Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Metoder för att testa endokrina störningar i Drosophila melanogaster

Published: July 3, 2019 doi: 10.3791/59535
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1,2
1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

Summary

Kemikalier för hormonstörande ämnen utgör ett allvarligt problem för organismer och för naturliga miljöer. Drosophila melanogaster är en idealisk modell för att studera EDC-effekter in vivo. Här presenterar vi metoder för att undersöka endokrina störningar i Drosophila, ta itu med EDC effekter på fruktsamhet, fertilitet, utveckling timing, och livs längd i farten.

Abstract

Under de senaste åren har det funnits allt fler belägg för att alla organismer och miljön utsätts för hormonliknande kemikalier, så kallade hormonstörande kemikalier (EDCs). Dessa kemikalier kan förändra den normala balansen i endokrina system och leda till negativa effekter, samt ett ökande antal hormonella störningar i den mänskliga populationen eller störd tillväxt och minskad reproduktion i vilda arter. För vissa hormonrelaterade ämnen finns dokumenterade hälso effekter och restriktioner för deras användning. Men för de flesta av dem finns det fortfarande inga vetenskapliga belägg i den meningen. För att kontrol lera potentiella endokrina effekter av en kemikalie i hela organismen, måste vi testa den i lämpliga modell system, liksom i banan fluga, Drosophila melanogaster. Här rapporterar vi detaljerade in vivo-protokoll för att studera endokrina störningar i Drosophila, ta itu med EDC effekter på fruktsamhet/fertilitet, utveckling timing, och livs längd i farten. Under de senaste åren har vi använt dessa Drosophila livs drag för att undersöka effekterna av exponering för 17-α-etinylestradiol (EE2), bisfenol A (BPA), och bisfenol AF (BPA F). Sammantaget omfattade dessa tester alla Drosophila livs stadier och gjorde det möjligt att utvärdera endokrina störningar i alla hormon-medierade processer. Fecundity/fertilitet och utveckling timing analyser var användbara för att mäta EDC inverkan på fluga fortplantnings förmågan och på utvecklingsstadier, respektive. Slutligen, livs längd analysen inblandade kronisk EDC exponeringar mot vuxna och mätt deras överlevnad. Dessa livs egenskaper kan dock också påverkas av flera experimentella faktorer som måste kontrol leras noggrant. Så, i detta arbete, föreslår vi en rad förfaranden som vi har optimerat för rätt resultat av dessa analyser. Dessa metoder gör det möjligt för forskarna att etablera endokrina störningar för alla HORMONSTÖRANDE ämnen eller för en blandning av olika hormonstörande egenskaper i Drosophila, men för att identifiera den endokrina mekanismen som är ansvarig för effekten kan ytterligare uppsatser behövas.

Introduction

Mänsklig verksamhet har släppt ut i miljön en massiv mängd kemikalier, som utgör ett allvarligt problem för organismer och för naturliga eko system1. Av dessa föroreningar uppskattas det att cirka 1 000 olika kemikalier kan förändra den normala balansen i endokrina system; enligt denna egenskap klassificeras de som endokrinstörande kemikalier (hormonstörande ämnen). Specifikt, baserat på en nyligen definition av endokrina samfundet, EDCs är "en exogen kemikalie, eller blandning av kemikalier, som kan störa någon aspekt av hormon åtgärder"2. Under de senaste tre decennierna har det vuxit fram vetenskapliga belägg för att hormonstörande ämnen kan påverka reproduktion och utveckling av djur och växter3,4,5,6,7, och 8. Ytterligare, EDC exponering har varit relaterad till den ökande prevalensen av vissa mänskliga sjukdomar, inklusive cancer, fetma, diabetes, sköldkörtel sjukdomar, och beteendemässiga störningar9,10,11.

