Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

doi: 10.3791/59534 Published: September 20, 2019

Summary

Questo protocollo descrive una serie di metodi per identificare la connettività funzionale specifica del tipo di cellula degli input a lungo raggio provenienti da regioni cerebrali lontane utilizzando stimolazioni optogenetiche in fette cerebrali ex vivo.

Abstract

La conoscenza della connettività sinaptica specifica di tipo cellulare è un prerequisito fondamentale per comprendere i circuiti neuronali a livello di cervello. Lo studio funzionale delle connessioni a lungo raggio richiede registrazioni mirate di singoli neuroni combinati con la stimolazione specifica di input distanti identificati. Questo è spesso difficile da ottenere con tecniche di stimolazione convenzionali ed elettriche, perché gli assoni provenienti da aree cerebrali a monte convergenti possono mescolarsi nella regione bersaglio. Il targeting stereotassico di una regione cerebrale specifica per l'espressione mediata da virus dei canali ionici sensibili alla luce consente una stimolazione selettiva degli assoni provenienti da quella regione con la luce. Le iniezioni stereotassiche intracerebrali possono essere utilizzate in strutture ben delimitate, come i nuclei talamici anteriori, oltre ad altre aree subcorticali o corticali in tutto il cervello.

Descritto qui è un insieme di tecniche per l'iniezione stereotassica precisa di vettori virali che esprimono channelrhodopsin nel cervello del topo, seguita da fotostimolazione dei terminali assoni nella preparazione della fetta del cervello. Questi protocolli sono semplici e ampiamente applicabili. In combinazione con la registrazione di morsetto di cervo a tutta cellula da un neurone postsynaptaptically collegato, la fotostimolazione degli assoni consente il rilevamento di connessioni sinaptiche funzionali, la caratterizzazione farmacologica e la valutazione della loro forza. Inoltre, il riempimento della biocitina del neurone registrato può essere utilizzato per l'identificazione morfologica post-hoc del neurone post-sinaptico.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La definizione della connettività tra le regioni del cervello è necessaria per comprendere i circuiti neurali. I classici metodi di tracciamento anatomico consentono di stabilire la connettività interregionale e gli studi di lesione aiutano a comprendere l'organizzazione gerarchica del flusso di informazioni. Ad esempio, i circuiti cerebrali per l'orientamento spaziale e la segnalazione della direzione della testa coinvolgono il flusso direzionale di informazioni dal talamo al presubiculum. Ciò è stato dimostrato da studi di lesioni di nuclei talamici cioco-dorsalici (ADN) che degradano il segnale di direzione della testa nel presubiculum dorsale a valle, così come il segnale della rete della griglia paraippocampale1,2.

La connettività funzionale tra le aree del cervello è più difficile da stabilire a livello cellulare e subcellulare. Nell'ippocampo, un'anatomia altamente organizzata permette di studiare le connessioni sinaptiche specifiche del percorso utilizzando la simulazione elettrica nella preparazione della fetta. Gli elettrodi di stimolazione collocati nel radiato stratificato di CA1 possono essere utilizzati specificamente per stimolare l'input collaterale di Schaffer da CA33. Stimolando gli elettrodi collocati nella molecolare di lacunoso stratificante di CA1 attiverà l'ingresso del percorso perforante a CA14,5. La stimolazione elettrica attiva il rilascio del neurotrasmettitore dai terminali assoni; tuttavia, attiva i neuroni con somata vicino al sito di stimolazione e assoni di passaggio. È quindi di uso limitato per studiare gli afferenti da regioni cerebrali definite quando le fibre di diverse regioni di origine si mescolano nella struttura bersaglio, come è tipicamente il caso nella neocorteccia.

I neuroni possono anche essere stimolati con la luce. I metodi ottici includono la fotoattivazione del glutammato in gabbia, che può essere combinato con la scansione laser a uno o due fotoni. Più siti strettamente distanziati possono essere stimolati in sequenza, senza danni meccanici al tessuto6. Questo è stato utilizzato con successo per mappare i recettori sinaptici così come attivare i singoli neuroni7. Mentre lo sblocco del glutammato può essere utilizzato per l'analisi del circuito locale, non consente l'attivazione specifica di input a lungo raggio.

Un metodo di scelta per lo studio della connettività a lungo raggio nei circuiti neuronali è l'uso dell'espressione channelrhodopsin mediata da virus. Utilizzando iniezioni stereotassiche in vivo come descritto qui, l'espressione dei canali ionici illuminati può essere mirata e limitata spazialmente a una regione del cervello desiderata. In questo modo, le channelrhodopsins sono efficaci per mappare la connettività eccitatoria o inibitoria da una regione al suo obiettivo. I terminali degli assoni transettati possono essere stimolati con la luce nella preparazione di una fetta di cervello, e le registrazioni patch-clamp come una lettura consente l'esame delle funzioni e dei punti di forza di specifici componenti del circuito nel cervello8. L'approccio optogenetico combinato con l'iniezione stereotassica di un virus offre una specificità senza precedenti e il controllo genetico9. La stimolazione con la luce consente inoltre un'elevata precisione temporale che spaziale10,11.

Il presubiculum è una struttura corticale a sei strati alla transizione dell'ippocampo e della formazione para-ippocampale12,13. Riceve un importante input sinaptico dall'ADN11 ma anche da diverse altre regioni corticali e subcorticali14. Pertanto, la stimolazione selettiva dei terminali degli assoni talamici all'interno di una fetta presubicolare non è possibile con la stimolazione elettrica né con lo sblocco del glutammato. Descritto in questo protocollo sono metodi per determinare la connettività funzionale tra le regioni del cervello (ADN e presubiculum) utilizzando precise iniezioni stereotassiche di vettori virali che esprimono canali illuminati. È stata descritta anche la fotostimolazione dei terminali degli assoni dei neuroni proiettanti nella loro regione bersaglio, insieme alle registrazioni a morsetto a tutta cellula dei neuroni post-sinaptici nella preparazione delle fette cerebrali.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la direttiva del Consiglio della Comunità europea (2010/63/UE) e approvate dal comitato etico dell'Università Cartesio di Parigi. Lo sperimentatore deve ottenere l'autorizzazione per la procedura di conformità alle normative locali.

1. Pianificazione dell'esperimento

  1. Definire l'area del cervello da prendere di mira. Determinare le coordinate stereotaxiche del sito di iniezione con l'aiuto di un atlante cerebrale del topo15. Per il nucleo talamico talamico talamico destro (ADN), le coordinate sono: -0,82 posteriore, 0,75 laterali, -3,2 profondità (mm) relative al bregma. Potrebbe essere necessario regolare le coordinate per animali di diversa età, sesso o sforzo.
  2. Confermare e documentare l'esattezza delle coordinate iniettando un tracciante fluorescente (150 a 300 nL) osservabile con un microscopio a epifluorescenza in un esperimento pilota (Figura 1A,B).
  3. Definire il tipo di virus da iniettare. Conservare il virus in 6 aliquote a -80 gradi centigradi come raccomandato dal produttore. Portare 1 aliquota posta sul ghiaccio nella sala operatoria, per l'iniezione di uno o sei animali in un dato giorno. Le norme sulla biosicurezza per l'uso dell'AAV possono dipendere dal paese o dall'istituzione e può essere richiesto l'uso di una cappa PSM 2.
    NOTA: Qui, usiamo un sierotipo AAV22/5 che esprime Chronos, una variante veloce di channelrhodospin-2, fusa in proteina fluorescente verde sotto il controllo del promotore di Synapsin: AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.

2. Chirurgia stereotassica

  1. Installare un telaio stereotaxic dotato di supporto a pompa su un banco di laboratorio standard stabile. Regolare lo stereoscopio in modo da vedere chiaramente la zona in cui verrà posizionata la testa dell'animale. Utilizzare una sorgente luminosa a LED per l'illuminazione. Ruotare lo stereoscopio per accedere al supporto della pompa, che non è necessario per i primi passi dell'intervento chirurgico.
  2. Installare una siringa Hamilton da 10 ll dotata di ago metallico smussato da 33 G nel supporto della pompa. Testare il sistema di espulsione con acqua.
  3. Anestesizzare un topo C57BL6 di 4-5 settimane con un'iniezione intraperitoneale di una miscela di cloridrato di chetamina e xilola (100 mg/kg e 10 mg/kg, rispettivamente). Preparare un mix di 1 mL di ketamina e 0,5 mL di xilosina in 8,5 mL di 0,9% NaCl. Questo si tradurrà in 10 mg/mL ketamina e 1 mg/mL xilola nel mix. Di questo mix, iniettare intraperittealmente 10 l per grammo del peso corporeo dell'animale. La durata dell'anestesia è di circa 1 h.
  4. Verificare che l'animale sia ben anetizzato con un pizzico di dita dei dei diici. Quindi, estrarre la lingua per facilitare la respirazione. Rasa i capelli cranici.
  5. Iniettare 20 - L di cloruro di lidocaina (4 mg/mL; 2 mg/kg) sotto la pelle della testa per l'anestesia locale e attendere 5 minuti per l'effetto di iniziare. Per evitare danni agli occhi dovuti alla secchezza, coprire gli occhi con unguento oftalmico topico.
  6. Per esporre il cranio, creare un taglio dritto nel cuoio capelluto con piccole forbici chirurgiche. Posizionare l'animale in un telaio stereotassico, inserendo le barre dell'orecchio leggermente rostral all'orecchio reale per poggiare sull'osso e tirare giù la pelle, che dovrebbe creare un buon accesso al cranio. Stringere in posizione. Installare il nose piece.
  7. Mantenere il corpo dell'animale orizzontalmente a livello della testa utilizzando un supporto regolato in altezza. Posizionare un cuscinetto di riscaldamento sotto il mouse per mantenerlo a temperatura fisiologica.
  8. Pulire il cranio applicando lo 0,9% NaCl con un tampone di cotone per rimuovere i tessuti molli dall'osso. Utilizzare lo stereoscopio per il resto dell'intervento chirurgico.
  9. Regolare il cranio in modo che l'asse bregma-lambda sia livellato, muovendosi verso l'alto o verso il basso nel naso e nel pezzo dei denti. Ciò richiede misure iterative di bregma e lamba, in quanto entrambi cambieranno in seguito alla regolazione del livello del naso.
  10. Trova la posizione del sito di iniezione sul cranio. Regolare l'ago di iniezione sopra il sito di iniezione in base alle coordinate posteriori e mediali e contrassegnare il cranio con un ago usa e getta. Spostare l'ago di iniezione verso l'alto di 4 cm.
  11. Utilizzare una bava da 0,5 mm con un trapano per realizzare una craniotomia di diametro di 1 mm sul marchio, a metà della velocità massima. Swab eventuale sanguinamento con un tessuto di carta.
  12. Svuotare l'acqua contenuta nella siringa Hamilton per lo stoccaggio espellendola completamente con la pompa. Solo l'ago sarà ancora riempito con acqua. L'ago viene lavato tra ogni uso con acqua pura deionizzata. La sterilizzazione non è necessaria.
  13. Prendete l'aliquota del virus che deve essere utilizzato per questo giorno. Assicurarsi che la soluzione virale non sia più congelata, ma sia rimasta raffreddata (vicino a 0 gradi centigradi, sul ghiaccio). Solo brevemente rimuovere dal ghiaccio per ottenere 700 nL con una micropipetta per piccoli volumi. Depositare la goccia su un pezzo di pellicola di paraffina di 5 cm x 5 cm. Evitare di creare bolle. Rimetti la soluzione virale rimanente sul ghiaccio.
    NOTA: Il volume di caduta deve essere maggiore del volume di iniezione desiderato (700 nL per 200 nL iniettato). Questo darà un margine di sicurezza nel caso in cui una parte del liquido viene persa durante il trasferimento e permette di eseguire una piccola espulsione di prova (passaggio 2.16) prima di procedere.
  14. Posizionare la pellicola di paraffina sopra la craniotomia. Immergere l'ago nella goccia della soluzione virale senza cambiare la posizione antero-posteriore e laterale.
  15. Utilizzare la funzione "ritiro" della pompa per riempire la siringa con circa 500 nL di soluzione virale smaltita sulla pellicola di paraffina.  Fate questo sotto controllo visivo (stereoscopio), guardare la goccia scomparire, e assicurarsi di non aspirare l'aria.
  16. Assicurarsi che la siringa sia stata riempita correttamente. Verificare il funzionamento del sistema di espulsione guidando verso il basso lo stantuffo per testare l'espulsione di una piccola goccia di liquido di 50 nL sotto controllo visivo. Pulisci la goccia.
  17. Inserire l'ago nel cervello alla profondità scelta, ruotando la manopola controllando l'asse dorso-ventrale dell'apparato stereotassico in senso orario. Premere il pulsante "run" (velocità 15 nL/min per volume di 150 nL iniettato). Un piccolo volume (50-300 nL, a seconda del virus utilizzato) viene lentamente espulso oltre 10 min con una pompa automatica.
  18. Attendere 10 min dopo l'iniezione per evitare perdite dal sito di iniezione. Quindi, rimuovere lentamente l'ago oltre 3-5 min ruotando la manopola controllando l'asse dorso-ventrale in senso antiorario.
  19. Ruotare la parte verticale del telaio stereotaxic con la siringa lontano dall'animale. Lavare immediatamente l'ago in acqua pulita distillata riempiendolo più volte, al fine di evitare l'intasamento. Conservare la siringa riempita d'acqua.
  20. Rimuovere il mouse dalla cornice stereotaxic. Suturare la pelle con 4-0 filamento di sutura poliammide. Fare tre o quattro stiches, legati con nodi chirurgici standard 2-1-1.
  21. Mettere il topo in una gabbia riscaldata fino a quando non si sveglia completamente dall'anestesia e fornire acqua e cibo imbevuto in un piatto Petri posto a terra. Se la fonte di calore è sotto la gabbia, utilizzare una griglia distanziale per evitare il surriscaldamento.
    NOTA: Secondo le linee guida locali, una singola dose di chetoprofene (2-5 mg/kg, sottocutaneamente) o buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg, sottocutanea) può essere applicata per prevenire il dolore.
  22. Quando l'animale è completamente sveglio, riportarlo nella sua gabbia di casa e monitorarne il benessere, in particolare il giorno successivo all'iniezione. Verificare la presenza di segni di dolore. Se si osserva una modifica comportamentale, l'animale viene pesato per monitorare il suo peso corporeo.
  23. A seconda del virus utilizzato, il tempo per l'espressione completa può variare. Qui, permettiamo 3 settimane per l'espressione di AAV5. Syn.Chronos-GFP.

3. Soluzioni per registrazioni e fissazione di fette acute

  1. Preparare soluzioni di stock di 10x soluzione di taglio concentrato (125 mM NaCl, 25 mM di saccarosio, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4 e 2,5 mM D-glucose) e soluzione artificiale di cerebro fluido (ACSF) (124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4 e 11 mM D-glucosio) in acqua pura deionizzata prima degli esperimenti di elettrofisiologia. Conservare queste soluzioni a 4 gradi centigradi in bottiglie da 1 L senza CaCl2 e MgCl2.
  2. Il giorno dell'esperimento, diluire le soluzioni di stock di soluzione di taglio e ACSF 10x ad un volume finale di 0,5 L ciascuno. Agitare con un agitatore magnetico e ossigenare spumeggiando con 95%/5% O2/CO2. Aggiungere ioni divalenti per ottenere concentrazioni finali di 0,1 mM CaCl2 e 7 mM MgCl2 per la soluzione di taglio e 2 mM CaCl2 e 2 mM MgCl2 per ACSF.
  3. Preparare la soluzione pipetta a base di glucona di potassio per contenere: 135 mM K-gluconate, 1,2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2,4 mM MgATP, 0,4 mM Tris-GTP, 10 mM Na 2-phosphocreatine e 2,7–7,1 mM di biocytina per cellule post-hoc rivelazione morfologia. Regolare il pH della soluzione a 7.3 e l'osmolarità a 290 mOsm. Conservare 1 aliquote mL a -20 gradi centigradi.
  4. Preparare 0,1 M PBS diluindo sacchetti di polvere BupH PBS a secco in 500 mL di acqua distillata, con conseguente fosfato di sodio da 0,1 M, 0,15 M NaCl, pH 7.2.
  5. Per preparare 1 L del 4% di soluzione PFA, diluire 111 mL di 36% PFA liquido e 90 mL di 10x soluzione PBS in acqua distillata.
  6. Preparare una soluzione 30% di saccarosio contenente 150 g di saccarosio in 500 mL di 0,1 M PBS.

