Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Methoden voor het testen van endocriene verstoring in fruitvliegje melanogaster

Published: July 3, 2019 doi: 10.3791/59535
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1,2
1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

Summary

Endocriene verstorende chemicaliën (Edc's) vormen een ernstig probleem voor organismen en voor natuurlijke omgevingen. Fruit vliegje melanogaster is een ideaal model om EDC-effecten in vivo te bestuderen. Hier presenteren we methoden om endocriene verstoring in fruitvliegje te onderzoeken, het aanpakken van EDC effecten op Fecundity, vruchtbaarheid, ontwikkelingsstoornissen timing, en de levensduur van de vliegen.

Abstract

In de afgelopen jaren is er steeds meer bewijs dat alle organismen en het milieu worden blootgesteld aan hormoon-achtige chemicaliën, bekend als endocriene verstorende chemicaliën (Edc's). Deze chemische stoffen kunnen veranderen de normale balans van endocriene systemen en leiden tot negatieve effecten, evenals een toenemend aantal hormonale stoornissen in de menselijke populatie of verstoorde groei en verminderde voortplanting in de wild levende dieren. Voor sommige Edc's, zijn er gedocumenteerd gezondheidseffecten en beperkingen op het gebruik ervan. Nochtans, voor de meesten van hen, is er nog geen wetenschappelijk bewijsmateriaal in deze betekenis. Om de mogelijke endocriene effecten van een chemische stof in het volledige organisme te verifiëren, moeten we deze testen in geschikte modelsystemen, evenals in de fruitvlieg, melanogaster. Hier rapporteren wij gedetailleerde in vivo protocollen om endocriene verstoring in fruitvliegje te bestuderen, dat EDC gevolgen voor de Fecundity/de vruchtbaarheid, ontwikkelings timing, en levensduur van de vlieg aanpakt. In de afgelopen jaren, gebruikten we deze vlieg fruit levens trekken om de effecten van blootstelling aan 17-α-ethinylestradiol (EE2), Bisfenol A (BPA), en bisfenol AF (BPA F) te onderzoeken. In totaal behandelden deze analyses alle stadia van het fruitvliegje en maakten ze het mogelijk om de endocriene ontwrichting in alle hormoon gemedieerde processen te evalueren. Fecundity/vruchtbaarheid en ontwikkeling timing assays waren nuttig om de EDC impact op de Fly reproductieve prestaties en ontwikkelingsstadia te meten, respectievelijk. Ten slotte, de levensduur assay betrokken chronische EDC blootstelling aan volwassenen en gemeten hun overlevingspensioen. Deze levens eigenschappen kunnen echter ook worden beïnvloed door verschillende experimentele factoren die zorgvuldig gecontroleerd moesten worden. Dus, in dit werk, raden we een reeks van procedures die we hebben geoptimaliseerd voor de juiste uitkomst van deze tests. Deze methoden kunnen wetenschappers vast te stellen endocriene ontwrichting voor een EDC of voor een mengsel van verschillende Edc's in fruitvliegje, hoewel het endocriene mechanisme verantwoordelijk voor het effect te identificeren, verdere essays nodig zou kunnen zijn.

Introduction

Menselijke activiteiten zijn het vrijgeven van in het milieu een enorme hoeveelheid chemicaliën, die een ernstig probleem voor organismen en voor natuurlijke ecosystemen vertegenwoordigen1. Van deze verontreinigende stoffen wordt geschat dat ongeveer 1.000 verschillende chemicaliën het normale evenwicht van endocriene systemen kunnen veranderen; Volgens deze eigenschap, worden zij geclassificeerd als endocriene verstorende chemische producten (Edc's). Specifiek, op basis van een recente definitie van de endocriene samenleving, de Edc's zijn "een exogene chemische stof, of een mengsel van chemicaliën, die kunnen interfereren met elk aspect van hormoon actie"2. In de afgelopen drie decennia zijn er steeds meer wetenschappelijke aanwijzingen dat edc's de voortplanting en ontwikkeling van dieren en planten3,4,5,6,7, 8. Verder, EDC blootstelling is gerelateerd aan de toenemende prevalentie van sommige ziekten van de mens, met inbegrip van kanker, obesitas, diabetes, schildklier ziekten, en gedragsstoornissen9,10,11.

Algemene mechanismen van EDC

Door hun moleculaire eigenschappen, edc's gedragen zich als hormonen of hormoon precursoren3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. In deze zin kunnen ze binden aan de receptor van een hormoon en verstoren endocriene systemen, hetzij door het nabootsen van hormoon activiteit of door het blokkeren van endogene hormonen bindend. In het eerste geval, na binding aan de receptor, kunnen ze activeren als zijn natuurlijke hormoon zou doen. In het andere geval, binding van het EDC aan de receptor voorkomt dat de binding van zijn natuurlijke hormoon, zodat de receptor is geblokkeerd en kan niet meer worden geactiveerd, zelfs in de aanwezigheid van zijn natuurlijke hormoon3. Als gevolg daarvan kan Edc's invloed hebben op verschillende processen, zoals de synthese, secretie, transport, metabolisme, of perifere werking van endogene hormonen die verantwoordelijk zijn voor het onderhoud van de homeostase, voortplanting, ontwikkeling, en/of gedrag van het organisme. Receptor binding is niet de enige manier van handelen tot nu toe beschreven voor de Edc's. Het is nu duidelijk dat zij ook kunnen handelen door het aanwerven van coactivatoren of corepressors in enzymatische wegen of door het wijzigen van epigenetische markers die gen-uitdrukking10,11,12,13 dereguleren ,14, met gevolgen niet alleen voor de huidige generatie maar ook voor de gezondheid van generaties om8te komen.

Fruitvliegje hormonen

De potentiële effecten van geselecteerde Edc's zijn op grote schaal bestudeerd, zowel in wilde dierensoorten als in verschillende modelsystemen waarin endocriene mechanismen redelijk bekend zijn. Voor ongewervelden, endocriene systemen die de groei, ontwikkeling en voortplanting beïnvloeden zijn uitvoerig gekenmerkt bij insecten om verschillende redenen, waarbij hun uitgebreide gebruik op het gebied van biologisch onderzoek, hun economisch belang, en Ten slotte is de ontwikkeling van insecticiden in staat om zich specifiek te bemoeien met het hormoon systeem van plagen insecten.

In het bijzonder, onder insecten, heeft de fruitvlieg D. melanogaster bewezen een zeer krachtig modelsysteem te zijn om de potentiële endocriene gevolgen van edc's te evalueren. In D. melanogaster, evenals in gewervelde dieren, hormonen spelen een belangrijke rol gedurende de hele levenscyclus. In dit organisme, zijn er drie belangrijke hormonale systemen, die de steroïde hormoon 20-hydroxyecdyson (20e)15,16, de sesquiterpenoid jeugd hormoon (JH)17te betrekken, en de peptiden en peptide/eiwit hormonen18. Deze derde groep bestaat uit verschillende peptiden ontdekt meer recentelijk, maar duidelijk betrokken bij een grote verscheidenheid van fysiologische en gedragsmatige processen, zoals levensduur, homeostase, metabolisme, voortplanting, geheugen, en bewegingscontrole. 20E is homoloog aan cholesterol-afgeleide steroïde hormonen zoals estradiol, terwijl JH sommige gelijkenissen met retinol zuur deelt; beiden zijn de beter bekende hormonen in fruitvliegje19,20. Hun evenwicht is van vitaal belang bij de coördinatie van molting en metamorfose, evenals bij het beheersen van verschillende postdevelopmental processen, zoals voortplanting, levensduur, en gedrag21, waardoor het aanbieden van verschillende mogelijkheden voor het testen van endocriene verstoring in fruitvliegje. Verder, ecdysteroid hormonen en JHs zijn de belangrijkste doelstellingen van de zogenaamde derde generatie insecticiden, ontwikkeld om zich te bemoeien met ontwikkelings-en reproductieve endocriene-gemedieerde processen in insecten. De agonist of antagonist werking van deze chemicaliën is bekend, en dus kunnen ze dienen als referentienormen voor de evaluatie van de effecten van potentiële Edc's op de groei, voortplanting en ontwikkeling van insecten22. Bijvoorbeeld, Methopreen, die op grote schaal is gebruikt bij de bestrijding van muggen en andere aquatische insecten23,24, werkt als een JH-agonist en onderdrukt 20e-geïnduceerde gen transcriptie en metamorfose.