Allmänna mekanismer för EDC

På grund av sina molekyl ära egenskaper beter sig edcs som hormoner eller hormon prekursorer3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. I denna mening, de kan binda till ett hormon ' s receptor och störa endokrina system antingen genom att imitera hormon aktivitet eller genom att blockera endogena hormoner bindande. I det första fallet, efter bindning till receptorn, de kan aktivera det som dess naturliga hormon skulle göra. I det andra fallet, bindning av EDC till receptorn förhindrar bindningen av dess naturliga hormon, så receptorn är blockerad och kan inte längre aktive ras, även i närvaro av dess naturliga hormon3. Som en följd, hormonstörande ämnen kan påverka flera processer, såsom syntes, sekretion, transport, metabolism, eller perifer verkan av endogena hormoner som är ansvariga för upprätthållandet av homeostas, reproduktion, utveckling, och/eller beteende av organismen. Receptor bindning är inte det enda sättet för åtgärder som hittills beskrivits för hormonerna. Det står nu klart att de också kan agera genom att rekrytera coactivatorer eller corepressorer i enzymatiska vägar eller genom att modifiera epigenetiska markörer avreglera gen uttryck10,11,12,13 ,14, med följder inte endast för ström utvecklingen men också för det vård-av utvecklingar att komma8.

Drosophila hormoner

De potentiella effekterna av utvalda hormonstörande ämnen har studerats brett, både i vilda djur och i flera modell system där endokrina mekanismer är tämligen välkända. För ryggradslösa djur har endokrina system som påverkar tillväxt, utveckling och reproduktion i stor utsträckning karaktäriserats av insekter av flera anledningar, vilket inbegriper deras omfattande användning inom området biologisk forskning, deras ekonomiska betydelse, och Slutligen utvecklingen av insekticider kan ingripa specifikt med hormon systemet av skadegörare insekter.

I synnerhet bland insekter, har frukten flyga D. melanogaster visat sig vara ett mycket kraftfullt modell system för att utvärdera de potentiella endokrina effekterna av hormonstörande ämnen. I D. melanogaster, liksom i ryggradsdjur, hormoner spelar en viktig roll under hela livs cykeln. I denna organism, det finns tre huvudsakliga hormonella system, som involverar steroid hormonet 20-hydroxyecdysone (20e)15,16, den sesquiterpenoid juvenila hormonet (Jh)17, och neuropeptider och peptid/protein hormoner18. Denna tredje grupp består av flera peptider som upptäcktes på senare tid men klart involverade i ett enormt utbud av fysiologiska och beteendemässiga processer, såsom livs längd, homeostas, metabolism, reproduktion, minne och rörelse kontroll. 20E är homologa till kolesterol-härledda steroidhormoner såsom estradiol, medan JH delar vissa likheter med retinoinsyra; båda är de mer kända hormonerna i Drosophila19,20. Deras balans är avgörande för att samordna ömsat och metamorfos, samt för att kontrol lera flera postutvecklande processer, såsom reproduktion, livs längd, och beteende21, vilket erbjuder olika möjligheter för att testa endokrina störningar i Drosophila. Ytterligare, ecdysteroid hormoner och JHs är de viktigaste målen för den så kallade tredje generationens insekticider, som utvecklats för att störa utvecklings-och reproduktiva endokrina medierade processer i insekter. Den agonist eller antagonist verkningsmekanismen av dessa kemikalier är välkänd, och därmed kan de fungera som referens standarder för att utvärdera effekterna av potentiella hormonstörande ämnen på tillväxt, reproduktion, och utveckling av insekter22. Till exempel, Methoprene, som har varit allmänt används för att kontrol lera myggor och andra vatten levande insekter23,24, fungerar som en Jh-agonist och pressar 20e-inducerad gentranskription och metamorfos.

Förutom hormoner, kärn-receptor (NR) superfamiljen i Drosophila är också välkänd; Den består av 18 evolutionärt bevarade transkriptionsfaktorer involverade i att kontrol lera hormon beroende utvecklings vägar, samt reproduktion och fysiologi25. Dessa hormon NRS tillhör alla sex nr superfamiljen subtypes, inklusive de inblandade i neurotransmission26, två för retinoinsyra Acid NRS, och de för steroid NRS att, på ryggradsdjur, utgör ett av de primära målen för hormonstörande ämnen27.

