позволяет селективной стимуляции аксонов, происходящих из этой области со светом. Внутримозговые стереотаксические инъекции могут быть использованы в хорошо разграниченных структурах, таких как передние таламические ядра, в дополнение к другим подкорковышам или корковым областям по всему мозгу.
Описан освоен здесь набор методов для точного стереотаксической инъекции вирусных векторов, выражающих channelrhodopsin в мозге мыши, а затем фотостимуляция аксонтерминалов в подготовке ломтик мозга. Эти протоколы просты и широко применимы. В сочетании с цельноклеточной записи зажима патча с постсинаптически связанного нейрона, фотостимуляция аксонов позволяет обнаруживать функциональные синаптические связи, фармакологическую характеристику и оценивать их прочность. Кроме того, биоцитиновый наполнение записанного нейрона может быть использован для пост-специальной морфологической идентификации постсинаптического нейрона.
Introduction
Определение связи между областями мозга необходимо для понимания нейронных цепей. Классические методы анатомического отслеживания позволяют установить межрегиональную связь, а исследования поражений помогают понять иерархическую организацию информационного потока. Например, мозговые схемы для пространственной ориентации и сигнализации направления головы включают направленный поток информации от таламуса до пресубикула. Это было продемонстрировано исследования поражения антеро-дорсал саломных ядер (ADN), которые ухудшают сигнал направления головы в вниз по течению дорсальный presubiculum, а также парагиппокампальной сетки сигнала ячейки1,2.
Функциональную связь между областями мозга труднее установить на клеточном и субклеточном уровне. В гиппокампе, высокоорганизованная анатомия позволяет исследовать пути конкретных синаптические соединения с помощью электрического моделирования в срез подготовки. Стимулирующие электроды, помещенные в радиат сточки CA1, могут быть использованы специально для стимулирования ввода залога Schaffer от CA33. Стимулирующие электроды, помещенные в молекулярный слой лачуносума CA1, активируют перфорантный вход пути в CA14,5. Электрическая стимуляция активирует высвобождение нейромедиатора из аксонных терминалов; однако, он активирует нейроны с somata вблизи места стимуляции, а также аксоны прохода. Поэтому он имеет ограниченное применение для изучения афферентов из определенных областей мозга, когда волокна различных регионов происхождения перемешивается в целевой структуре, как это обычно бывает в неокортексе.
Нейроны также могут быть стимулированы светом. Оптические методы включают фотоактивацию глутамата в клетке, который можно комбинировать с одно- или двухфотонным лазерным сканированием. Несколько близко расположенных участков могут быть стимулированы последовательно, без механических повреждений ткани6. Это было успешно использовано для картирования синаптических рецепторов, а также активировать отдельные нейроны7. Хотя глутамат неприкосновения могут быть использованы для локального анализа цепи, это не позволяет для конкретной активации дальнего ввода.
Методом выбора для исследования дальнего подключения в нейронных цепях является использование вирусо-опосредованного выражения channelrhodopsin. Используя виво стереотаксические инъекции, описанные здесь, выражение световых ионных каналов может быть целенаправленным и пространственно ограничено желаемой областью мозга. Таким образом, channelrhodopsins эффективны для картирования возбуждающих или ингибирующих подключения из одного региона в свою цель. Трансинфицированные аксоны терминалы могут быть стимулированы светом в подготовке ломтик мозга, и патч-зажим записи как считывание позволяют изучить функции и сильные стороны конкретных компонентов цепи в мозге8. Оптогенетический подход в сочетании со стереотаксической инъекцией вируса предлагает беспрецедентную специфичность и генетический контроль9. Стимулирование со светом дополнительно позволяет как высокой временной и пространственной точности10,11.
Пресубикул является шестислойной корковой структурой при переходе гиппокампа и парагиппокампа формирования12,13. Он получает важный синаптический вход от ADN11, но и от нескольких других корковых и подкорковых областей14. Таким образом, селективная стимуляция таламических аксонов терминалов в пределах presubicular ломтик не представляется возможным с электрической стимуляции, ни глутамата uncaging. Описанные в этом протоколе методы для определения функциональной связи между областями мозга (ADN и presubiculum) с использованием точных стереотаксических инъекций вирусных векторов, выражающих световые каналы. Также описана фотостимуляция аксонов терминалов проецирования нейронов в их целевой области, в сочетании с цельноклеточными зажимными записями постсинаптических нейронов в подготовке среза мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были выполнены в соответствии с Директивой Совета Европейского сообщества (2010/63/EU) и одобрены комитетом по этике Парижского университета Декарта. Экспериментатор должен получить разрешение на соблюдение правил, установленных местными правилами.