In aanvulling op hormonen, de nucleaire receptor (NR) Superfamily in fruitvliegje is ook goed bekend; het bestaat uit 18 evolutionair behouden transcriptiefactoren die betrokken zijn bij de bestrijding van hormonale-afhankelijke ontwikkelingstrajecten, evenals de voortplanting en fysiologie25. Deze hormoon NRs behoren tot alle zes NR superfamilie subtypen, met inbegrip van die betrokken bij neurotransmissie26, twee voor retinoic zuur NRs, en die voor steroïde NRs die, in gewervelde dieren, één van de primaire doelstellingen van edc's27vertegenwoordigen.

Fruitvliegje als modelsysteem voor het bestuderen van Edc's

Op dit moment, op basis van moleculaire eigenschappen, zijn verschillende milieu-agentschappen over de hele wereld toe te schrijven het potentieel om te interfereren met de endocriene systemen om verschillende kunststof-en-klare chemicaliën. Aangezien de Edc's een mondiaal en alomtegenwoordig probleem zijn voor het milieu en voor organismen, is het algemene doel van het onderzoek op dit gebied het verminderen van hun ziektelast en het beschermen van levende organismen tegen hun schadelijke effecten. Om het inzicht in de mogelijke endocriene effecten van een chemische stof te verdiepen, is het noodzakelijk om het in vivo te testen. Hiertoe vertegenwoordigt D. melanogaster een geldig modelsysteem. Tot op heden, is de fruitvlieg uitgebreid gebruikt zoals in vivo model om de gevolgen van verscheidene milieu Edc's te evalueren; Er is gemeld dat de blootstelling aan verschillende Edc's, zoals dibutylftalaat ftalaten (DBP)28, Bisfenol a (BPA), 4-nonylfenol (4-NP), 4-tert-octylfenol (4-tert-op)29, Methylparaben (MP)30, Ethylparaben (EP)31, 32, bis-(2-ethylhexyl) FTALATEN (DEHP)33, en 17-α-ethinylestradiol (EE2)34, invloeden metabolisme en endocriene functies zoals in gewervelde modellen. Verschillende redenen hebben geleid tot het gebruik ervan als een model op dit gebied van onderzoek. Naast een uitstekende kennis van de endocriene systemen, verdere voordelen zijn de korte levenscyclus, lage kosten, gemakkelijk manipuleerbaar genoom, een lange geschiedenis van het onderzoek, en diverse technische mogelijkheden (Zie de FlyBase website, http://flybase.org/). D. melanogaster biedt ook een krachtig model voor het gemakkelijk bestuderen van transgenerationele effecten en bevolkings reacties op omgevingsfactoren8 en vermijdt ethische kwesties die relevant zijn voor in vivo studies bij hogere dieren. Daarnaast is de fruitvlieg aandelen een hoge mate van het behoud van het gen met mensen die het mogelijk maken voor vlieg fruit EDC assays te helpen bij het voorspellen of suggereren potentiële effecten van deze chemicaliën voor de menselijke gezondheid. Naast het vergroten van het begrip over de gevolgen voor de gezondheid van de mens kan fruitvliegje bijdragen aan de beoordeling van Risico's van EDC-blootstelling aan het milieu, zoals verlies van biodiversiteit en milieudegradatie. Ten slotte, de fruitvlieg biedt het extra voordeel dat wordt gebruikt in laboratoria, waar de factoren die mogelijk van invloed zijn ontwikkeling, voortplanting, en levensduur kan worden gehouden onder controle om elke variatie aan de te testen stof toeschrijven.

Met dit in gedachten, hebben we geoptimaliseerd eenvoudige en robuuste fitness-analyses voor het bepalen van EDC-effecten op sommige fruitvliegje hormonale eigenschappen, zoals Fecundity/vruchtbaarheid, ontwikkelingsstoornissen timing, en volwassen levensduur. Deze tests zijn op grote schaal gebruikt voor een aantal edc's23,24,25,26,27. In het bijzonder hebben we gebruik gemaakt van de volgende protocollen om de effecten van de blootstelling aan de synthetische oestrogeen EE234 en BPA en bisfenol af (BPA F) (ongepubliceerde gegevens) te evalueren. Deze protocollen kunnen gemakkelijk worden gewijzigd om de effecten van een bepaald EDC te onderzoeken op een moment, evenals de gecombineerde effecten van meerdere Edc's in D. melanogaster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voedselbereiding

  1. Voor voorraad onderhoud en voor larvale groei, gebruik maken van een flappen medium met 3% poeder gist, 10% sacharose, 9% voorgekookt flappen, 0,4% agar, daarna genoemd flappen medium (CM).
    1. Zet 30 g gist in 100 mL van leidingwater, breng het aan de kook en laat het koken voor 15 minuten.
    2. Afzonderlijk, meng goed 90 g van voorgekookte flappen, 100 g suiker, en 4 g agar in 900 mL van leidingwater.
    3. Breng de oplossing aan de kook, lager het vuur en bak gedurende 5 minuten continu roeren.
    4. Na 5 minuten, voeg de hete gist oplossing en laat sudderen voor nog eens 15 minuten.
    5. Zet de warmtebron uit en laat de oplossing afkoelen tot ongeveer 60 °C.
    6. Voeg 5 mL/L van 10% methyl 4-hydroxybenzoate in ethanol, meng grondig en laat het zitten voor 10 minuten.
      Opmerking: Wees voorzichtig met het bedrag van methyl-4-hydroxybenzoate, gezien het dat een hoge concentratie van fungicide dodelijk zou kunnen zijn voor larven.
    7. Doseer het medium in flacons/flessen: 8 mL in elke vlieg flacon (25 mm x 95 mm), 3 mL in elke vlieg flacon (22 mm x 63 mm) en 60 mL in elke vlieg fles (250 mL).
    8. Deksel flacons met kaasdoek en laat ze drogen bij kamertemperatuur (RT) voor 24 uur voorafgaand aan de opslag.
    9. Kalibreer experimenteel juiste consistentie en hydratatie van de CM door het wijzigen van hetzij de hoeveelheid agar gebruikt en/of de koeling/droogtijden.
      Opmerking: niet aangesloten, boxed en verpakt flacons zijn stabiel voor ongeveer 15 dagen bij 4 ° c.
  2. Voor fruitvliegje volwassenen, gebruik een medium met 10% poeder gist, 10% sacharose, 2% agar, daarna genaamd Adult medium (AM).
    1. Meng 10 g poeder gist, 10 g sacharose, 2 g agar in 100 mL gedestilleerd water.
    2. Breng dit mengsel aan de kook twee keer, met een interval van 3 minuten, of totdat agar wordt opgelost, met behulp van een magnetron.
    3. Zodra de oplossing afkoelt tot 60 ° c, voeg 5 mL/L van 10% methyl 4-hydroxybenzoate in ethanol, meng grondig en afzien in flacons (10 mL per flacon).
    4. Deksel flacons met kaasdoek en laat ze drogen bij RT voor 24 uur voor het opslaan.
      Opmerking: niet aangesloten, boxed en verpakt flacons zijn stabiel voor ongeveer 15 dagen bij 4 ° c.
  3. Voor Fecundity/vruchtbaarheid Assay, gebruik fruitvliegje tomaten SAP-flappen medium.
    1. Giet 70 mL warm flappen voedsel in een bekerglas van 100 mL en Voeg 30 mL tomaten SAP toe (30% v/v).
    2. Meng grondig met een keukenmachine en pipet 3 mL in kleine flacons.
    3. Bedek flacons met kaasdoek en laat ze drogen bij RT voor 24 uur voorafgaand aan de opslag.
      Opmerking: niet aangesloten, boxed en verpakt flacons zijn stabiel voor ongeveer 15 dagen bij 4 ° c.
  4. Voor het verzamelen van embryo's, gebruik agar-platen, met 3% agar, 30% tomatensaus, en 3% suiker.
    Opmerking: wees voorzichtig om geen bubbels te maken bij het gieten van het medium in de platen.