Drosophila som modell system för att studera hormonerna

För närvarande, på grund val av molekyl ära egenskaper, kan flera miljö byråer runt om i världen tillräkna potentialen att störa de endokrina systemen till olika konstgjorda kemikalier. Med tanke på att hormonerna är ett globalt och allmänt förekommande problem för miljön och för organismer, är det övergripande målet för forskningen på detta område att minska deras sjukdoms börda, samt att skydda levande organismer från deras negativa effekter. För att fördjupa förståelsen om de potentiella endokrina effekterna av en kemikalie, är det nödvändigt att testa den in vivo. För detta ändamål representerar D. melanogaster ett giltigt modell system. Hittills har frukt flugan använts i stor utsträckning som in vivo modell för att utvärdera effekterna av flera miljö-Hormonorganiska ämnen; Det har rapporter ATS att exponering för flera hormonerna, såsom dibutylftalat (DBP)28, bisfenol a (BPA), 4-nonylfenol (4-NP), 4-tert-octylfenol (4-TERT-OP)29, METYLPARABEN (MP)30, ethylparaben (EP)31, 32, bis-(2-etylhexyl) ftalat (dehp)33, och 17-α-ETINYLESTRADIOL (EE2)34, påverkar metabolism och endokrina funktioner som i ryggradsdjur modeller. Flera anledningar har lett till dess användning som förebild inom detta forsknings område. Utöver en utmärkt kunskap om dess endokrina system, ytterligare fördelar inkluderar dess korta livs cykel, låg kostnad, lätt manipulerbara genom, en lång historia av forskning, och flera tekniska möjligheter (se FlyBase hem sida, http://flybase.org/). D. melanogaster ger också en kraftfull modell för att enkelt studera transgenerationseffekter och populations reaktioner på miljö faktorer8 och undviker etiska frågor som är relevanta för in vivo-studier på högre djur. Dessutom, banan fluga delar en hög grad av gen bevarande med människor som kan göra det möjligt för Drosophila EDC analyser för att hjälpa till att förutsäga eller föreslå potentiella effekter av dessa kemikalier för människors hälsa. Förutom att öka förståelsen för människors hälso effekter kan Drosophila hjälpa till att bedöma riskerna med EDC-exponering för miljön, såsom förlust av biologisk mångfald och miljöförstöring. Slutligen ger frukt flugan den extra fördelen att de används i laboratorier, där de faktorer som potentiellt påverkar dess utveckling, reproduktion och livs längd kan hållas under kontroll för att tillskriva en variant av ämnet som skall testas.

Med detta i åtanke, vi har optimerat enkla och robusta Fitness analyser för att fastställa EDC effekter på vissa Drosophila hormonella egenskaper, såsom fruktsamhet/fertilitet, utveckling timing, och vuxen livs längd. Dessa analyser har ofta använts för vissa edcs23,24,25,26,27. I synnerhet har vi använt följande protokoll för att utvärdera effekterna av exponeringen för syntetiskt östrogen EE234 och till BPA och BISFENOL AF (BPA F) (opublicerade data). Dessa protokoll kan lätt ändras för att undersöka effekterna av en given EDC i taget, liksom de kombinerade effekterna av flera hormonerna i D. melanogaster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av livsmedel

