Summary
Detta protokoll beskriver en uppsättning metoder för att identifiera den cell-typ specifik funktionell anslutning av långväga ingångar från avlägsna hjärnregioner med hjälp av optogenetiska stimuleringar i ex vivo hjärn skivor.
Abstract
Kunskap om cell-typ specifik synaptisk anslutning är en avgörande förutsättning för att förstå hjärnans hela neuronala kretsar. Den funktionella utredningen av långväga anslutningar kräver riktade inspelningar av enstaka nervceller i kombination med den specifika stimulering av identifierade avlägsna ingångar. Detta är ofta svårt att uppnå med konventionell och elektrisk stimulering tekniker, eftersom axoner från konvergerande uppströms hjärnområden kan blandas i målregionen. Stereotaxic-inriktningen av en specifik hjärnregion för virusmedierat uttryck av ljuskänsliga jonkanaler möjliggör selektiv stimulering av axoner som kommer från den regionen med ljus. Intracerebral stereotaxic injektioner kan användas i väl avgränsade strukturer, såsom främre thalamic kärnor, förutom andra subkortikala eller kortikala områden i hela hjärnan.
Beskrivs här är en uppsättning tekniker för exakt stereotaxic injektion av virala vektorer uttrycker channelrhodopsin i mushjärna, följt av photostimulation av axon terminaler i hjärnan slice beredning. Dessa protokoll är enkla och allmänt tillämpliga. I kombination med hela-cell patch klämma inspelning från en postsynaptically ansluten neuron, photostimulation av axoner gör det möjligt att upptäcka funktionella synaptiska anslutningar, farmakologiska karakterisering, och utvärdering av deras styrka. Dessutom kan biocytin fyllning av den inspelade neuron användas för post-hoc morfologisk identifiering av postsynaptiska neuron.
Introduction
Definiera anslutning mellan hjärnregioner är nödvändigt att förstå neurala kretsar. Klassiska anatomiska spårningsmetoder gör det möjligt att etablera interregionala anslutningar och lesionsstudier hjälper till att förstå den hierarkiska organisationen av informationsflödet. Till exempel hjärnkretsar för rumslig orientering och huvudriktning signalering innebär riktad flödet av information från thalamus till presumbiculum. Detta har visats genom lesionsstudier av Antero-dorsala thalamic kärnor (ADN) som försämrar huvud riktnings signalen i nedströms dorsala presumbiculum, liksom parahippocampal Grid cell signal1,2.
Den funktionella anslutningen mellan hjärnområden är svårare att etablera sig på en cellulär och subcellulär nivå. I hippocampus, en mycket organiserad anatomi gör det möjligt att undersöka Pathway-specifika synaptiska anslutningar med hjälp av elektrisk simulering i segmentet förberedelse. Stimulering elektroder placeras i stratum radiatum av CA1 kan användas för att specifikt stimulera Schaffer säkerheter input från CA33. Stimulerande elektroder placerade i stratum lacunosum moleculare av CA1 kommer att aktivera perforant Path input till CA14,5. Elektrisk stimulering aktiverar signalsubstansen frisättning från Axon terminaler; emellertid, det aktiverar nervceller med Somata nära stimulering webbplats samt axoner passage. Det är därför av begränsad användning för att studera afferenter från definierade hjärnregioner när fibrer av olika ursprungsregioner blandas i målstrukturen, vilket är typiskt fallet i hjärnbarken.
Nervceller kan också stimuleras med ljus. Optiska metoder inkluderar ljusaktivering av bur Glutamat, som kan kombineras med en-eller två-Photon laserskanning. Flera tätt placerade platser kan stimuleras sekventiellt, utan mekaniska skador på vävnaden6. Detta har framgångsrikt använts för att kartlägga synaptiska receptorer samt aktivera enskilda nervceller7. Medan glutamat uncaging kan användas för lokal krets analys, det tillåter inte för specifik aktivering av långväga ingångar.
En metod att välja för utredning av långväga anslutning i neuronala kretsar är användningen av virumedierade channelrhodopsin uttryck. Använda in vivo stereotaxic injektioner som beskrivs här, uttrycket av ljus-gated jonkanaler kan riktas och rumsligt begränsas till en önskad hjärnregion. På så sätt är channelrhodopsins effektiva för att kartlägga excitatoriska eller hämmande anslutningar från en region till målet. Transfected axoner terminaler kan stimuleras med ljus i en hjärna slice förberedelse, och patch-klämma inspelningar som en Read-out möjliggör undersökning av funktioner och styrkor av specifika kretskomponenter i hjärnan8. Den optogenetiska metoden kombinerat med stereotaxic injektion av ett virus erbjuder oöverträffad specificitet och genetisk kontroll9. Stimulerande med ljus ger dessutom både hög tidsmässig och rumslig precision10,11.
Den presumbiculum är en sex lager kortikala struktur vid övergången av hippocampus och para-hippocampal formation12,13. Det mottar viktigt Synaptic matar in från ADN11 men också från flera andra kortikala och subkortikala regioner14. Sålunda, selektiv stimulering av thalamic axoner terminaler inom en presumbicular slice är inte möjligt med elektrisk stimulering eller glutamat uncaging. Beskrivs i detta protokoll är metoder för att fastställa funktionell anslutning mellan hjärnregioner (ADN och presumbiculum) med hjälp av exakta stereotaxic injektioner av virala vektorer uttrycker ljus-gated kanaler. Beskrivs också är photostimulation av axoner terminaler av projicering av nervceller i deras mål region, i kombination med hela cellen patch-klämma inspelningar av post-synaptiska neuroner i hjärnan slice förberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden genomfördes i enlighet med Europeiska gemenskapens rådsdirektiv (2010/63/EU) och godkändes av etikkommittén för Paris Descartes universitet. Försöksledaren måste få tillstånd för förfarandet för att följa lokala föreskrifter.
1. planering av experimentet
- Definiera det hjärnområde som ska riktas. Bestäm stereotaxic koordinaterna för injektionsstället med hjälp av en mushjärna Atlas15. För rätt Antero-dorsal thalamic Nucleus (ADN), koordinaterna är:-0,82 posterior, 0,75 lateral,-3,2 djup (mm) i förhållande till bregma. Koordinater kan behöva justeras för djur av olika ålder, kön, eller stam.
- Bekräfta och dokumentera koordinaterna genom att injicera en fluorescerande spårämne (150 till 300 NL) observerbart med ett epifluorescensmikroskopi Mikroskop i ett pilotexperiment (figur 1a, B).
- Ange vilken typ av virus som ska injiceras. Förvara viruset i 6 μL alikvoter vid-80 ° c enligt tillverkarens rekommendationer. Ta 1 alikvot placerad på is till operationssalen, för injektion av ett till sex djur på en given dag. Biosäkerhets bestämmelser för användning av AAV kan bero på landet eller institutionen, och användning av en PSM 2 huva kan krävas.
Obs: här använder vi en AAV2/5 serotyp uttrycker Chronos, en snabb channelrhodospin-2 variant, smält till grönt fluorescerande protein under kontroll av Synapsin promotorn: AAV5. Syn. Chronos-GFP. WPRE. bGH.
2. stereotaxic kirurgi
- Installera en stereotaxic ram utrustad med en pump hållare på en stabil standard laboratorie bänk. Justera stereoskop för att tydligt se den zon där djurets huvud kommer att placeras. Använd en LED-ljuskälla för belysning. Rotera stereoscopet bort för att komma åt pump hållaren, som inte behövs för de första stegen i operationen.
- Installera en 10 μL Hamilton-spruta utrustad med en 33 G avfasad metallnål i pump hållaren. Testa ejektionssystemet med vatten.
- Anesthetize en 4-till 5-veckors gammal C57BL6 mus med en intraperitoneal injektion av en blandning av ketamin hydroklorid och xylazin (100 mg/kg och 10 mg/kg, respektive). Bered en blandning av 1 mL ketamin och 0,5 mL xylazin i 8,5 mL 0,9% NaCl. Detta kommer att resultera i 10 mg/mL ketamin och 1 mg/mL xylazin i blandningen. Av denna blandning, injicera intraperitonealt 10 μL per gram av djurets kroppsvikt. Varaktigheten av anestesi är ca 1 h.
- Kontrollera att djuret är väl anesthetized med en tå nypa. Dra sedan ut tungan för att underlätta andningen. Raka kraniellt hår.
- Injicera 20 μL lidokain hydroklorid (4 mg/mL; 2 mg/kg) under huden på huvudet för lokalbedövning och vänta 5 min för att effekten ska börja. För att undvika ögonskador på grund av torrhet, täck ögonen med aktuell oftalmologiska salva.
- För att exponera skallen, skapa en rak klippa i hårbotten med små kirurgiska saxar. Placera djuret i en stereotaxic ram, sätter öron stänger något rostralt till själva örat för att vila på benet och dra ner huden, vilket bör skapa god tillgång till skallen. Dra åt på plats. Installera näs stycket.
- Behåll djurets kropp horisontellt på huvudets nivå med hjälp av ett höjdjusterat stöd. Placera en värmedyna under musen för att hålla den vid fysiologisk temperatur.
- Rengör skallen genom att applicera 0,9% NaCl med en bomullstuss för att avlägsna mjuk vävnad från benet. Använd stereoscopet för resten av operationen.
- Justera skallen så att bregma-lambda-axeln är nivå, flytta upp eller ner i näsan och tänderna pjäs. Detta nödvändiger iterativa åtgärder av bregma och Lamba, eftersom båda kommer att ändras efter justering av näsan nivå.
- Hitta platsen för injektionsstället på skallen. Justera injektionsnålen ovanför injektionsstället enligt bakre och mediala koordinater och markera skallen med en engångsnål. Flytta injektionsnålen uppåt med 4 cm.
- Använd en 0,5 mm skorr med en borr för att realisera en 1 mm diameter kraniotomi på märket, vid en halv av högsta hastighet. Eventuell blödning med pappers vävnad.
- Töm det vatten som finns i Hamilton sprutan för lagring genom att helt mata ut den med pumpen. Endast nålen kommer fortfarande att fyllas med vatten. Nålen tvättas mellan varje användning med rent avjoniserat vatten. Sterilisering krävs inte.
- Ta den alikvot av virus som ska användas för denna dag. Se till att den virala lösningen inte fryses längre men har förblivit kyld (nära 0 ° c, på is). Endast kort bort från isen för att få 700 nL med en micropipett för små volymer. Deponera Drop på en 5 cm x 5 cm bit paraffin film. Undvik att skapa bubblor. Sätt resterande viral lösning tillbaka på is.
Obs: dropp volymen bör vara större än den önskade injektionsvolymen (700 nL för 200 nL injicerad). Detta kommer att ge en säkerhetsmarginal om en del av vätskan går förlorad under överföringen och gör det möjligt att utföra en liten test utmatning (steg 2,16) innan du fortsätter. - Placera paraffin filmen ovanpå kraniotomi. Doppa nålen i droppe av viral lösning utan att ändra Antero-posterior och laterala position.
- Använd pumpens "uttag" funktion för att fylla sprutan med ca 500 nL av viral lösning som kasseras på paraffin filmen. Gör detta under visuell kontroll (stereoskop), titta på Drop försvinna, och se till att inte aspirera luft.
- Kontrollera att sprutan har fyllts korrekt. Kontrollera att utkastnings systemet fungerar genom att köra ner kolven för att testa att mata ut en liten droppe vätska på 50 nL under visuell kontroll. Torka av droppat.
- För in nålen i hjärnan till det valda djupet, genom att vrida ratten styra Dorso-ventrala axeln av stereotaxic apparaten medurs. Tryck på "Run"-knappen (hastighet 15 nL/min per volym 150 nL injiceras). En liten volym (50-300 nL, beroende på vilket virus som används) långsamt matas ut över 10 min med en automatisk pump.
- Vänta 10 min efter injektionen för att undvika läckage från injektionsstället. Sedan långsamt ta bort nålen över 3-5 min genom att vrida ratten kontrollera Dorso-ventrala axeln motsols.
- Rotera den vertikala delen av stereotaxic-ramen med sprutan bort från djuret. Tvätta genast nålen i rent destillerat vatten genom att fylla-tömma den flera gånger, för att undvika igensättning. Förvara sprutan fylld med vatten.
- Ta bort musen från stereotaxic-ramen. Sutur huden med 4-0 polyamid sutur glödtråden. Gör tre eller fyra stiches, bunden med 2-1-1 standard kirurgiska knop.
- Placera musen i en uppvärmd bur tills den helt vaknar upp från anestesi, och ge vatten och blöt mat i en petriskål placeras på marken. Om värmekällan är under buren, Använd ett spacer rutnät för att undvika överhettning.
Anmärkning: enligt lokala riktlinjer, en engångsdos av ketoprofen (2-5 mg/kg, subkutant) eller buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg, subkutant) kan användas för att förhindra smärta. - När djuret är helt vaken, returnera den till sin hem bur och övervaka dess välbefinnande, särskilt på dagen efter injektionen. Kontrollera om det finns tecken på smärta. Om någon beteendemässig modifiering observeras, är djuret vägs för att övervaka dess kroppsvikt.
- Beroende på vilket virus som används kan tiden för fullt uttryck variera. Här tillåter vi 3 veckor för uttryck av AAV5. Syn. Chronos-GFP.
3. lösningar för akuta segment inspelningar och fixering
- Förbered lagerlösningar av 10X koncentrerad skär lösning (125 mM NaCl, 25 mM sackaros, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1,25 mm NaH2PO4, och 2,5 mm D-glukos) och artificiell cerebrospinalvätska (Acsf) lösning (124 mm NaCl, 2,5 mm KCL, 26 mm NaHCO3, 1 mm NaH2Po4, och 11 mm D-glukos) i ren avjoniserat vatten före elektrofysiologi experiment. Förvara dessa lösningar vid 4 ° c i 1 L flaskor utan CaCl2 och mgcl2.
- På dagen för experimentet, späd lagerlösningar av skärande lösning och ACSF 10X till en slutlig volym av 0,5 L vardera. Agitera med en magnetisk omrörare och syresätta genom att bubblande med 95%/5% O2/Co2. Tillsätt divalenta joner för att erhålla slutliga koncentrationer på 0,1 mM CaCl2 och 7 mm mgcl2 för skär lösningen, och 2 mm CaCl2 och 2 mm mgcl2 för acsf.
- Bered den kaliumglukonat-baserade pipettlösningen till innehåll: 135 mM K-glukonat, 1,2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 4 mm MgATP, 0,4 mm Tris-GTP, 10 mm na2-fosfokreatin och 2,7 – 7,1 mm biocytin för post-hoc-cell morfologi uppenbarelse. Justera lösningens pH till 7,3 och osmolaritet till 290 mOsm. Förvara 1 mL-portioner vid-20 ° c.
- Förbered 0,1 M PBS genom att späda BupH PBS torr-blandning pulver påsar i 500 mL destillerat vatten, vilket resulterar i 0,1 M natriumfosfat, 0,15 M NaCl, pH 7,2.
- För beredning av 1 L 4% PFA-lösning, späd 111 mL 36% flytande PFA och 90 mL 10X PBS-lösning i destillerat vatten.
- Bered 30% sackaroslösning innehållande 150 g sackaros i 500 mL 0,1 M PBS.
4. beredning av hjärn skivor
- Förbered bänk utrymmet med absorberande bänk papper före perfusion.
- Installera ett dropp ca 1 m ovanför bänken för gravitation-Fed perfusion. Fäst en 24 G fjärilnål.
- Omger skärkammaren i vibratome med is och förvara den i en frys.
- Anesthetize musen med intraperitoneal injektion av samma ketamin-xylazin blandning som används för kirurgi. Bedöma stadiet av anestesi genom att nypa tån med pinkoppar. Vid full sömn, injicera 100 μL heparin (5000 U.I./ml) intraperitonealt.
- Fäst djuret med tejp på det absorberande papperet, liggande på ryggen. Öppna bröstkorg genom att skära revbenen på vänster och höger sida med liten sax, från membranet uppåt. Håll bröstkorgen öppen med hjälp av tejp.
- Klämma den fallande aorta med en hemostat och BEGJUTA via vänster kammare i hjärtat med 4 ° c kyls och syresätter (95%/5% O2/Co2), skära lösningen genom 24 G fjäril nål. Efter 5 s, öppna höger förmak med liten sax.
- Efter 5 min av perfusion, när organen är blodlösa, stoppa perfusion. Halshugga djuret med stora saxar och föreställ huvudet i 4 ° c kyls och syrade skär lösning i en petriskål.
- För att extrahera hjärnan, klippa huden från halsen till näsan, sedan avsnitt de sista Kotor från skallen med sax. Manuellt dra tillbaka huden och använda små sax för att öppna skallen, skära den längs mittlinjen, från caudal till rostral, uppåt till mellan ögonen.
- Ta försiktigt bort parietalbenet och kaudala delen av pannbenet med böjda eller benpinps. Extrahera hjärnan med en liten rundad spatel genom att infoga instrumentet mellan hjärnan och kranialgolvet, sektionering av luktbulben, synnerven och andra kranialnerver, och cerebellum.
- Sänk försiktigt in hjärnan i iskall skär lösning (4 ° c) i en bägare. Placera hjärnan på filtrerpapper för att försiktigt torka den kortikala ytan. Limma hjärnbarken-ner till preparathållaren av en vibratome, med den kaudala sidan vänd mot bladet, för att skära horisontella hjärn skivor.
- Fyll skärkammaren med iskallt syresatt skär lösning så att hjärnan är helt immerged. Gör ett snitt på vänster hjärnhalva (kontralateral till den injicerade sidan) för att undvika potentiella vänster-höger tvetydighet på skivor.
FÖRSIKTIGHET: oxygenera alltid lösningen och skydda skivor från ljus exponering. - Skär 300 μm tjocka skivor med vibratome, med en hastighet av 0,07 mm/s vid 1 mm amplitud. I detta skede, är det rekommenderat att kortfattat kontrollera Chronos-GFP uttrycket i thalamus med hjälp av en fluorescerande ficklampa (440-460 Nm) och motsvarande filter glasögon (500 Nm Long pass).
- Isolera Hippocampus regionen med en skalpell och överföra den till en kammare placerad i en bägare fylld med bad-värmas (34 ° c), syrade (95%/5% O2/Co2) acsf.
- Efter 15 min, ta kammaren ur det uppvärmda vattenbadet och låt skivorna vila i rumstemperatur, fortfarande syrade i minst 45 min tills den används.
5. inspelning med hel cells patch-klämma
- Överför försiktigt en hjärn skiva som innehåller Hippocampus-komplexet med en specialtillverkad pipettöverföringspipett till inspelnings kammaren monterad på ett upprätt Mikroskop. En överföringspipett är gjord av en förkortad Pastavpipett (innerdiameter 6,5 mm) fäst på en gummipipett. Kontinuerligt parfymera inspelnings kammaren (3 mL) med 34 ° c (värmd) ACSF bubblade med 95%/5% O2/Co2. Ställ in hastigheten på den peristaltiska pumpen till 2-3 mL/min.
- Kort undersöka Chronos-GFP uttryck i Axon terminaler i regionen av intresse med blå LED-belysning (470 nm) och observera med en 4x mål. GFP-fluorescens visualiseras genom ett lämpligt utsläpps filter, med en CCD-kamerabild som visas på en datorskärm.
- Placera ett segment ankare gjort av en U-formad platina tråd med tätt fördelade nylonsträngar ("harpa") på skiva för att bibehålla den.
- Ändra till ett 63x fördjupnings mål och justera fokus. Kontrollera axoner uttrycker Chronos-GFP och välj en pyramidal neuron för patch inspelning.
- Flytta målet uppåt.
- Dra pipetter med en brun-flammande elektrod avdragare från borosilikatglas. Avdragare är inställd på att producera pipetter med ca 1 μm i spets diameter. Fyll pipetter med K-glukonat-baserad intern lösning.
- Montera pipetten i pipetthållaren på huvudscenen. Sänk pipetten i kammaren och hitta spetsen under målet. Pipettmotståndet ska vara mellan 3 – 8 MΩ. Applicera ett lätt positivt tryck med en spruta för att se en kon av lösnings utflöde ut ur pipetten och successivt sänka pipetten och målet till ytan av segmentet.
- Patch cellen i spännings-klämma konfiguration: närma sig den identifierade neuron och försiktigt trycka pipettspetsen på Soma. Det positiva trycket bör ge en Dimple på membran ytan. Frigör trycket för att skapa en Giga-ohms tätning (> 1 GΩ-resistans). När förseglad, Ställ in håll spänningen till-65 mV. Bryt membranet med en skarp puls av negativt tryck: Detta uppnås genom att tillämpa starkt sug till ett rör som är anslutet till pipetthållaren.
- Spela in i hel cells ström klämma läge Svaren av neuron till hyperpolariserande och depolariserande aktuella steg (figur 2a).
ANMÄRKNINGAR: detta protokoll kommer att användas för att bestämma aktiva och passiva inneboende egenskaper hos cellen. Specialskrivna MATLAB-rutiner används för off-line analys10,16. - Rekord i ström-eller spännings-klämma postsynaptiska svar på hela fältet 475 nm ledde stimulering av afferenta fibrer uttrycker Chronos. Stimulera med tåg av 10 stimuleringar av 2 MS varaktigheter vid 20 Hz (figur 2B, C). Ljusintensiteten kan variera mellan 0,1 – 2 mW.
Obs: ljusintensiteten mättes med en digital handhållen optisk ström konsol utrustad med en fotodiodsensor, placerad under målet. Svars latenser av 2 – 4 MS är karakteristiska för en monosynaptisk anslutning. - För att undersöka vilken typ av synaptisk transmission mellan lång räckvidd afferenter och den inspelade neuron, olika farmakologiska medel kan användas. Att farmakologiskt särskilja direkta, monosynaptiska svar från indirekta svar via nätverks aktivering, tillsätt 1 μM TTX och 100 μM 4-AP till ACSF.
Obs: bad applicering av glutamatreceptorblockerare gör det möjligt att avgöra vilken typ av signalsubstansen som frigörs och identiteten hos postsynaptiska receptorer. Till exempel, AMPA typ glutamatreceptorer kommer att blockeras av NBQX (10 μM) och NMDA-receptorer av APV (100 μM). Beroende på syftet med studien, protokoll kan utformas för att undersöka spänningsberoende av synaptiska svar eller responsdynamik över tid. - Tvätta med original ACSF lösning för att lappa en annan cell, eller överföra segmentet som innehåller en biocytin fyllda neuron i en liten flaska fylld med 4% PFA.
- Efter övernattning fixering i 4% PFA, tvätta segmentet i 0,1 M PBS (2x för 5 min, 1x för 20 min).
- Förvaras i 30% sackaros vid 4 ° c.
6. biocytin uppenbarelse
- Överför de fasta skivor som innehåller biocytin-fyllda neuroner på ett glas blad i en droppe av 30% sackaros och utföra tre cykler av frysning-upptining: placera bladet på torris kastas i en frigolit låda i 1 min tills droppar sackaros är helt frysta, sedan Tryck på bladet mot handflatan för att Tina.
- Tvätta slice 3x i 0,1 M PBS (2x för 5 min, 1x för 1 h och 50 min), försiktigt agiterade. Överskrid inte 2 h för den sista tvätten.
- Pre-Inkubera segmentet vid RT för 2 h i upprörd buffertlösning som innehåller 2% mjölkpulver (0,4 g i 20 mL) för att mätta icke-specifika platser och 0,5% Triton X100 (0,1 mL i 20 mL) för att permeabilisera membranen i 0,1 M PBS.
- Inkubera över natten vid 4 ° c i en lösning som innehåller 2% mjölkpulver, 1% Triton X100, streptavidin-Cy5 konjugat (1/500) och DAPI (1/1000) i 0,1 M PBS, försiktigt upprörd.
- Tvätta skiva tre gånger i 0,1 M PBS (2x för 5 min, 1x för 2 h). Den sista tvätten kan pågå längre, upp till 4 h, för att minska bakgrunds färgning.
- Innan du monterar segmentet, Använd ett epifluorescensmikroskopi Mikroskop vid 10X förstoring konfigurerad för att observera Cy5 fluorescerande markörer för att identifiera den sida av segmentet som innehåller den markerade cellen i en kammare fylld med PBS.
- Överför segmentet till ett blad, cell-sida upp, torka den med en pappers vävnad, och montera den med hög motståndskraft monteringsmedel.
- Använd ett epifluorescensmikroskop vid 10X förstoring i Cy5 och DAPI-konfiguration för att undersöka cell kroppens placering, och i GFP-konfiguration för att iaktta de markerade afferenterna, eller ett högupplöst konfokalmikroskop vid 20x för detaljerad somatisk, axonal och dendritiska morfologin (figur 2D, E). Filter inställningarna beskrivs i tabellen med material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det förfarande som presenteras här användes för att uttrycka en blå ljuskänsliga channelrhodopsin (Chronos) smält till GFP i Antero-dorsal kärnan i thalamus (ADN), genom stereotaxic injektion av anterograd Adeno-Associated virus. Den stereotaxic koordinater bestämdes enligt en mus Brain Atlas och testats genom att injicera 200 nL av fluorescerande Tracer fluoro-ruby. Djuret offrades 10 min efter injektionen och hjärnan extraherades och fixerades över natten. Koronala hjärn sektioner var beredda att undersöka injektionsstället, som var korrekt placerat i och begränsat till ADN (figur 1A, B).
För att uttrycka Chronos-GFP i nervceller av ADN, injicerade vi 300 nL av AAV5. Syn. Chronos-GFP. WPRE. bGH. tre veckor efter injektionen var akuta horisontella hjärn skivor förberedda. Figur 1 C visar en hjärn skiva som innehåller thalamic injektionsstället i den högra hjärnhalvan, med GFP-uttryck i grönt. Vid inspektion med en EPI-fluorescens Mikroskop utrustad med en 4x mål, GFP märkt thalamic axoner observerades i presumbiculum (figur 1C, D). Det noterades att thalamic axoner tätt innerverade de ytliga lagren I och III av presumbiculum (figur 1D).
Aktiviteten av presumbicular neuroner i Layer III spelades in i hela cellen patch-klämma konfiguration. Hyperpolariserande och depolariserande aktuella steg tillämpades under inspelningen av membranets potentiella variationer (figur 2A). Data lagrades på en dator för senare offlineanalys av aktiva och passiva membran egenskaper. Presumbicular Layer III primära celler besatt vanligtvis en negativ vilande potential nära-63 mV och krävde depolariserande aktuella injektioner att driva membranet potential att skjuta tröskel. En fullständig beskrivning av deras inneboende egenskaper har publicerats11.
Stimulerande ADN Axon terminaler uttrycker Chronos-GFP framkallade excitatoriska efter Synaptic potentialer (EPSPs) i presumbicular Layer III primära celler i nuvarande kläm läge (figur 2B). Beroende på ljusintensitet kan EPSPs nå en potentiell tröskel för åtgärden. Postsynaptiska reaktioner observerades också i spännings-kläm läge som excitatoriska post-synaptiska strömmar (EPSCs) var framkallade (figur 2C). Debut latenser av EPSCs framkallat av ljus stimuleringar var korta (median, 1,4 MS10), vilket indikerar en direkt synaptisk kontakt mellan thalamic axoner och Layer III presumbicular nervceller. Ihållande EPSCs i TTX-4AP villkor bekräftade denna monosynaptiska aktiveringen. Det är anmärkningsvärt att dessa celler svarade tillförlitligt på ljus stimuleringar av afferenta axoner med en regelbunden bränning mönster.
Figur 1 : Stereotaxic injektion i anterodorsal thalamic Nucleus (ADN). A) schematisk representation av injektionen. (B) bekräftelse på injektionsstället med fluoro-ruby i ett koronalt avsnitt. Inset indikerar Antero-dorsal nivå och avstånd från bregma. (C) horisontell skiva efter AAV-Chronos-GFP injektion i thalamus. De axonala projektionerna till ipsilaterala presumbiculum bör noteras. Ett snitt på den vänstra sidan av segmentet (indikeras av en svart triangel) markerar kontralaterala halvklotet. (B, C) Skal stång 1 mm. (D) förstorad bild av infällt i (C) med ADN-projektioner till de presumbikulära ytliga lagren. Scale bar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Presumbicular Layer III neuron: inneboende egenskaper, svar på ljus stimulering av thalamic afferents, och post-hoc uppenbarelse av cellmorfologi. (A) bränning mönster och membran potentiella variationer av Layer III neuron för hyperpolariserande och depolariserande aktuella steg. (B, C) Svar från Layer III neuron till 2 MS ljus stimuleringar (blå staplar) av thalamic axoner inspelade i (B) ström-klämma och (C) spännings-Clamp lägen. (D, E) Layer III pyramidala neuron (vit, indikeras av fyllda gula triangeln) omgiven av thalamic axoner uttrycker Chronos-GFP (grön) i presumbicular ytliga skikt med DAPI färgning (blå) i horisontell skiva avbildas med ett epifluorescensmikroskopi Mikroskop ( D, skalstapel = 100 μm) och konfokal Mikroskop vid hög förstoring (E, skalstapel = 50 μm). Cellen i (a) indikeras med fyllda gula trianglar. En andra, delvis fylld neuron finns i detta segment anges med tomma gula trianglar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo viral injektion för att uttrycka ljuskänsliga opsins i ett definierat hjärnområde är en val metod för optogenetisk analys av lång räckvidd funktionell anslutning10,11,17,18. Stereotaxic injektioner erbjuder möjligheten att exakt rikta ett specifikt område i hjärnan. Den coexpression av en opsin med en fluorescerande reporter möjliggör praktiskt utvärdering av det framgångsrika uttrycket och bekräftelse av den exakta injektionsstället. Användning av AAV-serotyp 2/5 begränsar vanligtvis uttrycket till den riktade hjärnregionen. På detta sätt, en begränsad population av nervceller är transfected, uttrycker ljuskänsliga jonkanaler i sina cell kroppar och Axon terminaler. I efterföljande ex vivo segment experiment, är det möjligt att stimulera dessa Axon terminaler med ljuspulser direkt i deras mål område, samtidigt som man läser ut framgångsrik synaptisk transmission via patch-klämma inspelning av en post-synaptically ansluten neuron. Ovanstående protokoll är robust och bekvämt, och vissa ytterligare anteckningar kan hjälpa prestanda lyckade experiment.
Olika typer av anestesi kan användas. Beskrivs här är den intraperitoneala injektionen av en ketamin-xylazin kombination som en enkel att använda, kortsiktig anestesi med bekväm analgesi19. Djupet och varaktigheten av anestesi kan variera i viss utsträckning. I vissa fall kan det vara nödvändigt att injicera en annan halv dos av ketamin-xylazin under protokollet. Isofluran anestesi kan vara ett bra alternativ för att inducera snabbare och bättre kontroll djupet av anestesi. Koordinater för injektionsställen kan bestämmas med hjälp av en mushjärna Atlas. I praktiken måste koordinaterna testas och justeras vid behov.
Rena arbetsförhållanden är också viktiga. Det rekommenderas att använda disponibel skyddsutrustning, inklusive handskar, en Mob mössa, och en labbrock. Vid positionering djuret i stereotaxic ram, särskild uppmärksamhet bör ägnas åt bekvämligheten av djuret, vilket kommer att avsevärt förbättra effektiviteten i anestesi. Kroppen av djuret ska vara i linje med huvud och hals. Det mest kritiska steget i positionering djuret och innan kraniotomi är justering av bregma-lambda-axeln. Speciellt när inriktning djupa hjärnstrukturer, även en liten avvikelse kommer att generera fel när du sänker injektionsnålen i hjärnan. I vissa fall kan man medvetet välja och beräkna en sned nålbana.
Injektionsvolymen är en avgörande faktor för att få exakt lokaliserade opsin uttryck. En liten volym är idealisk för att privilegiera en tätt begränsad transfektionszon. Högre volymer kan vara användbara för att täcka hela omfattningen av ett stort mål område. Om ett stort område behöver täckas, såsom septum18, kan det vara bra att placera flera små injektioner med en rad angränsande koordinater. Intervallet till den elektrofysiologiska inspelningen ex vivo är också kritiskt. En minsta tid för fullt uttryck är nödvändigt. Medan 3 veckor verkar vara en optimal fördröjning för dessa experiment11, den nödvändiga förseningen kan variera beroende på viruset, dess serotyp, och avståndet till den postsynaptiska hjärnregionen.
Den metod som beskrivs här är ännu kraftfullare i kombination med injektioner i transgena djur. Tidigare arbete har utnyttjat olika mus linjer för subtyper av GABAergic neuroner, för att specifikt rikta antingen PV-eller SST-uttrycker interneuroner för patch-klämma inspelningar20. Samtidig dubbelinspelning av angränsande PV och pyramidala nervceller eller SST och pyramidala nervceller tillåter sedan jämförelse av styrkor av långväga ingångar mellan två neuron typer11. Detta ger resultat som är standardiserade med avseende på en neuron typ. Denna standardisering är särskilt viktig i fall där uttrycksnivåerna för opsins varierar mellan olika djur eller olika sektorer.
Slice Health är avgörande för högkvalitativa patch-Clamp inspelningar. Konstant syresättning av skivorna är avgörande, och en långsam skärhastighet avsevärt förbättrar slice ytkvalitet. En segment tjock lek på 300 μm bevarar, till viss del, mikrokrets integritet i horisontella presumbicular sektioner, inklusive pyramidala nervceller med sina cell kroppar, dendritiska och lokala axonala förgreningar, och lokala synaptiska anslutningar. Den typ av ljus-gated kanaler valt att inducera aktivering av afferenta fibrer kommer att kraftigt påverka stimulering parametrarna (varaktighet, ljusintensitet). Chronos är en blå ljuskänslig channelrhodopsin, och ett brett spektrum av belysnings våglängder kan användas för aktivering (topp känslighet runt 500 Nm, även med minimal ljusintensitet på 0,05 mW/mm2, även aktiverad vid 405 nm, och upp till 530 nm21 ). Dessutom har Chronos snabba kinetiska egenskaper i jämförelse med klassisk ChR2, vilket möjliggör högfrekventa stimuleringar och tillförlitlig aktivering av långväga projektioner22. I kombination med uttrycket av Chrimson, en röd-skiftad opsin variant, blir den oberoende optiska excitation av distinkta neurala populationer genomförbart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang, och Jean SIMONNET för deras hjälp i utvecklingen av tidigare versioner av stereotaxic Injection Protocol och marin Manuel och Patrice Jegouzo för teknisk hjälp. Detta arbete stöddes av det franska ministeriet för utbildning och forskning (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.), och Agence nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN - 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 - 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), New York, N.Y. 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, Pt 17 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic. New York. (2013).
- Huang, L. -W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