2. fruit vlieger EDC dosering

  1. Bereid een geschikte voorraad oplossing het oplossen van de geselecteerde EDC in het geschikte oplosmiddel. Los voor de EE2 (molecuulgewicht 296,403) 1,48 g op in 10 mL 100% ethanol om een 0,5 M stockoplossing te maken en op te slaan bij-80 °C.
    Let op: Edc's worden beschouwd als milieu-verontreinigende stoffen en voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij de behandeling ervan.
  2. Verdun de EE2 voorraad oplossing in 10% ethanol in water (v/v) om een 100 mM oplossing te verkrijgen. Maak de volgende verdunningen (0,1 mM, 0,5 mM en 1 mM) in CM voedsel, te beginnen met de laagste concentratie en het gebruik van dezelfde uiteindelijke concentratie van oplosmiddel voor elke behandeling groep. Voor de controle flacons gebruik van hetzelfde volume van het oplosmiddel alleen.
    Opmerking: het wordt aangeraden om de uiteindelijke concentratie van het oplosmiddel zo laag mogelijk te houden, in het achterhoofd dat de uiteindelijke concentratie van ethanol niet meer dan 2% in vlieg voedsel mag zijn.
  3. Voeg de oplossing met de juiste verdunning van de geselecteerde EDC aan de flappen op basis van voedsel vóór de stolling, grondig mengen met een keukenmachine, afzien van 10 mL in flacons, dek af met katoenen gaas en laat drogen bij RT voor 16 uur voor gebruik.
    Opmerking: gebruik dit medium onmiddellijk na de voorbereiding.
  4. Voor de volwassen fokken, bereid verschillende werk EE2 oplossingen (10 mM, 50 mM en 100 mM, respectievelijk) in 10% ethanol in water (v/v) en laag 100 µ L van elk op het oppervlak van de AM, om de gewenste concentratie van de EE2 te verkrijgen (0,1 mM , 0,5 mM en 1 mM). Voor de controle gebruik zelfde volume van het oplosmiddel alleen.
    Opmerking: alternatief, voeg de oplossing met de juiste verdunning van de geselecteerde EDC tot een kleine hoeveelheid am in een 50 ml kegelvormige buis, Vortex grondig en stratificeren 1 ml van het op het oppervlak van de am flacons.
    1. Deksel flacons met katoenen gaas, laat drogen bij RT voor 12-16 h onder zachte agitatie en gebruik ze onmiddellijk.
      Opmerking: het droogproces moet experimenteel worden aangepast, omdat afhankelijk van de omgevingsvochtigheid.
  5. Voor het voederen van Assay, voeg zowel de oplossing met de juiste verdunning van de geselecteerde EDC (EE2 0,1 mM, 0,5 mM en 1 mM) en een kleurend voedsel (b.v., de rode kleurstof nr. 40 bij 1 mg/mL)35 aan cm vóór verharding, mengeling sterk met een voedselbewerker en dan afgeven e in flacons.

3. opvoeding vliegen

  1. Gebruik een robuuste isogenic stam, zoals Oregon R, onderhouden door verschillende generatie in het laboratorium.
  2. Houd vliegen in een bevochtigde, met een temperatuur gecontroleerde incubator, met een natuurlijke 12 h licht: 12 h donkere fotoperiode bij 25 ° c in flacons met CM voedsel.
  3. In elke test, gebruik flacons op RT.

4. het voeden analyse

Opmerking: Deze assay wordt aanbevolen om te testen of de aanwezigheid van de geselecteerde EDC in het medium kan het voederen van vliegen beïnvloeden.

  1. Zet 15 jonge vliegen in flacons met CM aangevuld met verschillende concentraties van de geselecteerde EDC en een kleurstof voedsel. Laat vliegen te voeden op de media voor 1 dag.
    Opmerking:gebruik bijvoorbeeld rode kleurstof no. 4035 (1 mg/ml).
  2. Zet 15 jonge vliegen in flacons met CM aangevuld met het oplosmiddel alleen en een kleurstof voor controle. Laat vliegen te voeden op de media voor 1 dag.
  3. Verdoven individueel elke groep vliegen met ether.
    1. Transfer vliegen van elke groep naar een cilindrische glazen container (etherizer) met een trechter ingevoegd in het open einde, het omkeren van de flacon over de trechter en zachtjes te tikken de twee containers samen om de vliegen vallen in de etherizer.
      Opmerking:  De trechter zal voorkomen dat ze uit het krijgen van de etherizer.
    2. Knock vliegt door zachtjes te tikken op de etherizer op een zacht oppervlak, zoals een muis-pad, en snel de trechter te vervangen door een ether-doorweekt katoen en gaas stekker.
    3. Wacht ongeveer 1 minuut tot de vliegen vallen op de bodem en stoppen met bewegen.
      Opmerking: niet hoger zijn dan de tijd of de vliegen zal sterven.
  4. Zet immobiled vliegen onder een stereo-microscoop en vergelijk de buik kleuring van elke behandelgroep met betrekking tot de controlegroep.

5. Fecundity/vruchtbaarheids analyse

  1. Voor elke EDC concentratie, voor te bereiden 3 flacons van vliegen, daarna genoemd ouderlijke flacons, met 8 wijfjes en 4 mannetjes in 10 mL CM/EDC voedsel; voor de controle voor te bereiden 6 flacons van vliegen met 8 wijfjes en 4 mannetjes in 10 mL CM voedsel aangevuld met oplosmiddel. Achter vliegt in een incubator bij 25 °C.
    Opmerking: Vermijd overbevolkte larven tijdens hun ontwikkeling en proberen om consistente larvale dichtheden te gebruiken over behandelingen.
  2. Na 4 dagen, verwijder de ouders en de flacons terug in de incubator voor 5 dagen.
  3. In de late namiddag van de dag 9, verwijder alle nieuwe vliegen uit de flacons en zet de flacons in een incubator bij 18 ° 's nachts.
    Opmerking: Deze verwijdering moet zeer zorgvuldig worden gedaan, het controleren van de oppervlakte van het medium goed.
    1. Op de ochtend van dag 10, voor elke behandelingsgroep, verzamel maagdelijke wijfjes en jonge mannetjes in twee groepen, onder licht CO2 anesthetization. Willekeurig onderverdelen elke groep van vliegen in kleine subgroepen (10 wijfjes en 20 mannetjes per flacon) in onafhankelijke flacons gevuld met verse overeenkomstige CM.
      1. Herhaal stap 5.3.1 Zorg zowel voor het zorgvuldig verwijderen van alle vliegen van de flacons 8-10 h voor de inzameling en laat flacons bij 18 ° c, tot het verkrijgen van ten minste 30 Virgin wijfjes en 30 mannetjes voor elke EDC concentraties en ten minste 90 Maagd vrouwen en 90 mannetjes voor de controle.
    2. Huis deze groepen vliegen bij 25 °C tot zij 4 dagen post-Eclosion zijn, overbrengend hen in nieuwe flacons die vers overeenkomstig middel om de twee dagen bevatten.
      Opmerking: 4 dagen is voldoende tijd voor de vliegen te worden volwassen volwassenen, maar het is zeer ver van het begin van de senescentie.
    3. Na twee dagen ervoor te zorgen dat er geen larven in de flacons van de vrouwtjes. Als ze dat doen, de vliegen zijn niet bruikbaar omdat ze niet Virgins en moet worden weggegooid.
  4. Gebruik 20 enkele vliegen van elk geslacht voor elke behandeling groep tot het opzetten van 20 enkele kruisen in kleine flacons met verse CM-tomaat medium zonder EDC, zoals hieronder beschreven.
    1. Aan elke behandelingsgroep wijs een verschillende reeks opeenvolgende aantallen toe, die het uniek identificeert en de respectieve flacons etiket teert; bijvoorbeeld, groep1 (oplosmiddel alleen) van 1 tot 20, groep 2 (EDC concentratie x) van 20 tot 40, en zo verder.
    2. Maak een vruchtbaarheid spreadsheet om de verschillende series, die elk overeenkomt met een behandelingsgroep record.
    3. Voor elk geslacht verdoven alle vliegen die behoren tot elke behandeling groep onder Light CO2 en willekeurig overdragen als volgt.
      1. Breng een oplosmiddel behandeld vrouwtje in een kleine flacon met verse CM-tomaat medium zonder EDC en voeg een oplosmiddel behandelde mannetje voor de controle Kruis.
        Opmerking: tomaten SAP moet worden toegevoegd aan medium tijdens de voorbereiding, omdat donkere medium verhoogt het contrast met de witte embryo's.
      2. Breng een EDC behandeld vrouwtje in een klein flesje met verse CM-tomaat zonder EDC en voeg een oplosmiddel behandeld mannetje voor elke behandeling.
      3. Breng een EDC behandeld mannetje in een kleine flacon met verse CM-tomaat medium zonder EDC en voeg een oplosmiddel behandeld vrouwtje voor elke behandeling.
    4. Huis al deze enige kruisen bij 25 °C.
  5. Breng elke paring paar in verse CM-tomaten flacons zonder EDC elke dag voor de daaropvolgende tien dagen. Label de gerepliceerde flacons van elke reeks sequentieel; bijvoorbeeld 1-a, 1B, 1c...... 20A, 20b, 20 en rapporteer dit aantal op de vruchtbaarheid spreadsheet.
  6. Visueel inspecteren elke flacon elke dag voor de eieren en het verslag van hun nummer op de vruchtbaarheid spreadsheet.
  7. Sla elke flacon en, wanneer nieuwe vliegen beginnen te ontstaan, ook het dagelijks aantal volwassen progenies record over de periode van 10 dagen. Na 10 dagen na de eerste dekking, verwijder de ouders.
    Opmerking: gooi flacon waarin een of beide ouders stierven; in geval van ontsnapping van een of beide ouders, in de analyse alle gegevens tot de dag dat ze verloren was.
  8. Som het dagelijkse aantal eieren en het dagelijkse aantal volwassen progenieën van elke behandelingsgroep, om het totale Fecundity/de vruchtbaarheid, het gemiddelde ei en de volwassen nakomelingen productie te verkrijgen door een vlieg tien dagen, en de verhouding van totale nakomelingen aan totaal aantal gelegde eieren. Bereken de verschillen in percentage van elke behandelings waarde met betrekking tot het besturingselement.
  9. Uitvoeren van drie onafhankelijke experimenten voor elke groep van vliegen, met behulp van een minimum van 10 vliegen voor elke behandeling groep.
  10. Statistische analyse uitvoeren om de verschillende groepen te vergelijken.

6. ontwikkelings timing

Opmerking: In de twee volgende alternatieve protocollen de ontwikkelings timing wordt geëvalueerd door het tellen van zowel het aantal poppen die vorm per dag en het aantal volwassen nakomelingen eclosing per dag.

  1. Eclosion assay Protocol 1
    1. Voor elke behandeling groep, het opzetten van 10 flacons van jonge (< 2 dagen), gezonde vliegen, elk met 6 wijfjes en 3 mannetjes in 10 mL flappen voedsel zonder EDC.
    2. Laat vliegen op voedsel voor 24 uur, en laat ze paren.
    3. Bereid 10 parallelle flacons per behandelingsgroep met 10 mL elk van vers flappen voedsel aangevuld met verschillende EDC concentraties of het oplosmiddel alleen voor de controle. Transfer gedekt vliegt naar deze nieuwe flacons.
      Nota: voor elke behandelingsgroep wijs een verschillende reeks opeenvolgende aantallen toe, die het uniek identificeert en de respectieve flacons etiket teert.
    4. Maak een ontwikkelings spreadsheet om de verschillende series op te nemen.
    5. Laat vliegen naar eieren te leggen voor 16 uur. Dan verwijderen ouders uit flacons.
      Opmerking: De ouder vliegen kan worden gebruikt om de stap 6.1.5 te herhalen, door ze over te dragen aan andere overeenkomstige flacons.
    6. Incubeer flacons voor 3-4 dagen bij 25 °C, of tot niet meer poppen vorm. Elke dag tellen het aantal nieuwe poppen in elke flacon en het verslag op de ontwikkelings-spreadsheet. Om te voorkomen dat het tellen van dezelfde pop twee keer, schrijf een nummer in de juiste volgorde bij elke pop met een permanent marker aan de buitenkant van de flacon.
    7. Vanaf de dag 9, tellen dagelijks het aantal opkomende volwassenen tot niet meer volwassenen ontstaan, en het verslag op de ontwikkelings-spreadsheet.
    8. Van deze ruwe gegevens, bereken de gemiddelde larvale periode, de gemiddelde popstadium periode, evenals de verschillen in percentage van elke behandeling met betrekking tot de controle.
    9. Uitvoeren van drie onafhankelijke experimenten voor elke groep van vliegen, met behulp van een minimum van 5 flacons voor elke behandeling groep.
    10. Statistische analyse uitvoeren om de verschillende groepen te vergelijken.
  2. Eclosion assay Protocol 2
    1. Achter jong en gezond vrouwelijk (ongeveer 150) en mannetje (ongeveer 50) vliegt op een inzamelings kooi (lijst van materialen) met agar-tomaat middel dat met het deeg van de verse bakkersgist wordt aangevuld (3 g van bakkersgist in 5 ml water), daarna geroepen het leggen van dienblad, voor 2 dagen bij 25 °C.
    2. Tijdens deze 2 dagen, laat vliegen naar acclimatiseren naar de kooi in een donkere, rustige plaats, vóór het begin van de eicel verzameling, en verander de lade tweemaal per dag.
    3. Op de derde dag, verander de lade in het begin van de ochtend. Na 1 uur, vervang de lade, het weggegooid van deze eieren gelegd.
    4. Laat vliegen om eieren te leggen voor 2 uur en vervangen door een nieuwe lade te leggen.
      Opmerking: Bij dag 3, zou een goed het leggen dienblad 100-200 eieren in 2 h moeten produceren.
    5. Voor elke behandeling groep, bereiden een reeks van 3 60 mm gerechten met tomaten flappen voedsel aangevuld met de overeenkomstige EDC concentratie of met oplosmiddel alleen en verslag van elke serie in de ontwikkeling timing spreadsheet. Als alternatief, indien gewenst, gebruik flacons in plaats van gerechten.
    6. Voorzichtig pick-up eieren onder een microscoop met behulp van een penseel of een sonde en breng ze naar de top van het medium in elke schotel/flacon. Om het tellen, op de het leggen dienblad te vergemakkelijken, schik eieren in 5 groepen van 10 elk en breng hen één tegelijk over.
      Opmerking: Herhaal stap 6.2.4 zo vaak als nodig is om genoeg embryo's te verkrijgen.
    7. Huis al deze gerechten/flacons bij 25 °C. Bewaar ook elke dienblad bij 25 °C, en Tel het totale aantal gelegde eieren.
    8. Na 24-30 h, Controleer elke schotel/flacon onder een stereomicroscoop en Tel zowel het aantal witte, onbevruchte eieren en het aantal donkere dode embryo's.
    9. Aftrekken van het aantal witte, onbevruchte eieren van de 50 overgedragen eieren waarde om de "totale embryo's" waarde te verkrijgen per schotel/flacon. Het aantal donkere dode embryo's kan worden gebruikt om potentiële EDC toxische effecten te bepalen tijdens embryogenese.
    10. Herhaal stappen 6.1.6-6.1.10 van het Eclosion assay Protocol 1.