  1. För lager underhåll och för larv tillväxt, Använd en majsmjöl medium som innehåller 3% pulveriserad jäst, 10% sackaros, 9% förkokt majsmjöl, 0,4% agar, därefter kallas majsmjöl medium (cm).
    1. Sätt 30 g jäst i 100 mL kran vatten, ta den till en koka och låt den koka i 15 min.
    2. Separat, blanda väl 90 g förkokt majsmjöl, 100 g socker, och 4 g agar i 900 mL kran vatten.
    3. Ta lösningen till en koka, Sänk värmen och koka i 5 minuter under ständig omrörning.
    4. Efter 5 minuter, tillsätt varm jäst lösning och låt sjuda i ytterligare 15 min.
    5. Stäng av värme källan och låt lösningen svalna till ca 60 ° c.
    6. Tillsätt 5 mL/L 10% metyl4-hydroxibensoat i etanol, blanda grundligt och låt det sitta i 10 min.
      Anmärkning: Var försiktig med mängden metyl 4-hydroxibensoat, med tanke på att en hög koncentration av fungicid kan vara dödlig för larver.
    7. Fördela mediet i injektions flaskor/flaskor: 8 mL i varje injektions flaska (25 mm x 95 mm), 3 mL i varje injektions flaska (22 mm x 63 mm) och 60 mL i varje flug flaska (250 mL).
    8. Täck injektions flaskorna med cheesecloth och låt dem torka i rums temperatur (RT) i 24 timmar före förvaring.
    9. Kalibrera experimentellt rätt konsistens och hydrering av CM genom att ändra antingen mängden agar som används och/eller kyla/tork tider.
      Obs: urkopplade, förpackade och förpackade injektions flaskor är stabila i ca 15 dagar vid 4 ° c.
  2. För Drosophila vuxna, använda ett medium som innehåller 10% pulveriserad jäst, 10% sackaros, 2% agar, därefter kallas vuxen medium (AM).
    1. Blanda 10 g pulveriserad jäst, 10 g sackaros, 2 g agar i 100 mL destillerat vatten.
    2. Ta denna blandning till en koka två gånger, med ett 3 minuters intervall, eller tills agar löses, med hjälp av en mikrovågsugn.
    3. När lösningen svalnat till 60 ° c, tillsätt 5 mL/L 10% metyl4-hydroxibensoat i etanol, blanda grundligt och fördela i injektions flaskor (10 mL per injektions flaska).
    4. Täck injektions flaskorna med cheesecloth och låt dem torka vid RT i 24 timmar innan förvaring.
      Obs: inkopplade, förpackade och förpackade injektions flaskor är stabila i ca 15 dagar vid 4 ° c.
  3. För Fecundity/fertilitet assay, Använd Drosophila tomatjuice-majsmjöl medium.
    1. Häll av 70 mL varm majsmjöl i en 100 mL-bägare och tillsätt 30 mL tomatjuice (30% v/v).
    2. Blanda noggrant med en mat beredare och Pipettera 3 mL i små injektions flaskor.
    3. Täck injektions flaskorna med cheesecloth och låt dem torka vid RT i 24 timmar före förvaring.
      Obs: inkopplade, förpackade och förpackade injektions flaskor är stabila i ca 15 dagar vid 4 ° c.
  4. För insamling av embryon, Använd agarplattor, innehåll Ande 3% agar, 30% tomatsås och 3% socker.
    Obs: var noga med att inte göra bubblor när du häller mediet i plattorna.

2. dosering av Drosophila EDC

  1. Bered en lämplig stam lösning som löser upp den valda EDC i lämplig spädnings vätska. För EE2 (molekyl vikt 296,403), lös 1,48 g i 10 mL 100% etanol för att tillverka en 0,5 M lager lösning och förvara vid-80 ° c.
    Var försiktig: Hormonerna anses vara miljö för oren ande och försiktighets åtgärder bör vidtas vid hantering av dessa.
  2. Späd ut EE2-lagerlösningen i 10% etanol i vatten (v/v) för att erhålla en 100 mM lösning. Gör nästa utspädningar (0,1 mM, 0,5 mM och 1 mM) i CM-mat, med början med lägsta koncentration och med samma koncentration av spädnings vätska för varje behandlings grupp. För kontroll injektions flaskorna Använd samma volym av spädnings vätskan ensamt.
    Anmärkning: det rekommenderas att hålla den slutliga koncentrationen av lösnings medlet så låg som möjligt, med tanke på att den slutliga koncentrationen av etanol inte bör överstiga 2% i flug foder.
  3. Tillsätt lösningen med rätt utspädning av den valda EDC till majsmjöl-baserade livsmedel före stelning, blanda grundligt med en mat beredare, Dispensera 10 mL i injektions flaskor, täck med bomull gasväv och låt torka vid RT för 16 h före användning.
    Obs: Använd detta medium omedelbart efter beredningen.
  4. För vuxen uppfödning, Förbered olika arbets EE2 lösningar (10 mM, 50 mM respektive 100 mM) i 10% etanol i vatten (v/v) och skikt 100 μL av varje på ytan av AM, för att erhålla den önskade koncentrationen av EE2 (0,1 mM , 0,5 mM och 1 mM). För kontroll Använd samma volym av spädnings vätskan ensamt.
    Anmärkning: alternativt, tillsätt lösningen som innehåller den rätta utspädningen av den valda EDC till en liten mängd am i ett 50 ml koniskt rör, vortexgrundligt och stratifiera 1 ml av det på ytan av am injektions flaskorna.
    1. Täck injektions flaskorna med bomullsgasväv, låt torkning vid RT för 12-16 h under mild agitation och använd dem omedelbart.
      Obs: tork processen bör justeras experimentellt eftersom är beroende på den omgivande luft fuktigheten.
  5. För utfodring assay, tillsätt både lösningen som innehåller den rätta utspädningen av den valda EDC (EE2 0,1 mM, 0,5 mM och 1 mM) och en färg mat (t. ex. den röda färg ämne nr. 40 på 1 mg/mL)35 till cm före stelning, blanda starkt med en mat beredare och sedan munstycket e i injektions flaskor.

3. uppfödning flugor

  1. Använd en robust ISOGEN stam, såsom Oregon R, som upprätthålls av flera generationer i laboratoriet.
  2. Håll flugor i en fuktad, temperaturkontrollerad inkubator, med en naturlig 12 h ljus: 12 h mörk foto period vid 25 ° c i injektions flaskor innehåll ande cm mat.
  3. Använd i varje analys injektions flaskor vid RT.

4. utfodring assay

Anmärkning: Denna analys rekommenderas att testa om närvaron av den valda EDC i mediet kan påverka utfodring av flugor.

  1. Sätt 15 unga flugor i injektions flaskor som innehåller CM kompletteras med olika koncentrationer av den valda EDC och en färg mat. Låt flugor att mata på mediet för 1 dag.
    Anmärkning:Använd till exempel rött färg ämne nr 4035 (1 mg/ml).
  2. Sätt 15 unga flugor i flaskor som innehåller CM kompletteras med lösnings medlet ensam och en färg mat för kontroll. Låt flugor att mata på mediet för 1 dag.
  3. Anesthetize individuellt varje grupp av flugor med eter.
    1. Transfer flugor i varje grupp till en cylindrisk glas behållare (etherizer) med en tratt insatt i den öppna änden, Invertera flaskan över tratten och försiktigt knacka de två behållarna tillsammans för att göra flugor falla i etherizer.
      Anmärkning:  Tratten kommer att hindra dem från att komma ur etherizer.
    2. Knock flyger ner genom att försiktigt knacka på etherizer på en mjuk yta, till exempel en musmatta, och snabbt ersätta tratten med en eter-indränkt bomull och gasväv plugg.
    3. Vänta ca 1 min tills flugorna faller till botten och sluta röra sig.
      Obs: överskrid inte tiden eller flugorna kommer att dö.
  4. Sätt orörlig flugor under en stereo-Mikroskop och jämföra buk färgning av varje behandlings grupp med avseende på kontroll gruppen.

5. Fecundity/fertilitet assay

  1. För varje EDC-koncentration, Förbered 3 injektions flaskor med flugor, därefter kallade föräldra flaskor, med 8 honor och 4 hanar i 10 mL CM/EDC mat; för kontroll förbereda 6 injektions flaskor med flugor med 8 honor och 4 hanar i 10 mL CM mat kompletterat med spädnings vätska. Bakre flugor i en inkubator vid 25 ° c.
    Obs: Undvik överbeläggning larver under deras utveckling och försöka använda konsekvent larv densiteter över behandlingar.
  2. Efter 4 dagar, ta bort föräldrarna och returnera injektions flaskorna i inkubator för 5 dagar.
  3. Ta bort alla nyflugor från injektions flaskorna sent på eftermiddagen dagen 9 och Lägg flaskorna i en inkubator vid 18 ° c över natten.
    Anmärkning: Detta avlägsnande måste göras mycket noggrant, kontrol lera ytan av mediet väl.
    1. På morgonen dag 10, för varje behandlings grupp, samla jungfru honor och unga män i två grupper, under lätta CO2 anestetization. Slumpmässigt dela upp varje grupp av flugor i små under grupper (10 honor och 20 hanar per injektions flaska) i oberoende injektions flaskor fyllda med färska motsvarande CM.
      1. Upprepa steg 5.3.1 och var noga med att försiktigt avlägsna alla flugor från injektions flaskorna 8-10 h före uppsamling och lämna injektions flaskorna vid 18 ° c, tills de får minst 30 jungfru honor och 30 hanar för varje EDC-koncentration och minst 90 jungfru honor och 90 hanar för kontroll.
    2. Hus dessa grupper av flugor vid 25 ° c tills de är i åldrarna 4 dagar efter eclosion, överföra dem till nya flaskor som innehåller färska motsvarande medium varannan dag.
      Obs: 4 dagar är tillräckligt med tid för flugor för att bli mogna vuxna, men det är mycket långt från början av senescence.
    3. Efter två dagar se till att det inte finns några larver i injektions flaskorna med Honor. Om de gör det, är flugorna inte användbara eftersom de inte är jungfrur och måste kasseras.
  4. Använd 20 singel flugor av varje kön för varje behandlings grupp att sätta upp 20 enstaka kors i små flaskor som innehåller färskt CM-tomat medium utan EDC, som beskrivs nedan.
    1. Till varje behandlings grupp tilldela en annan serie av sekventiella nummer, som unikt identifierar den och märka respektive flaskor; t. ex. Grupp1 (enbart lösnings medel) från 1 till 20, grupp 2 (EDC-koncentration x) från 20 till 40 och så vidare.
    2. Gör ett fruktbarhets kalkyl blad för att registrera de olika serierna, var och en motsvarande en behandlings grupp.
    3. För varje kön söva alla flugor som hör till varje behandlings grupp under lätta co2 och slumpmässigt överföra dem enligt följande.
      1. Överför en lösningsmedelsbehandlad hona till en liten injektions flaska som innehåller färskt CM-tomatsubstrat utan EDC och tillsätt en lösningsmedelsbehandlad hane för kontroll korset.
        Anmärkning: tomatjuice bör tillsättas till mediet under beredningen eftersom mörkt medium ökar kontrasten med de vita embryona.
      2. Överför en EDC-behandlad hona till en liten injektions flaska som innehåller färsk CM-tomat utan EDC och tillsätt en lösningsmedelsbehandlad hane för varje behandling.
      3. Överför en EDC-behandlad hane till en liten injektions flaska som innehåller färskt CM-tomatsubstrat utan EDC och tillsätt en lösningsmedelsbehandlad hona för varje behandling.
    4. Hus alla dessa enda korsar vid 25 ° c.
  5. Överför varje parnings par till färska CM-tomatflaskor utan EDC varje dag under de följande tio dagarna. Märk de replikerade flaskorna i varje serie sekventiellt. t. ex. 1-a, 1b, 1c...... 20a, 20b, 20c och rapportera dessa siffror på fertilitet kalkyl blad.
  6. Visuellt inspektera varje injektions flaska varje dag för äggen och rapportera deras antal på fertilitet kalkyl blad.
  7. Spara varje injektions flaska och, när nya flugor börjar dyka upp, också registrera det dagliga antalet vuxna avkommor under 10 dagars perioden. Efter 10 dagar från den första parningen, ta bort föräldrarna.
    Anmärkning: kassera injektions flaska där en eller båda föräldrarna dog. i händelse av flykt av en eller båda föräldrarna, inkludera i analysen alla uppgifter fram till den dag de förlorades.
  8. Summera det dagliga antalet ägg och det dagliga antalet vuxna avkommor från varje behandlings grupp, för att erhålla den totala fruktsamheten/fertiliteten, den genomsnittliga produktionen av ägg och vuxna avkomman med en fluga i tio dagar, och förhållandet mellan den totala avkomman och det totala antalet ägg som lagts. Beräkna skillnaderna i procent av varje behandlings värde med avseende på kontrollen.
  9. Utför tre oberoende experiment för varje grupp av flugor, genom att använda minst 10 flugor för varje behandlings grupp.
  10. Utför statistisk analys för att jämföra de olika grupperna.

6. utvecklande timing

Anmärkning: I de två följande alternativa protokollen utvärderas utvecklingstidpunkten genom att räkna både antalet puppor som bildas per dag och antalet vuxna avkomman per dag.

