Summary
このプロトコルは、ex vivo脳スライスにおける光遺伝学的刺激を用いて、遠方の脳領域からの長距離入力の細胞型特異的機能的接続性を同定する一連の方法を説明する。
Abstract
細胞型特異的シナプス結合の知識は、脳全体の神経回路を理解するための重要な前提条件である。長距離接続の機能的調査では、特定された遠隔入力の特定の刺激と組み合わせた単一ニューロンの標的を絞った記録が必要です。上流の脳領域を収束させる軸が標的領域に混入する可能性があるため、従来の電気刺激技術では実現が困難な場合が多い。光感受性イオンチャネルのウイルス媒介発現のための特定の脳領域の立体標的は、光でその領域から発信された軸ゾンの選択的刺激を可能にする。脳内立体注射は、脳全体の他の皮質下または皮質領域に加えて、前視体核などの十分に区切られた構造で使用することができる。
ここでは、マウス脳中のチャネルロドプシンを発現するウイルスベクターの正確な立体注射のための技術のセットであり、続いて脳スライス調製における軸線末端の光刺激を行う。これらのプロトコルはシンプルで広く適用可能です。シナプス後に接続されたニューロンからの全細胞パッチクランプ記録と組み合わせることで、軸子の光刺激は、機能的シナプス接続の検出、薬理学的特性評価、および強度の評価を可能にします。さらに、記録されたニューロンのバイオシチン充填は、後のシナプス後ニューロンのポストホック形態学的同定に使用することができる。
Introduction
神経回路を理解するには、脳領域間の接続性を定義する必要があります。古典的な解剖学的トレース方法は、地域間接続を確立することを可能にし、病変研究は情報フローの階層的な組織を理解するのに役立ちます。例えば、空間的な向きと頭方向シグナリングのための脳回路は、視床から前亜皮への情報の方向流れを伴う。これは、下流の後部前subiculumにおける頭部方向信号を劣化させるアンテロドーサルタラミック核(ADN)の病変研究、ならびに海馬グリッド細胞信号1、2によって実証されている。
脳領域間の機能的な接続性は、細胞レベルと細胞内レベルで確立することがより困難です。海馬では、高度に組織化された解剖学により、スライス調製中の電気シミュレーションを使用して経路特異的シナプス接続を調べることができる。CA1の地層ラジエータムに配置された刺激電極は、CA333からのシャファー担保入力を特異的に刺激するために使用することができる。CA1の層ラクノサム分子に置かれた電極を刺激すると、CA14,5への穿開経路入力が活性化する。電気刺激はアクソン端子からの神経伝達物質の放出を活性化します。しかし、 刺激部位の近くにソマタを持つニューロンと通路の軸が活性化します。したがって、ネオコルテックスの場合と同様に、起源の異なる領域の繊維が標的構造内で混ざり合う場合、定義された脳領域からのアフェレントを研究するための使用は限られています。
ニューロンはまた、光で刺激されてもよいです.光学的方法には、ケージ付きグルタミン酸の光活性化が含まれており、これは1つまたは2つの光子レーザー走査と組み合わせることができる。複数の密接に間隔をあけた部位は、組織6に機械的損傷を与えなく、順次刺激されてもよい。これは、シナプス受容体をマッピングするだけでなく、個々のニューロン7を活性化するために正常に使用されています.グルタミン酸アンカシングは局所回路解析に使用できますが、長距離入力の特定の活性化は許可されません。
神経回路における長距離接続性の調査のための選択の方法は、ウイルス媒介性チャネルロドプシン発現の使用である。ここで説明するように生体内立体注射を用いて、光ゲートイオンチャネルの発現を標的とし、所望の脳領域に空間的に制限することができる。このように、チャネルロドプシンは、ある領域からその標的に興奮性または阻害性の接続性をマッピングするのに有効である。トランスフェクトされた軸子末端は、脳スライス調製中の光で刺激され、脳内の特定の回路成分の機能および強度を調べることができるように読み出しとしてパッチクランプ記録を行う。ウイルスの立体注射と組み合わせた光遺伝学的アプローチは、前例のない特異性と遺伝的制御9を提供しています。光で刺激することはさらに高い時間的および空間的な精密10、11を可能にする。
