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Neuroscience

Injections stéréotaxiques intracérébrales in vivo pour la stimulation optogénétique des entrées à longue portée dans les tranches de cerveau de souris

doi: 10.3791/59534 Published: September 20, 2019

Summary

Ce protocole décrit un ensemble de méthodes pour identifier la connectivité fonctionnelle spécifique de type cellulaire des entrées à longue portée des régions éloignées de cerveau utilisant des stimulations optogénétiques dans des tranches de cerveau ex vivo.

Abstract

La connaissance de la connectivité synaptique spécifique de type cellulaire est une condition préalable cruciale pour comprendre les circuits neuronaux à l'échelle du cerveau. L'étude fonctionnelle des connexions à longue portée nécessite des enregistrements ciblés de neurones uniques combinés à la stimulation spécifique d'intrants éloignés identifiés. Ceci est souvent difficile à réaliser avec les techniques conventionnelles et de stimulation électrique, parce que les axones des zones convergentes du cerveau en amont peuvent se mêler dans la région cible. Le ciblage stéréotaxique d'une région spécifique du cerveau pour l'expression par le virus des canaux ioniques sensibles à la lumière permet la stimulation sélective des axones provenant de cette région avec la lumière. Les injections stéréotaxiques intracérébrales peuvent être utilisées dans des structures bien délimitées, telles que les noyaux thalamiques antérieurs, en plus d'autres zones sous-corticales ou corticales dans tout le cerveau.

Décrit ici est un ensemble de techniques pour l'injection stéréotaxique précise des vecteurs viraux exprimant la canalrhodopsine dans le cerveau de souris, suivie par la photostimulation des terminaux d'axone dans la préparation de tranche de cerveau. Ces protocoles sont simples et largement applicables. En combinaison avec l'enregistrement de pince de correction de pleine cellule d'un neurone postsynaptically relié, la photostimulation des axones permet la détection des connexions synaptiques fonctionnelles, la caractérisation pharmacologique, et l'évaluation de leur force. En outre, le remplissage de biocytine du neurone enregistré peut être employé pour l'identification morphologique post-hoc du neurone postsynaptic.

Introduction

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Définir la connectivité entre les régions du cerveau est nécessaire pour comprendre les circuits neuronaux. Les méthodes classiques de traçage anatomique permettent d'établir une connectivité interrégionale, et les études sur les lésions aident à comprendre l'organisation hiérarchique du flux d'information. Par exemple, les circuits cérébraux pour l'orientation spatiale et la signalisation de direction de la tête impliquent le flux directionnel de l'information du thalamus au présubiculum. Ceci a été démontré par des études de lésion des noyaux thalamicants antéro-dorsal (ADN) qui dégradent le signal de direction de tête dans le presubiculum dorsal en aval, aussi bien que le signal de cellule de grille parahippocampal1,2.

La connectivité fonctionnelle entre les zones du cerveau est plus difficile à établir au niveau cellulaire et subcellulaire. Dans l'hippocampe, une anatomie très organisée permet d'étudier les connexions synaptiques spécifiques à la voie à l'aide de la simulation électrique dans la préparation des tranches. Les électrodes de stimulation placées dans le radiatum de strate de CA1 peuvent être utilisées pour stimuler spécifiquement l'entrée collatérale de Schaffer de CA33. Des électrodes stimulantes placées dans la strate lacunosum moleculare de CA1 activeront l'entrée de chemin de perforant à CA14,5. La stimulation électrique active la libération de neurotransmetteurdes des terminaux d'axone ; cependant, il active les neurones avec somata près du site de stimulation ainsi que des axones de passage. Il est donc d'une utilité limitée pour l'étude des afférents des régions définies du cerveau lorsque les fibres de différentes régions d'origine s'entremêlent dans la structure cible, comme c'est généralement le cas dans le néocortex.

Les neurones peuvent également être stimulés par la lumière. Les méthodes optiques incluent la photoactivation du glutamate en cage, qui peut être combinée avec un ou deux photons de balayage laser. Plusieurs sites étroitement espacés peuvent être stimulés séquentiellement, sans dommages mécaniques au tissu6. Ceci a été utilisé avec succès pour cartographier les récepteurs synaptiques ainsi que d'activer les neurones individuels7. Bien que le décaissement du glutamate puisse être utilisé pour l'analyse des circuits locaux, il ne permet pas l'activation spécifique des entrées à longue portée.

Une méthode de choix pour l'étude de la connectivité à longue portée dans les circuits neuronaux est l'utilisation de l'expression de canalrhodopsine virus-négociée. En utilisant des injections stéréotaxiques in vivo telles que décrites ici, l'expression des canaux ioniques à portes lumineuses peut être ciblée et spatialement limitée à une région du cerveau désirée. De cette façon, les channelrhodopsines sont efficaces pour cartographier la connectivité excitatrice ou inhibitrice d'une région à sa cible. Les terminaux d'axones transfectés peuvent être stimulés avec la lumière dans une préparation de tranche de cerveau, et les enregistrements de correction-clamp comme lecture-out permettent l'examen des fonctions et des forces des composants spécifiques de circuit dans le cerveau8. L'approche optogénétique combinée à l'injection stéréotaxique d'un virus offre une spécificité sans précédent et un contrôle génétique9. Stimuler avec la lumière permet en outre à la fois haute précision temporelle et spatiale10,11.

Le présubiculum est une structure corticale à six couches à la transition de l'hippocampe et de la formation para-hippocampal12,13. Il reçoit une entrée synaptique importante de l'ADN11, mais aussi de plusieurs autres régions corticales et sous-corticales14. Ainsi, la stimulation sélective des terminaux d'axones thalamic dans une tranche présubiculaire n'est pas possible avec la stimulation électrique ni le glutamate uncaging. Décrits dans ce protocole sont des méthodes pour déterminer la connectivité fonctionnelle entre les régions du cerveau (ADN et presubiculum) en utilisant des injections stéréotaxiques précises de vecteurs viraux exprimant des canaux à porte-lumière. On décrit également la photostimulation des terminaux d'axones des neurones projetants dans leur région cible, couplée aux enregistrements de patch-clamp de cellules entières des neurones post-synaptiques dans la préparation de tranche de cerveau.

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Protocol

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Toutes les procédures ont été réalisées conformément à la directive du Conseil communautaire européen (2010/63/UE) et approuvées par le comité d'éthique de l'Université Paris Descartes. L'expérimentateur doit obtenir l'autorisation de la procédure pour se conformer à la réglementation locale.

1. Planification de l'expérience

  1. Définir la zone du cerveau à cibler. Déterminer les coordonnées stéréotaxiques du site d'injection à l'aide d'un atlas du cerveau de souris15. Pour le noyau thalamique antéro-dorsal droit (ADN), les coordonnées sont : -0,82 postérieur, 0,75 latéral, -3,2 profondeur (mm) par rapport au bregma. Les coordonnées peuvent devoir être ajustées pour les animaux d'âge, de sexe ou de souche différents.
  2. Confirmer et documenter l'exactitude des coordonnées en injectant un traceur fluorescent (150 à 300 nL) observable avec un microscope épifluorescence dans une expérience pilote(figure 1A,B).
  3. Définir le type de virus à injecter. Conserver le virus dans 6 aliquots de L à -80 oC, comme le recommande le producteur. Apportez 1 aliquot placé sur la glace à la salle de chirurgie, pour l'injection d'un à six animaux sur un jour donné. Les règlements de biosécurité pour l'utilisation de l'AAV peuvent dépendre du pays ou de l'institution, et l'utilisation d'un capot PSM 2 peut être nécessaire.
    REMARQUE: Ici, nous utilisons un sérotype AAV2/5 exprimant Chronos, une variante rapide channelrhodospin-2, fusionné à la protéine fluorescente verte sous le contrôle du promoteur Synapsin: AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.

2. Chirurgie stéréotaxique

  1. Installez un cadre stéréotaxique équipé d'un support de pompe sur un banc de laboratoire standard stable. Ajustez le stéréoscope afin de voir clairement la zone où la tête de l'animal sera placée. Utilisez une source de lumière LED pour l'éclairage. Faites pivoter le stéréoscope pour accéder au support de la pompe, ce qui n'est pas nécessaire pour les premières étapes de la chirurgie.
  2. Installez une seringue Hamilton de 10 l l munie d'une aiguille en métal bevée de 33 G dans le support de la pompe. Testez le système d'éjection avec de l'eau.
  3. Anesthésiez une souris C57BL6 de 4 à 5 semaines avec une injection intrapéritonéale d'un mélange d'hydrochlorure de kétamine et de xylazine (100 mg/kg et 10 mg/kg, respectivement). Préparer un mélange de 1 ml de kétamine et de 0,5 ml de xylazine dans 8,5 ml de 0,9 % de NaCl. Cela se traduira par 10 mg/mL de kétamine et 1 mg/mL de xylazine dans le mélange. De ce mélange, injectez intraperitoneally 10 L par gramme du poids corporel de l'animal. La durée de l'anesthésie est d'environ 1 h.
  4. Vérifier que l'animal est bien anesthésié avec une pincée d'orteil. Ensuite, sortez la langue pour faciliter la respiration. Raser les cheveux crâniens.
  5. Injecter 20 ll d'hydrochlorure de lidocaïne (4 mg/mL; 2 mg/kg) sous la peau de la tête pour une anesthésie locale et attendre 5 min pour que l'effet commence. Pour éviter les lésions oculaires dues à la sécheresse, recouvrez les yeux d'onguent ophtalmique topique.
  6. Pour exposer le crâne, créer une coupe droite dans le cuir chevelu avec de petits ciseaux de chirurgie. Placez l'animal dans un cadre stéréotaxique, en insérant les barres d'oreille légèrement rostral à l'oreille réelle pour se reposer sur l'os et tirer vers le bas la peau, ce qui devrait créer un bon accès au crâne. Resserrer en place. Installer le morceau de nez.
  7. Maintenir le corps de l'animal horizontalement au niveau de la tête à l'aide d'un support ajusté en hauteur. Placez un coussin chauffant sous la souris pour le garder à la température physiologique.
  8. Nettoyer le crâne en appliquant 0,9% NaCl avec un coton-tige pour enlever les tissus mous de l'os. Utilisez le stéréoscope pour le reste de la chirurgie.
  9. Ajustez le crâne de sorte que l'axe bregma-lambda est de niveau, se déplaçant vers le haut ou vers le bas du nez et des dents pièce. Cela nécessite des mesures itératives de bregma et lamba, car les deux vont changer après ajustement du niveau du nez.
  10. Trouvez l'emplacement du site d'injection sur le crâne. Ajustez l'aiguille d'injection au-dessus du site d'injection en fonction des coordonnées postérieures et médiales et marquez le crâne avec une aiguille jetable. Déplacez l'aiguille d'injection vers le haut de 4 cm.
  11. Utilisez une bavure de 0,5 mm avec une perceuse pour réaliser une craniotomie de 1 mm de diamètre sur la marque, à la moitié de la vitesse maximale. Swab saignement éventuel avec un tissu de papier.
  12. Videz l'eau contenue dans la seringue de Hamilton pour l'entreposer en l'éjectant complètement avec la pompe. Seule l'aiguille sera encore remplie d'eau. L'aiguille est lavée entre chaque utilisation avec de l'eau déionisée pure. La stérilisation n'est pas nécessaire.
  13. Prenez l'aliquot de virus qui doit être utilisé pour cette journée. Assurez-vous que la solution virale n'est plus congelée mais qu'elle est restée refroidie (près de 0 oC, sur la glace). Retirez seulement brièvement de la glace pour obtenir 700 nL avec une micropipette pour de petits volumes. Déposer la goutte sur un morceau de 5 cm x 5 cm de film de paraffine. Évitez de créer des bulles. Remettre la solution virale restante sur la glace.
    REMARQUE : Le volume de chute devrait être supérieur au volume d'injection souhaité (700 nL pour 200 nL injectés). Cela donnera une marge de sécurité au cas où une partie du liquide serait perdue pendant le transfert et permettra d'effectuer une petite éjection d'essai (étape 2.16) avant de procéder.
  14. Placer le film de paraffine sur la craniotomie. Plongez l'aiguille dans la goutte de la solution virale sans changer la position antéro-postérieure et latérale.
  15. Utilisez la fonction "retirer" de la pompe pour remplir la seringue avec environ 500 nL de solution virale éliminée sur le film de paraffine.  Faites-le sous contrôle visuel (stéréoscope), regardez la goutte disparaître, et assurez-vous de ne pas aspirer l'air.
  16. Assurez-vous que la seringue a été remplie correctement. Vérifier le fonctionnement du système d'éjection en descendant le piston pour tester l'éjection d'une petite goutte de liquide de 50 nL sous contrôle visuel. Essuyez la goutte.
  17. Insérez l'aiguille dans le cerveau à la profondeur choisie, en tournant le bouton contrôlant l'axe dorso-ventral de l'appareil stéréotaxique dans le sens des aiguilles d'une montre. Appuyez sur le bouton "run" (vitesse 15 nL/min par volume de 150 nL injecté). Un petit volume (50-300 nL, selon le virus utilisé) est lentement éjecté sur 10 min avec une pompe automatique.
  18. Attendez 10 min après l'injection pour éviter les fuites du site d'injection. Ensuite, retirez lentement l'aiguille de 3 à 5 min en tournant le bouton contrôlant l'axe dorso-ventral dans le sens inverse des aiguilles d'une montre.
  19. Faites pivoter la partie verticale du cadre stéréotaxique avec la seringue loin de l'animal. Lavez immédiatement l'aiguille dans de l'eau propre distillée en la remplissant plusieurs fois, afin d'éviter l'engorgement. Rangez la seringue remplie d'eau.
  20. Retirez la souris du cadre stéréotaxique. Suturer la peau avec 4-0 filament de suture polyamide. Faire trois ou quatre stiches, à égalité avec 2-1-1 noeuds chirurgicaux standard.
  21. Placez la souris dans une cage chauffée jusqu'à ce qu'elle se réveille complètement de l'anesthésie, et fournir de l'eau et de la nourriture trempée dans un plat Petri placé sur le sol. Si la source de chaleur est sous la cage, utilisez une grille d'espaceur pour éviter la surchauffe.
    REMARQUE : Selon les lignes directrices locales, une seule dose de kétoprofène (2-5 mg/kg, sous-cutanée) ou de buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg, sous-cutané) peut être appliquée pour prévenir la douleur.
  22. Lorsque l'animal est complètement éveillé, retournez-le dans sa cage d'origine et surveillez son bien-être, en particulier le lendemain de l'injection. Vérifiez s'il y a des signes de douleur. Si une modification comportementale est observée, l'animal est pesé pour surveiller son poids corporel.
  23. Selon le virus utilisé, le temps d'expression complète peut varier. Ici, nous permettons 3 semaines pour l'expression de AAV5. Syn.Chronos-GFP.

3. Solutions pour les enregistrements de tranches aigues et la fixation

  1. Préparer des solutions de stock de solution de coupe concentrée 10x (125 mM NaCl, 25 mM de saccharose, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, et 2,5 mM D-glucose) et solution artificielle de liquide céphalo-rachidien (ACSF) (124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mMM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, et 11 mM D-glucose) dans de l'eau déionisée pure avant les expériences d'électrophysiologie. Entreposez ces solutions à 4 oC en bouteilles de 1 L sans CaCl2 et MgCl2.
  2. Le jour de l'expérience, diluer les solutions stock de la solution de coupe et ACSF 10x à un volume final de 0,5 L chacun. Agiter avec un agitateur magnétique et oxygéner en bouillonnant avec 95%/5% O2/CO2. Ajouter des ions divalents pour obtenir des concentrations finales de 0,1 mM CaCl2 et 7 mM MgCl2 pour la solution de coupe, et 2 mM CaCl2 et 2 mM MgCl2 pour L'ACSF.
  3. Préparer la solution de pipette à base de potassium-gluconate pour contenir : 135 mM K-gluconate, 1,2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 4 mM MgATP, 0,4 mM Tris-GTP, 10 mM Na2-phosphocreatine, et 2,7 à 7,1 mM biocytine pour les cellules post-hoc révélation morphologie. Ajustez le pH de la solution à 7,3 et l'osmolarité à 290 mOsm. Conserver 1 ml d'aliquots à -20 oC.
  4. Préparer 0,1 M PBS en diluant les sachets de poudre à mélange sec BupH PBS dans 500 ml d'eau distillée, ce qui donne 0,1 M de phosphate de sodium, 0,15 M NaCl, pH 7,2.
  5. Pour préparer 1 L de 4% de solution PFA, diluer 111 ml de 36% de PFA liquide à 36% et 90 ml de solution 10x PBS dans de l'eau distillée.
  6. Préparer une solution de saccharose de 30 % contenant 150 g de saccharose dans 500 ml de 0,1 M PBS.

4. Préparation de tranches de cerveau

  1. Préparer l'espace de banc avec du papier absorbant avant la perfusion.
  2. Installez un goutte-à-goutte à environ 1 m au-dessus du banc pour la perfusion alimentée par gravité. Fixer une aiguille papillon de 24 G.
  3. Entourer la chambre de coupe du vibratome de glaçons et la conserver au congélateur.
  4. Anesthésiez la souris avec l'injection intrapéritonéale du même mélange de kétamine-xylazine utilisé pour la chirurgie. Évaluez le stade de l'anesthésie en pinçant l'orteil avec des forceps. Lorsque vous dormez complètement, injectez 100 l'héparine (5000 U.I./mL) par voie intrapéritone.
  5. Fixer l'animal avec du ruban adhésif sur le papier absorbant, couché sur le dos. Ouvrez la cage thoracique en coupant les côtes sur les côtés gauche et droit avec de petits ciseaux, du diaphragme vers le haut. Maintenir la cage thoracique ouverte à l'aide de ruban adhésif.
  6. Pincez l'aorte descendante avec un hemostat et perfssez par le ventricule gauche du cœur avec 4 oC refroidis et oxygénés (95%/5% O2/CO2), coupant la solution à travers l'aiguille papillon de 24 G. Après 5 s, ouvrir l'atrium droit avec de petits ciseaux.
  7. Après 5 min de perfusion, lorsque les organes sont sans sang, arrêter la perfusion. Décapiter l'animal avec de gros ciseaux et immerger la tête dans une solution de coupe refroidie et oxygénée à 4 oC dans un plat Petri.
  8. Pour extraire le cerveau, couper la peau du cou au nez, puis sectionnez les dernières vertèbres du crâne avec des ciseaux. Rétractez manuellement la peau et utilisez de petits ciseaux pour ouvrir le crâne, en le coupant le long de la ligne médiane, du caudal au rostral, vers le haut jusqu'entre les yeux.
  9. Enlever soigneusement l'os pariétal et la partie caudale de l'os frontal avec des forceps courbés ou osseux. Extraire le cerveau avec une petite spatule arrondie en insérant l'instrument entre le cerveau et le plancher crânien, sectionnant l'ampoule olfactive, le nerf optique et d'autres nerfs crâniens, et le cervelet.
  10. Plonger délicatement le cerveau dans une solution de coupe glacée (4 oC) dans un bécher. Placez le cerveau sur du papier filtre pour sécher doucement la surface corticale. Collez le cortex cérébral vers le bas au porte-échantillon d'un vibratome, avec le côté caudal faisant face à la lame, afin de couper les tranches horizontales de cerveau.
  11. Remplissez la chambre de coupe d'une solution de coupe oxygénée à froid afin que le cerveau soit complètement immergé. Faire une coupure sur l'hémisphère gauche (contralatéral au côté injecté) pour éviter l'ambiguïté gauche-droite potentielle sur les tranches.
    CAUTION : Oxygénez toujours la solution et protégez les tranches de l'exposition à la lumière.
  12. Couper des tranches de 300 m d'épaisseur avec le vibratome, à une vitesse de 0,07 mm/s à 1 mm d'amplitude. À ce stade, il est recommandé de vérifier brièvement l'expression Chronos-GFP dans le thalamus à l'aide d'une lampe de poche fluorescente (440-460 nm) et des verres filtrecorrespondant (500 nm de long pass).
  13. Isoler la région hippocampique à l'eau avec un scalpel et le transférer dans une chambre placée dans un bécher rempli de bain réchauffé (34 oC), oxygéné (95%/5% O2/CO2) ACSF.
  14. Après 15 min, sortir la chambre du bain d'eau chauffé et laisser reposer les tranches à température ambiante, encore oxygénée pendant au moins 45 min jusqu'à l'utilisation.

5. Enregistrement patch-clamp à cellules entières

  1. Transférer délicatement une tranche de cerveau contenant le complexe hippocampique avec une pipette de transfert de verre sur mesure à la chambre d'enregistrement montée sur un microscope droit. Une pipette de transfert est faite d'une pipette Pasteur raccourcie (diamètre intérieur de 6,5 mm) fixée à une ampoule de pipette en caoutchouc. Perfil le long de la chambre d'enregistrement (3 mL) avec 34 oC (chauffé) ACSF bullé avec 95%/5% O2/CO2. Définir la vitesse de la pompe péristétique à 2-3 ml/min.
  2. Examinez brièvement l'expression Chronos-GFP dans les terminaux d'axone dans la région d'intérêt avec l'éclairage LED bleu (470 nm) et observez avec un objectif 4x. La fluorescence du GFP est visualisée à l'aide d'un filtre d'émission approprié, avec une image de caméra CCD affichée sur un écran d'ordinateur.
  3. Placez une ancre de tranche faite à partir d'un fil de platine en forme de U avec des cordes de nylon étroitement espacées (« harpe ») sur la tranche pour la maintenir.
  4. Passer à un objectif d'immersion 63x et ajuster la mise au point. Vérifiez si les axones expriment Chronos-GFP et choisissez un neurone pyramidal pour l'enregistrement des correctifs.
  5. Déplacez l'objectif vers le haut.
  6. Tirez des pipettes à l'aide d'un pull à électrodes Brown-Flaming en verre borosilicate. Le tireur est réglé pour produire des pipettes d'environ 1 m de diamètre. Remplissez les pipettes avec une solution interne à base de K-gluconate.
  7. Monter la pipette dans le porte-pipette sur le front-étape. Abaissez la pipette dans la chambre et trouvez la pointe sous l'objectif. La résistance à la pipette doit se sier dans la distillage entre 3 et 8 M. Appliquer une légère pression positive avec une seringue afin de voir un cône de solution sortir de la pipette et abaisser progressivement la pipette et l'objectif à la surface de la tranche.
  8. Patchez la cellule en configuration tension-clamp : approchez-vous du neurone identifié et appuyez délicatement sur la pointe de la pipette sur le soma. La pression positive devrait produire une fossette sur la surface de la membrane. Relâchez la pression pour créer un sceau giga-ohm (résistance de g '. Une fois scellé, définir la tension de retenue à -65 mV. Briser la membrane avec une forte impulsion de pression négative: ceci est réalisé en appliquant une forte aspiration à un tube relié au porte-pipette.
  9. Enregistrez en mode pince à courant à cellules entières les réponses du neurone à l'hyperpolarisation et à la dépolarisation des étapes actuelles (Figure 2A).
    REMARQUE : Ce protocole sera utilisé pour déterminer les propriétés intrinsèques actives et passives de la cellule. Les routines MATLAB personnalisées sont utilisées pour l'analyse hors ligne10,16.
  10. Enregistrez dans les réponses postsynaptic de courant ou de tension-clamp à la stimulation de LED de champ entier 475 nm des fibres afférentes exprimant Des Chronos. Stimuler avec des trains de 10 stimulations de 2 ms durées à 20 Hz (Figure 2B,C). L'intensité lumineuse peut varier de 0,1 à 2 mW.
    REMARQUE : L'intensité lumineuse a été mesurée à l'aide d'une console de puissance optique numérique portative équipée d'un capteur photodiode, placée sous l'objectif. Les latences de réponse de 2 à 4 m s sont caractéristiques pour une connexion monosynaptique.
  11. Pour étudier la nature de la transmission synaptique entre les afférents à longue portée et le neurone enregistré, différents agents pharmacologiques peuvent être utilisés. Pour distinguer pharmacologiquement les réponses directes et monosynaptiques des réponses indirectes par l'activation du réseau, ajoutez 1 M TTX et 100 M 4-AP à l'ACSF.
    REMARQUE : L'application de bain des bloqueurs de récepteur de glutamate permet de déterminer la nature du neurotransmetteur qui est libéré et l'identité des récepteurs postsynaptic. Par exemple, les récepteurs de glutamate de type AMPA seront bloqués par les récepteurs NBQX (10 M) et NMDA par aPV (100 m). Selon l'objectif de l'étude, des protocoles peuvent être conçus pour étudier la dépendance à la tension des réponses synaptiques ou de la dynamique de réponse au fil du temps.
  12. Laver avec la solution ACSF originale pour patcher une autre cellule, ou transférer la tranche contenant un neurone rempli de biocytine dans une petite fiole remplie de 4% de PFA.
  13. Après la fixation de nuit en 4% PFA, laver la tranche en 0.1 M PBS (2x pour 5 min, 1x pour 20 min).
  14. Conserver dans un saccharose de 30 % à 4 oC.

6. Révélation de Biocytin

  1. Transférer les tranches fixes contenant des neurones remplis de biocytine sur une lame de verre dans une goutte de 30% de saccharose et effectuer trois cycles de gel-dégel: placer la lame sur la glace sèche disposée dans une boîte en polystyrène pendant 1 min jusqu'à ce que les gouttes de saccharose sont complètement congelées, puis appuyez sur la lame contre la paume de la main pour décongeler.
  2. Laver la tranche 3x en 0,1 M PBS (2x pour 5 min, 1x pour 1 h et 50 min), doucement agitée. Ne pas dépasser 2 h pour le dernier lavage.
  3. Pré-incuber la tranche à RT pendant 2 h dans une solution tampon agitée contenant 2 % de lait en poudre (0,4 g sur 20 ml) pour saturer les sites non spécifiques et 0,5 % Triton X100 (0,1 ml sur 20 ml) pour perméabiliser les membranes en 0,1 M PBS.
  4. Incuber toute la nuit à 4 oC dans une solution contenant 2 % de lait en poudre, 1 % de Triton X100, de conjugué streptavidin-Cy5 (1/500) et DAPI (1/1000) dans 0,1 M PBS, doucement agité.
  5. Laver la tranche trois fois en 0,1 M PBS (2x pour 5 min, 1x pour 2 h). Le dernier lavage peut durer plus longtemps, jusqu'à 4 h, pour réduire la coloration de fond.
  6. Avant de monter la tranche, utilisez un microscope épifluorescence à 10x grossissement configuré pour observer les marqueurs fluorescents Cy5 afin d'identifier le côté de la tranche contenant la cellule marquée dans une chambre remplie de PBS.
  7. Transférer la tranche sur une lame, côté cellule vers le haut, la sécher avec un papier mouchoir et la monter à l'aide d'un milieu de montage à haute résistance.
  8. Utilisez un microscope épifluorescence à 10x grossissement en configuration Cy5 et DAPI pour examiner l'emplacement du corps cellulaire, et dans la configuration GFP pour observer les afférents marqués, ou un microscope confocal à haute résolution à 20x pour le somatique détaillé, axonal, et morphologie dendritique (Figure 2D,E). Les paramètres du filtre sont détaillés dans le tableau des matériaux.

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Representative Results

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La procédure présentée ici a été utilisée pour exprimer une canalrhodopsine bleu sensible à la lumière (Chronos) fusionnée à GFP dans le noyau antéro-dorsal du thalamus (ADN), par injection stéréotaxique du virus antérograde adéno-associé. Les coordonnées stéréotaxiques ont été déterminées selon un atlas du cerveau de souris et testées en injectant 200 nL de fluoro-ruby fluorescent. L'animal a été sacrifié 10 min après l'injection, et le cerveau a été extrait et fixé pendant la nuit. Les sections du cerveau coronal ont été préparées pour examiner le site d'injection, qui a été correctement placé et limité à l'ADN (Figure 1A,B).

Afin d'exprimer Chronos-GFP dans les neurones de l'ADN, nous avons injecté 300 nL d'AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH. Trois semaines après l'injection, des tranches de cerveau horizontales aigues ont été préparées. Figure 1 C montre une tranche de cerveau contenant le site d'injection thalamic dans l'hémisphère droit, avec l'expression de GFP en vert. Lors de l'inspection avec un microscope épifluorescence équipé d'un objectif 4x, des axones thalamic étiquetés GFP ont été observés dans le présubiculum(figure 1C,D). Il a été noté que les axones thalamiques intériorisaient densément les couches superficielles I et III du présubiculum (Figure 1D).

L'activité des neurones présubiculaires dans la couche III a été enregistrée dans la configuration de patch-clamp de cellule entière. Des étapes actuelles hyperpolarisantes et dépolarisantes ont été appliquées lors de l'enregistrement des variations potentielles de la membrane (figure 2A). Les données ont été stockées sur un ordinateur pour une analyse hors ligne ultérieure des propriétés de la membrane active et passive. Les cellules principales de la couche présubiculaire III possédaient généralement un potentiel de repos négatif proche de -63 mV et nécessitaient des injections de courant dépolarisant pour conduire le potentiel de la membrane au seuil de tir. Une description complète de leurs propriétés intrinsèques a été publiée11.

Les terminaux d'axone d'ADN stimulants exprimant Chronos-GFP ont suscité des potentiels excitatifs post-synaptiques (EPSP) dans les cellules principales de la couche présubiculaire III en mode de pince actuelle (Figure 2B). Selon l'intensité lumineuse, les EPSP pourraient atteindre le seuil potentiel d'action. Des réponses postsynaptiques ont également été observées en mode tension-clamp à mesure que des courants excitatifs post-synaptiques (EPSC) ont été obtenus (figure 2C). Les latences de début des EPSC évoqués par stimulations lumineuses étaient courtes (médiane, 1.4 ms10),indiquant un contact synaptique direct entre les axones thalamic séquencés et les neurones présubiculaires de couche III. Les EPSC persistants dans l'état de TTX-4AP ont confirmé cette activation monosynaptique. Il est à noter que ces cellules ont répondu de façon fiable aux stimulations lumineuses des axones afférents avec un modèle de tir régulier.

Figure 1
Figure 1 : Injection stéréotaxique dans le noyau thalamique antétodoral (ADN). (A) Représentation schématique de l'injection. (B) Confirmation du site d'injection avec fluoro-ruby dans une section coronale. L'enset indique le niveau antéro-dorsal et la distance de bregma. (C) Tranche horizontale suite à l'injection AAV-Chronos-GFP dans le thalamus. Les projections axonales au presubiculum ipsilateral devraient être notées. Une incision sur le côté gauche de la tranche (indiquée par un triangle noir) marque l'hémisphère contralatéral. (B, C) Échelle barre 1 mm. (D) Vue agrandie de l'enset dedans(C) avec des projections d'ADN aux couches superficielles présubicular. Barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Neurone de la couche présubiculaire III : propriétés intrinsèques, réponse à la stimulation lumineuse des afférents thalamiques et révélation post-hoc de la morphologie cellulaire. (A) Modèle de tir et variations potentielles de membrane du neurone de couche III pour hyperpolariser et dépolariser les étapes actuelles. (B, C) Réponses du neurone de couche III à 2 ms de stimulations lumineuses (barres bleues) d'axones thalamic enregistrés dans (B) courant-clamp et (C) modes tension-clamp. (D, E) Le neurone pyramidal de la couche III (blanc, indiqué par un triangle jaune rempli) entouré d'axones thalamiques exprimant Chronos-GFP (vert) en couches superficielles présubiculaires avec coloration DAPI (bleu) en tranche horizontale représentée avec un microscope épifluorescence ( D, barre d'échelle de 100 m) et microscope confocal à un grossissement élevé(E, barre d'échelle de 50 m). La cellule de (A) est indiquée avec des triangles jaunes remplis. Un deuxième neurone partiellement rempli est présent dans cette tranche indiquée avec des triangles jaunes vides. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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L'injection virale in vivo pour exprimer les opsines sensibles à la lumière dans une zone cérébrale définie est une méthode de choix pour l'analyse optogénétique de la connectivité fonctionnelle à longue portée10,11,17,18. Les injections stéréotaxiques offrent la possibilité de cibler précisément une zone spécifique du cerveau. La coexpression d'un opsin avec un journaliste fluorescent permet commodément l'évaluation de l'expression réussie et la confirmation du site d'injection précis. L'utilisation du sérotype 2/5 de l'AAV limite généralement l'expression à la région cérébrale ciblée. De cette façon, une population restreinte de neurones est transfectée, exprimant des canaux ioniques sensibles à la lumière dans leur corps cellulaire et les terminaux d'axone. Dans les expériences ultérieures de tranches ex vivo, il est possible de stimuler ces terminaux d'axone avec des impulsions lumineuses directement dans leur zone cible, tout en lisant la transmission synaptique réussie par l'enregistrement de patch-clamp d'un neurone post-synaptically connecté. Le protocole ci-dessus est robuste et pratique, et quelques notes supplémentaires peuvent aider à la performance des expériences réussies.

Différents types d'anesthésie peuvent être utilisés. Décrit ici est l'injection intrapéritonéale d'une combinaison de kétamine-xylazine comme une anesthésie facile à utiliser, à court terme avec analgésie pratique19. La profondeur et la durée de l'anesthésie peuvent varier dans une certaine mesure. Dans certains cas, il peut être nécessaire d'injecter une autre demi-dose de kétamine-xylazine pendant le protocole. L'anesthésie isoflurane peut être une bonne alternative pour induire plus rapidement et mieux contrôler la profondeur de l'anesthésie. Les coordonnées des sites d'injection peuvent être déterminées à l'aide d'un atlas du cerveau de souris. Dans la pratique, les coordonnées doivent être testées et ajustées, si nécessaire.

Des conditions de travail propres sont également essentielles. Il est recommandé d'utiliser des vêtements de protection jetables, y compris des gants, un bonnet de foule et une blouse de laboratoire. Lors du positionnement de l'animal dans le cadre stéréotaxique, une attention particulière doit être accordée au confort de l'animal, ce qui permettra d'améliorer considérablement l'efficacité de l'anesthésie. Le corps de l'animal doit être aligné avec la tête et le cou. L'étape la plus critique dans le positionnement de l'animal et avant la craniotomie est l'ajustement de l'axe bregma-lambda. Surtout lorsque vous ciblez les structures profondes du cerveau, même une petite déviation va générer des erreurs lors de l'abaissement de l'aiguille d'injection dans le cerveau. Dans certains cas, on peut délibérément choisir et calculer une trajectoire oblique d'aiguille.

Le volume d'injection est un facteur déterminant pour obtenir l'expression précisément localisée d'opsin. Un petit volume est idéal pour privilégier une zone de transfection strictement restreinte. Des volumes plus élevés peuvent être utiles pour couvrir toute l'étendue d'une grande zone cible. Si une grande zone doit être couverte, comme le septum18, il peut être utile de placer plusieurs petites injections avec une gamme de coordonnées voisines. L'intervalle jusqu'à l'enregistrement électrophysiologique ex vivo est également critique. Un temps minimum pour la pleine expression est nécessaire. Tandis que 3 semaines semblent être un retard optimal pour ces expériences11,le retard nécessaire peut varier selon le virus, son sérotype, et la distance à la région de cerveau postsynaptic.

L'approche décrite ici est encore plus puissante lorsqu'elle est combinée avec des injections chez les animaux transgéniques. Des travaux antérieurs ont exploité différentes lignées de souris pour les sous-types de neurones GABAergic, afin de cibler spécifiquement les interneurons PV- ou SST-exprimant pour les enregistrements patch-clamp20. L'enregistrement simultané double des neurones PV et pyramidaux voisins ou SST et neurones pyramidaux permet alors de comparer les forces des entrées à longue portée entre deux types de neurones11. Cela donne des résultats qui sont normalisés par rapport à un type de neurone. Cette normalisation est particulièrement importante dans les cas où les niveaux d'expression des opsines varient d'un animal à l'autre ou de différentes tranches.

La santé des tranches est essentielle pour les enregistrements de patch-clamp de haute qualité. L'oxygénation constante des tranches est cruciale, et une vitesse de coupe lente améliore considérablement la qualité de la surface des tranches. Une épaisseur de tranche de 300 m préserve, dans une certaine mesure, l'intégrité du microcircuit dans les sections présubiculaires horizontales, y compris les neurones pyramidaux avec leur corps cellulaire, les ramifications axonales dendritiques et locales, et les connexions synaptiques locales. Le type de canaux à portes lumineuses choisis pour induire l'activation des fibres afférentes influencera grandement les paramètres de stimulation (durée, intensité lumineuse). Chronos est une canalrhodopsine bleu sensible à la lumière, et une large gamme de longueurs d'onde d'éclairage peut être utilisée pour l'activation (sensibilité maximale autour de 500 nm, même avec une intensité de lumière minimale de 0,05 mW/mm2, également activé à 405 nm, et jusqu'à 530 nm21 ). En outre, Chronos a des propriétés cinétique rapide par rapport à ChR2 classique, qui permet des stimulations à haute fréquence et l'activation fiable des projections à longue portée22. En combinaison avec l'expression de Chrimson, une variante d'opsine rouge décalée, l'excitation optique indépendante des populations neuronales distinctes devient faisable.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Nous remercions Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang et Jean Simonnet pour leur aide dans le développement des versions précédentes du protocole d'injection stéréotaxique et Marin Manuel et Patrice Jegouzo pour leur aide technique. Ce travail a été soutenu par le ministère Français de l'éducation et de la recherche (L. R., L. S.), le Centre national des Etudes Spatiales (M. B.) et l'Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm bur  Harvard Apparatus 724962
10 µL Hamilton syringe Hamilton 1701 RN - 7653-01
10X PBS solution Thermofisher Scientific AM9624  text
36% PFA Sigma-Aldrich F8775
470 nm LED  Cairn Research P1105/470/LED  DC/59022m use with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP 
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Penn Vector Core AV-5-PV3446 lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 
All chemicals Sigma
Bath temperature controler Luigs & Neumann SM7 Set at 34°C 
beveled metal needle Hamilton 7803-05 33 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissors Dahle Allround 50038
Biocytin Sigma B4261 final 1-3 mg/ml
Borosilicate Capillaries Havard Apparatus GC150-10 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode puller Sutter Instruments P-87
BupH Phosphate Buffered Saline pack Thermofisher Scientific 28372
butterfly needle for perfusion Braun  Venofix A 24G
CCD Camera Andor  DL-604M
Confocal Microscope Zeiss LSM710 20X
curved forceps FST  11011-17
CY5 configuration (confocal) Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 
CY5 configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPI Sigma D9542
DAPI configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440A Axon Instruments
Digital handheld optical meter ThorLabs PM100D Parametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein Flashlight Nightsea DFP-1 excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTA Sigma E4368 final 0,2 mM
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse TE-2000E 10 or 20X
Filter paper Whatman
Fluoro-Ruby 10% Millipore AG335 disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
Heatingplate Physitemp HP4M
Heparin choay 5000 U.I./ml Sanofi 5 ml vial
HEPES Sigma H3375 final 10 mM
High speed rotary micromotor kit Foredom K.1070 maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse Stimulator A-M Systems 2100
KCl Sigma P4504 final 1,2 mM
Ketamine 1000 Virbac
Ketofen 10% Merial 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine) MSD 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgery Photonic (via Phymep) 10044
LED Power Supply Cairn Research OptoLED Light Source
Manipulators Luigs & Neumann SM-7
Mg-ATP 2H20 Sigma A9187 final 4 mM
MgCl2 Sigma 63069 final 2 mM
Micro temperature controler Physitemp MTC-1
Milk powder Carnation
MultiClamp 700B Axon Instruments
Na Phosphocreatine Sigma P7936 final 10 mM
Na3-GTP 2H20 Sigma G9002 final 0.4 mM
needle holder/hemostat FST 13005-14
pClamp acquisition software Axon Instruments
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3 14-16 on the display for 2-3 ml/min 
Potassium gluconate (K-gluconate) Sigma G4500 Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting medium Thermofisher Scientific P36390
Rompun 2% (xylazine) Bayer
small scissors FST 14060-09
Sodium chloride 0.9%  Virbac dilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZT VWR 630-1584
Stereotaxic frame with digital display Kopf Model 940 Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugate Life technologies  434315
Streptavidin-Cy5 conjugate Thermofisher Scientific S32357
Superglue3 Loctite Dutscher 999227 1g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid Ethicon F3210
Syringe pump kdScientific Legato 130 - 788130 Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicer Leica VT1200S speed 0.07, amplitude 1.
tubing Gilson F117942, F117946 Yellow/Black, Purple/Black
upright microscope Olympus BX51W1
Versi-dry bench absorbant paper Nalgene

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References

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Injections stéréotaxiques intracérébrales in vivo pour la stimulation optogénétique des entrées à longue portée dans les tranches de cerveau de souris
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Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (151), e59534, doi:10.3791/59534 (2019).More

Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (151), e59534, doi:10.3791/59534 (2019).

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