4. Preparazione di fette cerebrali

  1. Preparare lo spazio del banco con carta da banco assorbente prima della perfusione.
  2. Installare una flebo a circa 1 m sopra la panca per la perfusione alimentata a gravità. Attacca un ago a farfalla da 24 G.
  3. Circondare la camera di taglio del vibratoma con ghiaccio e conservarlo in un congelatore.
  4. Anestesizzare il topo con iniezione intraperitoneale della stessa miscela di ketamina-xilizina utilizzata per la chirurgia. Valutare lo stadio dell'anestesia pizzicando la dita dei dei fino a dire con pinze. In modalità completamente addormentata, iniettare 100 l di eparina (5000 U.I./mL) intraperitonealmente.
  5. Fissare l'animale con nastro adesivo sulla carta assorbente, sdraiato sulla schiena. Aprire la gabbia toracica tagliando le costole sui lati sinistro e destro con piccole forbici, dal diaframma verso l'alto. Mantenere la gabbia toracica aperta con l'aiuto di nastro adesivo.
  6. Bloccare l'aorta discendente con un emolaro e perfuso attraverso il ventricolo sinistro del cuore con 4 gradi centigradi raffreddati e ossigenati (95%/5% O2/CO2),tagliando la soluzione attraverso l'ago delle farfalle da 24 G. Dopo 5 s, aprire l'atrio destro con piccole forbici.
  7. Dopo 5 min di perfusione, quando gli organi sono senza sangue, fermare la perfusione. Decapitare l'animale con grandi forbici e immergere la testa in 4 gradi centigradi raffreddato e ossigenato soluzione di taglio in un piatto Petri.
  8. Per estrarre il cervello, tagliare la pelle dal collo al naso, quindi sezionare le ultime vertebre dal cranio con le forbici. Ritrarre manualmente la pelle e utilizzare piccole forbici per aprire il cranio, tagliandolo lungo la linea mediana, da caudala a rostral, verso l'alto e tra gli occhi.
  9. Rimuovere con attenzione l'osso parietale e la parte caudale dell'osso frontale con pinze curve o ossee. Estrarre il cervello con una piccola spatola arrotondata inserendo lo strumento tra il cervello e il pavimento cranico, sezionando il bulbo olfattivo, nervo ottico e altri nervi cranici, e cervelletto.
  10. Immergere delicatamente il cervello in una soluzione di taglio ghiacciata (4 gradi centigradi) in un bicchiere. Posizionare il cervello sulla carta da filtro per asciugare delicatamente la superficie corticale. Incollare la corteccia cerebrale verso il basso al portacampioni di un vibratoma, con il lato caudale rivolto verso la lama, al fine di tagliare le fette cerebrali orizzontali.
  11. Riempire la camera di taglio con soluzione di taglio ossigenata ghiacciata in modo che il cervello sia completamente immerso. Effettuare un taglio sull'emisfero sinistro (contralaterale al lato iniettato) per evitare una potenziale ambiguità sinistra-destra sulle sezioni.
    AVVISO: ossigenare sempre la soluzione e proteggere le fette dall'esposizione alla luce.
  12. Tagliare 300 fette spesse 300 m con il vibratome, ad una velocità di 0,07 mm/s con un'ampiezza di 1 mm. In questa fase, si consiglia di controllare brevemente l'espressione Chronos-GFP nel talamo utilizzando una torcia fluorescente (440-460 nm) e gli occhiali da filtro corrispondenti (500 nm long pass).
  13. Isolare la regione dell'ippocampo con un bisturi e trasferirlo in una camera posizionata in un becher pieno di bagno riscaldato (34 gradi centigradi), ossigenato (95%/5% O2/CO2) ACSF.
  14. Dopo 15 min, prendere la camera dal bagno d'acqua riscaldata e lasciare riposare le fette a temperatura ambiente, ancora ossigenate per almeno 45 min fino all'uso.

5. Registrazione patch-clon a cella intera

  1. Trasferire delicatamente una fetta di cervello contenente il complesso ippocampale con una pipetta di trasferimento del vetro su misura alla camera di registrazione montata al microscopio verticale. Una pipetta di trasferimento è costituita da una pipetta Pasteur accorciata (diametro interno 6,5 mm) attaccata a una lampadina di pipetta di gomma. Perfuso continuamente la camera di registrazione (3 mL) con 34 gradi centigradi (riscaldato) ACSF bollente con 95%/5% O2/CO2. Impostare la velocità della pompa peristaltica a 2-3 mL/min.
  2. Esaminare brevemente l'espressione Chronos-GFP nei terminali assoni nella regione di interesse con l'illuminazione a LED blu (470 nm) e osservare con un obiettivo 4x. La fluorescenza GFP viene visualizzata tramite un filtro di emissione appropriato, con un'immagine della telecamera CCD visualizzata sullo schermo di un computer.
  3. Posizionare un'ancora a fette costituita da un filo di platino a forma di U con corde di nylon strettamente distanziate ("arpa") sulla fetta per mantenerla.
  4. Passare a un obiettivo di immersione 63x e regolare la messa a fuoco. Verificare la presenza di assoni che esprimono Chronos-GFP e scegliere un neurone piramidale per la registrazione delle patch.
  5. Spostare l'obiettivo verso l'alto.
  6. Tirare pipette utilizzando un estrattore di elettrodo Brown-Flaming dal vetro borosilicate. L'emittente è impostato per produrre pipette con circa 1 m di diametro della punta. Riempire le pipette con una soluzione interna a base di K-gluconate.
  7. Montare la pipetta nel supporto della pipetta sul palco della testa. Abbassare la pipetta nella camera e trovare la punta sotto l'obiettivo. La resistenza alle pipette dovrebbe essere compresa tra 3 e 8 M. Applicare una leggera pressione positiva con una siringa in modo da vedere un cono di flusso di soluzione fuori dalla pipetta e abbassare progressivamente la pipetta e l'obiettivo alla superficie della fetta.
  8. Applicare la patch alla cella nella configurazione del morsetto di tensione: avvicinare il neurone identificato e premere delicatamente la punta della pipetta sul soma. La pressione positiva dovrebbe produrre una fossetta sulla superficie della membrana. Rilasciare la pressione per creare un sigillo giga-ohm (>1 resistenza G. Una volta sigillato, impostare la tensione di mantenimento su -65 mV. Rompere la membrana con un forte impulso di pressione negativa: questo si ottiene applicando una forte aspirazione a un tubo collegato al supporto pipette.
  9. Registrare in modalità di morsetto corrente a tutta cell le risposte del neurone all'iperpolarizzazione e alla depolarizzazione dei passi correnti (Figura 2A).
    NOTA: questo protocollo verrà utilizzato per determinare le proprietà intrinseche attive e passive della cella. Le routine MATLAB scritte su misura vengono utilizzate per l'analisi off-line10,16.
  10. Registrare nelle risposte post-naptiche di corrente o di morsa di tensione alla stimolazione LED da 475 nm per tutto il campo delle fibre afferenti che esprimono Chronos. Stimolare con treni di 10 stimolazioni di 2 ms di durata a 20 Hz(Figura 2B,C). L'intensità della luce può variare da 0,1 a 2 mW.
    NOTA: l'intensità della luce è stata misurata con una console di alimentazione ottica portatile digitale dotata di un sensore fotodiodo, posizionato sotto l'obiettivo. Le latenze di risposta di 2-4 ms sono caratteristiche per una connessione monossinaptica.
  11. Per studiare la natura della trasmissione sinaptica tra gli afferenti a lungo raggio e il neurone registrato, possono essere utilizzati diversi agenti farmacologici. Per distinguere farmacologicamente le risposte dirette e monosintiche dalle risposte indirette tramite l'attivazione della rete, aggiungere all'ACSF 1 TTX e 100 M 4-AP.
    NOTA: l'applicazione bath dei recettori del glutammato permette di determinare la natura del neurotrasmettitore che viene rilasciato e l'identità dei recettori post-sinaptici. Ad esempio, i recettori del glutammato di tipo AMPA saranno bloccati dai recettori NBQX (10 m) e NMDA da APV (100 M). A seconda dello scopo dello studio, i protocolli possono essere concepiti per studiare la dipendenza dalla tensione delle risposte sinaptiche o delle dinamiche di risposta nel tempo.
  12. Lavare con soluzione ACSF originale per correggere un'altra cellula, o trasferire la fetta contenente un neurone pieno di biocitina in una piccola fiala riempita con 4% PFA.
  13. Dopo una fissazione notturna in 4% PFA, lavare la fetta in 0,1 M PBS (2x per 5 min, 1x per 20 min).
  14. Conservare in saccarosio del 30% a 4 gradi centigradi.

6. Rivelazione biocitina

  1. Trasferire le fette fisse contenenti neuroni riempiti di biocitina su una lama di vetro in una goccia del 30% di saccarosio ed eseguire tre cicli di congelamento-scongelamento: mettere la lama sul ghiaccio secco smaltito in una scatola di polistirolo per 1 min fino a quando le gocce di saccarosio sono completamente congelate, quindi premere la lama contro il palmo della mano per scongelare.
  2. Lavare la fetta 3x in 0,1 M PBS (2x per 5 min, 1x per 1 h e 50 min), delicatamente agitata. Non superare 2 h per l'ultimo lavaggio.
  3. Pre-incubare la fetta a RT per 2 h in una soluzione tampone agitata contenente 2% latte in polvere (0,4 g in 20 mL) per saturare siti non specifici e 0,5% Triton X100 (0,1 mL in 20 mL) per permeabilizzare le membrane in PBS da 0,1 M.
  4. Incubare pernottamento a 4 gradi centigradi in una soluzione contenente il 2% di latte in polvere, 1% Triton X100, coniugato streptavidin-Cy5 (1/500) e DAPI (1/1000) in 0,1 M PBS, delicatamente agitato.
  5. Lavare la fetta tre volte in 0,1 M PBS (2x per 5 min, 1x per 2 h). L'ultimo lavaggio può durare più a lungo, fino a 4 h, per ridurre la colorazione dello sfondo.
  6. Prima di montare la fetta, utilizzare un microscopio a epifluorescenza a ingrandimento 10x configurato per osservare i marcatori fluorescenti Cy5 al fine di identificare il lato della fetta contenente la cella contrassegnata in una camera piena di PBS.
  7. Trasferire la fetta su una lama, lato cellulare verso l'alto, asciugarla con un tessuto di carta e montarla utilizzando un supporto di montaggio ad alta resistenza.
  8. Utilizzare un microscopio a epifluorescenza a ingrandimento 10x nella configurazione Cy5 e DAPI per esaminare la posizione del corpo cellulare, e nella configurazione GFP per osservare gli afferenti marcati, o un microscopio confocale ad alta risoluzione a 20x per dettagliato somatico, assonale, e morfologia dendritica (Figura 2D,E). Le impostazioni del filtro sono descritte in dettaglio nella Tabella dei materiali.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La procedura qui presentata è stata utilizzata per esprimere una channelrhodopsin (Chronos) blu sensibile alla luce fusa alla GFP nel nucleo antero-dorsale del talamo (ADN), mediante iniezione stereotassica di virus anterogrado adeno-associato. Le coordinate stereotassiche sono state determinate secondo un atlante cerebrale del topo e testate iniettando 200 nL di fluoro-ruby fluorescente. L'animale è stato sacrificato 10 min dopo l'iniezione, e il cervello è stato estratto e fissato durante la notte. Le sezioni cerebrali coronali sono state preparate per esaminare il sito di iniezione, che è stato correttamente collocato e limitato ad ADN (Figura 1A, B).

Al fine di esprimere Chronos-GFP nei neuroni di ADN, abbiamo iniettato 300 nL di AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH. Tre settimane dopo l'iniezione, sono state preparate fette cerebrali orizzontali acute. Figura 1 C mostra una fetta di cervello contenente il sito di iniezione talamica nell'emisfero destro, con espressione GFP in verde. Dopo l'ispezione con un microscopio epi-fluorescenza dotato di un obiettivo 4x, GFP etichettato assoni talamici sono stati osservati nel presubicolo (Figura 1C,D). Si notò che gli assoni talamici innervavano densamente gli strati superficiali I e III del presubicolo (Figura 1D).

L'attività dei neuroni presubicolari nello strato III è stata registrata nella configurazione del morsetto a tutta cell. Durante la registrazione delle variazioni potenziali della membrana (Figura 2A) sono stati applicati passaggi di corrente iperpolarizzazione e depolarizzazione . I dati sono stati memorizzati su un computer per un'analisi offline successiva delle proprietà della membrana attiva e passiva. Le cellule principali dello strato presubicolare III in genere possedevano un potenziale di riposo negativo vicino a -63 mV e richiedevano iniezioni di corrente depolarizzante per guidare il potenziale della membrana verso la soglia di cottura. Una descrizione completa delle loro proprietà intrinseche è stata pubblicata11.

Stimolare i terminali assoni ADN che esprimono Chronos-GFP hanno suscitato potenzialità post-sinaptiche eccitatori (EPP) nelle cellule principali dello strato presubicolare III in modalità morsetto corrente (Figura 2B). A seconda dell'intensità della luce, gli EPSP potrebbero raggiungere la soglia potenziale di azione. Le risposte post-sinaptiche sono state osservate anche in modalità tensione-clamp poiché sono state suscitate correnti post-sinaptiche eccitatorie (EPSC) (Figura 2C). Le latencie sincissioni di EPSC evocate da stimolazioni luminose erano brevi (mediana, 1,4 ms10), indicando un contatto sinaptico diretto tra gli assoni talamici e i neuroni preicolari di strato III. Le EPSC persistenti nella condizione TTX-4AP hanno confermato questa attivazione monossinaptica. È interessante notare che queste cellule hanno risposto in modo affidabile alle stimolazioni della luce degli assoni afferenti con un modello di cottura regolare.

Figure 1
Figura 1 : Iniezione stereotassica nel nucleo talhomico anterodorsale (ADN). (A) Rappresentazione schematica dell'iniezione. (B) Conferma del sito di iniezione con fluoro-rubino in una sezione coronale. Rientro indica il livello antero-dorsale e la distanza da bregma. (C) Fetta orizzontale a seguito dell'iniezione AAV-Chronos-GFP nel talamo. Le proiezioni assonali al presubiculum ipsilaterale devono essere notate. Un'incisione sul lato sinistro della fetta (indicata da un triangolo nero) indica l'emisfero contralaterale. (B, C) Barra di scala 1 mm.(D) Vista ingrandita dell'inset in (C) con proiezioni ADN agli strati superficiali presubicolari. Barra di scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Neurone dello strato presubicolare III: proprietà intrinseche, risposta alla stimolazione della luce degli afferenti talamici e rivelazione post-hoc della morfologia cellulare. (A) Modello di cottura e membrana potenziali variazioni del neurone strato III per iperpolarizzare e depolarizzare i passi attuali. (B, C) Risposte del neurone di strato III a stimolazioni di luce di 2 ms (barre blu) di assoni talamici registrati in modalità di morsetto di corrente (B) e(C). (D, E) Neurone piramidale di livello III (bianco, indicato da triangolo giallo pieno) circondato da assoni talamici che esprimono Chronos-GFP (verde) in strati superficiali presubicolari con colorazione DAPI (blu) in fetta orizzontale immagine con un microscopio epifluorescenza ( D, barra di scala 100 m) e microscopio confocale ad alto ingrandimento (E, barra di scala - 50 m). La cella in (A) è indicata con triangoli gialli riempiti. Un secondo neurone parzialmente riempito è presente in questa fetta indicata con triangoli gialli vuoti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

L'iniezione virale in vivo per esprimere le opsine sensibili alla luce in un'area del cervello definita è un metodo di scelta per l'analisi optogenetica della connettività funzionale a lungo raggio10,11,17,18. Le iniezioni stereotassiche offrono la possibilità di indirizzare con precisione una specifica area del cervello. La coespressione di un opsino con un reporter fluorescente permette comodamente di valutare l'espressione di successo e la conferma del preciso sito di iniezione. L'uso del sierotipo AAV 2/5 limita in genere l'espressione all'area cerebrale di destinazione. In questo modo, una popolazione ristretta di neuroni viene trasinfezione, esprimendo canali ionici sensibili alla luce nei loro corpi cellulari e terminali degli assoni. Nei successivi esperimenti di fetta ex vivo, è possibile stimolare questi terminali assoni con impulsi di luce direttamente nella loro area di destinazione, mentre legge la trasmissione sinaptica di successo tramite la registrazione patch-clamp di un neurone collegato post-sinapicamente. Il protocollo di cui sopra è robusto e conveniente, e alcune note aggiuntive possono aiutare le prestazioni di esperimenti di successo.

Possono essere utilizzati diversi tipi di anestesia. Descritto qui è l'iniezione intraperitoneale di una combinazione ketamina-xilozina come un facile da usare, anestesia a breve termine con comoda analgesia19. La profondità e la durata dell'anestesia possono variare in una certa misura. In alcuni casi, può essere necessario iniettare un'altra mezza dose di ketamina-xilosina durante il protocollo. L'anestesia di Isoflurane può essere una buona alternativa per indurre più rapidamente e meglio controllare la profondità dell'anestesia. Le coordinate dei siti di iniezione possono essere determinate con l'aiuto di un atlante cerebrale del topo. In pratica, le coordinate devono essere testate e regolate, se necessario.

Anche le condizioni di lavoro pulite sono fondamentali. Si consiglia di utilizzare indumenti protettivi usa e getta, tra cui guanti, un berretto da mafia e un camice da laboratorio. Quando si posiziona l'animale nel telaio stereotaxic, particolare attenzione dovrebbe essere prestata al comfort dell'animale, che migliorerà notevolmente l'efficienza dell'anestesia. Il corpo dell'animale deve essere allineato con la testa e il collo. Il passo più critico nel posizionamento dell'animale e prima della craniotomia è la regolazione dell'asse bregma-lambda. Soprattutto quando si mira strutture cerebrali profonde, anche una piccola deviazione genererà errori quando si abbassa l'ago di iniezione nel cervello. In alcuni casi, si può deliberatamente scegliere e calcolare una traiettoria dell'ago obliquo.

Il volume di iniezione è un fattore determinante per ottenere un'espressione opsin localizzata con precisione. Un piccolo volume è ideale per privilegiare una zona di trasfezione strettamente limitata. Volumi più elevati possono essere utili per coprire l'intera estensione di un'ampia area di destinazione. Se una vasta area deve essere coperta, come il setto18, può essere utile inserire diverse piccole iniezioni con una gamma di coordinate vicine. Anche l'intervallo fino alla registrazione elettrofisiologica ex vivo è fondamentale. È necessario un tempo minimo per l'espressione completa. Mentre 3 settimane sembrano essere un ritardo ottimale per questi esperimenti11, il ritardo necessario può variare a seconda del virus, il suo sierotipo, e la distanza dalla regione del cervello postsinaptico.

L'approccio qui descritto è ancora più potente se combinato con iniezioni in animali transgenici. Il lavoro precedente ha sfruttato diverse linee del topo per sottotipi di neuroni GABAergici, al fine di indirizzare specificamente gli interneuroni che esprimono il fotofoto PV o SST per le registrazioni patch-clamp20. La doppia registrazione simultanea di neuroni fotovoltaici e piramidali vicini o neuroni SST e piramidali consente quindi il confronto dei punti di forza degli input a lungo raggio tra due tipi di neuroni11. Questo produce risultati che sono standardizzati rispetto a un tipo di neurone. Questa standardizzazione è particolarmente importante nei casi in cui i livelli di espressione delle operazioni variano tra diversi animali o fette diverse.

La salute delle fette è essenziale per le registrazioni patch-clamp di alta qualità. L'ossigenazione costante delle fette è fondamentale e una velocità di taglio lenta migliora significativamente la qualità della superficie della fetta. Uno spessore di fetta di 300 m conserva, in una certa misura, l'integrità del microcircuito in sezioni presubicolari orizzontali, compresi i neuroni piramidali con i loro corpi cellulari, le ramificazioni assonali dendritiche e locali e le connessioni sinaptiche locali. Il tipo di canali illuminati scelti per indurre l'attivazione di fibre afferenti influenzerà notevolmente i parametri di stimolazione (durata, intensità della luce). Chronos è una channelrhodopsin blu sensibile alla luce e un'ampia gamma di lunghezze d'onda di illuminazione può essere utilizzata per l'attivazione (sensibilità al picco di circa 500 nm, anche con intensità di luce minima di 0,05 mW/mm2, attivata anche a 405 nm e fino a 530 nm21 ). Inoltre, Chronos ha proprietà cinetica veloci rispetto alla ChR2 classica, che consente stimolazioni ad alta frequenza e l'attivazione affidabile delle proiezioni a lungo raggio22. In combinazione con l'espressione di Chrimson, una variante dell'opsina con spostamento rosso, l'eccitazione ottica indipendente di popolazioni neurali distinte diventa fattibile.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Ringraziamo Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang e Jean Simonnet per il loro aiuto nello sviluppo di versioni precedenti del protocollo di iniezione stereotassico e Marin Manuel e Patrice Jegouzo per l'aiuto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero francese per l'istruzione e la ricerca (L. R., L. S.), Centro Nazionale di Des Etudes Spatiales (M. B.), e Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm bur  Harvard Apparatus 724962
10 µL Hamilton syringe Hamilton 1701 RN - 7653-01
10X PBS solution Thermofisher Scientific AM9624  text
36% PFA Sigma-Aldrich F8775
470 nm LED  Cairn Research P1105/470/LED  DC/59022m use with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP 
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Penn Vector Core AV-5-PV3446 lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 
All chemicals Sigma
Bath temperature controler Luigs & Neumann SM7 Set at 34°C 
beveled metal needle Hamilton 7803-05 33 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissors Dahle Allround 50038
Biocytin Sigma B4261 final 1-3 mg/ml
Borosilicate Capillaries Havard Apparatus GC150-10 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode puller Sutter Instruments P-87
BupH Phosphate Buffered Saline pack Thermofisher Scientific 28372
butterfly needle for perfusion Braun  Venofix A 24G
CCD Camera Andor  DL-604M
Confocal Microscope Zeiss LSM710 20X
curved forceps FST  11011-17
CY5 configuration (confocal) Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 
CY5 configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPI Sigma D9542
DAPI configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440A Axon Instruments
Digital handheld optical meter ThorLabs PM100D Parametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein Flashlight Nightsea DFP-1 excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTA Sigma E4368 final 0,2 mM
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse TE-2000E 10 or 20X
Filter paper Whatman
Fluoro-Ruby 10% Millipore AG335 disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
Heatingplate Physitemp HP4M
Heparin choay 5000 U.I./ml Sanofi 5 ml vial
HEPES Sigma H3375 final 10 mM
High speed rotary micromotor kit Foredom K.1070 maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse Stimulator A-M Systems 2100
KCl Sigma P4504 final 1,2 mM
Ketamine 1000 Virbac
Ketofen 10% Merial 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine) MSD 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgery Photonic (via Phymep) 10044
LED Power Supply Cairn Research OptoLED Light Source
Manipulators Luigs & Neumann SM-7
Mg-ATP 2H20 Sigma A9187 final 4 mM
MgCl2 Sigma 63069 final 2 mM
Micro temperature controler Physitemp MTC-1
Milk powder Carnation
MultiClamp 700B Axon Instruments
Na Phosphocreatine Sigma P7936 final 10 mM
Na3-GTP 2H20 Sigma G9002 final 0.4 mM
needle holder/hemostat FST 13005-14
pClamp acquisition software Axon Instruments
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3 14-16 on the display for 2-3 ml/min 
Potassium gluconate (K-gluconate) Sigma G4500 Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting medium Thermofisher Scientific P36390
Rompun 2% (xylazine) Bayer
small scissors FST 14060-09
Sodium chloride 0.9%  Virbac dilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZT VWR 630-1584
Stereotaxic frame with digital display Kopf Model 940 Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugate Life technologies  434315
Streptavidin-Cy5 conjugate Thermofisher Scientific S32357
Superglue3 Loctite Dutscher 999227 1g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid Ethicon F3210
Syringe pump kdScientific Legato 130 - 788130 Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicer Leica VT1200S speed 0.07, amplitude 1.
tubing Gilson F117942, F117946 Yellow/Black, Purple/Black
upright microscope Olympus BX51W1
Versi-dry bench absorbant paper Nalgene

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17, (23), 9315-9330 (1997).
  2. Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347, (6224), New York, N.Y. 870-874 (2015).
  3. Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8, (11), 1542-1551 (2005).
  4. Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62, (1), 102-111 (2009).
  5. Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222, (5), 2421-2438 (2017).
  6. Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12, (5), 587-592 (2002).
  7. Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
  8. Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72, (1), 111-123 (2011).
  9. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5, (3), 439-456 (2010).
  10. Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
  11. Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38, (28), 6411-6425 (2018).
  12. Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, Pt 17 4249-4264 (2009).
  13. Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37, (4), 583-597 (2013).
  14. Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373, (3), 541-556 (2018).
  15. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic. New York. (2013).
  16. Huang, L. -W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4, (2), (2017).
  17. Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65, (2), 230-245 (2010).
  18. Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34, (50), 16739-16743 (2014).
  19. Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31, (6), 685-696 (2015).
  20. Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
  21. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, (3), 338-346 (2014).
  22. Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116, (5), 2056-2066 (2016).
In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (151), e59534, doi:10.3791/59534 (2019).More

Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (151), e59534, doi:10.3791/59534 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter