Summary
פרוטוקול זה מתאר ערכה של שיטות לזיהוי הקישוריות הפונקציונלית הספציפית של כניסות לטווח ארוך מאזורי מוח רחוקים באמצעות הגירוי בתוך המוח בפרוסות מvivo לשעבר.
Abstract
ידיעת הקישוריות הסינפטית הספציפית לסוג תא היא תנאי מוקדם להבנת המעגלים העצביים הכלל-מהותיים. החקירה תפקודית של חיבורים ארוכי טווח דורש הקלטות ממוקדות של נוירונים בודדים בשילוב עם גירוי ספציפי של קלט מרחוק מזוהה. לעתים קרובות קשה להגיע לטכניקות גירוי מקובלות וחשמליות, משום שהאקטונים מאזורי המוח המתקונים עשויים להתערבב באזור המטרה. המיקוד הסטריאוטקאלי של אזור מוחי מסוים לביטוי וירוס-מתווך של ערוצי יון רגישים לאור מאפשר גירוי סלקטיבי של אקטונים שמקורם באותו אזור באור. זריקות סטריאוטקאיות גרם ניתן להשתמש במבנים מופרדים היטב, כגון הגרעין התלמי הקדמי, בנוסף לאזורים משניים או קורטיקליים אחרים ברחבי המוח.
המתואר כאן היא סדרה של טכניקות הזרקה סטריאוטקאית מדויקת של וקטורים וקטורי המבטא המתקשרים במוח העכבר, ואחריו גירוי של מסופי אקסון בהכנת פרוסת המוח. פרוטוקולים אלה הם פשוטים וחלים באופן נרחב. בשילוב עם מהדק תיקון תא שלם הקלטה מתוך תא עצב מחובר postsynaptically, גירוי של אקסונים מאפשר זיהוי של קשרים פונקציונלית סינפטית, אפיון תרופתי, והערכה של כוחם. בנוסף, מילוי ביוציטוטין של תא העצב המוקלט יכול לשמש לזיהוי מורפולוגית שלאחר-הוק של תא העצב הפוסטסינפטית.
Introduction
הגדרת הקישוריות בין אזורי המוח. נחוצה כדי להבין את המעגלים העצביים שיטות האיתור האנטומי הקלאסיות מאפשרות יצירת קישוריות בין-אזורית, ולימודי הנגעים מסייעים להבנת הארגון ההיררכי של זרימת המידע. לדוגמה, מעגלי המוח לאוריינטציה מרחבית וכיוון הראש מעורבים בזרימה כיוונית של מידע מתלמוס ל-presubiculum. זה הוכח על ידי מחקרים נגעים של הגרעין של אנארטרו-טתלמי (adn) כי לבזות את האות בכיוון הראש במורד הזרם presubiculum, כמו גם את המוח של הפרהיפוקאמאל תא1,2.
הקישוריות הפונקציונלית בין אזורי המוח קשה יותר ליצור ברמה התאית והתת-תאית. בהיפוקמפוס, אנטומיה מאורגנת מאוד מאפשר לחקור קשרים סינפטית ספציפיים מסלול באמצעות סימולציה חשמלית בהכנה פרוסה. אלקטרודות גירוי להציב שכבה רדיואטום של CA1 ניתן להשתמש במיוחד לעורר את הקלט הנלווה של שייפר מ CA33. אלקטרודות מעוררות מונחה בשכבה lacunosum מCA1 מפעילים את הכניסה לנתיב הנקבים לCA14,5. גירוי חשמלי מפעיל שחרור נוירוטרנסמיטר ממסופי אקסון; עם זאת, הוא מפעיל נוירונים עם somata ליד האתר גירוי, כמו גם אקסונים של מעבר. לכן, השימוש המוגבל לחקר האפפראנטים מאזורי המוח המוגדרים כאשר סיבים של אזורים שונים של מוצא מתערבבים במבנה היעד, כפי שבדרך כלל המקרה בקליפת הקליפה.
נוירונים יכולים גם להיות מגורה עם אור. שיטות אופטיות כוללות את ההפעלה של גלוטמט בכלוב, אשר ניתן לשלב עם סריקת לייזר אחת או שתיים-פוטון. אתרים מרובים במרווחים מקרוב עשויים להיות מגורה ברציפות, ללא נזק מכני לרקמה6. זה נעשה בהצלחה למפות קולטני סינפטית, כמו גם להפעיל נוירונים בודדים7. בעוד גלוטמט שימוש הזדקנות יכול לשמש ניתוח מעגל מקומי, זה לא מאפשר הפעלה ספציפית של תשומות לטווח ארוך.
שיטת בחירה לחקירת קישוריות ארוכת טווח במעגלים עצביים היא השימוש בביטוי מתווך של וירוסים בתיווך. שימוש בזריקות vivo סיטקאיות כפי שמתואר כאן, ביטוי של ערוצי יונים מגודרת באור יכול להיות ממוקד ומוגבל לאזור המוח הרצוי. בדרך זו, מתקשרים הם יעילים למיפוי התקשרות מתוך מחוז אחד למטרה. מסופי מסופים מתוונים עשויים להיות ממריצים עם אור בהכנה לחיתוך המוח, והקלטות הדבקה מהדק כקריאה מאפשרת בדיקה של הפונקציות והעוצמות של רכיבי מעגל ספציפיים במוח8. הגישה האופגנטית בשילוב עם הזרקת סטריאוטקאית של וירוס מציעה ספציפיות ללא תקדים ושליטה גנטית9. גירוי באור מאפשר בנוסף לדיוק בזמן התיכון ומרחבית10,11.
Presubiculum הוא שישה שכבות מבנה קורטיקלית במעבר של ההיפוקמפוס ואת היווצרות פרה-היפוקמאל12,13. הוא מקבל קלט סינפטית חשוב מן ADN11 אבל גם מכמה אזורים אחרים קליפת המוח הקליפת המוח14. לפיכך, הגירוי הסלקטיבי של המסופים התאלתלמי בתוך פרוסה מפרה-משנית אינו אפשרי עם גירוי חשמלי ולא מגלוטמט הזדקנות. המתואר בפרוטוקול זה הם שיטות לקביעת קישוריות תפקודית בין אזורי המוח (ADN ו presubiculum) באמצעות זריקות סטריאוטקאית מדויקת של וקטורים ויראליות המבטא ערוצים מגודרת אור. כמו כן תיאר את הגירוי של מסופי אקסונים של הקרנת נוירונים באזור היעד שלהם, בשילוב עם הקלטות של תאים שלמים הקלטה-קלאמפ של נוירונים פוסט סינפטית בהכנה לחיתוך המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות מועצת הקהילה האירופית (2010/63/האיחוד האירופי) ואושרה על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת פריז דקארט. הניסויים חייבים לקבל אישור על ההליך לקיים את התקנות המקומיות.
1. תכנון הניסוי
- הגדירו את אזור המוח. שמיועד למטרה לקבוע את הקואורדינטות סטריאוטקאיות של אתר ההזרקה בעזרת המוח העכבר אטלס15. בשביל הזכות הימנית הזאת (ADN), הקואורדינטות הן:-0.82 אחורי, 0.75 לרוחב,-3.2 עומק (mm) ביחס לברגמה. ייתכן שיהיה צורך להתאים קואורדינטות לבעלי חיים בגילאים שונים, במין או במתח.
- לאשר ולתעד את הקואורדינטות של נקודות הציון על ידי הזרקת מעקב פלורסנט (150 כדי 300 nL) הנצפה עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בניסוי פיילוט (איור 1א, ב).
- הגדר את סוג הווירוס שיש להזריק. אחסן את הווירוס בשש μL-80 ° c, כפי שמומלץ על ידי המפיק. מביאים 1 סדרת מחלקים על הקרח לחדר הניתוח, להזרקה של אחד עד שישה בעלי חיים ביום נתון. תקנות ביוטיחות לשימוש ב-AAV עשויות להיות תלויות במדינה או במוסד, והשימוש ב-PSM 2 כיפה עשוי להידרש.
הערה: כאן, אנו משתמשים סוג AAV2/5 המבטא כרונו, משתנה channelrhodospin-2 מהיר, התמזגו חלבון פלורסנט ירוק תחת השליטה של היזם סינפסין: AAV5. צין. כרונו-GFP.
2. כירורגיה סטריאוטקאית
- התקן מסגרת סטריאוטקאית מצויד במחזיק משאבה על ספסל יציב מעבדה סטנדרטי. התאם סטריאוסקופ כדי לראות בבהירות את האזור שבו ימוקם ראשו של בעל החיים. השתמש במקור אור LED לתאורה. סובב את סטריאוסקופ כדי לגשת למחזיק המשאבה, אשר אינו נדרש עבור הצעדים הראשונים של הניתוח.
- התקנת 10 μL המילטון מזרק מצויד מחט מתכת 33 G משופע במחזיק המשאבה. בדוק את מערכת הפליטה עם המים.
- באמצעות הזרקת הצפק של שילוב של קטמין הידרוכלוריד ו-xylazine (100 מ"ג/ק"ג ו-10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה), הC57BL6 בעכבר 4 עד 5 שבועות. הכינו תערובת של 1 מ ל של קטמין ו 0.5 mL של xylazine ב 8.5 mL של 0.9% הנאל. זה יגרום 10 מג mg/mL קטמין ו 1 מ"ג/mL xylazine בתמהיל. של תערובת זו, להזריק intraperitoneally 10 μL לכל גרם של משקל הגוף של בעל החיים. משך ההרדמה הוא בערך 1 h.
- ודאו שהחיה מורדם היטב. עם צביטה בבוהן אז, תוציא את הלשון. כדי להקל על הנשימה . תגלח את השיער הגולגולתי
- הכנס 20 μL של לידוקאין הידרוכלוריד (4 מ"ג/mL; 2 מ"ג/ק"ג) תחת העור של הראש עבור הרדמה מקומית ולחכות 5 דקות כדי להתחיל את האפקט. כדי למנוע נזק העין עקב יובש, לכסות את העיניים עם משחה אופטלמולוגית אקטואלי.
- כדי לחשוף את הגולגולת, ליצור חתך ישר בקרקפת עם מספריים ניתוח קטן. מניחים את החיה בתוך מסגרת סטריאוטקאית, החדרת מוטות האוזניים מעט rostral אל האוזן בפועל כדי לנוח על העצם להוריד את העור, אשר צריך ליצור גישה טובה לגולגולת. . הדקו את המקום . התקינו את האף
- שמור על גוף החיה בצורה אופקית ברמת הראש באמצעות תמיכה מותאמת גובה. מניחים משטח חימום מתחת לעכבר כדי לשמור אותו בטמפרטורה פיזיולוגית.
- נקה את הגולגולת על ידי החלת 0.9% הנאגל עם מסיר כותנה להסרת רקמות רכות מן העצם. השתמש בסטריאוסקופ. לשאר הניתוח
- כוונן את הגולגולת כך שהציר ברז-למדא הוא רמה, הנע למעלה או למטה בחלק האף והשיניים. הדבר מחייבת צעדים איטרטיביים של ברגמה ולאמבה, כפי ששניהם ישתנו בהתאם לרמת האף.
- מצא את המיקום של אתר ההזרקה על הגולגולת. להתאים את המחט ההזרקה מעל אתר ההזרקה בהתאם קואורדינטות האחורי המדיאלי ולסמן את הגולגולת עם מחט חד פעמית. להזיז את המחט ההזרקה כלפי מעלה על ידי 4 ס מ.
- השתמש בבור 0.5 מ"מ עם מקדחה כדי להגשים פתיחת גולגולת בקוטר 1 מ"מ על הסימן, במחצית של מהירות מקסימלית. לנקות דימום בסופו של דבר עם רקמת נייר.
- לרוקן את המים הכלולים במזרק המילטון לאחסון על ידי הוצאת לחלוטין את זה עם המשאבה. רק המחט עדיין. תתמלא במים המחט נשטף בין כל שימוש. במים מוהים טהורים עיקור אינו נדרש.
- קח את סדרת מחלקים של וירוס כי יש להשתמש ליום זה. ודא שהפתרון הנגיפי אינו מוקפא עוד, אך נשאר מקורר (קרוב ל -0 ° c, על הקרח). רק בקצרה להסיר מן הקרח כדי להשיג 700 nL עם מיקרופיפטה עבור כרכים קטנים. הפקדה את הירידה על פיסת 5 ס מ x 5 ס מ של סרט פרפין. להימנע מיצירת בועות. שים את הפתרון הנגיפי שנותר בחזרה על הקרח.
הערה: אמצעי האחסון של השחרור צריך להיות גדול יותר מעוצמת הזריקה הרצויה (700 nL עבור 200 nL מוזרק). זה ייתן מרווח בטיחות במקרה שחלק מהנוזל יאבד במהלך ההעברה ומאפשר ביצוע הוצאה בדיקה קטנה (צעד 2.16) לפני שתמשיך. - הניחו את סרט הפרפין על גבי פתיחת הגולגולת. לצלול את המחט בירידה של הפתרון הנגיפי מבלי לשנות את המיקום האחורי של האנארטרו ולרוחב.
- השתמש בפונקציה "משיכה" של המשאבה כדי למלא את המזרק עם כ 500 nL של פתרון נגיפי הושלך על הסרט פרפין. לעשות את זה תחת שליטה חזותית (סטריאוסקופ), לצפות את הירידה נעלמים, ולוודא לא לבשל אוויר.
- ודא שמזרק התמלא כראוי. בדוק את תפקוד מערכת הפליטה על ידי נהיגה במורד הבוכנה כדי לבדוק הוצאת טיפה קטנה של נוזל של 50 nL תחת בקרה חזותית. . תמחק את המסירה
- הכנס את המחט לתוך המוח לעומק הנבחר, על-ידי הפיכת הידית לשליטה על הציר הנוריק של המנגנון הסטריאוטקאלי בכיוון השעון. ללחוץ על כפתור "לרוץ" (מהירות 15 nL/מינימום לכרך של 150 nL הוזרק). נפח קטן (50-300 nL, בהתאם וירוס בשימוש) הוא הנפלט לאט מעל 10 דקות עם משאבה אוטומטית.
- לחכות 10 דקות לאחר הזריקה כדי למנוע דולף מאתר ההזרקה. לאחר מכן, לאט להסיר את המחט מעל 3-5 דקות על ידי הפיכת כפתור שליטה על הציר dorso-הגחוני נגד כיוון השעון.
- סובב את החלק האנכי של המסגרת הסטריאוטקאית עם המזרק הרחק מהחיה. לשטוף מיד את המחט במים מזוקקים נקי על ידי מילוי-ריקון זה מספר פעמים, כדי למנוע סתימת. . אחסן את המזרק מלא במים
- הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקאית. תפר את העור עם. חוט תפירה 4-0 פוליאמיד לעשות שלושה או ארבעה סטיצ'ים, קשור עם 2-1-1 קשרים כירורגיים סטנדרטיים.
- מניחים את העכבר בכלוב מחומם עד שהוא מתעורר לחלוטין מהרדמה, ומספקים מים ומזון שנספג בצלחת פטרי הממוקמת על הקרקע. אם מקור החום נמצא מתחת לכלוב, השתמש ברשת מרווח כדי למנוע התחממות יתר.
הערה: על פי הנחיות מקומיות, מנה אחת של ketoprofen (2-5 mg/kg, תת-עורי) או בופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג, תת-עורי) ניתן להחיל על מנת למנוע כאב. - כאשר בעל החיים ער לגמרי, החזר אותו אל כלוב הבית שלו ונטר את רווחתם, במיוחד ביום שלאחר ההזרקה. . בדוק אם יש סימני כאב אם השינוי התנהגותי מוצג, החיה שקלה לעקוב אחר משקל גופו.
- בהתאם לווירוס שבשימוש, הזמן לביטוי מלא עשוי להשתנות. כאן, אנו מאפשרים 3 שבועות לביטוי של AAV5. צין. כרונוס-גFP
3. פתרונות להקלטות וקיבוע של פרוסות חדות
- הכנת פתרונות מניות של מרוכז 10x הפתרון חיתוך (125 מ"מ היום, 25 מ"מ סוכות, 2.5 mM KCl, 25 mM נחקו3, 1.25 mm נה2PO4, ו 2.5 mm D-גלוקוז) ו נוזל מלאכותי בעובי השדרה (acsf) פתרון (124 mm הנאקל, 2.5 מילימטר kcl, 26 מ"מ נחקו3, 1 מ"מ2פו4, ו 11 מ"מ D-גלוקוז) במים מוכי טהור לפני ניסויים אלקטרופיזיולוגיה. אחסן את הפתרונות הללו ב-4 ° c בבקבוקים 1 L ללא CaCl2 ו-MgCl2.
- ביום הניסוי, לדלל את פתרונות המניה של פתרון גזירה ו-ACSF 10x לנפח הסופי של 0.5 L כל. מתפרעים עם מערבב מגנטי וחמצן על ידי מבעבע עם 95% או 5% O2/co2. הוסף יוניםדיאטתיים כדי להשיג ריכוזים סופיים של 0.1 Mm cacl 2 ו 7 מ"מ mgcl2 עבור פתרון החיתוך, ו 2 מ"מ cacl2 ו 2 מ"מ MGCL2 עבור acsf.
- הכינו את פתרון הפיפטה המבוסס על אשלגן-גלוקונאט שיכיל: 135 mM K-גלוקונאט, 1.2 mM KCl, 10 מ"מ HEPES, 0.2 mM EGTA, 2 מ"מ MgCl2, 4 מ"מ mgcl, 0.4 mm טריס-gtp, 10 מ"מ Na2-פוספולקראטין, ו 2.7 – 7.1 מ"מ ביולוציטין עבור תא post-הוק מורפולוגיה ההתגלות. התאם את ה-pH של הפתרון ל 7.3 ו-osmolarity ל 290 mOsm. מאגר 1 מ"ל משמאל ל -20 ° c.
- להכין 0.1 M PBS ידי לדלל BupH בתערובת שקיות האבקה מיזוג יבש ב 500 מ ל של מים מזוקקים, וכתוצאה מכך 0.1 M נתרן פוספט, 0.15 M הנאל, pH 7.2.
- כדי להכין 1 L של 4% בתחתית הפתרון, לדלל 111 mL של 36% בתחתית נוזלי ו 90 mL של 10 x PBS פתרון במים מזוקקים.
- הכינו 30% הפתרון המכיל 150 גרם של סוכרוז ב 500 מ ל של 0.1 M PBS.
4. הכנת פרוסות מוח
- הכינו את מרחב הספסל עם נייר הספסל הסופג לפני הפרזיה.
- התקן טפטוף כ 1 מ' מעל הספסל עבור perfusion ההזנה הכבידה. לצרף המחט פרפר 24 G.
- הקף את החדר חיתוך של הרטט עם קרח ולאחסן אותו במקפיא.
- הזרקת את העכבר עם הזרקה תוך הצפק של אותו תערובת של קטמין-קסיטין המשמש לניתוח. להעריך את השלב של ההרדמה ידי צובט את הבוהן עם מלקחיים. כאשר ישן לגמרי, להזריק 100 μL של הפארין (5000 U.I./mL) intraperitoneally.
- לתקן את החיה עם דבק דביק על נייר סופג, שוכב על גבו. פתח את כלוב החזה על ידי חיתוך הצלעות בצד שמאל וימין עם מספריים קטנים, מן הסרעפת כלפי מעלה. שמור על כלוב החזה פתוח בעזרת דבק סלוטייפ.
- הצמד את העורקים היורדים עם הדימום והשם דרך החדר השמאלי של הלב עם 4 ° c מקורר ו חמצן (95% O2/CO2), חיתוך הפתרון דרך מחט פרפר 24 G. לאחר 5 s, לפתוח את האטריום הימני עם מספריים קטנים.
- לאחר 5 דקות של הפרזיה, כאשר האיברים חסרי דם, לעצור את הפרזיה. ראשו של בעל החיים עם מספריים גדולים ומלא מיזוג הראש לתוך 4 ° c מקורר ותמיסת החיתוך חמצן בצלחת פטרי.
- כדי לחלץ את המוח, לחתוך את העור מהצוואר אל האף, ואז לחלק את החוליה האחרונה מהגולגולת עם מספריים. באופן ידני למשוך את העור ולהשתמש מספריים קטנים כדי לפתוח את הגולגולת, חיתוך אותו לאורך קו האמצע, מ caudal אל rostral, כלפי מעלה בין העיניים.
- הסר בזהירות את עצם הקודקוד ואת החלק caudal של העצם הקדמית עם מלקחיים מעוקל או עצם. לחלץ את המוח עם מרית מעוגל קטן על ידי החדרת המכשיר בין המוח לבין רצפת הגולגולת, הפרדת נורת הריח, עצב הראייה ועצבי הגולגולת אחרים, והמוח הזעיר.
- הכנס בעדינות את המוח בתמיסה לחיתוך קרח קר (4 ° c) בגביע. מקמו את המוח על נייר מסנן כדי לייבש בעדינות את משטח הקורטיפה. הדבק את קליפת המוח-למטה למחזיק הדגימה של הרטט, עם הצד caudal מול להב, כדי לחתוך פרוסות המוח האופקי.
