Summary
Este protocolo descreve um conjunto de métodos para identificar a conectividade funcional específica do tipo de célula de entradas de longo alcance de regiões cerebrais distantes usando estimulações optogenéticas em fatias de cérebro ex vivo.
Abstract
O conhecimento da conectividade sináptica específica do tipo celular é um pré-requisito crucial para a compreensão de circuitos neuronais cerebrais. A investigação funcional de conexões de longo alcance requer gravações direcionadas de neurônios únicos combinados com a estimulação específica de entradas distantes identificadas. Isto é frequentemente difícil de conseguir com técnicas convencionais e elétricas da estimulação, porque os axônios das áreas ascendentes convergentes do cérebro podem misturar-se na região de alvo. A segmentação estereotaxica de uma região cerebral específica para a expressão mediada por vírus de canais iônicos sensíveis à luz permite a estimulação seletiva de axônios originários daquela região com luz. As injeções Stereotaxic intracerebral podem ser usadas em estruturas bem delimitadas, tais como os núcleos thalamic anteriores, além do que outras áreas subcortical ou corticais durante todo o cérebro.
Descrito aqui é um conjunto de técnicas para a injeção estereotaxica precisa de vetores virais expressando channelrhodopsina no cérebro do rato, seguido por fotoestimulação de terminais AXON na preparação fatia do cérebro. Esses protocolos são simples e amplamente aplicáveis. Em combinação com a gravação da braçadeira de remendo da todo-pilha de um Neuron pós-sinapticamente conectado, o photoestimulação dos axônios permite a deteção de conexões sináptica funcionais, de caracterização farmacológica, e de avaliação de sua força. Além, o enchimento do biocytin do neurônio gravado pode ser usado para a identificação morfológica post-hoc do neurônio pós-sináptica.
Introduction
A definição de conectividade entre regiões cerebrais é necessária para compreender os circuitos neurais. Os métodos anatômicos de traçado clássicos permitem estabelecer a conectividade inter-regional, e os estudos da lesão ajudam a compreender a organização hierárquica do fluxo de informação. Por exemplo, os circuitos cerebrais para a orientação espacial e a sinalização do sentido da cabeça envolvem o fluxo direcional da informação do tálamo ao presubiculum. Isto foi demonstrado por estudos de lesão de núcleos talâmicos Antero-dorsais (ADN) que degradam o sinal de direção da cabeça no presubiculum dorsal a jusante, bem como osinal de célulade grade hipocampal1,2.
A conectividade funcional entre as áreas cerebrais é mais difícil de estabelecer a nível celular e subcelular. No hipocampo, uma anatomia altamente organizada permite investigar conexões sinápticas via-específicas usando simulação elétrica na preparação da fatia. Eletrodos de estimulação colocados no radiatum de estrato de CA1 podem ser usados para estimular especificamente a entrada colateral de Schaffer de3a. Estimular eletrodos colocados em estrato lacunosum moleculare de CA1 ativará a entrada derivação caminho para CA14,5. A estimulação elétrica ativa a liberação do neurotransmissor dos terminais do AXON; no entanto, ele ativa os neurônios com SOMATA perto do local de estimulação, bem como axônios de passagem. É, portanto, de uso limitado para estudar aferentes de regiões cerebrais definidas quando fibras de diferentes regiões de origem se misturam na estrutura-alvo, como é tipicamente o caso no neocórtex.
Os neurônios também podem ser estimulados com a luz. Os métodos ópticos incluem a fotoativação do glutamato enjaulado, que pode ser combinada com a digitalização a laser de um ou dois fótons. Vários locais com espaçamento próximo podem ser estimulados sequencialmente, sem danos mecânicos ao tecido6. Isso foi usado com sucesso para mapear os receptores sinápticos, bem como ativar os neurônios individuais7. Quando o glutamato que uncaging puder ser usado para a análise de circuito local, não permite a ativação específica de entradas de longo alcance.
Um método de escolha para a investigação da conectividade de longo alcance em circuitos neuronais é o uso da expressão de channelrhodopsina mediada por vírus. Usando injeções estereotaxicas in vivo como descrito aqui, a expressão de canais iônicos leves pode ser direcionada e espacialmente restrita a uma região cerebral desejada. Desta forma, channelrhodopsins são eficazes para mapear a conectividade excitatória ou inibitório de uma região para o seu alvo. Os terminais dos axônios transfected podem ser estimulados com luz em uma preparação da fatia do cérebro, e as gravações da remendo-braçadeira como uma leitura-para fora permitem o exame das funções e dos pontos fortes de componentes específicos do circuito no cérebro8. A aproximação optogenética combinada com a injeção Stereotaxic de um vírus oferece a especificidade sem precedentes e o controle genético9. Estimular com luz Adicionalmente permite a precisão temporal e espacial elevada10,11.
O presrubiculum é uma estrutura cortical de seis camadas na transição do hipocampo e a formação para-hippocampal12,13. Recebe a entrada sináptica importante do ADN11 mas também de diversas outras regiões corticais e subcortical14. Assim, a estimulação seletiva de terminais thalamic dos axônios dentro de uma fatia presubicular não é possível com estimulação elétrica nem glutamato uncaging. Descritos neste protocolo são métodos para determinar a conectividade funcional entre as regiões cerebrais (ADN e presubiculum) usando injeções estereotaxicas precisas de vetores virais expressando canais de luz bloqueada. Também descrito é a fotoestimulação dos terminais de axônios de projetar neurônios em sua região-alvo, juntamente com gravações de patch-Clamp de células inteiras de neurônios pós-sinápticos na preparação da fatia cerebral.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a diretiva do Conselho da Comunidade Europeia (2010/63/UE) e aprovados pelo Comitê de ética da Universidade de Paris Descartes. O experimentador deve obter autorização para que o procedimento cumpra as regulamentações locais.
1. planejamento do experimento
- Defina a área do cérebro a ser alvejada. Determine as coordenadas estereotaxicas do local da injeção com a ajuda de um Atlas do cérebro do rato15. Para o núcleo talâmico Antero-dorsal direito (ADN), as coordenadas são:-0,82 posterior, 0,75 lateral,-3,2 profundidade (mm) em relação à Bregma. As coordenadas podem necessitar de ser ajustadas para animais de diferentes idades, sexo ou estirpe.
- Confirme e documente a exatidão das coordenadas injetando um traçador fluorescente (150 a 300 nL) observável com um microscópio de epifluorescência em um experimento piloto (Figura 1a, B).
- Defina o tipo de vírus a ser injetado. Armazene o vírus em alíquotas de 6 μL a-80 ° c, conforme recomendado pelo produtor. Trazer 1 alíquota colocada no gelo para a sala de cirurgia, para injeção de um a seis animais em um determinado dia. Os regulamentos de biossegurança para o uso de AAV podem depender do país ou da instituição, e o uso de um capuz de PSM 2 pode ser exigido.
Nota: aqui, utilizamos um serotipo AAV2/5 expressando Chronos, uma variante channelrhodospin-2 rápida, fundida à proteína fluorescente verde o controle do promotor Synapsin: AAV5. SYN. Chronos-GFP. WPRE. bGH.
2. cirurgia estereottaxica
- Instale um frame Stereotaxic equipado com um suporte da bomba em um banco padrão estável do laboratório. Ajuste o estereoscópio de modo a ver claramente a zona onde a cabeça do animal será colocada. Use uma fonte luminosa do diodo emissor de luz para a iluminação. Gire o estereoscópio afastado para acessar o suporte da bomba, o que não é necessário para os primeiros passos da cirurgia.
- Instale uma seringa de 10 μL Hamilton equipada com uma agulha de metal chanfrada 33 G no suporte da bomba. Teste o sistema de ejeção com água.
- Anestesiar um rato de 4 a 5 semanas de idade C57BL6 com uma injecção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina e xilazina (100 mg/kg e 10 mg/kg, respetivamente). Prepare uma mistura de 1 mL de cetamina e 0,5 mL de xilazina em 8,5 mL de 0,9% de NaCl. Isto resultará em 10 mg/mL de cetamina e 1 mg/mL de xilazina na mistura. Desta mistura, injete intraperitonealmente 10 μL por grama do peso corporal do animal. A duração da anestesia é de cerca de 1 h.
- Verifique se o animal está bem anestesiado com uma pitada de dedo do pé. Em seguida, retire a língua para facilitar a respiração. Raspar o cabelo craniano.
- Injete 20 μL de cloridrato de lidocaína (4 mg/mL; 2 mg/kg) a pele da cabeça para anestesia local e aguarde 5 minutos para que o efeito comece. Para evitar danos oculares devido à secura, cubra os olhos com pomada oftalmológico tópica.
- Para expor o crânio, crie um corte reto no escalpe com tesouras pequenas da cirurgia. Coloc o animal em um frame Stereotaxic, introduzindo as barras da orelha ligeiramente rostral à orelha real para descansar no osso e para puxar para baixo a pele, que deve criar o bom acesso ao crânio. Aperte no lugar. Instale a parte do nariz.
- Mantenha o corpo do animal horizontalmente no nível da cabeça usando uma sustentação altura-ajustada. Coloque uma almofada de aquecimento o mouse para mantê-lo em temperatura fisiológica.
- Limpe o crânio aplicando 0,9% de NaCl com um cotonete de algodão para remover o tecido mole do osso. Use o estereoscópio para o resto da cirurgia.
- Ajuste o crânio de modo que o eixo de Bregma-lambda esteja nivelado, movendo para cima ou para baixo o nariz e a parte dos dentes. Isso requer medidas iterativas de Bregma e lamba, pois ambas irão mudar após o ajuste do nível do nariz.
- Encontre a localização do local de injeção no crânio. Ajuste a agulha de injeção acima do local de injeção de acordo com as coordenadas posteriores e mediais e marque o crânio com uma agulha descartável. Mova a agulha de injecção para cima por 4 cm.
- Use uma rebarba de 0,5 mm com uma broca para realizar uma craniotomia de 1 mm de diâmetro na marca, a uma metade da velocidade máxima. Swab eventual sangramento com um tecido de papel.
- Esvazie a água contida na seringa de Hamilton para armazenamento, ejectando-a completamente com a bomba. Apenas a agulha ainda será preenchida com água. A agulha é lavada entre cada uso com água deionizada pura. A esterilização não é exigida.
- Tome a alíquota do vírus que deve ser usado para este dia. Certifique-se de que a solução viral não está mais congelada, mas permaneceu arrefecida (perto de 0 ° c, no gelo). Apenas retire brevemente do gelo para obter 700 nL com uma micropipeta para pequenos volumes. Deposite a gota num pedaço de 5 cm x 5 cm de película de parafina. Evite criar bolhas. Coloque a solução viral restante de volta no gelo.
Observação: o volume de descarte deve ser maior que o volume de injeção desejado (700 nL para 200 nL injetado). Isto dará uma margem de segurança no caso de algum do líquido é perdido durante a transferência e permite realizar uma pequena ejeção de teste (passo 2,16) antes de prosseguir. - Coloque a película de parafina em cima da craniotomia. Mergulhe a agulha na gota da solução viral sem mudar a posição antero-posterior e lateral.
- Utilize a função "retirar" da bomba para encher a seringa com cerca de 500 nL de solução viral disposta na película de parafina. Faça isso controle visual (estereoscópio), observe a queda desaparecer, e certifique-se de não aspirar a Air.
- Certifique-se de que a seringa foi preenchida correctamente. Verifique o funcionamento do sistema de ejeção dirigindo o êmbolo para testar ejectar uma pequena gota de líquido de 50 nL controlo visual. Limpe a gota.
- Insira a agulha no cérebro para a profundidade escolhida, girando o botão controlando o eixo dorso-ventral do aparelho estereotaxico no sentido horário. Empurre o botão "Run" (velocidade 15 nL/min por volume de 150 nL injetado). Um pequeno volume (50-300 nL, dependendo do vírus utilizado) é lentamente ejetado mais de 10 min com uma bomba automática.
- Aguarde 10 minutos após a injecção para evitar fugas no local da injecção. Em seguida, retire lentamente a agulha sobre 3-5 min girando o botão controlando o eixo dorso-ventral no sentido anti-horário.
- Gire a parte vertical do quadro estereotódico com a seringa longe do animal. Lave imediatamente a agulha em água destilada limpa enchendo-o esvaziando-o diversas vezes, a fim evitar o entupimento. Guarde a seringa preenchida com água.
- Remova o mouse do quadro estereotódico. Sutura da pele com 4-0 filamento de sutura de poliamida. Faça três ou quatro stiches, amarrados com 2-1-1 nós cirúrgicos padrão.
- Coloc o rato em uma gaiola heated até que acorde completamente da anestesia, e forneça a água e o alimento embebido em um prato de Petri coloc na terra. Se a fonte de calor estiver abaixo da gaiola, use uma grade espaçador para evitar o superaquecimento.
Nota: de acordo com as diretrizes locais, uma dose única de cetoprofeno (2-5 mg/kg, por via subcutânea) ou buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg, por via subcutânea) pode ser aplicada para prevenir a dor. - Quando o animal está totalmente acordado, devolvê-lo à sua gaiola de casa e monitorar seu bem-estar, especialmente no dia seguinte à injeção. Verifique se há sinais de dor. Se qualquer modificação comportamental for observada, o animal é pesado para monitorar seu peso corporal.
- Dependendo do vírus usado, o tempo para a expressão completa pode variar. Aqui, nós permitimos 3 semanas para a expressão de AAV5. SYN. Chronos-GFP.
3. soluções para gravações de fatias agudas e fixação
- Prepare soluções de estoque de solução de corte concentrada 10x (125 mM de NaCl, 25 mM de sacarose, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1,25 mm NaH2po4 e 2,5 mm D-glucose) e solução de fluido cefalorraquidiano artificial (ACSF) (124 mm NaCl, 2,5 mm KCl, 26 mm NaHCO3, 1 mm NaH2po4 e 11 mm D-glucose) em água desionizada pura antes de experimentos de eletrofisiologia. Guarde estas soluções a 4 ° c em garrafas de 1 L sem CaCl2 e MgCl2.
- No dia do experimento, diluir as soluções de estoque de solução de corte e ACSF 10x para um volume final de 0,5 L cada. Agitar com um agitador magnético e oxigenar por borbulhar com 95%/5% O2/co2. Adicionar íons divalentes para obter concentrações finais de 0,1 mM CaCl2 e 7 mm MgCl2 para a solução de corte, e 2 mm CAcl2 e 2 mm MgCl2 para ACSF.
- Prepare a solução de pipeta baseada em potássio-gluconato para conter: 135 mM K-gluconato, 1,2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2,4mm MgATP, 0,4 mm Tris-GTP, 10 mm na2-fosfocreatina e 2,7 – 7,1 mm biocitina para células pós-hoc revelação morfológica. Ajuste o pH da solução para 7,3 e osmolaridade para 290 mOsm. Conservar alíquotas de 1 mL a-20 ° c.
- Prepare 0,1 M PBS diluindo malotes em pó de mistura seca de BupH PBS em 500 mL de água destilada, resultando em 0,1 M de fosfato de sódio, 0,15 M NaCl, pH 7,2.
- Para preparar 1 L de solução de PFA de 4%, diluir 111 mL de 36% de PFA líquida e 90 mL de solução de PBS 10x em água destilada.
- Prepare 30% de solução de sacarose contendo 150 g de sacarose em 500 mL de 0,1 M de PBS.
4. preparação de fatias cerebrais
- Prepare o espaço de bancada com papel de bancada absorvente antes da perfusão.
- Instale um gotejamento aproximadamente 1 m acima do banco para a perfusão gravidade-alimentada. Fixe uma agulha de borboleta de 24 G.
- Cerque a câmara de corte do do com gelo e armazene-a em um congelador.
- Anestesiar o rato com injeção intraperitoneal da mesma mistura de cetamina-xilazina utilizada para cirurgia. Avaliar o estágio da anestesia por beliscar o dedo do pé com fórceps. Quando totalmente adormecido, injete 100 μL de heparina (5000 U.I./mL) intraperitonealmente.
- Fixar o animal com fita adesiva sobre o papel absorvente, deitado em suas costas. Abra a gaiola torácica cortando as costelas nos lados esquerdo e direito com pequenas tesouras, do diafragma para cima. Manter a gaiola torácica aberta com a ajuda de fita adesiva.
- Aperte a aorta descendente com um hemostato e perfuse através do ventrículo esquerdo do coração com 4 ° c arrefecido e oxigenado (95%/5% O2/co2), cortando a solução através da agulha de borboleta de 24 G. Após 5 s, abra o átrio direito com uma tesoura pequena.
- Após 5 min de perfusão, quando os órgãos são sem sangue, parar a perfusão. Decapitar o animal com grande tesoura e imfundir a cabeça em 4 ° c refrigerado e solução de corte oxigenada em uma placa de Petri.
- Para extrair o cérebro, corte a pele do pescoço para o nariz, em seguida, seção as últimas vértebras do crânio com tesouras. Manualmente retrair a pele e usar pequenas tesouras para abrir o crânio, cortando-o ao longo da linha média, de caudal a rostral, para cima para entre os olhos.
- Retire cuidadosamente o osso parietal e a parte caudal do osso frontal com fórceps curvo ou ósseo. Extraia o cérebro com uma pequena espátula arredondada inserindo o instrumento entre o cérebro e o assoalho craniano, seccionando o bulbo olfativo, nervo óptico e outros nervos cranianos, e cerebelo.
- Mergulhe suavemente o cérebro na solução de corte gelada (4 ° c) em um copo. Posicione o cérebro no papel de filtro para secar suavemente a superfície cortical. Cole o córtex cerebral-para baixo para o suporte de amostra de um vibratome, com o lado caudal de frente para a lâmina, a fim de cortar fatias cerebrais horizontais.
- Encha a câmara de corte com solução de corte oxigenada gelada para que o cérebro seja totalmente imergido. Faça um corte no hemisfério esquerdo (contralateral ao lado injetado) para evitar a ambigüidade esquerda-direita potencial em fatias.
PRECAUÇÃO: sempre oxigenar a solução e proteger as fatias da exposição à luz. - Corte 300 μm de fatias grossas com o vibratome, a uma velocidade de 0, 7 mm/s a 1 mm de amplitude. Nesta fase, recomenda-se verificar brevemente a expressão Chronos-GFP no tálamo usando uma lanterna fluorescente (440-460 nm) e óculos de filtro correspondentes (500 nm de passagem longa).
- Isolar a região hipocampal com um bisturi e transferi-la para uma câmara posicionada em um béquer preenchido com banho aquecido (34 ° c), oxigenado (95%/5% O2/co2) ACSF.
- Após 15 min, tirar a câmara do banho de água aquecida e deixar as fatias descansar à temperatura ambiente, ainda oxigenada por pelo menos 45 min até o uso.
5. gravação da remendo-braçadeira da inteiro-pilha
- Transfira delicadamente uma fatia do cérebro que contem o complexo hippocampal com uma pipeta de transferência de vidro feito-à-medida à câmara de gravação montada em um microscópio ereto. Uma pipeta de transferência é feita de uma pipeta encurtada de Pasteur (diâmetro interno 6,5 milímetros) unida a uma ampola de borracha da pipeta. Perfuse continuamente a câmara de gravação (3 mL) com 34 ° c (aquecido) ACSF borbulhou com 95%/5% O2/co2. Ajuste a velocidade da bomba peristáltica a 2-3 ml/min.
- Examine brevemente a expressão Chronos-GFP em terminais AXON na região de interesse com iluminação LED azul (470 nm) e observe com um objetivo de 4x. A fluorescência do GFP é visualizada através de um filtro de emissão apropriado, com uma imagem da câmera CCD exibida em uma tela de computador.
- Coloc uma âncora da fatia feita de um fio em forma de U da platina com cordas de nylon firmemente espaçadas ("harpa") na fatia para mantê-la.
- Mude para um objetivo de imersão de 63x e ajuste o foco. Verifique se há axônios expressando Chronos-GFP e escolha um neurônio piramidal para gravação de patches.
- Mova o objetivo para cima.
- Puxe pipetas usando um extrator de eletrodo marrom-flamejante de vidro de borosilicato. O extrator é ajustado para produzir pipetas com aproximadamente 1 μm no diâmetro da ponta. Encha as pipetas com solução interna com base em K-gluconato.
- Monte a pipeta no suporte da pipeta na cabeça-fase. Abaixe a pipeta na câmara e encontre a ponta o objetivo. A resistência da pipeta deve estar entre 3 – 8 MΩ. Aplique uma pressão positiva clara com uma seringa para ver um cone da saída da solução fora da pipeta e diminua progressivamente a pipeta e o objetivo à superfície da fatia.
- Remende a pilha na configuração da tensão-braçadeira: aproxime o neurônio identificado e pressione delicadamente a ponta da pipeta no soma. A pressão positiva deve produzir uma ondulação na superfície da membrana. Liberte a pressão para criar um selo giga-ohm (> 1 resistência GΩ). Uma vez selado, defina a tensão de retenção para-65 mV. Quebre a membrana com um pulso afiado da pressão negativa: isto é conseguido aplicando a sucção forte a um tubo conectado ao suporte da pipeta.
- Registre no modo de pinça atual de células inteiras as respostas do neurônio às etapas atuais de hiperpolarização e despolarizante (Figura 2a).
Nota: Este protocolo será utilizado para determinar propriedades intrínsecas activas e passivas da célula. Rotinas MATLAB personalizadas são usadas para análise off-line10,16. - Registro em corrente-ou tensão-braçadeira pós-sináptica respostas para todo-campo 475 nm LED estimulação de fibras aferentes expressando Chronos. Estimular com trens de 10 estimulações de 2 MS durações em 20 Hz (Figura 2B, C). A intensidade da luz pode variar de 0,1 – 2 mW.
Nota: a intensidade da luz foi medida com um console digital Handheld da potência ótica equipado com um sensor do fotodiodo, posicionado o objetivo. As latências de resposta de 2 – 4 MS são características para uma conexão monosináptica. - Para investigar a natureza da transmissão sináptica entre os aferentes de longo alcance e o Neuron gravado, diferentes agentes farmacológicos podem ser usados. Para distinguir farmacologicamente respostas diretas, monosinápticas de respostas indiretas via ativação de rede, adicionar 1 μM TTX e 100 μM 4-AP ao ACSF.
Nota: a aplicação de banho de bloqueadores dos receptores de glutamato permite determinar a natureza do neurotransmissor que é liberado e a identidade dos receptores pós-sinápticos. Por exemplo, os receptores de glutamato tipo AMPA serão bloqueados pelos receptores NBQX (10 μM) e NMDA pela APV (100 μM). Dependendo do objetivo do estudo, protocolos podem ser concebidos para investigar a dependência de tensão de Respostas sinápticas ou dinâmicas de resposta ao longo do tempo. - Lave com a solução original de ACSF para corrigir outra célula, ou transfira a fatia contendo um neurônio biocytin-enchido em um frasco pequeno enchido com o PFA de 4%.
- Após a fixação durante a noite em 4% PFA, lave a fatia em 0,1 M PBS (2x por 5 min, 1x por 20 min).
- Conservar em 30% de sacarose a 4 ° c.
6. revelação de biocytin
- Transfira as fatias fixas contendo neurônios cheios de biocitina em uma lâmina de vidro em uma gota de sacarose a 30% e realize três ciclos de congelamento-descongelação: Coloque a lâmina no gelo seco disposta em uma caixa de isopor por 1 min até que as gotas de sacarose estejam completamente congeladas, então Pressione a lâmina contra a palma da mão para descongelar.
- Lave a fatia 3x em 0,1 M PBS (2x por 5 min, 1x por 1 h e 50 min), agitadas suavemente. Não exceda 2 h para a última lavagem.
- Pré-incubar a fatia em RT por 2 h em solução tampão agitada contendo 2% de leite em pó (0,4 g em 20 mL) para saturar sítios não específicos e 0,5% de Triton X100 (0,1 mL em 20 mL) para permeabilizar as membranas em PBS de 0,1 M.
- Incubar durante a noite a 4 ° c em uma solução contendo 2% leite em pó, 1% Triton X100, streptavidin-Cy5 conjugado (1/500), e DAPI (1/1000) em 0,1 M PBS, suavemente agitado.
- Lave a fatia três vezes em 0,1 M PBS (2x por 5 min, 1x por 2 h). A última lavagem pode durar mais tempo, até 4 h, para reduzir a coloração de fundo.
- Antes de montar a fatia, use um microscópio da epifluorescência na ampliação 10x configurada para observar Cy5 marcadores fluorescentes a fim identificar o lado da fatia que contem a pilha marcada em uma câmara enchida com o PBS.
- Transfira a fatia para uma lâmina, lado da célula para cima, seque-a com um lenço de papel e monte-a usando um meio de montagem de alta resistência.
- Use um microscópio da epifluorescência na ampliação 10x na configuração de Cy5 e de DAPI para examinar a posição do corpo de pilha, e na configuração de GFP para observar os aferentes marcados, ou um microscópio confocal de alta resolução em 20x para detalhado somático, axonal, e morfologia dendrítica (Figura 2D, E). As configurações de filtro são detalhadas na tabela de materiais.
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Representative Results
O procedimento aqui apresentado foi utilizado para expressar uma channelrhodopsina sensível à luz azul (Chronos) fundida ao GFP no núcleo Antero-dorsal do tálamo (ADN), por injeção estereotóica de vírus anterógrado adeno-associado. As coordenadas Stereotaxic foram determinadas de acordo com um Atlas do cérebro do rato e testadas injetando 200 nL do fluoro-rubi fluorescente do Tracer. O animal foi sacrificado 10 min após a injeção, e o cérebro foi extraído e fixado durante a noite. As seções do cérebro coronal foram preparadas para examinar o local da injeção, que foi coloc corretamente e limitado ao ADN (Figura 1a, B).
A fim de expressar Chronos-GFP em neurônios de ADN, injetamos 300 nL de AAV5. SYN. Chronos-GFP. WPRE. bGH. três semanas após a injeção, as fatias horizontais agudas do cérebro foram preparadas. Figura 1 C mostra uma fatia cerebral contendo o local de injeção talâmica no hemisfério direito, com expressão de GFP em verde. Após a inspeção com um microscópio de EPI-fluorescência equipado com um objetivo de 4x, os axônios talâmicos rotulados com GFP foram observados no presrubiculum (Figura 1C, D). Observou-se que os axônios talâmicos inervaram densamente as camadas superficiais I e III do presubiculum (Figura 1D).
A atividade de neurônios presubiculares na camada III foi registrada na configuração da braçadeira de remendo da todo-pilha. As etapas atuais de hiperpolarização e despolarizante foram aplicadas durante o registro das variações de potencial de membrana (Figura 2a). Os dados foram armazenados em um computador para posterior análise offline das propriedades da membrana ativa e passiva. As células principais da camada III presubicular tipicamente possuíam um potencial de repouso negativo perto de-63 mV e necessitaram de injeções de corrente despolarizantes para impulsionar o potencial da membrana ao limiar de queima. Uma descrição completa de suas propriedades intrínsecas foi publicada11.
Estimulando os terminais de AXON ADN expressando Chronos-GFP desencadeou potenciais pós-sinápticos excitatórios (EPSPs) em células principais da camada presubicular III no modo de pinça atual (Figura 2B). Dependendo da intensidade da luz, os EPSPs podem atingir o limiar potencial de ação. As respostas pós-sinápticas também foram observadas no modo tensão-pinça, pois as correntes pós-sinápticas excitatórias (EPSCs) foram eliciadas (Figura 2C). As latências de início das EPSCs evocadas por estimulações leves foram curtas (mediana, 1,4 MS10), indicando um contato sináptico direto entre os axônios talâmicos e os neurônios presubiculares da camada III. Persistindo epscs na condição de TTX-4ap confirmou esta ativação monosináptico. Vale ressaltar que essas células responderam de forma confiável às estimulações leves de axônios aferentes com padrão de queima regular.
Figura 1 : Injeção Stereotaxic no núcleo thalamic os (ADN). (A) representação esquemática da injecção. (B) confirmação do local de injeção com fluoro-Ruby em uma seção coronal. O Inset indica o nível Antero-dorsal e a distância de Bregma. (C) fatia horizontal após injeção de AAV-Chronos-GFP no tálamo. As projeções axonais ao presubiculum ipsilateral devem ser anotadas. Uma incisão no lado esquerdo da fatia (indicada por um triângulo preto) marca o hemisfério contralateral. (B, C) Barra de escala 1 mm. (D) visão ampliada do embutido em (C) com projeções de ADN para as camadas superficiais presubiculares. Barra de escala = 100 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Neuron da camada III de Presubicular: propriedades intrínsecas, resposta à estimulação clara de aferentes thalamic, e revelação post-hoc da morfologia da pilha. (A) padrão de queima e variações potenciais de membrana do neurônio da camada III para etapas de corrente hiperpolarizante e despolarizante. (B, C) Respostas do neurônio da camada III a 2 estimulações leves da senhora (barras azuis) de axônios thalamic gravados em (B) corrente-braçadeira e (C) modos da tensão-braçadeira. (D, E) Neurônio piramidal da camada III (branco, indicado pelo triângulo amarelo enchido) cercado por axônios thalamic que expressam Chronos-GFP (verde) em camadas superficiais presubicular com mancha de DAPI (azul) na fatia horizontal imaged com um microscópio da epifluorescência ( D, barra de escala = 100 μm) e microscópio confocal em alta ampliação (e, escala bar = 50 μm). A célula em (a) é indicada com triângulos amarelos preenchidos. Um segundo neurônio parcialmente preenchido está presente nesta fatia indicada com triângulos amarelos vazios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A injeção viral in vivo para expressar opsinas sensíveis à luz em uma área cerebral definida é um método de escolha para a análise optogenética da conectividade funcional de longo alcance10,11,17,18. As injeções Stereotaxic oferecem a possibilidade para alvejar precisamente uma área específica do cérebro. A coexpressão de um opsina com um repórter fluorescente permite convenientemente a avaliação da expressão bem sucedida e da confirmação do local preciso da injeção. O uso do serotipo 2/5 de AAV limita tipicamente a expressão à região alvejada do cérebro. Desta forma, uma população restrita de neurônios é transfected, expressando canais iônicos sensíveis à luz em seus corpos celulares e terminais axônio. Em experimentos de fatia ex vivo subsequentes, é possível estimular esses terminais de AXON com pulsos de luz diretamente em sua área alvo, enquanto lê a transmissão sináptica bem-sucedida através da gravação de patch-Clamp de um Neuron pós-synapticamente conectado. O protocolo acima é robusto e conveniente, e algumas notas adicionais podem ajudar no desempenho de experimentos bem-sucedidos.
Podem ser utilizados diferentes tipos de anestesia. Descrito aqui é a injeção intraperitoneal de uma combinação de cetamina-xilazina como uma anestesia fácil de usar e de curto prazo com analgesia conveniente19. A profundidade e a duração da anestesia podem variar até certo ponto. Em alguns casos, pode ser necessário injetar outra meia dose de cetamina-xilazina durante o protocolo. A anestesia com isoflurano pode ser uma boa alternativa para induzir mais rapidamente e controlar melhor a profundidade da anestesia. As coordenadas dos locais de injeção podem ser determinadas com a ajuda de um Atlas cerebral do rato. Na prática, as coordenadas precisam ser testadas e ajustadas, se necessário.
As condições de trabalho limpas também são fundamentais. Recomenda-se usar a engrenagem protetora descartável, incluindo luvas, uma tampa da multidão, e um revestimento do laboratório. Ao posicionar o animal no frame Stereotaxic, a atenção especial deve ser pagada ao conforto do animal, que melhorará extremamente a eficiência da anestesia. O corpo do animal deve ser alinhado com a cabeça e o pescoço. O passo mais crítico no posicionamento do animal e antes da craniotomia é o ajuste do eixo Bregma-lambda. Especialmente quando a segmentação de estruturas cerebrais profundas, mesmo um pequeno desvio irá gerar erros ao abaixar a agulha de injeção no cérebro. Em alguns casos, pode-se deliberadamente escolher e calcular uma trajetória oblíqua da agulha.
O volume de injeção é um fator determinante para a obtenção da expressão de opsina localizada precisamente. Um pequeno volume é ideal para privilegiando uma zona de transfecção firmemente restrita. Volumes mais altos podem ser úteis para cobrir a extensão total de uma grande área de destino. Se uma grande área precisa de ser coberta, tal como o septo18, pode ser útil coloc diversas injeções pequenas com uma escala de coordenadas vizinhas. O intervalo até a gravação eletrofisiológica ex vivo também é crítico. É necessário um tempo mínimo para A expressão completa. Enquanto 3 semanas parecem ser um atraso ideal para esses experimentos11, o atraso necessário pode variar dependendo do vírus, seu sorotipo, e a distância para a região do cérebro pós-sináptica.
A abordagem descrita aqui é ainda mais potente quando combinada com injeções em animais transgênicos. O trabalho precedente explorou linhas diferentes do rato para subtipos de neurônios gabaergic, a fim alvejar especificamente os interneurônios PV-ou SST-expressando para gravações do remendo-grampo20. Simultânea dupla gravação de vizinhos PV e neurônios piramidais ou SST e neurônios piramidais, em seguida, permite a comparação de pontos fortes de entradas de longo alcance entre dois tipos de neurônio11. Isso produz resultados que são padronizados em relação a um tipo de neurônio. Esta padronização é particularmente importante nos casos em que os níveis de expressão de opsinas variam entre diferentes animais ou fatias diferentes.
A saúde da fatia é essencial para gravações de patch-Clamp de alta qualidade. A oxigenação constante das fatias é crucial, e uma velocidade de corte lenta melhora significativamente a qualidade da superfície da fatia. Uma espessura de fatia de 300 μm preserva, até certo ponto, a integridade do microcircuito em seções presubiculares horizontais, incluindo neurônios piramidais com seus corpos celulares, ramificações axonais dendríticas e locais e conexões sinápticas locais. O tipo de canais de luz-fechados escolhidos para induzir a ativação de fibras aferentes influenciará grandemente os parâmetros de estimulação (duração, intensidade da luz). Chronos é um channelrhodopsin luz-sensível azul, e uma escala larga de comprimentos de onda da iluminação pode ser usada para a ativação (sensibilidade máxima em torno de 500 nanômetro, mesmo com intensidade de luz mínima de 0, 5 mW/milímetro2, igualmente ativada em 405 nanômetro, e até 530 nanômetro21 ). Além disso, Chronos tem propriedades de cinética rápida em comparação com a ChR2 clássica, que permite estimulantes de alta frequência e ativação confiável de projeções de longo alcance22. Em combinação com a expressão de Chrimson, uma variante vermelha-deslocada do opsina, a excitação ótica independente de populações neural distintas torna-se praticável.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a Bertrand Mathon, Mérie Nassar, li-Wen Huang, e Jean Simonnet por sua ajuda no desenvolvimento de versões anteriores do protocolo de injeção estereotótaxica e Marin Manuel e Patrice Jegouzo para obter ajuda técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério francês da educação e investigação (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.), e Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN - 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 - 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
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