従属体は、海馬および海馬形成12,13の遷移における6層皮質構造である。これは、ADN11からだけでなく、いくつかの他の皮質および皮質下領域14から重要なシナプス入力を受け取ります。従って、前subasubs内のタラミック軸線端子の選択的刺激は、電気刺激またはグルタミン酸の無加分化では不可能である。このプロトコルに記載されているのは、光ゲートチャネルを発現するウイルスベクターの正確な立体注射を用いて脳領域(ADNおよび従属体)間の機能的接続性を決定する方法である。また、標的領域にニューロンを投影する軸子末端の光刺激と、脳スライス調製におけるシナプス後ニューロンの全細胞パッチクランプ記録についても説明する。
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Protocol
すべての手順は、欧州共同体理事会指令(2010/63/EU)に従って行われ、パリデカルト大学の倫理委員会によって承認されました。実験者は、現地の規制に準拠するための手順の承認を取得する必要があります。
1. 実験の計画
- 標的とする脳領域を定義します。マウス脳アトラス15の助けを借りて、注射部位の立体座標を決定する。右のアンテロドーサルタラミック核(ADN)の座標は、ブレグマに対して-0.82後部、横向き0.75、深さ-3.2(mm)です。年齢、性別、ひずみの異なる動物に合わせて座標を調整する必要がある場合があります。
- パイロット実験で蛍光顕微鏡で観測可能な蛍光トレーサー(150~300nL)を注入して座標の正確性を確認し、文書化する(図1A,B)。
- 注入するウイルスの種類を定義します。生産者の推奨通り、-80°Cで6μLアリコートにウイルスを保存します。氷の上に置かれた1アリコを手術室に持ち込み、1日に1~6匹の動物を注射する。AAVの使用のためのバイオセーフティ規制は、国や機関に依存する場合があり、PSM 2フードの使用が必要な場合があります。
注:ここでは、シナプシンプロモーター:AAV5の制御下で緑色蛍光タンパク質に融合した高速チャネルロドスピン-2変異体であるクロノスを発現するAAV2/5血清型を使用します。Syn.クロノス-GFP.WPRE.bGH.
2. 立体手術
- 安定した標準的な実験室のベンチにポンプホールダーが装備されている立体フレームを取付す。動物の頭が置かれるゾーンをはっきりと見るようにステレオスコープを調整します。照明には LED 光源を使用します。ステレオスコープを回転させてポンプホルダーにアクセスしますが、これは手術の最初のステップでは必要ありません。
- ポンプホルダーに33Gベベルメタルニードルを装備した10μLハミルトンシリンジを取り付けます。吐出システムを水でテストします。
- 塩酸ケタミンとキシラジンの混合物の精前注射で4〜5週齢のC57BL6マウスを麻酔する(それぞれ100mg/kgおよび10mg/kg)。0.9%NaClの8.5 mLでケタミン1mLとキシラジンの0.5 mLの混合物を調調します。これは、ミックスで 10 mg/mL ケタミンと 1 mg/mL キシラジンになります。.この混合物のうち、動物の体重のグラム当たり10μLを経体内に注入する。麻酔の持続時間は約1時間である。
- 動物がつま先のピンチでよく麻酔されていることを確認します。その後、呼吸を容易にするために舌を引き出します。頭蓋の毛を剃る。
- 塩酸リドカインの20 μLを局所麻酔のために頭の皮膚の下に注入し、効果が始まるのを5分間待ちます。乾燥による眼の損傷を避けるために、眼科用のチントで目を覆う。
- 頭蓋骨を露出させるには、小さな手術ハサミで頭皮にストレートカットを作成します。動物を立体フレームに入れ、実際の耳に少しロストラルを挿入して骨の上に休ませ、皮膚を引き下げ、頭蓋骨への良好なアクセスを作成する必要があります。所定の位置に締め付けなさい。ノーズピースを取り付します。
- 高さ調整されたサポートを使用して、頭のレベルで動物の体を水平に維持します。マウスの下に加熱パッドを置き、生理的な温度に保ちます。
- 骨から柔らかいティッシュを取り除くために綿棒で0.9%NaClを適用することによって頭蓋骨をきれいにする。残りの手術にはステレオスコープを使用してください。
- ブレグマラムダ軸が水平になり、鼻と歯の部分を上下に動かないように頭蓋骨を調整します。これは、両方が鼻のレベルの調整後に変更されますので、ブレグマとランバの反復的な措置を必要とします。
- 頭蓋骨の注射部位の位置を見つける。後部および中間座標に従って注射部位の上の注射針を調節し、使い捨て針で頭蓋骨をマークする。注射針を4cm上に動かします。
- ドリル付きの0.5mmバリを使用して、最高速度の半分でマークに直径1mmの開頭術を実現します。綿棒最終的な紙組織で出血する。
- ポンプで完全に排出することにより、貯蔵のためにハミルトンシリンジに含まれている水を空にします。針だけが水で満たされます。針は純粋な脱イオン水で各使用の間に洗浄される。殺菌は必要ありません。
- この日に使用されるウイルスのアリコートを取る。ウイルス溶液がもはや凍結されていないが、冷却されたままであることを確認してください(氷の上で0°Cに近い)。氷から一時的に取り出すだけで、少量用のマイクロピペットで700 nLを得ます。パラフィンフィルムの5 cm x 5 cmの部分にドロップを堆積します。バブルの作成は避けてください。残りのウイルス溶液を氷の上に戻します。
注: ドロップボリュームは、所望の射出量よりも大きくする必要があります (200 nL 注入の場合は 700 nL)。これは、転送中に液体の一部が失われた場合に安全マージンを与え、進む前に小さなテスト排出(ステップ2.16)を行うことを可能にします。 - パラフィンフィルムを開頭術の上に置きます。前皮および横の位置を変えることなく、ウイルス溶液の滴に針を突っ込む。
- ポンプの「撤退」機能を使用して、パラフィンフィルム上に配置されたウイルス溶液の約500 nLで注射器を充填します。 視覚制御(ステレオスコープ)の下でこれを行い、ドロップが消えるのを見て、空気を吸引しないようにしてください。
- 注射器が正しく塗りつぶされていることを確認します。目視制御下で50nLの液体の小さな滴を放出するためにプランジャーを下げることによって、排出システムの機能を確認します。ドロップを拭きます。
- 選択した深さに針を挿入し、立体装置のドーソ通気軸を制御するノブを時計回りに回す。「実行」ボタンを押します(150 nL注入されたボリュームあたりの速度15 nL/分)。少量(使用されるウイルスに応じて50-300 nL)は自動ポンプによって10分以上ゆっくりと排出される。
- 注射部位からの漏れを避けるために注射後10分待ちます。その後、ドーソ通り軸を制御するノブを反時計回りに回して、3〜5分にわたって針をゆっくりと取り外します。
- シリンジを動物から離して、ステレオタックスフレームの垂直部分を回転させます。目詰まりを避けるために、すぐにそれを数回空に充填することにより、きれいな蒸留水で針を洗浄します。水で満たされた注射器を保管してください。
- ステレオタックスフレームからマウスを取り外します。皮膚を4-0ポリアミド縫合糸フィラメントで縫合する。2-1-1標準的な外科結び目で結ばれた3つまたは4つのステッチを作る。
- 麻酔から完全に目が覚めるまで加熱されたケージにマウスを置き、地面に置かれたペトリ皿に水と浸した食べ物を提供します。熱源がケージの下にある場合は、スペーサーグリッドを使用して過熱を避けます。
注:地元のガイドラインに従って、ケトプロフェン(2-5 mg/kg、皮下)またはブプレノルフィン(0.05-0.1 mg/kg、皮下)の単回用量は、痛みを防ぐために適用されてもよい。 - 動物が完全に目を覚ましているときは、それを自宅のケージに戻し、特に注射の翌日に、その幸福を監視します。痛みの兆候を確認します。何らかの行動の変更が観察された場合、動物は体重を監視するために計量されます。
- 使用されるウイルスに応じて、完全な発現の時間は異なる場合があります。ここでは、AAV5の発現に3週間を許可する。Syn.クロノス-GFP.
3. 急性スライスの記録および固定のための解決
- 10x濃縮切断液(125mM NaCl、25mMショ糖、2.5mM KCl、25mM NaHCO 3、1.25mM NaHH2PO4、および2.5mM D-グルコース)および人工脳脊髄液(ACSF)溶液(124 mM NaCl、2.5M MM)のストック溶液を調製NaHCO3,1mM NaH2PO4,および11mM D-グルコース)は、電気生理学実験の前に純粋な脱イオン化水中である。これらの溶液をCaCl 2およびMgCl2なしで1Lボトルで4°Cに保管してください。
- 実験当日、切断液とACSF10xのストック溶液をそれぞれ0.5Lの最終容積に希釈します。磁気攪拌機で攪拌し、95%/5%O2/CO2で泡立てて酸素化します。切断液に対して0.1mMCaCl2および7 mM MgCl2の最終濃度を得るために二価イオンを添加し、ACSFに対して2mMCaCl2および2mM MgCl2を得る。
- 含有するカリウム-グルコン酸カリウムベースのピペット溶液を調製する:135 mM K-グルコン酸、 1.2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2,4 mM MgATP, 0.4 mM トリス-GTP, 10 mM Na2-ホスホクレアチン, およびポストホック細胞のための 2.7-7.1 mM バイオシシン形態学の啓示。溶液のpHを7.3に調整し、浸透度を290 mOsmに調整します。-20 °Cで1 mLのアリコートを保存します。
- 蒸留水の500 mLでBupH PBSドライブレンドパウダーパウチを希釈することにより0.1 M PBSを調製し、0.1Mリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH 7.2を得る。
- 4%PFA溶液の1Lを調出すために、蒸留水中で36%液体PFAの111 mLと10x PBS溶液の90 mLを希釈する。
- 0.1 M PBSの500 mLで150gのショ糖を含む30%ショ糖溶液を調出す。
4. 脳スライスの調製
- 灌流の前に吸収性ベンチペーパーでベンチスペースを準備します。
- 重力供給灌流のためにベンチの上に約1メートルの点滴を取り付けます。24Gの蝶の針を取り付けます。
- ビブラートムの切断室を氷で囲み、冷凍庫に保管します。
- 手術に使用されるのと同じケタミン-キシラジン混合物の精前注射でマウスを麻酔する。鉗子でつまむことで麻酔の段階を評価する。完全に眠るとき、100 μLのヘパリン(5000 U.I./mL)を経口に注入する。
- 吸収性紙に粘着テープで動物を固定し、背中に横たわっています。横隔膜から上向きに小さなはさみで左右の肋骨を切って胸郭を開きます。粘着テープの助けを借りて胸腔ケージを開いたままにします。
- 4 °C冷却して酸素化した心臓の左心室を介して止虫とパーフューズで下降大動脈をクランプし、24G蝶の針を通して溶液を切断します。5の後、小さなはさみで右のアトリウムを開きます。
- 灌流の5分後、臓器が無血の場合は、灌流を停止する。大きなはさみで動物を切断し、ペトリ皿で4°C冷却し、酸素化切断液に頭を吸収します。
- 脳を抽出するには、首から鼻に皮膚を切り取り、頭蓋骨から最後の椎骨をはさみで切り取る。手動で皮膚を引き込み、小さなはさみを使用して頭蓋骨を開き、中線に沿って、より上向きに、目の間に切り取ります。
- 湾曲したまたは骨の鉗子を持つ前頭骨と口蓋骨部分を慎重に取り除きます。脳と頭蓋床の間に器具を挿入し、嗅球、視神経および他の頭蓋神経、小脳を区切ることによって、小さな丸みを帯びたへらで脳を抽出する。
- ビーカーで氷冷切断液(4°C)で脳を静かに浸します。フィルターペーパーの上に脳を置き、皮質表面を穏やかに乾燥させます。脳皮質をビブラートの標本ホルダーに接着し、刃に向かって側を向けて、水平な脳のスライスをカットします。
- 脳が完全に浸透するので、氷冷酸素切断液で切断室を埋めます。スライスに潜在的な左右のあいまいさを避けるために、左半球(注入側と反対側)にカットを行います。
注意:常に溶液を酸素化し、光の露出からスライスを保護します。 - 1 mm 振幅で 0.07 mm/s の速度で、ビブレーターで 300 μm の厚さのスライスをカットします。この段階では、蛍光灯(440-460nm)と対応するフィルターメガネ(500nmロングパス)を使用して、視床内のクロノス-GFP発現を簡単に確認することをお勧めします。
- メスで海馬領域を分離し、入浴温めたビーカー(34°C)で満たされたチャンバーに移し、酸素化(95%/5%O 2/CO2)ACSFに移します。
- 15分後、加熱された水浴からチャンバーを取り出し、スライスを室温で休ませ、使用するまで少なくとも45分間酸素化します。
5. 全セルパッチクランプ記録
- 海馬複合体を含む脳スライスを、直立顕微鏡に取り付けた記録室にカスタムメイドのガラス転写ピペットでゆっくりと移します。転写ピペットは、ゴム製ピペット電球に取り付けられた短縮されたパスツールピペット(内径6.5mm)で作られています。連続的に34 °C(温めた)ACSFで記録室(3 mL)を注入し、95%/5%O2/CO2で泡立たします。蠕動ポンプの速度を2-3 mL/分に設定します。
- 青色LED照明(470nm)で対象領域のアクソン端子におけるクロノス-GFP式を簡単に調べ、4倍の目的で観察します。GFP蛍光は、適切な発光フィルタを通じて可視化され、CCDカメラ画像がコンピュータ画面に表示されます。
- U字型のプラチナワイヤーで作られたスライスアンカーをスライスにしっかりと間隔をあけたナイロンストリング(「ハープ」)を置き、それを維持します。
- 63倍の没入目標に変更し、フォーカスを調整します。クロノス-GFPを発現する軸を確認し、パッチ記録のためのピラミッド型ニューロンを選択します。
- 目的を上に移動します。
- ホウケイ酸ガラスからブラウン燃える電極引き身を使用してピペットを引っ張ります。引き手は先端の直径のおよそ1 μmのピペットを作り出すために設定される。ピペットにK-グルコン酸ベースの内部溶液を充填します。
- ヘッドステージのピペットホルダーにピペットを取り付けます。チャンバー内のピペットを下げ、目的の下に先端を見つけます。ピペット抵抗は3~8MΩの間でなければなりません。ピペットから溶液の流出の円盤を見るように、シリンジで光陽性圧力を加え、徐々にピペットと目的をスライスの表面に下げます。
- 電圧クランプ構成でセルにパッチを当てる:識別されたニューロンに近づき、ピペット先端をソマに繊細に押し付けます。正の圧力は、膜表面にディンプルを生成する必要があります。圧力を離してギガオームシール(>1 GΩ抵抗)を作成します。シールしたら、保持電圧を-65 mVに設定します。負圧の鋭い脈拍で膜を壊す:これはピペットのホールダーに接続される管に強い吸引を加えることによって達成される。
- 全細胞電流クランプモードで記録し、過分極および脱分極電流ステップに対するニューロンの応答(図2A)。
注: このプロトコルは、セルのアクティブおよびパッシブ固有のプロパティを決定するために使用されます。カスタム記述された MATLAB ルーチンは、オフライン分析10,16に使用されます。 - クロノスを発現するアフェレントファイバーの全界475nm LED刺激に対する電流または電圧クランプ後の応答を記録します。20 Hzで2ミリ秒の持続時間の10の刺激の列車で刺激する(図2B,C)。光の強度は0.1-2 mWから変化する場合があります。
注:光強度は、目的の下に配置されたフォトダイオードセンサーを搭載したデジタルハンドヘルド光学パワーコンソールで測定しました。2~ 4 ミリ秒の応答待ち時間は、単シナプス接続の特性です。 - 長距離アフェレントと記録されたニューロンとの間のシナプス伝達の性質を調べるために、異なる薬理学的薬剤が使用され得る。ネットワーク活性化を介した間接応答から直接単シナプス応答を薬理学的に区別するには、ACSFに1 μM TTXおよび100 μM 4-APを追加します。
注:グルタミン酸受容体遮断薬の浴室アプリケーションは、放出される神経伝達物質の性質および後浸膜受容体のアイデンティティを決定することを可能にする。例えば、AMPA型グルタミン酸受容体は、APV(100μM)によってNBQX(10μM)およびNMDA受容体によって遮断される。研究の目的に応じて、プロトコルは、時間の経過とともにシナプス応答または応答ダイナミクスの電圧依存性を調査するために考案される場合があります。 - 別の細胞にパッチを当てる元のACSF溶液で洗浄するか、または4%PFAで満たされた小さなバイアルでバイオシチン充填ニューロンを含むスライスを転送します。
- 4%のPFAで一晩固定した後、0.1 M PBS(5分間2x、20分間1倍)でスライスを洗浄します。
- 4°Cで30%ショ糖に保存します。
6. バイオシリンの啓示
- バイオシチンで満たされたニューロンを含む固定スライスを30%のスクロースの滴でガラスブレードに移し、凍結解凍の3サイクルを実行する:スクロースの滴が完全に凍結されるまで、発泡スチロールボックスに1分間処分されたドライアイスにブレードを置き、その後ブレードを手のひらに押して雪解けします。
- スライス3xを0.1 M PBS(5分間2x、1時間50分1x)で洗い、ゆっくりと撹拌します。最後の洗濯は2時間を超えないようにしてください。
- 2%の粉ミルク(20mLで0.4g)を含む攪拌バッファー溶液でRTでスライスを事前インキュベートし、0.1 M PBSで膜を透過するために0.5%トリトンX100(20mLで0.1mL)を飽和させます。
- 2%の粉ミルク、1%のトリトンX100、ストレプトアビジン-Cy5コンジュゲート(1/500)、およびDAPI(1/1000)を0.1M PBSで含有する溶液中で4°Cで一晩インキュベートし、穏やかに攪拌する。
- スライスを0.1 M PBSで3回洗います(5分間2倍、2時間1分)。最後の洗浄は、バックグラウンド染色を減らすために、4時間まで、より長く続くことができます。
- スライスを取り付ける前に、PBSで満たされたチャンバ内のマークされた細胞を含むスライスの側面を識別するためにCy5蛍光マーカーを観察するように構成された10倍倍倍のエピ蛍光顕微鏡を使用してください。
- スライスをブレードに移し、セル側を上にして、紙ティッシュで乾かし、高抵抗の取り付け媒体を使用して取り付けます。
- Cy5およびDAPI構成で10倍の倍率でエピ蛍光顕微鏡を使用して細胞体の位置を調べ、GFP構成でマークされたアフェレントを観察するか、または20倍の高リゾリューション共焦点顕微鏡を20倍で観察し、詳細な体性、軸軸、および樹状形態学 (図 2D,E)フィルタの設定については、[材料の表]を参照してください。
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Representative Results
ここで提示される手順は、視床(ADN)の前歯核(ADN)でGFPに融合した青色光感受性チャネルロドプシン(Chronos)を発現するために用いられた。立体座標はマウス脳アトラスに従って決定し、蛍光トレーサーフルオロルビーの200 nLを注入することによって試験した。動物は注射の10分後に犠牲になり、脳を一晩抽出して固定した。冠状脳切片は、正しく配置され、ADNに限定された注射部位を調べるために準備された(図1A,B)。
ADNのニューロンでクロノス-GFPを発現させるために、AAV5の300nLを注入した。Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH. 注射の3週間後, 急性水平脳スライスを調製した.図 1Cは、右半球にタラミック注射部位を含む脳スライスを示し、GFP発現は緑色である。4倍目的を備えたエピ蛍光顕微鏡で検査したところ、GFP標識のタラミック軸ソンが前亜クルムで観察された(図1C,D)。視膜軸が前亜クルムの表面層IおよびIIIを緻密に内在させることが指摘された(図1D)。
層IIIにおけるサブキュラニューロンの活性は、全細胞パッチクランプ構成に記録された。膜電位変動を記録しながら過偏光・脱分極電流ステップを施した(図2A)。データは、アクティブおよびパッシブ膜特性の後でオフライン分析のためにコンピュータに保存されました。経次層III主細胞は、典型的には-63 mVに近い負の休止電位を有し、膜電位を焼成しきい値に駆動するために脱分極電流注入を必要としていた。彼らの組み込みプロパティの完全な説明が公開されています11.
Chronos-GFPを発現するADN軸ゴン末端子を刺激し、現在のクランプモードにおけるサブスリア層III主細胞において興奮性シナプス電位(EPSP)を誘発した(図2B)。光の強度に応じて、EPSP はアクションの潜在的なしきい値に達する可能性があります。興奮性シナプス電流(EPSC)が引き出されたとして、電圧クランプモードにおいてもポストシナプス応答が観察された(図2C)。光刺激によって誘発されたEPSCの発症待ち時間は短く(中央値、1.4ms10)、視節軸と層IIIのサブスリアニューロンとの間の直接シナプス接触を示した。TTX-4AP 条件で EPSC を永続化することで、この単シナプス活性化が確認されました。これらの細胞は、規則的な発射パターンを持つアフェレント軸を伴う光刺激に確実に反応した点が注目に値する。
図 1: 前臭のタラミック核(ADN)における立体注射。(A)注射の概略表現。(B)冠動脈部にフルオロルビーを含む注射部位確認。インセットは、アンテロドーサルレベルとブレグマからの距離を示します。(C)視床におけるAAV-クロノス-GFP注射後の水平スライス。イプシタル前subiculumに対する軸索突起に留意すべきである。スライスの左側の切開(黒い三角形で示される)は、反対側の半球を示します。(B, C)スケール バー 1 mm (D)前亜面層への ADN 投影を使用した(C)内のインセットの拡大図。スケールバー = 100 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 従属層IIIニューロン:固有の性質、タラミックアフェレントの光刺激に対する応答、および細胞形態のポストホック啓示。(A)過分極および脱分極電流ステップのための層IIIニューロンの焼成パターンおよび膜電位変動。(B, C)(B)電流クランプおよび(C)電圧クランプモードで記録されたタラミック軸線の2ms光刺激(青い棒)に対する層IIIニューロンの応答。(D、E)層IIIピラミッドニューロン(白、満たされた黄色の三角形で示される)は、上蛍光顕微鏡で画像化された水平スライスでDAPI染色(青)を有するサブキュラ表面層でクロノス-GFP(緑色)を表すタラミック軸線で囲まれています(D、スケールバー=100μm)と高倍率で共焦点顕微鏡(E、スケールバー=50μm)。(A)のセルは、黄色の三角形で塗りつぶされた色で示されます。2番目の、部分的に充填されたニューロンは、空の黄色の三角形で示されるこのスライスに存在します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
定義された脳領域で光感受性オプシンを発現する生体内ウイルス注射は、長距離機能的接続性10、11、17、18の光遺伝学的分析のための選択方法である。ステレオタキシック注射は、正確に脳の特定の領域をターゲットにする可能性を提供します.蛍光レポーターとのオプシンの共発現は、成功した発現の評価と正確な注入部位の確認を便利に可能にする。AAV血清型2/5の使用は、通常、標的脳領域への発現を制限する。このようにして、ニューロンの制限された集団がトランスフェクトされ、細胞体内および軸線端子に光感受性イオンチャネルが発現される。その後のex vivoスライス実験では、これらの軸線端子をターゲット領域に直接光パルスで刺激し、シナプス後に接続されたニューロンのパッチクランプ記録を介して成功したシナプス伝達を読み取り得る。上記のプロトコルは堅牢で便利であり、いくつかの追加の注意事項は、実験の成功のパフォーマンスに役立つ場合があります。
異なるタイプの麻酔が使用されてもよい。ここで説明するケタミン-キシラジンの組み合わせの経皮注射は、便利な鎮鎮薬19を用いた使いやすい短期麻酔である。麻酔の深さと持続時間はある程度異なる場合があります。場合によっては、プロトコル中にケタミン-キシラジンの別の半用量を注入する必要があるかもしれません。イソファラン麻酔は、麻酔の深さをより迅速かつより良く制御するための良い代替手段となりうる。注射部位の座標は、マウス脳アトラスの助けを借りて決定されてもよい。実際には、必要に応じて座標をテストおよび調整する必要があります。
クリーンな労働条件も重要です。手袋、モブキャップ、ラボコートなどの使い捨て保護具を使用することをお勧めします。ステレオタキスティックフレームに動物を配置する場合、麻酔の効率を大幅に向上させる動物の快適さに特別な注意を払う必要があります。動物の体は、頭と首に整列する必要があります。動物の位置と開頭術の前に最も重要なステップは、ブレグマラムダ軸の調整です。特に深い脳の構造を標的にする場合、小さな偏差でも脳に注射針を下げるとエラーが発生します。場合によっては、斜めの針の軌道を意図的に選択して計算する場合があります。
射出量は、正確に局在するオプシン式を得るための決定要因である。小さい容積は厳密に制限されたトランスフェクション地帯の特権に理想的である。ボリュームが大きいほど、大きなターゲット領域の全範囲をカバーするのに役立ちます。中隔18など、広い領域をカバーする必要がある場合は、隣接する座標の範囲を持ついくつかの小さな注入を配置すると便利です。生体電気生理学的記録までの間隔も重要である。式全体を表現するための最小時間が必要です。3週間はこれらの実験に最適な遅延であるように見えるが、必要な遅延は、ウイルス、その血清型、および後の脳領域までの距離によって異なる場合がある。
ここで説明するアプローチは、トランスジェニック動物の注射と組み合わせるとさらに強力です。以前の研究は、GABAergicニューロンのサブタイプに対して異なるマウスラインを利用し、パッチクランプ記録20用のPV-またはSST発現インターニューロンのいずれかを具体的に標的とするために行った。隣接するPVおよびピラミッド型ニューロンまたはSSTおよびピラミッド型ニューロンの同時二重記録は、2つのニューロンタイプ11間の長距離入力の強度の比較を可能にする。これは、1つのニューロンタイプに対して標準化された結果をもたらす。この標準化は、オプシンの発現レベルが異なる動物または異なるスライス間で異なる場合に特に重要です。
スライスの正常性は、高品質のパッチクランプ記録に不可欠です。スライスの一定の酸素化は非常に重要であり、遅い切断速度は大幅にスライス表面の品質を向上させます。300 μmのスライス厚さは、細胞体を持つピラミッド状ニューロン、樹状および局所軸方向の衝突、局所シナプス接続を含む水平前subsubalセクションのマイクロ回路の完全性をある程度保持します。アフェレント繊維の活性化を誘発するために選択された光ゲートチャネルのタイプは、刺激パラメータ(持続時間、光強度)に大きく影響します。クロノスは青色の光感受性チャネルロドプシンであり、広い範囲の照明波長を活性化に使用することができます(ピーク感度は500nm前後、光強度は0.05 mW/mm2でも、405nmで活性化され、最大530nm21).さらに、クロノスは、高周波刺激と長距離投影22の信頼性の高い活性化を可能にする古典的なChR2と比較して、高速運動特性を有する。赤シフトオプシン変異体であるChrimsonの発現と組み合わせることで、異なる神経集団の独立した光学励起が実現可能となる。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
Acknowledgments
私たちは、ベルトラン・マトン、メリー・ナサール、Li-Wen Huang、ジャン・サイモンネットが、ステレオタキシック注射プロトコルの以前のバージョンの開発に協力し、マリン・マヌエルとパトリス・ジェグーゾに技術的な助けを与えてくださったことに感謝します。この研究は、フランスの教育研究省(L.R.、L.S.)、センター・ナショナル・デ・エチュード・スプライス(M.B.)、アジェンス・ナショナル・デ・ラ・レヒャーチェ・グラントANR-18-CE92-0051-01(D.F.)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN - 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 - 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
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