- ממלאים את חדר החיתוך עם פתרון חיתוך חמצן קר, כך שהמוח אינו ממוזג לחלוטין. לחתוך את האונה השמאלית (הצידה הצלעות בצד המוזרקים) כדי למנוע בהירות פוטנציאלית שמאל על פרוסות.
התראה: תמיד חמצן הפתרון ולהגן על פרוסות מפני חשיפה באור. - גזור 300 יקרומטר פרוסות עבה עם הרטט, במהירות של 0.07 מ"מ/s בשרעת 1 מ"מ. בשלב זה, מומלץ לבדוק בקצרה את הביטוי כרונו-GFP בתלמוס באמצעות פנס פלורסנט (440-460 nm) ומשקפיים המקביל מסנן (500 ננומטר לעבור ארוך).
- לבודד את אזור ההיפוקמאל עם אזמל ולהעביר אותו לחדר ממוקם בגביע מלא אמבטיה-מחומם (34 ° c), חמצן (95% או 5% O2/co2) acsf.
- לאחר 15 דקות, קחו את החדר מתוך מרחץ המים המחומם והנח לפרוסות לנוח בטמפרטורת החדר, עדיין חמצן לפחות 45 דקות עד השימוש.
5. הקלטה מדבקת של תאים שלמים
- מעבירים בעדינות פרוסת מוח המכילה את מתחם ההיפוקמאל עם פיפטה בהזמנה מותאמת זכוכית לחדר ההקלטה רכוב על מיקרוסקופ זקוף. פיפטה העברה עשוי מצינורות פסטר מקוצרים (קוטר פנימי 6.5 מ"מ) המחובר לנורת הצינורות גומי. באופן רציף את חדר ההקלטה (3 מ"ל) עם 34 ° צ' (מחומם) ACSF בוקבלד עם 95% או 5% O2/co2. הגדר את המהירות של המשאבה הפריסטטית ל 2-3 mL/min.
- לבחון בקצרה את הביטוי כרונו-gfp במסופים אקסון באזור הריבית עם תאורה LED כחולה (470 nm) ולהתבונן עם מטרה 4x. הקרינה הפלואורסצנטית GFP הוא דמיינו דרך מסנן פליטה המתאים, עם תמונת מצלמה CCD מוצג על מסך המחשב.
- מניחים עוגן פרוסה מחוט פלטינה בצורת U עם מחרוזות ניילון מרווח בחוזקה ("נבל") על הפרוסה כדי לשמור עליו.
- שנה למטרת טבילה של 63 x וכוונן את המוקד. בדקו את האקטונים המבטאים את כרונו-GFP ובחרו תא עצב-על מסלול להקלטה מדבקת.
- . הזיזו את המטרה כלפי מעלה
- משוך את הפיפטות בעזרת להבות אלקטרודות. חומות מזכוכית בורוסיליקט הפולר מוגדר לייצר פיפטות עם כ 1 יקרומטר בקוטר קצה. ממלאים את הפיפטות בפתרון פנימי מבוסס ק gluconate.
- הבהר את הפיפטה במחזיק הצינורות בראש הבמה. הורידו את הפיפטה בחדר. ומצאו את המידע מתחת למטרה התנגדות הפיפטה צריכה להיות בין 3 – 8 MΩ. החילו לחץ חיובי קל עם מזרק כדי לראות חרוט של הפתרון יוצא מתוך הפיפטה ובהדרגה הנמך את הפיפטה והמטרה למשטח הפרוסה.
- לתקן את התא בתצורת קלאמפ מתח: גישה לעצב מזוהה ולחץ בעדינות את העצה הפיפטה על הסומה. הלחץ החיובי אמור לייצר גומה על משטח הקרום. שחררו את הלחץ כדי ליצור חותם giga-אוהם (> 1 GΩ התנגדות). לאחר שנחתם, הגדר את מתח ההחזקה ל-65 mV. לשבור את הקרום עם דופק חד של לחץ שלילי: זה מושגת על ידי הפעלת יניקה חזקה צינור מחובר מחזיק הפיפטה.
- הקלטה במצב תא שלם מלחציים הנוכחי את התגובות של תא העצב כדי להקטפולזציה והקטפולאת הצעדים הנוכחיים (איור 2א).
הערה: פרוטוקול זה ישמש לקביעת המאפיינים הפנימיים הפעילים והפאסיביים של התא. שגרות MATLAB כתובות מותאמות אישית משמשות לניתוח לא מקוון10,16. - שיא התגובה הנוכחית או מתח הצבת התגובות הפוסט המלא-שדה 475 ננומטר LED גירוי של סיבי כלי לימפה המבטא כרונו. לעורר עם רכבות של 10 ממריצים של 2 ms משכים ב 20 הרץ (איור 2ב, ג). עוצמת האור עשויה להשתנות מ-0.1 – 2 mW.
הערה: עוצמת האור נמדדה עם קונסולת חשמל אופטי כף-יד דיגיטלי המצויד בחיישן פוטודיודה, הממוקם תחת המטרה. השהיות תגובה של 2 – 4 אלפיות השני מאפיינים לחיבור מונוסינפטית. - כדי לחקור את האופי של השידור הסינפטית בין afferents ארוכי טווח לבין העצב המוקלט, סוכני תרופתי שונים ניתן להשתמש. כדי פרמקוסליטיות הבחנה ישירה, תגובות monosynaptic מתגובות עקיפות באמצעות הפעלת הרשת, להוסיף 1 μM TTX ו-100 μM 4-AP ל-ACSF.
הערה: היישום אמבטיה של חוסמי קולטן גלוטמט מאפשר לקבוע את טבעו של הנוירוטרנסמיטור כי הוא שוחרר ואת זהותו של קולטנים פוסט-סינפטית. לדוגמה, קולטני גלוטמט סוג אמפא ייחסמו על ידי NBQX (10 μM) ו NMDA קולטנים על ידי APV (100 μM). בהתאם למטרת המחקר, ניתן לתכנן פרוטוקולים כדי לחקור את התלות המתח של תגובות סינפטיות או הדינמיקה תגובה לאורך זמן. - לשטוף עם הפתרון ACSF המקורי כדי לתקן תא אחר, או להעביר את הפרוסה המכילה תא ממולא בביוציטוטין בבקבוקון קטן מלא עם 4% כולייתי.
- לאחר קיבוע הלילה ב 4% בכיוון הערוץ, לשטוף את הפרוסה ב 0.1 M PBS (2x עבור 5 דקות, 1x עבור 20 דקות).
- החנות ב-30% סוכרוז ב -4 ° c.
6. התגלות ביוציטוטין
- העבירו את הפרוסות הקבועות המכילות נוירונים ממולאים בביולוציטין על להב זכוכית בטיפה של 30% סוכרוז ובצעו שלושה מחזורים של הקפאת הקפאה: מניחים את הלהב על הקרח היבש הושלך בקופסת קלקר במשך 1 דקות עד שטיפות של סוכרוז קפואות לחלוטין, ואז לחץ על הלהב כנגד כף היד כדי להפשיר.
- לשטוף את הפרוסה 3x ב 0.1 M PBS (2x עבור 5 דקות, 1x עבור 1 h ו 50 דקות), נסער בעדינות. אין לחרוג 2 h עבור הכביסה האחרונה.
- Pre-מודאט פרוסה ב RT עבור 2 h בפתרון מאגר נסער המכיל 2% אבקת חלב (0.4 g ב 20 מ ל) כדי הרוויה אתרים שאינם ספציפיים ו 0.5% טריטון X100 (0.1 mL ב 20 מ ל) כדי לחלחל את הקרומים ב 0.1 M PBS.
- דגירה לילה ב 4 ° c בפתרון המכיל 2% אבקת חלב, 1% טריטון X100, streptavidin-Cy5 המשלים (1/500), ו DAPI (1/1000) ב 0.1 M PBS, נסער בעדינות.
- לשטוף את הפרוסה שלוש פעמים ב 0.1 M PBS (2x עבור 5 דקות, 1x עבור 2 h). השטיפה האחרונה יכולה להימשך זמן רב יותר, עד 4 שעות, כדי להפחית את צביעת הרקע.
- לפני שאתם ממלאים את הפרוסה, השתמשו במיקרוסקופ אפידלנטית בהגדלה של 10x שהוגדר להתבונן בסמני פלורסנט Cy5 כדי לזהות את הצד של הפרוסה המכילה את התא המסומן בתא מלא ב-PBS.
- העבר את הפרוסה ללהב, לצד התא כלפי מעלה, ייבש אותו ברקמת נייר וטען אותו באמצעות מדיום הרכבה עם עמידות גבוהה.
- השתמש במיקרוסקופ אפידלנטית בהגדלה של 10x ב-Cy5 ו-dapi כדי לבחון את מיקום הגוף התא, ובתצורת gfp כדי להתבונן afferents מסומנים, או מיקרוסקופ קונפוקלית ברזולוציה גבוהה ב 20x עבור מפורטים הסומלית, axonal, ו מורפולוגיה דנדריטית (איור 2D, E). הגדרות הסינון מפורטות בטבלת החומרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההליך המוצג כאן שימש כדי לבטא באור כחול רגיש המתקשר (כרונו) התמזגו GFP ב הגרעין האנארטרו-מתלמוס (ADN), על ידי הזרקת סטריאוטקאית של החדרת וירוס adn הקשורים. הקואורדינטות הסטריאוטקאיות נקבעו על פי אטלס המוח של העכבר ונבדק על ידי הזרקת 200 nL של מעקב פלורסנט פלואורו-אודם. החיה הוקרבה 10 דקות לאחר הזריקה, והמוח הופק ומקובע בן לילה. קטעים המוח coronal היו מוכנים לבחון את אתר ההזרקה, אשר הוצב כראוי והוגבל ADN (איור 1א, ב).
כדי לבטא את כרונו-GFP בנוירונים של ADN, הזרקנו 300 nL של AAV5. צין. כרונו-GFP. מערכת הפעלה שלושה שבועות לאחר ההזרקה, פרוסות המוח האופקי חריפה הוכנו. איור 1 C מראה פרוסת מוח המכילה את אתר ההזרקה התלמי באונה הימנית, עם ביטוי gfp בירוק. עם הבדיקה עם מיקרוסקופ אפינפרין-פלואורסצנטית מצויד במטרה 4x, GFP המסומנים התווית התלמי נצפו presubiculum (איור 1ג, ד). יצוין כי הinnervated בצפיפות ברבדים שטחיים אני ו III של presubiculum (איור 1ד).
הפעילות של הנוירונים הקדם-שכבתי בשכבה III הוקלטה בתצורת טלאי תא כולו-קלאמפ. הפרפולפרזציה והקטפולזציה של הצעדים הנוכחיים הוחלו בזמן הקלטת וריאציות פוטנציאליות של הממברנה (איור 2א). הנתונים אוחסנו במחשב לניתוח לא מקוון מאוחר יותר של מאפייני ממברנה פעילים ופאסיביים. שכבת presubicular התאים העיקריים השלישי בדרך כלל בעל פוטנציאל שלילי מנוחה קרוב ל-63 mV ונדרש לדיכוי זריקות הנוכחי כדי לכונן את פוטנציאל הממברנה לסף ירי. תיאור מלא של המאפיינים הפנימיים שלהם פורסם11.
מגרה adn אקסון מסופים המבטא כרונו-gfp מעורר התגובה הפוסט-סינפטית פוטנציאל (epsps) בתאים העיקריים השלישי שכבת הראשי במצב קלאמפ הנוכחי (איור 2B). בהתאם לעוצמת האור, ה-EPSPs יכול להגיע לסף פוטנציאלי לפעולה. תגובות פוסט סינפטיות נצפו גם במצב מלחציים מתח כמו זרמים מרגש פוסט-סינפטית (EPSCs) היו ה (איור 2ג). הEPSCs התפרצות של השהיות באמצעות מגירוי אור היו קצרות (חציון, 1.4 ms10), המציין קשר סינפטית ישיר בין הרובד התלמי השלישי שכבת הנוירונים presubicular. מתעקש EPSCs בתנאי TTX-4AP אישר הפעלה מונוסינפטית זו. ראוי לציין כי תאים אלה הגיבו באופן מהימן לגירוי האור של האקפרנט אקסונים עם תבנית ירי רגילה.
איור 1 : הזרקת סטריאוטקנית בתוך הגרעין התלתלמי (ADN). (א) ייצוג סכמטי של הזריקה. (ב) הזרקת אישור האתר עם fluoro-אודם בסעיף ילתית. ההזחה מצביעה על רמה. ומרחק מברגמה (C) פרוסה אופקית אחרי הזרקת aav-כרונו-gfp בתלמוס. יש לציין את התחזיות האקאליות למערכת הצלעות הפסיצילית. חתך בצד שמאל של הפרוסה (מצוין על ידי משולש שחור) מסמן את האונה הצדדית הצלעות. (ב, ג) סרגל בקנה מידה 1 מ"מ. (ד) תצוגה מוגדלת של הכניסה (ג) עם התחזיות adn לשכבות שטחיות presubicular. סרגל קנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : תא עצב השלישי של השכבה השלישית: מאפיינים פנימיים, תגובה לגירוי בהיר של התתלמי התלמי, והתגלות פוסט-הוק של מורפולוגיה של התא. (א) מעצב הירי ווריאציות פוטנציאליות של השכבה השלישית של תא שכבה השלישי להקטפולזציה והקטאת הצעדים הנוכחיים. (ב, ג) תגובות של השכבה השלישי של תא העצב כדי 2 ms מגירוי קל (ברים כחולים) של תלתלמי הקליט (ב) מהדק הנוכחי ו (C) מהדק מצבי מתח. (ד, ה) שכבה III תא העצב (לבן, המצוין על ידי משולש צהוב ממולא) מוקף משולשים התלמי המבטא כרונו-GFP (ירוק) בשכבות שטחיות presubicular עם כתמים DAPI (כחול) בתמונה אופקית פרוסה עם מיקרוסקופ אפידלנטית ( D, סרגל קנה מידה = 100 μm) ומיקרוסקופ קונפוקלית וקד בהגדלה גבוהה (E, סרגל בקנה מידה = 50 μm). התא ב-(A) מצוין עם משולשים צהובים מלאים. תא עצב שניה, מתמלא חלקית נמצא בפרוסה זו שמצוינת עם משולשים צהובים ריקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהזרקה vivo נגיפית כדי לבטא opsins רגישים לאור באזור המוח המוגדר היא שיטת בחירה עבור הניתוח אלקטרואופטיקה של קישוריות ארוכת טווח פונקציונליות של10,11,17,18. זריקות סטריאוטקאיות מציעות את האפשרות למטרה מדויקת של אזור מסוים במוח. הביטוי של אופסין עם כתב פלורסנט מאפשר בנוחות להעריך את הביטוי המוצלח ואישור של אתר ההזרקה המדויק. השימוש ב-AAV סוג 2/5 מגביל בדרך כלל את הביטוי לאזור המוח המיועד. בדרך זו, אוכלוסייה מוגבלת של נוירונים הוא מנוכר, המבטא ערוצי יונים רגישים לאור בגוף התא שלהם מסופי אקסון. בניסויים הבאים vivo slice לשעבר, אפשר לעורר את מסופי אקסון אלה עם פולסים באור ישירות באזור היעד שלהם, תוך קריאת הילוכים סינפטית מוצלחת באמצעות תיקון-קלאמפ הקלטה של עצב פוסט-synaptically מחובר. הפרוטוקול הנ ל הוא חזק ונוח, וכמה פתקים נוספים עשויים לסייע בביצועים של ניסויים מוצלחים.
ניתן להשתמש בסוגים שונים של הרדמה. המתואר כאן היא הזרקה התוך הצפק של שילוב קטמין-xylazine כהרדמה קלה לשימוש, לטווח קצר עם כאבים נוחים19. עומק ומשך ההרדמה עשוי להשתנות במידה מסוימת. במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך להזריק עוד חצי מנה של קטמין-xylazine במהלך הפרוטוקול. הרדמה isofלאנה יכול להיות חלופה טובה כדי לגרום במהירות רבה יותר וטוב יותר לשלוט על עומק ההרדמה. קואורדינטות של אתרי הזרקה עשויים להיקבע בעזרת אטלס מוח העכבר. בפועל, הקואורדינטות צריכות להיבדק ולהיות מותאמות, במידת הצורך.
תנאי עבודה נקיים הם גם מפתח. מומלץ להשתמש בציוד הגנה חד פעמי, כולל כפפות, כובע המאפיה, וחלוק מעבדה. כאשר ממקמים את החיה במסגרת הסטריאוטקאית, יש לשלם תשומת לב מיוחדת לנוחיותו של בעל החיים, דבר שישפר במידה רבה את יעילות ההרדמה. גוף החיה צריך להיות מיושר עם הראש והצוואר. הצעד הקריטי ביותר במיקום החיה ולפני פתיחת הגולגולת הינו הסתגלות של ציר הברגמה-למדא. במיוחד כאשר מיקוד מבנים במוח עמוק, אפילו סטייה קטנה תיצור שגיאות כאשר הנמכת מחט הזריקה לתוך המוח. במקרים מסוימים, אפשר לבחור ולחשב במכוון מסלול מחט אלכסוני.
עוצמת ההזרקה היא גורם הקובע לקבלת ביטוי אופסין בדיוק מקומי. אמצעי אחסון קטן הוא אידיאלי כדי לזכות באזור החצייה המוגבל היטב. אמצעי אחסון גבוהים יותר עשויים להועיל לכיסוי מלוא ההיקף של אזור יעד גדול. אם שטח גדול צריך להיות מכוסה, כגון מחיצת18, זה עשוי להועיל לשים כמה זריקות קטנות עם מגוון של קואורדינטות שכנות. מרווח הזמן עד ההקלטה vivo אלקטרופזיולוגים לשעבר הוא גם קריטי. נדרש זמן מינימלי לביטוי מלא. בעוד 3 שבועות נראה להיות עיכוב אופטימלי עבור ניסויים אלה11, העיכוב הדרוש עשוי להשתנות בהתאם הנגיף, סוג הסרושלו, ואת המרחק לאזור המוח פוסטסינפטית.
הגישה המתוארת כאן היא עוד יותר חזקה בשילוב עם זריקות בעלי חיים טרנסגניים. העבודה הקודמת יש לנצל קווי העכבר השונים עבור תת הנוירונים GABAergic, על מנת להתמקד במיוחד או PV-או SST-ביטוי interneurons עבור טלאי-קלאמפ הקלטות20. הקלטה כפולה בו זמנית של PV השכנה, והנוירונים או SST והנוירונים בעלי מידות ולאחר מכן מאפשר השוואה של כניסות לטווח ארוך בין שני סוגי תא העצב11. התשואות האלה תוצאות מתוקננת ביחס לסוג תא אחד. סטנדרטיזציה זו חשובה במיוחד במקרים שבהם רמות הביטוי של האטימות משתנות בין בעלי חיים שונים או פרוסות שונות.
בריאות פרוסה חיונית עבור הקלטות מהדק באיכות גבוהה. החמצון התמידי של הפרוסות הוא קריטי, ומהירות חיתוך איטית משפרת באופן משמעותי את איכות משטח הפרוסה. עובי פרוסה של 300 יקרומטר שומר, במידה מסוימת, את שלמות המיקרו מעגלים בסעיפים מראש אופקי, כולל הנוירונים המוח עם גוף התאים שלהם, דנדריטים השלכות מקומיות המקומי, וחיבורים סינפטית מקומיים. סוג של ערוצים מגודרת אור שנבחרו כדי לגרום הפעלה של סיבים כלי לימפה יהיה מאוד להשפיע על הפרמטרים גירוי (משך, אור בעוצמה). כרונו הוא מתקשר כחול רגיש אור, ומגוון רחב של אורכי גל תאורה ניתן להשתמש להפעלה (רגישות השיא סביב 500 nm, אפילו עם עוצמת אור מינימלית של 0.05 mW/mm2, גם הופעל ב 405 nm, ועד 530 ננומטר21 ). יתר על כן, כרונו יש תכונות קינטיקה מהירה בהשוואה ChR2 הקלאסי, אשר מאפשר מגירוי בתדר גבוה והפעלה אמינה של תחזיות טווח ארוך22. בשילוב עם הביטוי של Chrimson, משתנה אדום הזזה, העירור האופטי העצמאי של אוכלוסיות עצביות נפרדות הופך לאפשרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים ברטרנד Mathon, מארי נסאר, Li-Wen הואנג, ו ז'אן סימוננט לעזרתם בפיתוח גרסאות קודמות של פרוטוקול ההזרקה סטריאוטקאית ו מארין מנואל ו פטריס Jegouzo לעזרה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי המשרד הצרפתי לחינוך ומחקר (L. R., L. S.), המרכז הלאומי של אטיודים Spatiales (M. B.), ו-סוכנות הידיעות הלאומית דה לה רצ'רצ'ה גרנט Anr-18-CE92-0051-01 (ד. פ.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN - 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 - 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), New York, N.Y. 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, Pt 17 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic. New York. (2013).
- Huang, L. -W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