7. levensduur Protocol

  1. Stel 20 flacons met vliegen met 8 wijfjes en 4 mannetjes en huis bij 25 °C in CM (10 mL elk) in.
  2. Na 4 dagen gooit vliegen en plaats flacons terug in de incubator.
    Nota: deze vliegen kunnen worden gebruikt om opnieuw te beginnen om andere leeftijd-gesynchroniseerde cohorten van de vliegen te verkrijgen.
  3. In de late namiddag van de dag 9, verwijder alle nieuwe vliegen uit de flacons en terug flacons aan de incubator.
    Opmerking: een paar volwassenen moeten beginnen te Eclose zo vroeg als de negende dag; teruggooi van deze vliegen maakt het mogelijk om een maximum aantal gesynchroniseerde vliegen te verzamelen, het vermijden van de achteloze selectie van de vroege opkomende.
  4. 16-24 h later, de overdracht van de volwassen vliegen (1 dag oud) van beide geslachten in vier groepen van 250 mL flessen met AM voedsel aangevuld met drie verschillende EDC concentraties en een met het oplosmiddel alleen. Indien nodig, verzamel een andere partij de volgende dag.
  5. Handhaaf vliegen bij 25 °C voor 2-3 dagen om hen toe te staan om te paren.
    Opmerking: de dag van de transfer naar am voedsel flacons komt overeen met de eerste dag van de volwassenheid.
  6. Na twee-drie dagen, Sorteer elke cohort van vliegen door seks in twee groepen onder licht CO2 anesthetization. Willekeurig onderverdelen elk geslacht in vijf flacons per behandeling bij een dichtheid van 20 personen per flacon, totdat er drie replica's van 5 parallelle flacons voor elk geslacht per elke behandeling.
    Opmerking: Werken met kleine groepen vliegen om te voorkomen dat mogelijke langdurige gezondheidsproblemen als gevolg van lange belichtingstijd naar CO2.
  7. Bereid een levensduur spreadsheet waarin het aantal dode vliegen wordt afgetrokken van het aantal overlevende vliegen naar de vorige Transfer, op een zodanige wijze dat het aantal overlevenden automatisch te verkrijgen bij elke overdracht.
  8. Transfer vliegt in nieuwe flacons met de overeenkomstige voedsel om de 3 dagen op hetzelfde moment en controleer voor de dood.
    Opmerking: de overdracht moet plaatsvinden zonder verdoving die een lange termijn negatief effect op de vlieg levensduur kan hebben.
    1. Bij elke overdracht, registreert de leeftijd van de vliegen en het aantal dode vliegen.
      Opmerking: het aantal overlevende vliegen wordt automatisch berekend in de spreadsheet, maar het wordt aanbevolen om het visueel te controleren. Vliegen die per ongeluk zowel ontsnappen of sterven tijdens de overdracht mag niet worden beschouwd. Wees niet te tellen twee keer dode vliegen vervoerd naar de nieuwe flacon rapportage deze nota in de spreadsheet.
    2. Herhaal de stappen 7,8 en 7.8.1 totdat alle vliegen sterven.
  9. Voor elke behandelgroep, maak een overlevings curve zoals weergegeven in Figuur 6, om de overlevingskans van een vlieg op een bepaald tijdstip weer te geven.
  10. Voer drie onafhankelijke experimenten voor elke behandeling groep van vliegen, met behulp van 100 nieuw eclosed vliegt voor elk experiment.
  11. Bereid een tabel waarin de gemiddelde levensduur verslag (mean Survival dagen van alle vliegen voor elke groep), de halve dood tijd (periode van tijd in dagen die nodig zijn om 50% mortaliteit te bereiken) en de maximale levensduur (maximale hoeveelheid dagen die nodig zijn om 90% mortaliteit te bereiken).
  12. Bereken de verschillen in percentage tussen elke behandelingsgroep met betrekking tot de controlegroep.
  13. Statistische analyse uitvoeren om de verschillende behandelgroepen te vergelijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In deze sectie worden de belangrijkste stappen van de bovenstaande protocollen gerapporteerd in de vorm van vereenvoudigde regelingen. Gezien het dat vliegen de neiging om onsmakelijke verbindingen te vermijden, het eerste ding om te doen is om de smaak van de geselecteerde EDC assay. Dit kan worden gedaan door het mengen van een levensmiddel kleuren (bijvoorbeeld rood voedsel kleurstof No. 40)35 met het voedsel aangevuld met de geselecteerde EDC bij verschillende doses of met het oplosmiddel alleen. De vliegen die op deze media worden gevoed worden onderzocht onder een stereomicroscoop en de voedselopname wordt geschat door hun buik kleuring (Figuur 1). Een typische gewenste situatie wordt weergegeven in Figuur 1 met twee volwassen vrouwen: een gevoed op het medium met de geselecteerde EDC en een op het medium niet met het EDC, zowel de presentatie van dezelfde kleur in hun buik.

Het is algemeen aanvaard dat Edc's, zoals natuurlijke hormonen, effecten hebben op extreem lage doses en dat er geen eenvoudige, lineaire relatie tussen dosis en effect29, met hogere doses niet noodzakelijkerwijs een groter effect36, 37. Dus, in plaats van een dosis-respons aanpak, om volledig te beoordelen van hun effecten, is het raadzaam om meer doses te gebruiken, te beginnen met relevante concentraties voor het milieu of voor andere organismen. In ieder geval is het belangrijk om de EDC smaak assay bij elke gebruikte concentratie om ervoor te zorgen dat vliegt vergelijkbare hoeveelheden EDC verteren in elke behandeling groep (Figuur 2).

De endocriene verstoring beïnvloedt vele belangrijke eigenschappen van dierlijke fysiologie zoals vruchtbaarheid, levensduur, en ontwikkeling die, daarom, nuttige eindpunten zijn om Edc's te testen. Voor de bovenstaande protocollen, die we geoptimaliseerd om de EDC-effecten te meten op deze fruitvliegje levens kenmerken, primaire overwegingen zijn dat het noodzakelijk is om jonge en gezonde vliegen die correct moet worden gemanipuleerd voor het testen te gebruiken. Met dit in gedachten, moet veel aandacht worden besteed aan de productie, behandeling en opslag van het gebruikte voedsel. Bovendien moet de zorg worden besteed aan het gebruik van het beste oplosmiddel voor het geselecteerde EDC in geschikte eindconcentraties (d.w.z. minder dan 1% voor dimethyl sulfoxide [DMSO] en minder dan 2% voor ethanol)30.

Fecundity en vruchtbaarheid zijn gebruikt om het reproductieve succes in D. melanogasterte evalueren. Figuur 3 toont een schema van het gebruikte protocol. Fecundity wordt experimenteel gemeten als het totale aantal vastgestelde eieren, terwijl de vruchtbaarheid als totale volwassen nakomelingen wordt gemeten. Op basis van de overweging dat de productie van eieren in de eerste 10 dagen van het volwassen leven is een goede referentie voor de hele volwassen leven ei/nakomelingen productie van een organisme38,39, vruchtbaarheid en Fecundity assays kunnen worden uitgevoerd gedurende 10 dagen door met behulp van 4 dagen oude vliegen uitgebroed uit de blootgestelde larven. Het is belangrijk om te proberen vergelijkbare waarden te verkrijgen in de parallelle flacons van elke groep; anders zou het moeilijk zijn voor te stellen welke buis te verwijderen uit de analyse. Dus, is het raadzaam om dagelijks elke repliceren flacon te onderzoeken om een stressvolle omgeving te voorkomen, zoals gedroogd of vloeibaar voedsel; beginnend van 20 enige kruisen, wordt het geadviseerd om minstens 10 flacons in goede omstandigheden te verkrijgen waarin beide ouders 10 dagen in leven waren. Aantallen eieren en volwassen nakomelingen, dagelijks verzameld, moeten worden gerapporteerd op een tabel zoals weergegeven in Figuur 3 en gebruikt voor de berekening van de gemiddelde ei en volwassen nakomelingen productie van een vlieg voor 10 dagen. Dan, kan het Fecundity/Vruchtbaarheidspercentage van EDC-behandelde vliegen in vergelijking met controle vliegen worden verkregen het toepassen van de volgende formule: Fecundity/vruchtbaarheids verandering% = [(controle-behandeling)/Control] x 100. Voor elke groep moeten ten minste drie onafhankelijke replicaties worden verkregen.

Hormonen spelen essentiële rollen in de ontwikkeling van overgangen in het leven van D. melanogaster40, waarvoor het waarschijnlijk is dat deze fasen van de groei zijn bijzonder kwetsbaar voor de negatieve effecten van edc's. Bij 25 °C, zowel de groei van de larven als het popstadium stadium elk spanwijdte ongeveer 4 dagen. Na EDC blootstelling, de gemiddelde duur van deze stadia kunnen worden beïnvloed41. Gebaseerd op deze overweging, werden de ontwikkelings timing protocollen geoptimaliseerd om het percentage en de tijd van overgang van larven aan poppen te bepalen en van poppen aan volwassenen na EDC blootstelling met betrekking tot onbehandelde vliegen. Twee alternatieve protocollen konden deze analyse uitvoeren. Beiden waren geldig en gebaseerd op de EDC chronische blootstelling aan larven over een periode van 4 dagen. Op basis van deze larvale behandeling, heeft het eerste protocol geen rekening gehouden met de leeftijd van de embryo's, die werden verzameld over een periode van 16-18 uur (overnachting). De daaruit voortvloeiende leeftijd variabiliteit onder de larven moet echter aanwezig zijn in alle flacons van elke behandeling, waardoor de binnen-behandeling variantie, maar zonder noemenswaardige invloed op de ramingen van de ontwikkeling timing door middel van behandelingen. In plaats daarvan, gebruikte het tweede protocol een vast aantal synchrone vroege embryo's, die het mogelijk maken om ook de potentiële gevolgen van het geselecteerde EDC tijdens embryogenese42,43te evalueren. Verder, het minimaliseren van de leeftijd verschillen tussen de larven verminderde de binnen-behandeling variantie en verhoogde de mogelijkheid om echte verschillen tussen de behandelingen te schatten. Figuur 4 meldt een schema van de Eclosion assay. In beide protocollen, platen/flacons moest dagelijks worden gecontroleerd, en het aantal van zowel de poppen en volwassenen van de blootgestelde en niet-blootgesteld aan het EDC moesten afzonderlijk worden gerapporteerd op een tafel als in Figuur 4. Alle gevormde poppen en volwassen vliegen moesten worden geteld, of dood of levend. Dan, werden deze ruwe gegevens gebruikt om percentages en tijden van overgang van larven aan poppen en van poppen aan volwassenen te berekenen en het veranderingspercentage van deze waarden van de EDC-behandelde vliegen te berekenen in vergelijking met controle vliegen. Na EDC blootstelling, een algehele ontwikkeling vooraf of vertraging met betrekking tot de controle vliegt was te verwachten. De gekozen protocol moest worden uitgevoerd in drievoud voor elke groep van vliegen. Het was raadzaam dat voor de Eclosion assay Protocol 2, elke reeks van een repliceren voor een bepaalde EDC-concentratie werden gezaaid met embryo's uit dezelfde route om de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid in het embryo enscenering in de gehele EDC concentraties te handhaven.

Tot slot, Figuur 5 toont de belangrijkste stappen voor het meten van levensduur. Voor dit protocol, was het essentieel dat alle vliegen onder analyse werden synchroon door leeftijd en geslacht, gekoppeld, en hield op een dichtheid laag genoeg om het vrije verkeer mogelijk te maken. Het is belangrijk om levensduur experimenten uit te voeren in beide geslachten afzonderlijk, omdat het bekend is dat er significante verschillen in levensduur tussen mannetjes en vrouwtjes44.

Het voedsel moest om de 3 dagen worden veranderd om een gezonde bevolking te handhaven, en de mortaliteit moest ook om de 3 dagen worden beoordeeld. Op een levensduur spreadsheet, zoals in Figuur 5, het aantal dode vliegen werden gemeld, en dat aantal zou automatisch worden afgetrokken van het aantal overlevende vliegen van de vorige Transfer. Voor elke EDC concentratie en voor het oplosmiddel alleen, het cumulatieve overlevingsvermogen versus de verstreken dagen werd uitgezet om levensduur bochten te verkrijgen. Een typische overlevings curve wordt gerapporteerd in Figuur 6; na een lange initiële periode waarin de overlevings curve relatief hoog bleef, daalde het exponentieel na ongeveer 60 dagen. Na EDC blootstelling, kan de overlevings curve van de behandelde vliegen aanzienlijk worden beïnvloed. Om te bepalen of dit effect te wijten is aan de geselecteerde EDC, was het raadzaam om uit te voeren ten minste twee, of beter nog, drie onafhankelijke, niet-gelijktijdige repliceren experimenten.

In elk van bovengenoemde protocollen, was het mogelijk om abnormale flacons (bijvoorbeeld, zonder eieren of abnormale sterfgevallen) te hebben; Deze flacons kunnen zijn ontstaan door verschillende oorzaken, zoals slechte voedselkwaliteit of infectie, en kan aanzienlijk veranderen de waarden van de maatregelen. De beste manier om deze abnormale situaties te beheren was om ze te vermijden door middel van goede experimentele praktijk. Dus, moet worden benadrukt dat, voor alle bovengenoemde protocollen, grote en zorgvuldige werk nodig was in het repliceren van de flacons, houden vliegen gezond, en in de behandeling van vliegen die, eenmaal blootgesteld aan een EDC, zou kunnen worden delicate, waardoor het risico van de dood wanneer Gemanipuleerd.

Figure 1
Figuur 1: voeding assay. Volwassen vliegen in flacons met CM/kleurstof aangevuld met een geselecteerde EDC (boven) of oplosmiddel alleen (onder) worden overgelaten aan te voeden voor 24 uur. Twee vliegen gevoed op medium aangevuld met een EDC (boven) of oplosmiddel alleen (onder) tonen soortgelijke kleuren op hun buik. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: EDC dosering. Schema van de EDC administratie om fruitvliegje door dieet. Volwassen vliegt uit een isogenic voorraad worden blootgesteld aan verschillende concentraties van een EDC (boven) of oplosmiddel alleen (onder). N = de referentie concentratie van het EDC. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: vruchtbaarheids analyse. Schematisch van het Protocol, dat de stappen van de vlieg groei in aangewezen media aan de maagdelijke inzameling en tot enige kruisen afbeeldt. Stap 1: volwassenen (10 flacons met acht wijfjes en vier mannetjes elk) van een isogenic spanning worden overgebracht naar flacons met CM/EDC (bovenkant) of CM/oplosmiddel alleen (bodem). (Merk op dat de regeling, voor de eenvoud, verwijst naar slechts een van de drie flacons.) Stap 2: na 4 dagen, worden de volwassenen weggegooid, en de gelegde eieren worden verlaten om 9 dagen tot het volwassen stadium te ontwikkelen. Stap 3: nieuw eclosed volwassenen zijn gesorteerd op geslacht en verzameld in flacons (max. 20 mannetjes/flacon en 10 Virgin-vrouwtjes/flacon). Stap 4: volwassenen worden overgelaten aan leeftijd voor 4 dagen op het overeenkomstige medium van de larvale groei. Stap 5: opstelling van 40 enige kruisen voor EDC-behandelde vliegen in CM-tomaat middel zonder een EDC, 20x één EDC-behandeld mannetje met één controle wijfje en 20x het mannetje van de controle met EDC-behandeld wijfje (bovenkant); opstelling van 20 enige kruisen voor controle vliegen, 20x één controle mannetje met één controle wijfje (bodem). Geel medium is een CM aangevuld met een EDC (boven) of oplosmiddel als controle (onder), en rood medium is een tomaat/CM zonder een EDC of oplosmiddel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: ontwikkelings timing (Eclosion assay Protocol 2). Op de linkerzijde, toont dit cijfer een regeling van de inzamelings kooi waarin de volwassenen (ongeveer 150 wijfjes en 50 mannetjes) aan acclimatiseren en partner in Dark vóór de depositie stap worden geplaatst (Zie Protocol). Na 2 dagen, de oude schuiflade wordt vervangen door een met vers voedsel, en de eieren afgezet in de volgende 1 uur worden weggegooid omdat ze asynchroon zijn. Hierna worden de eieren elke 2 uur op een nieuwe schuiflade, geteld en op gerechten met tomaten/CM verzameld, aangevuld met een EDC of alleen met oplosmiddel. Gegevens (totale eieren, geheime eieren, poppen, en eclosed volwassenen) worden gerapporteerd over een reeks van ontwikkelings-timing spreadsheets (rechts). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: levensduur assay. Een dag gesynchroniseerd vliegen worden overgedragen aan een 250 mL fles met volwassen voedsel (AM) aangevuld met een EDC (boven) of oplosmiddel (onder) als controle, om het voeden (links in de regeling). Na 2-3 dagen, zijn de vliegen gesorteerd op geslacht en overgedragen aan vijf flacons (met het overeenkomstige medium van de start fles) voor elk geslacht, in groepen van 20 personen/flacon. Elke 3 dagen, de volwassenen worden overgedragen aan verse flacons tot niet meer nodig (centrale deel van de regeling). Aan de rechterkant is een schema van de tabel waarin de gegevens worden geregistreerd voor elke dag. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: levensduur bochten. Aan de linkerkant, een representatieve tabel wordt gemeld waarin het aantal dode vliegen is geregistreerd om de 3 dagen, zowel voor de behandeling groep (medium + EDC [0,05 mM EE2]) en voor de controlegroep (medium + oplosmiddel), gedurende de gehele experimentele periode. De gemiddelde levensduur van elke groep is berekend met behulp van de matrix sum. PRODUCT; de behandelde groep verkortte de gemiddelde levensduur ten opzichte van de controlegroep. Aan de rechterkant, een typische overlevings curve wordt weergegeven van mannelijke vliegen gevoed met medium met EE2 (0,05 mM) of alleen ethanol voor de controle. De overlevende kromme verminderde sneller voor behandelde vliegen dan voor de controlegroep, met een vroeger het draaien dalings punt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De fruitvlieg D. melanogaster is op grote schaal gebruikt als een in vivo modelsysteem om de mogelijke effecten van milieu EDC'S zoals DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-op29, MP30, EP31te onderzoeken, 32, DEHP33, en EE234. Verschillende redenen hebben geleid tot het gebruik ervan als een model op dit gebied van onderzoek. Naast zijn onbetwiste voordelen als modelsysteem, heeft fruitvliegje een hoge mate van genetische instandhouding met mensen, waarvoor fruitvliegjes EDC-assays kunnen helpen bij het voorspellen of suggereren van potentiële effecten voor de menselijke gezondheid. Bovendien behoort het fruitvliegje tot de ongewervelde dieren, die op grote schaal in alle ecosystemen vertegenwoordigd zijn en die meer beschermingsmaatregelen vereisen tegen de schadelijke effecten van Edc's. Ongewervelden bevinden zich aan de basis van de voedselketen en voeren zeer belangrijke functies uit voor de omgeving waarin ze leven. Er is gemeld dat verscheidene Edc's die in het milieu worden vrijgegeven een schadelijke invloed op de ontwikkeling en de reproductie van verscheidene dierlijke soorten kunnen hebben. Fruitvliegje biedt het extra voordeel dat het in het laboratorium wordt gebruikt, waar de factoren die de ontwikkeling, de voortplanting en de levensduur mogelijk beïnvloeden, onder controle kunnen worden gehouden om elke variatie aan de te testen stof toe te kennen.

Hier bieden we gedetailleerde protocollen voor het bestuderen van de effecten van EDC blootstelling in dit modelsysteem op hormonaal gereguleerde levens kenmerken, zoals Fecundity/vruchtbaarheid, ontwikkelings-rate, en levensduur. Wij hebben deze protocollen geoptimaliseerd die het mogelijk maakten om de gevolgen van EE234, BPA, en BPAF (ongepubliceerde gegevens) blootstelling te onderzoeken, maar zij kunnen gemakkelijk worden aangepast om de gevolgen van andere edc's te bestuderen. In het bijzonder, kunnen deze analyses worden gebruikt om zowel zuivere Edc's als combinaties van verschillende Edc's te onderzoeken, die dichter reproduceren wat in aard voorkomt. Hoewel blijkbaar, kunnen zij als eenvoudige de groei analyses schijnen, is het belangrijk om volgens de aangewezen richtlijnen te werken, die nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid45verzekeren. Het is bekend dat de vruchtbaarheid, ontwikkelings-timing, en de levensduur in D. melanogaster kan worden beïnvloed door externe en interne factoren. Deze kritieke factoren, met inbegrip van fotoperiode, temperatuur, vochtigheid, voeding, bevolkingsdichtheid, genetische structuur, en leeftijd, moeten zorgvuldig worden gecontroleerd voor de uitkomst van de gerapporteerde protocollen. Om de component van genetische veranderlijkheid te minimaliseren, zou een isogenic spanning moeten worden gebruikt. Deze stam moet zorgvuldig worden gefokt in een bevochtigde, met een natuurlijk 12 h licht: 12 h donkere fotoperiode bij 25 °C.

In aanvulling op het onderhoud van een gecontroleerde omgeving, larvale en Fly overbevolking moet worden vermeden. Er is gemeld dat larvale overbevolking kan de ontwikkelings-timing beïnvloeden en induceren de expressie van verschillende genen, met inbegrip van hitteschok of immuniteit-gerelateerde genen, die de totale geschiktheid van de volwassen vliegen46beïnvloeden. Ook volwassen vliegen moeten worden gehandhaafd op een laag genoeg dichtheid om vrij verkeer mogelijk te maken om volwassen stress te minimaliseren. Verder is het belangrijk om ervoor te zorgen dat vliegen verbruiken vergelijkbare hoeveelheden van het EDC in elke behandeling groep, rekening houdend met de smaak van de verbinding bij verschillende concentraties, omdat de vliegen de neiging om te voorkomen dat onsmakelijk voedsel. Een ander belangrijk aspect van deze protocollen is voedselkwaliteit; het voedsel moet er ook goed uitzien, verstoken van bubbels, bacteriën scheuren, en zo op47,48. Verder is het noodzakelijk om in gedachten te houden synchronisatie, paring status, en gender samenwonen voor de vliegen te testen. In alle gerapporteerde protocollen, is het belangrijk dat de parallelle flacons onder analyse moet zeer vergelijkbaar zijn; anders zou het moeilijk zijn te begrijpen welke te ontdoen, zodat maximale aandacht en goede experimentele praktijk nodig zijn. Ten slotte, door het gebruik van deze protocollen om de endocriene effecten van geselecteerde Edc's te evalueren, is het belangrijk om rekening te houden met mogelijke interacties met andere Edc's aanwezig in het medium, zoals methyl 4-hydroxybenzoate of de BPA van de plastic flacons. In deze zin kan het nuttig zijn om de antifungale agent te veranderen, gebruik glazen flacons, of voer pilot assays zowel met als zonder mogelijke verontreinigingen.

De gerapporteerde vlieg fruit assays kunnen zeer effectief zijn voor de beoordeling van chemicaliën of mengsels van chemicaliën, zoals Edc's, door de mogelijke effecten op hormonaal gereguleerde levens kenmerken te evalueren, zoals voortplanting, ontwikkeling en levensduur. Deze tests kunnen echter niet dienen om het endocriene mechanisme dat verantwoordelijk is voor de negatieve effecten van het EDC duidelijk te identificeren. Om deze beperking te overwinnen, is het mogelijk om de zelfde protocollen uit te voeren door verwijzings Edc's te gebruiken die reacties oproepen representatief voor een bepaalde manier van actie op het insect endocriene systeem (b.v., de insecticiden van de derde generatie die als JH of ecdysteroid werken agonist/antagonist)22. Afwisselend, is het ook mogelijk om moleculaire eindpunten te gebruiken, die moleculaire analyse uitvoeren op specifieke genen die hormonaal geregeld zijn en die als voorspellende en specifieke biomarkers voor de endocriene verstoring34worden beschouwd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Orsolina Petillo voor technische ondersteuning. De auteurs danken Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) voor bibliografische ondersteuning. De auteurs bedanken Dr Gustavo Damiano Mita voor de invoering ervan aan de EDC wereld. De auteurs danken Leica Microsystems en Pasquale Romano voor hun hulp. Dit onderzoek werd ondersteund door project PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie oriënteren alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Project PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17α-Ethinylestradiol Sigma E4876-1G
Agar for Drosophila medium BIOSIGMA 789148
Bisphenol A Sigma 239658-50G
Bisphenol AF Sigma 90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl ether Sigma
Drosophila Vials BIOSIGMA 789008 25 mm x 95 mm
Drosophila Vials BIOSIGMA 789009 29 mm x 95 mm
Drosophila Vials Kaltek 187 22 mm x 63 mm
Embryo collection cage Crafts Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol FLUKA 2860
Etherizer Crafts cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle 250 mL Bottles
Glass Vials Microtech ST 10024 Flat bottom tube 100 x 24
Hand blender Pimmy Ariete food processor
Instant Success yeast ESKA Powdered yeast
Laying tray Crafts plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate SIGMA H5501
Petri Dish Falcon 351016 60x5
Red dye no. 40 SIGMA 16035
Stereomicroscope with LED lights Leica S4E
Sucrose HIMEDIA MB025
Tomato sauce Cirio

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. Kareiva, P. M., Marvier, M. , Roberts and Company Publishers. Greenwood Village, CO. 460-509 (2011).
  2. Zoeller, R. T., et al. Endocrine-disrupting chemicals and public health protection: a statement of principles from The Endocrine Society. Endocrinology. 153 (9), 4097-4110 (2012).
  3. Guillette, J., Gunderson, M. P. Alterations in development of reproductive and endocrine systems of wildlife populations exposed to endocrine-disrupting contaminants. Reproduction. 122, 857-864 (2001).
  4. Guillette, L. J. Endocrine disrupting contaminants-beyond the dogma. Environmental Health Perspectives. 114, 9-12 (2006).
  5. Liao, C. S., Yen, J. H., Wang, Y. S. Growth inhibition in Chinese cabbage (Brassica rapa var. chinensis) growth exposed to di-n-butyl phthalate. Journal of Hazardous Materials. 163, 625-631 (2009).
  6. Qiu, Z., Wang, L., Zhou, Q. Effects of Bisphenol A on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence in above-ground organs of soybean seedlings. Chemosphere. 90, 1274-1280 (2013).
  7. Wang, S., et al. Effects of Bisphenol A, an environmental endocrine disruptor, on the endogenous hormones of plants. Environmental Science and Pollution Research. 22, 17653-17662 (2015).
  8. Quesada-Calderón, S., et al. The multigenerational effects of water contamination and endocrine disrupting chemicals on the fitness of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 7, 6519-6526 (2017).
  9. Bergman, A., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. The State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012. , United Nations Environment Programme and the World Health Organization. (2013).
  10. Bachega, T. A. S. S., Verreschi, I. T., Frade, E. M. C., D’Abronzo, F. H., Lazaretti-Castro, M. The environmental endocrine disruptors must receive the attention of Brazilian endocrinologists. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 55, 175-176 (2011).
  11. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127, 204-215 (2011).
  12. Lee, S. B., Choi, J. Effects of Bisphenol A and Ethynyl estradiol exposure on enzyme activities, growth and development in the fourth instar larvae of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 68, 84-90 (2007).
  13. Vos, J. G., et al. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Critical Reviews in Toxicology. 20, 71-133 (2000).
  14. Costa, E. M. F., Spritzer, P. M., Hohl, A., Bachega, T. A. S. S. Effects of endocrine disruptors in the development of the female reproductive tract. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 58 (2), 153-161 (2014).
  15. Thummel, C. S. From embryogenesis to metamorphosis: the regulation and function of Drosophila nuclear receptor superfamily members. Cell. 83, 871-877 (1995).
  16. Schwedes, C. C., Carney, G. E. Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 58, 293-302 (2012).
  17. Flatt, T., Kawecki, T. J. Pleiotropic effects of methoprene-tolerant (Met), a gene involved in juvenile hormone metabolism, on life history traits in Drosophila melanogaster. Genetica. 122, 141-160 (2004).
  18. Nassel, D. R., Winther, A. M. E. Drosophila neuropeptides in regulation of physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 92, 42-104 (2010).
  19. Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annual Review of Entomology. 47, 467-500 (2002).
  20. Gáliková, M., Klepsatel, P., Senti, G., Flatt, T. Steroid hormone regulation of C. elegans and Drosophila aging and life history. Experimental Gerontology. 46, 141-147 (2011).
  21. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in Drosophila. Trends in Endocrinology & Metabolism. 11, 276-280 (2000).
  22. Weltje, L. Techniques for Measuring Endocrine Disruption in Insects. Endocrine Disrupters: Hazard Testing and Assessment Methods. Matthiessen, P. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 100-115 (2013).
  23. Zou, Z., et al. Juvenile hormone and its receptor, methoprene-tolerant, control the dynamics of mosquito gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), E2173-E2181 (2013).
  24. Zhao, W. L., et al. Methoprene-tolerant 1 regulates gene transcription to maintain insect larval status. Journal of Molecular Endocrinology. 53 (1), 93-104 (2014).
  25. Mangelsdorf, D. J., et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83, 835-839 (1995).
  26. Bate, M., Martinez Arias, A. Hormones and Drosophila development. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 899-939 (1993).
  27. Watts, M. M., Pascoe, D., Carroll, K. Chronic exposure to 17a-ethinylestradiol and bisphenol A-effects on development and reproduction in the freshwater invertebrate Chironomus riparius (Diptera: chironomidae). Aquatic Toxicology. 55, 113-124 (2001).
  28. Atli, E. The effects of dibutyl phthalate (DBP) on the development and fecundity of Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 93, 164-171 (2010).
  29. Atli, E. The effects of three selected endocrine disrupting chemicals on the fecundity of fruit fly, Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 9, 433-437 (2013).
  30. Gu, W., Xie, D. J., Hou, X. W. Toxicity and estrogen effects of methylparaben on Drosophila melanogaster. Food Science. 30, 252-254 (2009).
  31. Liu, T., Li, Y., Zhao, X., Zhang, M., Gu, W. Ethylparaben affects lifespan, fecundity, and the expression levels of ERR, EcR and YPR in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 71, 1-7 (2014).
  32. Chen, Q., Pan, C., Li, Y., Zhang, M., Gu, W. The Combined Effect of Methyl- and Ethyl-Paraben on Lifespan and Preadult Development Period of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 1-8 (2016).
  33. Cao, H., Wiemerslage, L., Marttila, P. S., Williams, M. J., Schioth, H. B. Bis-(2-ethylhexyl) Phthalate Increases Insulin Expression and Lipid Levels in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 119, 309-316 (2016).
  34. Bovier, T. F., Rossi, S., Mita, D. G., Digilio, F. A. Effects of the synthetic estrogen 17-α-ethinylestradiol on Drosophila T melanogaster: Dose and gender dependence. Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 625-632 (2018).
  35. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147, 433-437 (1982).
  36. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and non- monotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33, 378-455 (2012).
  37. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Mini Review: Drosophila melanogaster as a Promising Model Organism in Toxicological Studies. Archives of Basic and Applied. 1, 33-38 (2013).
  38. Yesilada, E. Genotoxic Activity of Vinasse and Its Effect on Fecundity and Longevity of Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 63, 560-566 (1999).
  39. Atli, E., Ünlü, H. The effects of microwave frequency electromagnetic fields on the fecundity of Drosophila melanogaster. Turkish Journal of Biology. 31, 1-5 (2007).
  40. Flatt, T., Tu, M., Tatar, M. Hormonal pleiotropy and the juvenile hormone regulation of Drosophila development and life history. BioEssays. 27, 999-1010 (2005).
  41. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental Toxicity Assays Using the Drosophila Model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1-27 (2015).
  42. Fletcher, J. C., Burtis, K. C., Hogness, D. S., Thummel, C. S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone. Development. 121, 1455-1465 (1995).
  43. Giordano, E., Peluso, I., Senger, S., Furia, M. minifly, A Drosophila Gene Required for Ribosome Biogenesis. The Journal of Cell Biology. 144 (6), 1123-1133 (1999).
  44. Tower, J., Arbeitman, M. The genetics of gender and life span. The Journal of Biology. 8, 38 (2009).
  45. Digilio, F. A., et al. Quality-based model for Life Sciences research guidelines. Accreditation and Quality Assurance. 21, 221-230 (2016).
  46. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. Journal of Insect Physiology. 47, 1301-1307 (2001).
  47. Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (71), e50068 (2013).
  48. Weltje He, Y., Jasper, H. Studying aging in Drosophila. Methods. 68, 129-133 (2014).

Tags

Ontwikkelingsbiologie fruitvliegje melanogaster endocriene ontwrichting chemicaliën Fecundity vruchtbaarheid ontwikkeling levensduur
Methoden voor het testen van endocriene verstoring in fruitvliegje <em>melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovier, T. F., Cavaliere, D.,… More

Bovier, T. F., Cavaliere, D., Colombo, M., Peluso, G., Giordano, E., Digilio, F. A. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59535, doi:10.3791/59535 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter