Summary
يصف هذا البروتوكول مجموعة من الطرق لتحديد الاتصال الوظيفي الخاص من نوع الخلية من المدخلات طويلة المدى من مناطق الدماغ البعيدة باستخدام التحفيز البصري في شرائح الدماغ في الجسم الحي السابق.
Abstract
معرفة من نوع الخلية اتصال متشابك محددة هو شرط مسبق حاسم لفهم الدوائر العصبية على نطاق الدماغ. التحقيق الوظيفي للاتصالات طويلة المدى يتطلب تسجيلات مستهدفة من الخلايا العصبية واحدة جنبا إلى جنب مع التحفيز المحدد للمدخلات البعيدة المحددة. وغالبا ً ما يكون من الصعب تحقيق ذلك باستخدام تقنيات التحفيز التقليدية والكهربائية، لأن المحاور من مناطق الدماغ المتقاربة في المنبع قد تختلط في المنطقة المستهدفة. ويتيح استهداف منطقة دماغية محددة لتعبير قنوات أيون حساسة للضوء بتسمع مجسم ة من قبل الفيروس التحفيز الانتقائي للمحاور الناشئة من تلك المنطقة بالضوء. يمكن استخدام الحقن المجسمة داخل الدماغ في هياكل محددة جيدا، مثل النوى الثالية الأمامية، بالإضافة إلى المناطق الأخرى تحت القشرية أو القشرية في جميع أنحاء الدماغ.
وصف هنا هو مجموعة من التقنيات لحقن مجسمة دقيقة من ناقلات الفيروسية التي تعبر عن channelrhodopsin في الدماغ الماوس، تليها التحفيز الضوئي للمحطات axon في إعداد شريحة الدماغ. وهذه البروتوكولات بسيطة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع. في تركيبة مع كامل الخلية التصحيح تسجيل المشبك من الخلايا العصبية المتصلة postsynaptically، والتحفيز الضوئي للمحاور يسمح الكشف عن الاتصالات متشابك وظيفية، والتوصيف الدوائي، وتقييم قوتها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام ملء السيتين من الخلايا العصبية المسجلة لتحديد مورفولوجيما ما بعد مخصص للخلية العصبية postynaptic.
Introduction
تعريف الاتصال بين مناطق الدماغ ضروري لفهم الدوائر العصبية. تسمح أساليب التتبع التشريحي الكلاسيكية بإنشاء اتصال أقاليمي، وتساعد دراسات الآفات على فهم التنظيم الهرمي لتدفق المعلومات. على سبيل المثال، دوائر الدماغ للاتجاه المكاني واتجاه الرأس الإشارات تنطوي على تدفق الاتجاه من المعلومات من المهاد إلى presubiculum. وقد ثبت هذا من خلال دراسات الآفات من النوى الثالية الصدغية الصدغية (ADN) التي تتحلل إشارة اتجاه الرأس في presubiculum الظهرية المصب، فضلا عن إشارة خلية الشبكة parahippocampal1،2.
الاتصال الوظيفي بين مناطق الدماغ هو أكثر صعوبة في إنشاء على مستوى الخلوية ودون الخلوية. في الحصين، يسمح التشريح المنظم للغاية بالتحقيق في اتصالات متشابكة خاصة بالمسار باستخدام المحاكاة الكهربائية في إعداد الشريحة. يمكن استخدام أقطاب التحفيز الموضوعة في طبقة الراديوتوم من CA1 لتحفيز المدخلات الجانبية شافر على وجه التحديد من CA33. تحفيز الأقطاب الكهربائية وضعت في الطبقة lacunosum الجزيئية من CA1 سوف تنشيط مدخلات مسار مثقب إلى CA14،5. التحفيز الكهربائي ينشط الإفراج العصبي من محطات axon; ومع ذلك، فإنه ينشط الخلايا العصبية مع سوماتا بالقرب من موقع التحفيز، فضلا عن محاور المرور. ولذلك فهي ذات استخدام محدود لدراسة الأوفيرينتس من مناطق الدماغ المحددة عندما تختلط الألياف من مناطق منشأ مختلفة في الهيكل المستهدف، كما هو الحال عادة في القشرة الجديدة.
ويمكن أيضا تحفيز الخلايا العصبية مع الضوء. وتشمل الطرق البصرية التنشيط الضوئي للغلوتامات القفص، والتي يمكن الجمع بينها وبين واحد أو اثنين من المسح الضوئي بالليزر الفوتون. يمكن تحفيز مواقع متعددة متباعدة بشكل وثيق بالتتابع، مع عدم وجود ضرر ميكانيكي للأنسجة6. وقد استخدم هذا بنجاح لرسم خريطة مستقبلات متشابك وكذلك تنشيط الخلايا العصبية الفردية7. في حين يمكن استخدام الغلوتامات في تحليل الدوائر المحلية، فإنه لا يسمح لتنشيط محددة من المدخلات طويلة المدى.
طريقة الاختيار للتحقيق في الاتصال بعيد المدى في الدوائر العصبية هو استخدام التعبير channelrhodopsin بوساطة الفيروس. باستخدام الحقن المجسمة في الجسم الحي كما هو موضح هنا، يمكن استهداف التعبير عن قنوات أيون ذات بوابات خفيفة ويقتصر مكانيا على منطقة الدماغ المطلوبة. وبهذه الطريقة، تكون القنوات فعالة لرسم خرائط الاتصال المحفز أو المثبط من منطقة إلى هدفها. يمكن تحفيز محطات المحاور المتحولة مع الضوء في إعداد شريحة الدماغ، وتسجيلات التصحيح المشبك كقراءة تسمح بفحص وظائف ونقاط القوة من مكونات دائرة محددة في الدماغ8. النهج البصري جنبا إلى جنب مع حقن مجسمة من الفيروس يقدم خصوصية غير مسبوقة والسيطرة الوراثية9. تحفيز مع الضوء بالإضافة إلى ذلك يسمح لكل من الدقة الزمنية والمكانية العالية10،11.
وpresubiculum هو هيكل القشرية من ست طبقات في الانتقال من الحصين وتشكيل شبه فرس النهر12،13. هو يستلم مساهمة مهمّة متشابكة من ال [أدن]11 غير أنّ أيضا من عدّة أخرى [كورتك] ومناطق تحتالقشريّة 14. وهكذا، فإن التحفيز الانتقائي لمحطات المحاور الثلاميك داخل شريحة ما قبل الخضوع غير ممكن مع التحفيز الكهربائي ولا الغلوتامات المنقطع. الموصوفة في هذا البروتوكول هي طرق لتحديد الاتصال الوظيفي بين مناطق الدماغ (ADN وpresubiculum) باستخدام حقن مجسمة دقيقة من النواقل الفيروسية التي تعبر عن قنوات ذات بوابات خفيفة. كما وصف هو التحفيز الضوئي للمحطات axons من إسقاط الخلايا العصبية في منطقتهم المستهدفة، إلى جانب تسجيلات التصحيح المشبك الخلية الكاملة من الخلايا العصبية ما بعد متشابك في إعداد شريحة الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لتوجيه مجلس الجماعة الأوروبية (2010/63/EU) ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في جامعة باريس ديكارت. يجب على المُجرِّب الحصول على تفويض لإجراء الامتثال للوائح المحلية.
1- تخطيط التجربة
- حدد منطقة الدماغ التي سيتم استهدافها. تحديد إحداثيات stereotaxic من موقع الحقن بمساعدة أطلس الدماغ الماوس15. بالنسبة للنواة الثالية اللامعية اللاإتية اليمنى (ADN)، تكون الإحداثيات هي: -0.82 الخلفية، 0.75 الجانبي، -3.2 عمق (مم) نسبة إلى بريجما. قد تحتاج الإحداثيات إلى تعديل للالحيوانات من مختلف العمر أو الجنس أو الإجهاد.
- تأكيد وتوثيق دقة الإحداثيات عن طريق حقن التتبع الفلورسنت (150 إلى 300 نمل) يمكن ملاحظتها مع مجهر الفلورة في تجربة تجريبية(الشكل 1A، B).
- تحديد نوع الفيروس الذي سيتم حقنه. تخزين الفيروس في 6 ميكرولتر aliquots في -80 درجة مئوية على النحو الموصى به من قبل المنتج. جلب 1 aliquot وضعت على الجليد إلى غرفة الجراحة، لحقن واحد إلى ستة الحيوانات في يوم معين. وقد تعتمد لوائح السلامة الأحيائية لاستخدام المركبات المضادة للمركبات على البلد أو المؤسسة، وقد يلزم استخدام غطاء محرك محرك PSM 2.
ملاحظة: هنا، نستخدم AAV2/5 serotype التعبير عن كرونوس، وهو متغير channelrhodospin-2 سريع، تنصهر إلى بروتين الفلورسنت الأخضر تحت سيطرة المروج Synapsin: AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.
2. جراحة المجسمة
- تثبيت إطار مجسم مجهز بحامل مضخة على مقاعد البدلاء مختبر القياسية مستقرة. ضبط منظار ستيريو بحيث نرى بوضوح المنطقة التي سيتم وضع رأس الحيوان. استخدم مصدر ضوء LED للإضاءة. تدوير منظار مجسم بعيدا للوصول إلى حامل المضخة، والتي ليست هناك حاجة للخطوات الأولى من الجراحة.
- تثبيت حقنة هاميلتون 10 درجة مئوية مجهزة إبرة معدنية 33 G مجدول في حامل المضخة. اختبار نظام الإخراج بالماء.
- التخدير 4-إلى 5 أسابيع القديمة C57BL6 الماوس مع حقن داخل اقابية من مزيج من هيدروكلوريد الكيتامين وxylazine (100 ملغ / كغ و 10 ملغ / كغ، على التوالي). إعداد مزيج من 1 مل من الكيتامين و 0.5 مل من إكسيليزين في 8.5 مل من 0.9٪ NaCl. وهذا سيؤدي إلى 10 ملغ / مل الكيتامين و 1 ملغ / مل إكسيليزين في هذا المزيج. من هذا المزيج، حقن داخل peritoneally 10 درجة مئوية لكل غرام من وزن جسم الحيوان. مدة التخدير حوالي 1 ساعة.
- تحقق من أن الحيوان هو التخدير جيدا مع قرصة اصبع القدم. ثم، سحب اللسان لتسهيل التنفس. حلاقة الشعر القحفي.
- حقن 20 ميكرولتر من هيدروكلوريد ليدوكائين (4 ملغ /مل؛ 2 ملغ/كغ) تحت جلد الرأس للتخدير الموضعي والانتظار 5 دقائق ليبدأ التأثير. لتجنب تلف العين بسبب الجفاف ، قم بتغطية العينين بمرهم عيون موضعي.
- لفضح الجمجمة، وخلق قطع مستقيم في فروة الرأس مع مقص جراحة صغيرة. وضع الحيوان في إطار مجسم، وإدراج قضبان الأذن rostral قليلا إلى الأذن الفعلية للراحة على العظام وسحب الجلد، والتي ينبغي أن تخلق وصول جيد إلى الجمجمة. تشديد في مكانها. قم بتثبيت قطعة الأنف.
- الحفاظ على جسم الحيوان أفقيا على مستوى الرأس باستخدام دعم تعديل الارتفاع. وضع وسادة التدفئة تحت الماوس للحفاظ عليه في درجة الحرارة الفسيولوجية.
- تنظيف الجمجمة عن طريق تطبيق 0.9٪ NaCl مع مسحة القطن لإزالة الأنسجة الرخوة من العظام. استخدم منظار مجسم لبقية الجراحة.
- ضبط الجمجمة بحيث محور بريغا لامدا هو مستوى، تتحرك صعودا أو أسفل الأنف والأسنان قطعة. وهذا يتطلب تدابير متكررة من بريغا ولامبا، كما أن كلا سوف تتغير بعد تعديل مستوى الأنف.
- العثور على موقع الحقن على الجمجمة. ضبط إبرة الحقن فوق موقع الحقن وفقا لإحداثيات الخلفية والوسيطة ووضع علامة على الجمجمة مع إبرة المتاح. نقل إبرة الحقن صعودا من قبل 4 سم.
- استخدام لدغ 0.5 ملم مع الحفر لتحقيق استئصال الجمجمة قطرها 1 ملم على العلامة، في نصف السرعة القصوى. مسحة نزيف في نهاية المطاف مع الأنسجة الورقية.
- إفراغ المياه الواردة في حقنة هاملتون للتخزين عن طريق إخراج تماما مع المضخة. فقط الإبرة ستظل مليئة بالماء يتم غسل الإبرة بين كل استخدام مع الماء منزوع الأيونات النقي. التعقيم غير مطلوب.
- خذ aliquot من الفيروس الذي سيتم استخدامه لهذا اليوم. تأكد من أن الحل الفيروسي لم يعد مجمدا ً ولكنه ظل مبرداً (بالقرب من 0 درجة مئوية، على الجليد). فقط لفترة وجيزة إزالة من الجليد للحصول على 700 nL مع micropipette لأحجام صغيرة. إيداع قطرة على قطعة 5 سم × 5 سم من فيلم البارافين. تجنب إنشاء فقاعات. ضع الحل الفيروسي المتبقي على الجليد.
ملاحظة: يجب أن يكون حجم الانخفاض أكبر من حجم الحقن المطلوب (700 nL ل200 نل حقن). وهذا يعطي هامش أمان في حالة فقدان بعض السائل أثناء النقل ويسمح بإجراء طرد اختبار صغير (الخطوة 2.16) قبل المتابعة. - ضع فيلم البارافين فوق استئصال الجمجمة. يغرق الإبرة في قطرة من الحل الفيروسي دون تغيير موقف الأنتيرو الخلفي والجانبي.
- استخدام وظيفة "سحب" من المضخة لملء الحقنة مع حوالي 500 مل من محلول فيروسي التخلص منها على فيلم البارافين. القيام بذلك تحت السيطرة البصرية (منظار مجسم)، ومشاهدة انخفاض تختفي، وتأكد من عدم استنشاق الهواء.
- تأكد من ملء الحقنة بشكل صحيح. تحقق من أداء نظام الإخراج عن طريق القيادة إلى أسفل الغطاس لاختبار إخراج قطرة صغيرة من السائل من 50 نمل تحت السيطرة البصرية. امسح القطرة
- أدخل الإبرة في الدماغ إلى العمق المختار، عن طريق تحويل مقبض الباب الذي يتحكم في المحور الأورفي البطني لجهاز مجسم في اتجاه عقارب الساعة. اضغط على زر "تشغيل" (سرعة 15 nL/min لكل حجم من 150 nL حقن). يتم إخراج حجم صغير (50-300 nL، اعتمادا على الفيروس المستخدم) ببطء أكثر من 10 دقيقة مع مضخة أوتوماتيكية.
- انتظر 10 دقائق بعد الحقن لتجنب التسرب من موقع الحقن. ثم، إزالة ببطء الإبرة أكثر من 3-5 دقيقة عن طريق تحويل مقبض الباب السيطرة على محور الظهر البطني عكس اتجاه عقارب الساعة.
- تدوير الجزء الرأسي من الإطار stereotaxic مع حقنة بعيدا عن الحيوان. على الفور غسل الإبرة في المياه المقطرة نظيفة عن طريق ملء إفراغ ذلك عدة مرات، من أجل تجنب انسداد. تخزين الحقنة مليئة بالماء.
- إزالة الماوس من الإطار stereotaxic. خياطة الجلد مع 4-0 خيوط خياطة البولي أميد. جعل ثلاثة أو أربعة stiches، وتعادل مع 2-1-1 عقدة الجراحية القياسية.
- ضع الفأر في قفص ساخن حتى يستيقظ تماما من التخدير، وتوفير الماء والأغذية غارقة في طبق بيتري وضعت على الأرض. إذا كان مصدر الحرارة تحت القفص، استخدم شبكة فاصلة لتجنب ارتفاع درجة الحرارة.
ملاحظة: وفقاللمبادئ التوجيهية المحلية، يمكن استخدام جرعة واحدة من كيتوبروفين (2-5 ملغم/كغم، تحت الجلد) أو البوبرينورفين (0.05-0.1 ملغم/كغم، تحت الجلد) لمنع الألم. - عندما يكون الحيوان مستيقظا تماما، إعادته إلى قفصمنزله ومراقبة رفاهه، وخاصة في اليوم التالي للحقن. تحقق من علامات الألم. إذا لوحظ أي تعديل سلوكي، يتم وزن الحيوان لمراقبة وزن الجسم.
- اعتماداً على الفيروس المستخدم، قد يختلف وقت التعبير الكامل. هنا، نسمح 3 أسابيع للتعبير عن AAV5. Syn.Chronos-GFP.
3. حلول لتسجيلات شريحة حادة وتثبيت
- إعداد حلول الأسهم من 10X حلول القطع المركزة (125 مل NaCl، 25 مليون متر السكروز، 2.5 مليون متر قدم مربع، 25 مل NaHCO3،1.25 mM NaH2PO4، و 2.5 mM D-الجلوكوز) والسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF) الحل (124 M NaCl، 2.5 مليون متر كل NaHCO3,1 mM NaH2PO4, and 11 m D-الجلوكوز) في المياه الأيونات النقية قبل تجارب الفيزيولوجيا الكهربائية. تخزين هذه الحلول في 4 درجة مئوية في 1 زجاجات لتر دون CaCl2 وMgCl2.
- في يوم التجربة، تمييع حلول الأسهم من حل القطع وACSF 10X إلى حجم نهائي من 0.5 L لكل منهما. إثارة مع النمام المغناطيسي وأكسجين من قبل محتدما مع 95٪ / 5 ٪ س2/ CO2. إضافة أيونات ثنائية التكافؤ للحصول على تركيزات نهائية من 0.1 مليون CaCl2 و 7 M MgCl2 لحل القطع، و 2 مل CaCl2 و 2 M MMgCl2 لACSF.
- إعداد محلول ماصة البوتاسيوم-غلوكونات القائم على تحتوي على: 135 mM K-غلوكونات، 1.2 مل ككل، 10 مل HEPES، 0.2 mM EGTA، 2 MMMgCl2،4 MM MgATP، 0.4 mM Tris-GTP، 10 mM Na 2-phosphocreatine، و 2.7-7.1 mM biocytin لمرحلة ما بعد الخلية الوحي مورفولوجيا. ضبط الوظيفة الهيدروجينية للحل إلى 7.3 وosmolarity إلى 290 منوم. تخزين 1 مل aliquots في -20 درجة مئوية.
- إعداد 0.1 M PBS عن طريق تخفيف BupH PBS الجافة مزيج أكياس مسحوق في 500 مل من الماء المقطر، مما أدى إلى 0.1 M فوسفات الصوديوم، 0.15 M NaCl، درجة الحموضة 7.2.
- لإعداد 1 لتر من محلول PFA 4٪، تمييع 111 مل من 36٪ PFA السائل و 90 مل من محلول PBS 10X في الماء المقطر.
- إعداد 30٪ محلول السكروز الذي يحتوي على 150 غرام من السكروز في 500 مل من 0.1 M PBS.
4. إعداد شرائح الدماغ
- إعداد مساحة مقاعد البدلاء مع ورقة مقاعد البدلاء ماصة قبل التسريب.
- تثبيت بالتنقيط حوالي 1 متر فوق مقاعد البدلاء لالجاذبية تغذية التسريب. إرفاق إبرة فراشة 24 G.
- تحيط غرفة القطع من الاهتزاز مع الجليد وتخزينها في الثلاجة.
- التخدير الماوس مع حقن داخل اقاب من نفس خليط الكيتامين-xylazine المستخدمة في الجراحة. تقييم مرحلة التخدير عن طريق الضغط على اصبع القدم مع ملقط. عندما نائما تماما, حقن 100 € L من الهيبارين (5000 U.I./mL) داخل الجنة.
- إصلاح الحيوان مع شريط لاصق على ورقة ماصة، والكذب على ظهره. فتح القفص الصدري عن طريق قطع الأضلاع على الجانبين الأيسر والأيمن مع مقص صغير، من الحجاب الحاجز صعودا. الحفاظ على القفص الصدري مفتوحة مع مساعدة من شريط لاصق.
- المشبك الأبهر تنازلي مع hemostat وperfuse عبر البطين الأيسر من القلب مع 4 درجة مئوية تبريد وأكسجين (95٪ / 5٪ O2/ CO2)،وقطع الحل من خلال إبرة فراشة 24 G. بعد 5 s، فتح الأذين الأيمن مع مقص صغير.
- بعد 5 دقائق من التسريب ، عندما تكون الأعضاء بلا دم ، توقف التسريب. قطع رأس الحيوان مع مقص كبير وimmerge الرأس في 4 درجة مئوية تبريد والأكسجين حل القطع في طبق بيتري.
- لاستخراج الدماغ، وقطع الجلد من الرقبة إلى الأنف، ثم قسم الفقرات الأخيرة من الجمجمة مع مقص. سحب الجلد يدويا واستخدام مقص صغير لفتح الجمجمة، وقطع على طول خط الوسط، من caudal إلى rostral، صعودا إلى بين العينين.
- قم بإزالة العظام الجدارية والجزء الصدغي من العظام الأمامية بعناية باستخدام ملقط منحني أو عظم. استخراج الدماغ مع ملعقة مستديرة صغيرة عن طريق إدراج الصك بين الدماغ وأرضية الجمجمة، وقسمة لمبة الشم، والأعصاب البصرية وغيرها من الأعصاب القحفية، والمخيخ.
- غمر الدماغ بلطف في محلول قطع الجليد الباردة (4 درجة مئوية) في كوب. وضع الدماغ على ورقة فلتر لتجفيف بلطف سطح القشرية. الغراء قشرة الدماغ وصولا الى حامل عينة من الاهتزاز، مع الجانب الكظرية التي تواجه النصل، من أجل قطع شرائح الدماغ الأفقي.