1. Планирование эксперимента
- Определите область мозга, которая будет направлена. Определите стереотаксические координаты места инъекции с помощью атласа мозга мыши15. Для правого антеро-дорсального таламиального ядра (ADN) координаты: -0,82 заднего, 0,75 бокового, -3,2 глубины (мм) относительно брегмы. Координаты могут быть скорректированы для животных разного возраста, пола или деформации.
- Подтвердите и задокументируйте точность координат путем введения флуоресцентного трассировщика (150-300 нл), наблюдаемого с помощью эпифлюоресцентного микроскопа в экспериментальном эксперименте(рисунок 1A,B).
- Определите тип вируса, который будет введен. Храните вирус в 6 аликотах на уровне -80 градусов по Цельсию, как это рекомендовано производителем. Принесите 1 aliquot помещенный на льду к комнате хирургии, для впрыски одного до 6 животных на, котор дали день. Правила биобезопасности для использования AAV может зависеть от страны или учреждения, и использование PSM 2 капот может потребоваться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем серотип AAV2/5, выражающий Chronos, быстрый вариант канала, слитый с зеленым флуоресцентным белком под контролем промотора Synapsin: AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.
2. Стереотаксическая хирургия
- Установите стереотаксическая рама, оснащенная держателем насоса, на стабильную стандартную лабораторную скамейку. Отрегулируйте стереоскоп, чтобы четко видеть зону, где будет размещена голова животного. Используйте светодиодный источник света для освещения. Поверните стереоскоп, чтобы получить доступ к держателю насоса, который не нужен для первых шагов операции.
- Установите 10 л Шприц Гамильтон оснащен 33 G сбивается металлической иглой в держатель насоса. Проверьте систему выброса с водой.
- Анестезия от 4 до 5 недель старых C57BL6 мыши с интраперитонеальной инъекции смеси гидрохлорида кетамина и ксилазина (100 мг/кг и 10 мг/кг, соответственно). Приготовьте смесь 1 мл кетамина и 0,5 мл ксилазина в 8,5 мл 0,9% NaCl. Это приведет к 10 мг / мл кетамина и 1 мг / мл ксилазин в смеси. Из этой смеси вводят интраперитонеально 10 л на грамм массы тела животного. Продолжительность анестезии составляет около 1 ч.
- Убедитесь, что животное хорошо обезвлеживается с ног щепотку. Затем вытащите язык, чтобы облегчить дыхание. Бритье черепных волос.
- Вводят под кожу голову 20 л л/ л гидрохлорида лидокаина (4 мг/мл) и ждите 5 минут, чтобы начать действие. Чтобы избежать повреждения глаз из-за сухости, накройте глаза актуальнымо офтальмологическим мазь.
- Чтобы разоблачить череп, создайте прямой разрез на коже головы с помощью небольших хирургических ножниц. Поместите животное в стереотаксической раме, вставляя ухо баров слегка rostral к фактическому уху, чтобы отдохнуть на кости и потяните вниз кожи, которая должна создать хороший доступ к черепу. Затяните на место. Установите кусок носа.
- Поддерживайте тело животного горизонтально на уровне головы с помощью регулировки высоты. Поместите грелку под мышь, чтобы держать его при физиологической температуре.
- Очистите череп, применяя 0,9% NaCl с ватным тампоном, чтобы удалить мягкие ткани из кости. Используйте стереоскоп для остальной части операции.
- Отрегулируйте череп так, чтобы ось брегма-лямбда была ровной, двигаясь вверх или вниз по носу и куску зубов. Это требует итеративных мер брегма и лямба, так как оба будут меняться после корректировки уровня носа.
- Найдите место проведения инъекций на черепе. Отрегулируйте иглу инъекции над местом инъекции в соответствии с задними и медиальными координатами и пометьте череп одноразовой иглой. Переместите иглу для инъекций вверх на 4 см.
- Используйте 0,5 мм заусенец с дрелью, чтобы реализовать краниотомию диаметром 1 мм на отметке, на половине максимальной скорости. Возможное кровотечение с бумажной тканью.