- ملء غرفة القطع مع الجليد الباردة المؤكسدة حل القطع حتى يتم دمج الدماغ تماما. جعل قطع على نصف الكرة الأيسر (المضادة إلى الجانب حقن) لتجنب الغموض المحتمل ة اليسار واليمين على شرائح.
تحذير: دائما أكسجين الحل وحماية شرائح من التعرض للضوء. - قطع شرائح سميكة 300 م مع الاهتزاز، بسرعة 0.07 مم / ثانية في سعة 1 ملم. في هذه المرحلة، فمن المستحسن للتحقق لفترة وجيزة التعبير كرونوس-GFP في المهاد باستخدام مصباح يدوي الفلورسنت (440-460 نانومتر) والنظارات مرشح المقابلة (500 نانومتر تمريرة طويلة).
- عزل منطقة فرس النهر مع مشرط ونقله إلى غرفة المتمركزة في كوب مليئة حمام دافئ (34 درجة مئوية)، أكسجين (95٪ / 5٪ O2/ CO2)ACSF.
- بعد 15 دقيقة، تأخذ الغرفة من حمام الماء الساخن والسماح للشرائح بقية في درجة حرارة الغرفة، لا يزال الأوكسجين لمدة 45 دقيقة على الأقل حتى الاستخدام.
5. كامل الخلية التصحيح المشبك تسجيل
- نقل بلطف شريحة الدماغ التي تحتوي على مجمع فرس النهر مع ماصة نقل الزجاج حسب الطلب إلى غرفة التسجيل التي شنت على المجهر تستقيم. يتم إجراء ماصة نقل من ماصة باستور تقصير (القطر الداخلي 6.5 ملم) تعلق على لمبة ماصة المطاط. يتغلغل باستمرار في غرفة التسجيل (3 مل) مع 34 درجة مئوية (دافئ) ACSF فقاعة مع 95٪ / 5٪ س2/ CO2. تعيين سرعة المضخة التمعجية إلى 2-3 مل / دقيقة.
- فحص بإيجاز كرونوس-GFP التعبير في محطات axon في المنطقة ذات الأهمية مع الإضاءة LED الزرقاء (470 نانومتر) ومراقبة مع هدف 4X. يتم تصور الفلورة GFP من خلال مرشح الانبعاثات المناسبة، مع صورة كاميرا CCD المعروضة على شاشة الكمبيوتر.
- ضع مرساة شريحة مصنوعة من سلك البلاتين على شكل حرف U مع سلاسل النايلون متباعدة بإحكام ("القيثارة") على شريحة للحفاظ عليه.
- تغيير إلى هدف الغمر 63x وضبط التركيز. تحقق من وجود محاور تعبر عن كرونوس-GFP واختيار الخلايا العصبية الهرمية لتسجيل التصحيح.
- نقل الهدف إلى أعلى.
- سحب الماصات باستخدام البني المشتعلة الكهربائية الساحبة من الزجاج البورسليكات. يتم تعيين الساحبة لإنتاج الماصات مع ما يقرب من 1 ميكرومتر في قطر طرف. ملء الماصات مع الحل الداخلي القائم على K-غلوكونات.
- جبل ماصة في حامل الماصات على مرحلة الرأس. خفض ماصة في الغرفة والعثور على غيض تحت الهدف. يجب أن تكون مقاومة الماصات بين 3-8 MΩ. تطبيق ضغط إيجابي خفيف مع حقنة وذلك لرؤية مخروط من حل تدفق من الماصة وخفض تدريجيا ماصة والهدف على سطح الشريحة.
- تصحيح الخلية في تكوين الجهد المشبك: نهج الخلايا العصبية المحددة واضغط بدقة على طرف ماصة على سوما. يجب أن ينتج الضغط الإيجابي ديمبل على سطح الغشاء. الافراج عن الضغط لإنشاء ختم جيجا أوم (> 1 GΩ المقاومة). مرة واحدة مختومة، تعيين الجهد عقد إلى -65 مل فولت. كسر الغشاء مع نبض حاد من الضغط السلبي: ويتحقق هذا عن طريق تطبيق شفط قوي على أنبوب متصل بحامل الماصات.
- سجل في كامل الخلية وضع المشبك الحالي استجابات الخلايا العصبية لفرط الاستقطاب وإزالة الاستقطاب الخطوات الحالية(الشكل 2A).
ملاحظة: سيتم استخدام هذا البروتوكول لتحديد الخصائص المضمنة النشطة والسلبية للخلية. يتم استخدام إجراءات MATLAB المكتوبة حسب الطلب للتحليل خارج الخط10،16. - سجل في الحالية- أو الجهد المشبك الردود postsynaptic إلى حقل كامل 475 نانومتر LED التحفيز من ألياف afferent التعبير عن كرونوس. تحفيز مع القطارات من 10 التحفيز من 2 مللي ثانية مدة في 20 هرتز(الشكل 2B, C). قد تختلف شدة الضوء من 0.1 إلى 2 م.م.م.
ملاحظة: تم قياس شدة الضوء مع وحدة تحكم الطاقة الضوئية المحمولة الرقمية المجهزة بمستشعر الصمام الضوئي، المتمركزة تحت الهدف. الاستجابة latencies من 2-4 مللي ثانية هي سمة لاتصال أحادي ة. - للتحقيق في طبيعة انتقال متشابك بين afferents طويلة المدى والخلايا العصبية المسجلة، يمكن استخدام عوامل الدوائية المختلفة. للتمييز الدوائي بين الاستجابات المباشرة الأحادية المرادفة من الاستجابات غير المباشرة عن طريق تنشيط الشبكة، أضف 1 μM TTX و100 μM 4-AP إلى ACSF.
ملاحظة: تطبيق حمام حاصرات مستقبلات الغلوتامات يسمح لتحديد طبيعة الناقل العصبي الذي صدر وهوية مستقبلات postsynaptic. على سبيل المثال، سيتم حظر مستقبلات الغلوتامات من نوع AMPA بواسطة NBQX (10 μM) ومستقبلات NMDA بواسطة APV (100 درجة مئوية). اعتمادا على الهدف من الدراسة، يمكن وضع بروتوكولات للتحقيق في اعتماد الجهد من الاستجابات متشابك أو ديناميات الاستجابة مع مرور الوقت. - غسل مع حل ACSF الأصلي لتصحيح خلية أخرى، أو نقل شريحة تحتوي على الخلايا العصبية مليئة البيوتيسين في قارورة صغيرة مليئة 4٪ PFA.
- بعد التثبيت بين عشية وضحاها في 4٪ PFA، وغسل شريحة في 0.1 M PBS (2X لمدة 5 دقائق، 1X لمدة 20 دقيقة).
- يُحفظ في 30% من السكروز عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
6. الوحي البيوسيتوين
- نقل شرائح ثابتة تحتوي على الخلايا العصبية مليئة بالبيوتاين على شفرة زجاجية في قطرة من السكروز 30٪ وأداء ثلاث دورات من ذوبان التجميد: وضع النصل على الجليد الجاف التخلص منها في مربع الستايروفوم لمدة دقيقة واحدة حتى يتم تجميد قطرات من السكروز تماما، ثم اضغط على شفرة ضد كف اليد لذوبان.
- اغسل الشريحة 3x في 0.1 M PBS (2X لمدة 5 دقائق، 1X لمدة ساعة و 50 دقيقة)، تحريكها بلطف. لا تتجاوز 2 ساعة للغسيل الأخير.
- قبل احتضان شريحة في RT لمدة 2 ساعة في حل العازلة المهتاج التي تحتوي على 2٪ مسحوق الحليب (0.4 غرام في 20 مل) لتشبع المواقع غير المحددة و 0.5٪ تريتون X100 (0.1 مل في 20 مل) لنفاذ الأغشية في 0.1 M PBS.
- حضانة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في حل يحتوي على 2٪ مسحوق الحليب، 1٪ تريتون X100، streptavidin-Cy5 conjugate (1/500)، وDAPI (1/1000) في 0.1 M PBS، تحريكها بلطف.
- اغسل الشريحة ثلاث مرات في 0.1 M PBS (2X لمدة 5 دقائق، 1X لمدة 2 ساعة). يمكن أن تستمر الغسيل الأخير لفترة أطول، تصل إلى 4 ساعات، للحد من تلطيخ الخلفية.
- قبل تركيب الشريحة، استخدم مجهر الظهارة في 10x التكبير تكوين لمراقبة علامات الفلورسنت Cy5 من أجل تحديد جانب الشريحة التي تحتوي على الخلية ملحوظ في غرفة مليئة PBS.
- نقل شريحة على شفرة، الخلية الجانب حتى، وتجفيفها مع الأنسجة الورقية، وجبل ذلك باستخدام عالية المقاومة تصاعد المتوسطة.
- استخدام مجهر الفلورة في التكبير 10X في تكوين Cy5 وDAPI لفحص موقع جسم الخلية، وفي تكوين GFP لمراقبة afferents ملحوظ، أو مجهر البؤر عالية الدقة في 20X لجسدي مفصل، وaxonal، و مورفولوجيا الددرية(الشكل 2D, E). يتم تفصيل إعدادات التصفية في جدول المواد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدم الإجراء المعروض هنا للتعبير عن قناة زرقاء حساسة للضوء (كرونوس) تنصهر إلى GFP في النواة الأبهرية الظهرية للالمهاد (ADN)، عن طريق حقن مجسم ة من الفيروس المرتبط بالغدة الدرقية. تم تحديد إحداثيات مجسمة وفقا لأطلس الدماغ الماوس واختبارها عن طريق حقن 200 نانولتر من الفلورسنت التتبع فلورو روبي. تم التضحية بالحيوان بعد 10 دقائق من الحقن، وتم استخراج الدماغ وتثبيته بين عشية وضحاها. تم إعداد أقسام الدماغ الإكليلي لفحص موقع الحقن، الذي تم وضعه بشكل صحيح في ويقتصر على ADN(الشكل 1A، B).
من أجل التعبير عن كرونوس-GFP في الخلايا العصبية من ADN، حقننا 300 nL من AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH. بعد ثلاثة أسابيع من الحقن، تم إعداد شرائح الدماغ الأفقيالحاد. الشكل 1 C يظهر شريحة الدماغ التي تحتوي على موقع حقن الثالاميك في نصف الكرة الأيمن، مع التعبير GFP باللون الأخضر. عند التفتيش مع مجهر الفلورة إبي مجهزة هدف 4X، لوحظ GFP وصفت محاور الثالاميك في presubiculum(الشكل 1C، D). ولوحظ أن محاور الثالانية بكثافة تُعنى بالطبقات السطحية I و III من ما قبل السوبولوم(الشكل 1دال).
تم تسجيل نشاط الخلايا العصبية قبل الفرعية في الطبقة الثالثة في تكوين التصحيح المشبك الخلية بأكملها. تم تطبيق فرط الاستقطاب وإزالة الاستقطاب الخطوات الحالية أثناء تسجيل الاختلافات المحتملة الغشاء(الشكل 2A). تم تخزين البيانات على جهاز كمبيوتر لتحليل هالمحاليا في وقت لاحق من خصائص الغشاء النشط والسلبي. تمتلك الخلايا الرئيسية للطبقة ما قبل التجسير الثالث عادة ً إمكانية راحة سلبية قريبة من -63 ملي فولت وتتطلب حقن الحالية لإزالة الاستقطاب لدفع قدرة الغشاء على إطلاق العتبة. تم نشر وصف كامل لخصائصها الجوهرية11.
أثار تحفيز محطات أكسون ADN التي تعبر عن كرونوس-GFP إمكانات ما بعد المشبك (EPSPs) في الخلايا الرئيسية للطبقة الفرعية الثالثة في وضع المشبك الحالي(الشكل 2B). واعتماداً على شدة الضوء، يمكن أن تصل هذه الـ EPSPs إلى عتبة محتملة للعمل. كما لوحظت الاستجابات البوستينابتيك في وضع الجهد المشبك كما تم استثارة التيارات ما بعد متشابك (EPSCs)(الشكل 2C). كانت البلاغات المتأخرة من EPSCs التي أثارتها التحفيزات الضوئية قصيرة (متوسط، 1.4 مللي ثانية10)،مما يشير إلى اتصال متشابك مباشر بين محاور الثالانية والخلايا العصبية قبل الفرعية الطبقة الثالثة. وأكد استمرار EPSCs في حالة TTX-4AP هذا التنشيط أحادي ة. ومن الجدير بالذكر أن هذه الخلايا استجابت بشكل موثوق لتحفيزات الضوء من محاور afferent مع نمط اطلاق النار العادية.
الشكل 1 حقن مجسم في النواة الثلاميك الأنتيرودورسال (ADN). (أ) التمثيل التخطيطي للحقن. (ب) تأكيد موقع الحقن مع الفلورو روبي في قسم الإكليل. يشير الدخول إلى مستوى الظهر اللاتير والمسافة من البريما. (C)شريحة أفقية بعد حقن AAV-Chronos-GFP في المهاد. وتجدر الإشارة إلى الإسقاطات الإبطية لمرحلة ما قبل الخضوع للإقصول. شق على الجانب الأيسر من الشريحة (المشار إليها من قبل مثلث أسود) علامات نصف الكرة الأرضية. (باء، جيم) مقياس شريط 1 ملم.(D) عرض مكبر للدخول في(C) مع توقعات ADN إلى الطبقات السطحية قبل الفرعية. شريط مقياس = 100 درجة.
الشكل 2 الطبقة الفرعية الثالثة الخلايا العصبية: الخصائص الجوهرية، والاستجابة لتحفيز الضوء من afferents الثالاميك، والوحي بعد مخصص من مورفولوجيا الخلية. (أ) نمط إطلاق النار والاختلافات المحتملة غشاء من الخلايا العصبية الطبقة الثالثة لفرط الاستقطاب وإزالة الاستقطاب الخطوات الحالية. (باء، جيم) الردود من الخلايا العصبية الطبقة الثالثة إلى 2 MS التحفيز الخفيفة (القضبان الزرقاء) من محاور الثالاميك المسجلة في (B) الحالي المشبك و (C) أوضاع الجهد المشبك. (دال، هاء) الخلايا العصبية الهرمية الطبقة الثالثة (الأبيض، المشار إليها من قبل مثلث أصفر شغل) تحيط بها محاور الثالانية التعبير عن كرونوس-GFP (الأخضر) في طبقات سطحية قبل فرعي مع تلطيخ DAPI (الأزرق) في شريحة أفقية يصورها مع مجهر الظهارة ( D، شريط مقياس = 100 م) ومجهر البؤري في التكبير عالية(E،شريط مقياس = 50 ميكرومتر). يشار إلى الخلية في(A) مع مثلثات صفراء مملوءة. وهناك خلية عصبية ثانية مملوءة جزئيا موجودة في هذه الشريحة المشار إليها مع مثلثات صفراء فارغة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الحقن الفيروسي في الجسم الحي للتعبير عن أوبسينات حساسة للضوء في منطقة الدماغ المحددة هو طريقة الاختيار للتحليل البصري للاتصال الوظيفي طويل المدى10،11،17،18. حقن مجسمة توفر إمكانية لاستهداف منطقة محددة من الدماغ على وجه التحديد. التعبير المشترك لopsin مع مراسل الفلورسنت يسمح مريح تقييم التعبير الناجح وتأكيد موقع الحقن الدقيق. عادة ً ما يقيد استخدام النمط المصلي AAV 2/5 التعبير إلى منطقة الدماغ المستهدفة. وبهذه الطريقة، يتم نقل عدد محدود من الخلايا العصبية، والتعبير عن قنوات أيون حساسة للضوء في أجسام الخلايا ومحطات axon. في التجارب اللاحقة شريحة الجسم الحي السابق، فمن الممكن لتحفيز هذه المحطات axon مع نبضات الضوء مباشرة في المنطقة المستهدفة، في حين قراءة انتقال متشابك ناجحة عن طريق تسجيل التصحيح المشبك من الخلايا العصبية المتصلة ما بعد synaptically. البروتوكول أعلاه قوي ومريح، وبعض الملاحظات الإضافية قد تساعد على أداء التجارب الناجحة.
يمكن استخدام أنواع مختلفة من التخدير. يوصف هنا هو الحقن داخل اقابية من مزيج الكيتامين-xylazine كتخدير سهل الاستخدام، على المدى القصير مع التسكين مريحة19. قد يختلف عمق التخدير ومدته إلى حد ما. في بعض الحالات, قد يكون من الضروري حقن آخر نصف جرعة من الكيتامين-xylazine أثناء البروتوكول. يمكن أن يكون تخدير الإيسوفلوران بديلاً جيداً للحث بسرعة أكبر وتحكم بشكل أفضل في عمق التخدير. ويمكن تحديد إحداثيات مواقع الحقن بمساعدة أطلس دماغ الماوس. ومن الناحية العملية، يلزم اختبار الإحداثيات وتعديلها، إذا لزم الأمر.
كما أن ظروف العمل النظيفة هي المفتاح. من المستحسن استخدام معدات الحماية التي يمكن التخلص منها، بما في ذلك القفازات، وقبعة الغوغاء، ومعطف المختبر. عند وضع الحيوان في الإطار المجسم ، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لراحة الحيوان ، مما سيحسن إلى حد كبير كفاءة التخدير. يجب محاذاة جسم الحيوان مع الرأس والرقبة. الخطوة الأكثر أهمية في تحديد موقع الحيوان وقبل استئصال الجمجمة هو تعديل محور بريجما لامدا. خاصة عندما تستهدف هياكل الدماغ العميقة، حتى انحراف صغير سوف تولد أخطاء عند خفض إبرة الحقن في الدماغ. في بعض الحالات، يمكن للمرء أن يختار عمدا وحساب مسار إبرة مائلة.
حجم الحقن هو عامل محدد للحصول على التعبير أوزين المترجمة بدقة. حجم صغير مثالي لامتياز منطقة التغوط مقيدة بإحكام. وقد يكون من المفيد زيادة الأحجام لتغطية النطاق الكامل لمنطقة مستهدفة كبيرة. إذا كانت هناك حاجة إلى تغطية مساحة كبيرة، مثل الحاجز18، قد يكون من المفيد وضع عدة حقن صغيرة مع مجموعة من الإحداثيات المجاورة. الفاصل الزمني حتى تسجيل الكهرولوجية في الجسم الحي السابق هو أيضا حرجة. من الضروري الحد الأدنى من الوقت للتعبير الكامل. في حين أن 3 أسابيع يبدو أن التأخير الأمثل لهذه التجارب11, قد يختلف التأخير اللازم اعتمادا على الفيروس, النمط المصلي, والمسافة إلى منطقة الدماغ postsynaptic.
النهج الموصوف هنا هو أكثر قوة عندما جنبا إلى جنب مع الحقن في الحيوانات المعدلة وراثيا. وقد استغل العمل السابق خطوط الماوس المختلفة لأنواع فرعية من الخلايا العصبية GABAergic، من أجل استهداف على وجه التحديد إما PV- أو SST-التعبير بين الخلايا العصبية لتسجيلات التصحيح المشبك20. تسجيل مزدوج في وقت واحد من الخلايا العصبية PV والهرمية المجاورة أو SST والخلايا العصبية الهرمية ثم يسمح بمقارنة نقاط القوة من المدخلات طويلة المدى بين نوعين من الخلايا العصبية11. هذا ينتج النتائج التي يتم توحيدها فيما يتعلق بنوع الخلايا العصبية واحد. هذا التوحيد مهم بشكل خاص في الحالات التي تختلف فيها مستويات التعبير من opsins بين الحيوانات المختلفة أو شرائح مختلفة.
شريحة الصحة أمر ضروري لتسجيلات عالية الجودة التصحيح المشبك. الأوكسجين المستمر للشرائح أمر بالغ الأهمية، وسرعة القطع البطيئة يحسن بشكل كبير نوعية سطح الشريحة. ويحافظ سمك الشريحة البالغ 300 ميكرومتر، إلى حد ما، على سلامة الدوائر الدقيقة في المقاطع الأفقية قبل التجسير، بما في ذلك الخلايا العصبية الهرمية مع أجسام الخلايا، والتداعيات الإبطية والذاتية المحلية، والاتصالات المتشابكة المحلية. نوع من القنوات ذات البوابات الخفيفة التي تم اختيارها للحث على تنشيط ألياف afferent سوف تؤثر بشكل كبير على المعلمات التحفيز (المدة، كثافة الضوء). كرونوس هو الأزرق حساسة للضوء channelrhodopsin، ويمكن استخدام مجموعة واسعة من موجات الإضاءة للتنشيط (حساسية الذروة حول 500 نانومتر، حتى مع الحد الأدنى من كثافة الضوء من 0.05 مليواط / مم2،تنشيط أيضا في 405 نانومتر، وتصل إلى 530 نانومتر21 ). وعلاوة على ذلك، كرونوس له خصائص حركية سريعة بالمقارنة مع ChR2 الكلاسيكية، والتي تمكن من تحفيز التردد العالي وتفعيل موثوق بها من التوقعات طويلة المدى22. في تركيبة مع التعبير من [شريمن], [رد-شيفت] [أبسين] [فرينت], يصبح الإثارة مستقلّة بصريّة من السّكان بارزة عصبيّة عمليّة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
نشكر برتراند ماثون، ميري نصار، لي وين هوانغ، وجان سيمونيت على مساعدتهم في تطوير الإصدارات السابقة من بروتوكول حقن المجسمة ومارين مانويل وباتريس جيغوزو للمساعدة التقنية. وقد دعمت هذا العمل وزارة التعليم والبحث الفرنسية (L.R., L.S.), Centre National des Etudes Spatiales (M.B.), and Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN - 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 - 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), New York, N.Y. 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, Pt 17 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic. New York. (2013).
- Huang, L. -W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