- Опустошить воду, содержащуюся в шприцу Гамильтона для хранения, полностью выбрасывая его с насосом. Только игла все равно будет заполнена водой. Игла промывается между каждым использованием с чистой деионизированной водой. Стерилизация не требуется.
- Возьмите aliquot вируса, который должен быть использован в этот день. Убедитесь, что вирусный раствор больше не заморожен, но охлаждается (близко к 0 градусов по Цельсию, на льду). Только кратко удалить со льда, чтобы получить 700 nL с микропипеттом для небольших объемов. Депозит капли на 5 см х 5 см кусок парафина пленки. Избегайте создания пузырьков. Положите оставшийся вирусный раствор обратно на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем падения должен быть больше, чем желаемый объем инъекций (700 nL для 200 nL вводили). Это даст запас прочности в случае, если часть жидкости теряется во время передачи и позволяет выполнить небольшой тестовый выброс (шаг 2.16) перед началом. - Поместите парафина пленка на вершине краниотомии. Окунитесь в иглу вирусного раствора, не меняя антеро-задней и боковое положение.
- Используйте функцию "снять" насос для заполнения шприца около 500 нл вирусного раствора, утилизированного на парафинапленковой пленке. Сделайте это под визуальным контролем (стереоскоп), смотреть падение исчезают, и убедитесь, что не аспирировать воздух.
- Убедитесь, что шприц был заполнен правильно. Проверьте функционирование системы выброса, съезжая поршень для тестирования извлечь небольшую каплю жидкости 50 нл под визуальным контролем. Протрите каплю.
- Вставьте иглу в мозг на выбранную глубину, повернув ручку, контролируя дорсо-вентральную ось стереотаксического аппарата по часовой стрелке. Нажмите кнопку "Бег" (скорость 15 нл/мин на объем 150 nL вводили). Небольшой объем (50-300 нл, в зависимости от используемого вируса) медленно выбрасывается более 10 мин с автоматическим насосом.
- Подождите 10 минут после инъекции, чтобы избежать утечки из места инъекции. Затем медленно снимите иглу на 3-5 мин, повернув ручку, контролируя оси дорсо-вентральной против часовой стрелки.
- Поверните вертикальную часть стереотаксической рамы со шприцем подальше от животного. Немедленно промойте иглу в чистой дистиллированной воде, заполнив ее несколько раз, чтобы избежать засорения. Храните шприц, наполненный водой.
- Удалите мышь из стереотаксической рамы. Шов кожи с 4-0 полиамидный шов нити. Сделайте три или четыре stiches, связанные с 2-1-1 стандартных хирургических узлов.
- Поместите мышь в отапливаемой клетке, пока она полностью не проснется от анестезии, и обеспечить водой и пропитанной пищи в чашку Петри размещены на земле. Если источник тепла находится ниже клетки, используйте сетку для прокладки, чтобы избежать перегрева.
ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с местными руководящими принципами, одна доза кетопрофена (2-5 мг/кг, подкожно) или бупренорфина (0,05-0,1 мг/кг, подкожно) может быть применена для предотвращения боли. - Когда животное полностью проснется, верните его в домашнюю клетку и следите за его самочувствием, особенно на следующий день после инъекции. Проверьте наличие признаков боли. При наблюдении каких-либо поведенческих изменений животное взвешивается для контроля массы тела.
- В зависимости от используемого вируса время полного выражения может варьироваться. Здесь мы позволяем 3 недели для выражения AAV5. Син.Хронос-ГФП.
3. Решения для острых записей срезов и фиксации
- Подготовьте стоковые растворы 10x концентрированного режущего раствора (125 мМ NaCl, 25 мм сахароза, 2,5 мм КЛ, 25 мМ NaHCO3,1,25 мМ2PO4, и 2,5 мМ D-глюкоза) и искусственный спинномозговой спинномозговой жидкости (ACSF) NaHCO3, 1 мМ2PO4 и 11 мМ D-глюкоза) в чистой деионизированной воде до экспериментов по электрофизиологии. Храните эти решения при 4 градусах по Цельсию в бутылках по 1 л без CaCl2 и MgCl2.
- В день эксперимента разбавьте запасные растворы режущего раствора и ACSF 10x до конечного объема 0,5 л каждый. Агитировать с помощью магнитного мешалки и ожигать при пузырянии с 95%/5% O2/CO2. Добавьте divalent ионы для получения конечной концентрации 0,1 мм CaCl2 и 7 мМ MgCl2 для режущего раствора, и 2 мМ CaCl2 и 2 мМ MgCl2 для ACSF.
- Подготовка калий-глюконат на основе пипетки раствор содержать: 135 мМ K-глюконат, 1,2 мМ KCl, 10 мм HEPES, 0,2 мм EGTA, 2 мМ MgCl2, 4 мМ MgATP, 0,4 мм Tris-GTP, 10 мм Na2-фосфокреатин, и 2,7-7,1 мм биоцититин для пост-хок-клеток морфология откровения. Отрегулируйте рН раствора до 7,3 и осмоляритность до 290 мОсм. Храните 1 мл aliquots при -20 градусах по Цельсию.
- Приготовьте 0,1 М PBS путем разбавления сухих порошковых порошокBB BupH PBS в 500 мл дистиллированной воды, в результате чего 0,1 м фосфат натрия, 0,15 М NaCl, рН 7,2.
- Для приготовления 1 л 4% раствора PFA разбавьте 111 мл 36% жидкой PFA и 90 мл 10-x раствора PBS в дистиллированной воде.
- Приготовьте 30% сахарозный раствор, содержащий 150 г сахарозы в 500 мл 0,1 М ПБС.
4. Подготовка ломтиков мозга
- Подготовьте скамейку с абсорбирующим скамейке бумаги перед перфузией.
- Установите капельницу примерно на 1 м над скамейкой для перфузии, питаемых гравитацией. Прикрепите иглу бабочки 24 G.
- Окружите режущей камерой вибратом со льдом и храните его в морозильной камере.
- Анестезия мыши с интраперитонеальной инъекции той же смеси кетамин-ксилазин используется для хирургии. Оцените стадию анестезии, защипывая нос щипцы щипками. При полном сне вводят 100 л гепарина (5000 U.I./mL) интраперитонеально.
- Закрепите животное клейкой лентой на абсорбируемой бумаге, лежащей на спине. Откройте грудную клетку, разрезая ребра на левой и правой сторонах с небольшими ножницами, от диафрагмы вверх. Поддерживайте грудную клетку открытой с помощью клейкой ленты.
- Зажим нисходящей аорты с hemostat и perfuse через левый желудочек сердца с 4 КС охлажденных и оксигенированных (95%/5% O2/CO2), резка раствора через 24 G бабочка иглы. После 5 с, открыть правое предсердие с небольшими ножницами.
- После 5 мин перфузии, когда органы бескровны, остановить перфузию. Обезглавить животное большими ножницами и погрузить голову в охлажденный и насыщенный кислородом разделочный раствор в чашке Петри.
- Чтобы извлечь мозг, вырежьте кожу с шеи на нос, затем разделите последние позвонки из черепа ножницами. Вручную втягивайте кожу и используйте небольшие ножницы, чтобы открыть череп, разрезая его вдоль средней линии, от каудаля до рострала, вверх, между глазами.
- Тщательно удалите теменной кости и каудальной части лобной кости с изогнутыми или костными щипками. Извлеките мозг с небольшим округлым шпателем, вставив инструмент между мозгом и черепным полом, разделив обонятельную луковицу, зрительный нерв и другие черепные нервы, и мозжечок.
- Аккуратно погрузите мозг в ледяной режущий раствор (4 кВС) в стакан. Расположите мозг на фильтровальной бумаге, чтобы аккуратно высушить корковую поверхность. Клей коры головного мозга вниз к образцу держатель вибратом, с каудальной стороны перед лезвием, для того, чтобы сократить горизонтальные ломтики мозга.
- Заполните режущую камеру ледяным кислородом разрезающим раствором, чтобы мозг полностью погружался. Сделайте разрез на левом полушарии (контралатеральный с привитой стороны), чтобы избежать потенциальной лево-правой двусмысленности на ломтиках.
ВНИМАНИЕ: Всегда окисните раствор и защитите ломтики от воздействия света. - Вырезать 300 мкм толщиной ломтиками с вибратом, со скоростью 0,07 мм / с на 1 мм амплитуда. На этом этапе рекомендуется кратко проверить экспрессию Chronos-GFP в таламусе с помощью флуоресцентного фонарика (440-460 нм) и соответствующих фильтровальных стаканов (500 Нм в длину).
- Изолировать гиппокампа области с кальпельи и передать его в камеру, расположенную в стакане заполнены ванной нагревается (34 кВ), кислородом (95%/5% O2/CO2) ACSF.
- После 15 минут, взять камеру из нагретой водяной бане и пусть ломтики отдыха при комнатной температуре, по-прежнему кислородом, по крайней мере 45 мин до использования.
5. Цельно-клеточная запись патч-зажима
- Аккуратно перенесите ломтик мозга, содержащий гиппокампа комплекса с заказным стеклом передачи пипетки на записи камеры, установленной на вертикальном микроскопе. Передаваемый пипетка изготовлен из укороченной пипетки Pasteur (внутренний диаметр 6,5 мм), прикрепленной к резиновой лампе пипетки. Непрерывно пронизывает запись камеры (3 мл) с 34 C (подогретый) ACSF пузырились с 95%/5% O2/CO2. Установите скорость перистальтический насос до 2-3 мл/мин.
- Кратко изучите экспрессию Chronos-GFP в аксонных терминалах в интересуемом регионе с помощью синего светодиодного освещения (470 нм) и наблюдайте с 4x-целью. Флуоресценция GFP визуализируется с помощью соответствующего фильтра выбросов, с изображением камеры CCD отображается на экране компьютера.
- Поместите на срез якорь, сделанный из U-образной платиновой проволоки с плотно расставленными нейлоновыми струнами («арфа»), на срез, чтобы сохранить его.
- Измените сьюк с целью погружения 63x и отрегулируйте фокус. Проверьте аксоны, выражающие Chronos-GFP, и выберите пирамидальный нейрон для записи патча.
- Перемещение цели вверх.
- Вытяните пипетки с помощью электрода коричневого электрода из боросиликатного стекла. Выдвижной установлен для производства пипетки с примерно 1 мкм в диаметре кончика. Заполните пипетки внутренним раствором на основе K-глюконата.
- Смонтировать пипетку в держателе пипетки на головной ступени. Опустите пипетку в камеру и найдите наконечник под целью. Устойчивость к пипетке должна сосугова от 3 до 8 МЗ. Нанесите легкое положительное давление шприцем, чтобы увидеть конус изсывающего раствора из пипетки и постепенно снизить пипетку и объективно выложиться на поверхность среза.
- Патч клетки в конфигурации напряжения-зажима: подход определены нейрона и деликатно нажмите пипетки наконечник на сома. Положительное давление должно производить ямку на поверхности мембраны. Отпустите давление, чтобы создать гига-ому уплотнительное (сопротивление гига-ома). После герметичной установки установите удерживая напряжение до -65 мВ. Перерыв мембраны с резким пульсом отрицательного давления: это достигается путем применения сильного всасывания к трубке, подключенной к держателю пипетки.
- Запись в режиме зажима цельноклеточного тока реакции нейрона на гиперполяризацию и деполяризацию текущих шагов(рисунок 2A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол будет использоваться для определения активных и пассивных внутренних свойств клетки. Пользовательские написанные процедуры MATLAB используются для автономного анализа10,16. - Запись в текущем или напряжение зажима postsynaptic ответы на цельное поле 475 нм светодиодной стимуляции афферентных волокон, выражающих Chronos. Стимулировать с поездами 10 стимуляций 2 мс продолжительности на 20 Гц(Рисунок 2B, C). Интенсивность света может варьироваться от 0,1-2 мВт.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность света была измерена с помощью цифровой портативной оптической силовой консоли, оснащенной фотодиодным датчиком, расположенным под целью. Реакции опоздания 2-4 мс характерны для моносинаптической связи. - Для изучения характера синаптической передачи между афферентами дальнего действия и записанным нейроном могут использоваться различные фармакологические агенты. Чтобы фармакологически различать прямые, моносинаптические ответы от косвенных ответов через сетевую активацию, добавьте в ACSF 1 МКм TTX и 100 МКм 4-AP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Применение в ванной блокаторов рецепторов глутамата позволяет определить характер высвобожденного нейромедиатора и личность постсинаптических рецепторов. Например, рецепторы глутамата типа АМРА будут заблокированы рецепторами NB-X (10 мкм) и NMDA -1M- apV (100 мкм). В зависимости от цели исследования, протоколы могут быть задуманы для изучения зависимости напряжения синаптической реакции или динамики реакции с течением времени. - Вымойте оригинальным раствором ACSF, чтобы залатать другую клетку, или перенести ломтик, содержащий биоцитин заполненный нейрон в небольшой флакон заполнен ы 4% PFA.
- После ночной фиксации в 4% PFA, мыть ломтик в 0,1 М PBS (2x на 5 мин, 1x на 20 мин).
- Хранить в 30% сахарозы при 4 градусах Цельсия.
6. Откровение биоцитина
- Перенесите фиксированные ломтики, содержащие биоцитин заполненные нейроны на стеклянную лезвие в капле 30% сахарозы и выполнить три цикла замораживания оттаивания: место лезвие на сухой лед утилизируется в пенополистирола поле в течение 1 мин, пока капли сахарозы полностью заморожены, то прижмите лезвие к ладоням, чтобы оттаять.
- Вымойте ломтик 3x в 0,1 М PBS (2x на 5 мин, 1x на 1 ч и 50 мин), осторожно взволнован. Не превышать 2 ч для последней стирки.
- Предварительно инкубировать ломтик на RT на 2 ч в возбужденном буферном растворе, содержащем 2% сухого молока (0,4 г в 20 мл) для насыщения неспецифических участков и 0,5% Triton X100 (0,1 мл в 20 мл) для пермяки мемелинв в 0,1 М ПБС.
- Инкубировать ночь при 4 градусах Цельсия в растворе, содержащем 2% сухого молока, 1% Тритон X100, стрептавидин-Cy5 конъюгировать (1/500), и DAPI (1/1000) в 0.1 M PBS, мягко взволнован.
- Вымойте ломтик три раза в 0,1 M PBS (2x за 5 мин, 1x на 2 ч). Последняя стирка может длиться дольше, до 4 ч, чтобы уменьшить фоновое окрашивание.
- Перед монтажом ломтика используйте микроскоп эпифлюоресценции при 10-кратном увеличении, настроенном для наблюдения за флуоресцентными маркерами Cy5, чтобы определить сторону среза, содержащего отмеченную клетку в камере, заполненной PBS.
- Перенесите ломтик на лезвие, высушите его бумажной тканью и установите с помощью монтажной среды с высоким уровнем сопротивления.
- Используйте микроскоп эпифлюоресценции при 10-кратном увеличении в конфигурации Cy5 и DAPI для изучения местоположения тела клетки, а в конфигурации GFP для наблюдения за отмеченными афферентами, или конфокальным микроскопом с высоким разрешением в 20раз для детального соматического, аксонального и дендритной морфологии (Рисунок 2D, E). Настройки фильтра подробно описаны в таблице материалов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Процедура, представленная здесь, была использована для выражения синего светочувствительного канала (Chronos), слитого с GFP в антеро-дорсальном ядре таламуса (ADN), стереотаксической инъекцией антероградного адено-ассоциированного вируса. Стереотаксические координаты были определены в соответствии с атласом мозга мыши и протестированы путем введения 200 nL флуоресцентного трассирующего флюоро-рубина. После инъекции животное было принесено в жертву через 10 минут, а мозг был извлечен и зациклен на ночь. Корональные участки мозга были подготовлены для изучения места инъекции, который был правильно помещен в и ограничивается ADN(Рисунок 1A,B).
Для того, чтобы выразить Chronos-GFP в нейронах ADN, мы ввели 300 nL AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH. Через три недели после инъекции были подготовлены острые горизонтальные срезы мозга. Рисунок 1 C показывает срез мозга, содержащий таламическом месте инъекции в правом полушарии, с выражением GFP зеленым цветом. При осмотре с эпи-флуоресценции микроскоп оснащен 4x цели, GFP помечены таламичные аксоны были отмечены в presubiculum (Рисунок 1C,D). Было отмечено, что таламичные аксоны плотно иннервировали поверхностные слои I и III пресубикуля(рисунок 1D).
Активность пресубикулярных нейронов в слое III была зафиксирована в целоклеточной патч-зажимной конфигурации. Гиперполяризация и деполяризация текущих шагов были применены при записи мембраны потенциальных вариаций(рисунок 2A). Данные хранились на компьютере для последующего автономного анализа активных и пассивных мембранных свойств. Пресубикулярный слой III основных клеток, как правило, обладал отрицательным потенциалом отдыха близко к -63 мВ и требуетдеполяризации текущих инъекций, чтобы управлять мембранным потенциалом для стрельбы порога. Полное описание их внутренних свойств было опубликовано11.
Стимулирование ADN аксон терминалов, выражающих Chronos-GFP вызвал возбуждающие пост-синаптические потенциалы (EPSPs) в пресубикулярном слое III основных ячеек в текущем режиме зажима (Рисунок 2B). В зависимости от интенсивности света, EPSPs может достичь потенциального порога действия. Postsynaptic ответы были также отмечены в режиме напряжения-зажима, как возбуждательные пост-синаптические токи (EPSCs) были вызваны(Рисунок 2C). Натсев EPSCs вызванных светом стимуляции были короткими (средний, 1,4 мс10), что свидетельствует о прямом синаптический контакт между таламических аксонов и слой III пресубикулярных нейронов. Сохранение EPSCs в состоянии TTX-4AP подтвердило эту моносинапическую активацию. Примечательно, что эти клетки надежно реагировали на световые стимуляции афферентных аксонов с помощью регулярной схемы стрельбы.
Рисунок 1 : Стереотаксическая инъекция в антеродорсаль таламическом ядре (ADN). (A) Схематическое представление инъекции. (B) Подтверждение места инъекции флюоро-рубином в корональной секции. Врез указывает на антеро-дорсальный уровень и расстояние от брегмы. (C) Горизонтальный ломтик после инъекции AAV-Chronos-GFP в таламусе. Следует отметить аксональные проекции на ипсилатеральный пресубикул. Разрез на левой стороне среза (указано черным треугольником) означает контралатеральтольное полушарие. (B, C) Шкала бар 1 мм. (D) Увеличенный вид всета в (C) с aDN проекции пресубикулярных поверхностных слоев. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Пресубикулярный слой III нейрон: внутренние свойства, ответ на световую стимуляцию таламических афферентов, и пост-специальное откровение клеточной морфологии. (A) Огненная узор и мембранные потенциальные вариации нейрона слоя III для гиперполяризации и деполяризации текущих шагов. (B, C) Ответы слоя III нейрон 2 мс световых стимуляций (синие полосы) таламичных аксонов, зарегистрированных в режиме(B)ток-зажима и(C ) напряжения-зажима режимов. (D, E) Слой III пирамидальных нейронов (белый, указано заполнены желтый треугольник) окружен таламические аксоны, выражающие Chronos-GFP (зеленый) в пресубикулярных поверхностных слоев с DAPI окрашивания (синий) в горизонтальном ломтике изображения с эпифлюоресценции микроскопом ( D, шкала бар 100 мкм) и конфокальный микроскоп при высоком увеличении (E, шкала бар 50 мкм). Ячейка в (A) обозначена заполненными желтыми треугольниками. Второй, частично заполненный нейрон присутствует в этом ломтике, указанном пустыми желтыми треугольниками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo вирусная инъекция для выражения светочувствительных опсинов в определенной области мозга является методом выбора для оптогенетического анализа дальнего функционального подключения10,11,17,18. Стереотаксические инъекции дают возможность точно ориентироваться на определенную область мозга. Коэкспрессия опсина с флуоресцентным репортёрным удобно позволяет оценить успешное выражение и подтверждение точного места инъекции. Использование серотипа AAV 2/5 обычно ограничивает экспрессию целевой областью мозга. Таким образом, трансфицируется ограниченная популяция нейронов, выражающая светочувствительные ионные каналы в их клеточном теле и аксонных терминалах. В последующих экспериментах ex vivo slice, можно стимулировать эти аксонные терминалы световыми импульсами непосредственно в их целевой области, читая успешную синаптической передачи через патч-зажим записи пост-синапитически связанного нейрона. Вышеупомянутый протокол является надежным и удобным, и некоторые дополнительные заметки могут помочь производительности успешных экспериментов.
Могут использоваться различные виды анестезии. Описана интраперитонеальная инъекция комбинации кетамина-ксилазина в качестве простой в использовании, краткосрочной анестезии с удобной обезболиванием19. Глубина и продолжительность анестезии могут в некоторой степени варьироваться. В некоторых случаях может возникнуть необходимость вводить еще полдозы кетамина-ксилазина во время протокола. Изофлюранская анестезия может быть хорошей альтернативой, чтобы вызвать более быстро и лучше контролировать глубину анестезии. Координаты мест инъекций могут быть определены с помощью атласа мозга мыши. На практике координаты должны быть проверены и скорректированы, если это необходимо.
Чистые условия труда также являются ключевыми. Рекомендуется использовать одноразовые защитные снасти, в том числе перчатки, крышку для толпы и лабораторное пальто. При позиционировании животного в стереотаксической раме особое внимание следует уделить комфорту животного, что значительно повысит эффективность анестезии. Тело животного должно быть выровнено с головой и шеей. Наиболее важным шагом в позиционировании животного и до краниотомии является регулировка оси брегма-лямбда. Особенно при ориентации глубоких структур мозга, даже небольшое отклонение будет генерировать ошибки при снижении инъекционной иглы в мозг. В некоторых случаях можно намеренно выбрать и рассчитать косую траекторию иглы.
Объем инъекций является определяющим фактором для получения точно локализованного экспрессии опсина. Небольшой объем идеально подходит для привилегий плотно ограниченной зоны трансфекции. Более высокие объемы могут быть полезны для покрытия полной части большой целевой площади. Если большая площадь должна быть покрыта, например, перегородка18, это может быть полезно разместить несколько небольших инъекций с рядом соседних координат. Интервал до ex vivo электрофизиологической записи также имеет решающее значение. Минимальное время для полного выражения необходимо. Хотя 3 недели, как представляется, оптимальная задержка для этих экспериментов11, необходимая задержка может варьироваться в зависимости от вируса, его серотипа, и расстояние до постсинаптической области мозга.
Описанный здесь подход еще более мощный в сочетании с инъекциями трансгенных животных. Предыдущая работа использовала различные линии мыши для подтипов ГАМК нейронов, для того, чтобы конкретно целевой либо П.В. или SST-выражения interneurons для патч-зажим записи20. Одновременнодвойная запись соседних PV и пирамидальных нейронов или SST и пирамидальных нейронов затем позволяет сравнение сильных сторон дальнего входов между двумя типаминейронов 11. Это дает результаты, которые стандартизированы по отношению к одному типу нейронов. Эта стандартизация особенно важна в тех случаях, когда уровни экспрессии опсины различаются между разными животными или различными ломтиками.
Здоровье нарезанного фрагмента имеет важное значение для высококачественных записей патч-зажима. Постоянная оксигенация ломтиков имеет решающее значение, и медленная скорость резки значительно улучшает качество поверхности ломтика. Толщина ломтика 300 мкм сохраняет, в некоторой степени, целостность микросхем в горизонтальных предсубикулярных секциях, включая пирамидальные нейроны с их клеточными телами, дендритные и локальные аксональные последствия, и местные синаптические связи. Тип светозакрытых каналов, выбранных для индуцирования активации афферентных волокон, будет значительно влиять на параметры стимуляции (длительность, интенсивность света). Chronos является синим светочувствительным channelrhodopsin, и широкий спектр просветительных длин волн может быть использован для активации (пиковая чувствительность около 500 нм, даже при минимальной интенсивности света 0,05 мВт/мм2, также активирована на 405 нм, и до 530 нм21 ). Кроме того, Chronos обладает быстрыми свойствами кинетики по сравнению с классическим ChR2, что позволяет высокочастотные стимуляции и надежную активацию дальних проекций22. В сочетании с выражением Chrimson, красно-сдвинутый вариант опсина, независимое оптическое возбуждение различных нейронных популяций становится возможным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.
Acknowledgments
Мы благодарим Бертрана Матона, Мери Нассара, Ли-Вэнь Хуанга и Джина Симоннет за помощь в разработке предыдущих версий протокола стереотаксических инъекций и Марин Мануэль и Патрис аджегузо за техническую помощь. Эта работа была поддержана Французским министерством образования и исследований (L. R., L. S.), Национальным центром Этюдес Spatiales (M. B.), и Национальным agence de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (Д. Ф.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN - 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 - 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), New York, N.Y. 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, Pt 17 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic. New York. (2013).
- Huang, L. -W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