  1. Protokoll för eclosion-analys 1
    1. För varje behandlings grupp, inrätta 10 injektions flaskor med unga (< 2 dagar), friska flugor, var och en med 6 honor och 3 hanar i 10 mL majsmjöl mat utan EDC.
    2. Låt flugor på mat för 24 h, och låt dem para.
    3. Bered 10 parallella flaskor per behandlings grupp med 10 mL färska majsmjöl som kompletteras med olika EDC-koncentrationer eller enbart spädnings vätskan för kontroll. Transfer paras flugor till dessa nya flaskor.
      Anmärkning: för varje behandlings grupp tilldela en annan serie av sekventiella tal, som unikt identifierar den och märka respektive flaskor.
    4. Gör ett utvecklande kalkyl blad för att spela in de olika serierna.
    5. Låt flugor för att lägga ägg för 16 h. Ta sedan bort föräldrarna från injektions flaskorna.
      Anmärkning: Den överordnade flugor kan användas för att upprepa steg 6.1.5, genom att överföra dem till andra motsvarande flaskor.
    6. Inkubera injektions flaskor i 3-4 dagar vid 25 ° c, eller tills inga fler puppor bildas. Varje dag räkna antalet nya puppor i varje injektions flaska och rapportera det på utvecklingsprogrammet kalkyl blad. För att undvika att räkna samma puppa två gånger, skriv ett nummer i sekvens vid varje puppa med en permanent markör på utsidan av injektions flaskan.
    7. Från och med dagen 9, räkna dagligen antalet nya vuxna tills inga fler vuxna dök upp, och rapportera det på utvecklingsprogrammet kalkyl blad.
    8. Från dessa rå data, beräkna den genomsnittliga larv perioden, den genomsnittliga Pupp perioden, liksom skillnaderna i procent av varje behandling med avseende på kontrollen.
    9. Utför tre oberoende experiment för varje grupp av flugor, genom att använda minst 5 injektions flaskor för varje behandlings grupp.
    10. Utför statistisk analys för att jämföra de olika grupperna.
  2. Protokoll för eclosion-analys 2
    1. Bakre unga och friska kvinnliga (ca 150) och manliga (ca 50) flyger på en samling bur (tabell över material) med agar-tomat medium kompletteras med färska bagerijäst pasta (3 g bagerijäst i 5 ml vatten), därefter kallas läggnings bricka, för 2 dagar vid 25 ° c.
    2. Under dessa 2 dagar, låt flugor till vänja till buren i en mörk, lugn plats, innan början ägg insamling, och ändra läggnings brickan två gånger om dagen.
    3. På den tredje dagen, ändra läggnings brickan tidigt på morgonen. Efter 1 h, Byt ut läggnings brickan, kasta dessa ägg.
    4. Låt flugor för att lägga ägg för 2 h och Ersätt med färsk läggnings bricka.
      Anmärkning: Vid dag 3, en bra läggnings bricka bör producera 100-200 ägg i 2 h.
    5. För varje behandlings grupp, förbereda en serie av 3 60 mm rätter som innehåller tomat majsmjöl mat kompletteras med motsvarande EDC koncentration eller med lösnings medel ensam och rapportera varje serie i utvecklings mässiga timing kalkyl blad. Alternativt, om du föredrar, Använd flaskor istället för rätter.
    6. Plocka försiktigt upp ägg under ett Mikroskop genom att använda en pensel eller en sond och överför dem till toppen av mediet i varje skål/injektions flaska. För att under lätta räkning, på läggnings brickan, ordna ägg i 5 grupper om 10 vardera och överföra dem en i taget.
      Anmärkning: Upprepa steg 6.2.4 så många gånger som behövs för att få tillräckligt med embryon.
    7. Hus alla dessa rätter/injektions flaskor vid 25 ° c. Förvara även varje läggnings bricka vid 25 ° c och räkna det totala antalet ägg som läggs.
    8. Efter 24-30 h, kontrol lera varje skål/flaska under ett stereo mikroskopet och räkna både antalet vita, Obefruktade ägg och antalet mörkt döda embryon.
    9. Subtrahera antalet vita, Obefruktade ägg från 50 överförda ägg värde för att få "totala embryon" värde per fat/flaska. Antalet mörka döda embryon kan användas för att fastställa potentiella EDC toxiska effekter under embryogenes.
    10. Upprepa steg 6.1.6-6.1.10 i Eclosion-analysens protokoll 1.

7. livs längds protokoll

  1. Ställ upp 20 injektions flaskor med flugor med 8 honor och 4 hanar och hus vid 25 ° c i CM (10 mL vardera).
  2. Efter 4 dagar kasta flugor och placera flaskor tillbaka i inkubator.
    Obs: dessa flugor kan användas för att starta igen för att få andra ålderssynkroniserade kohorter av flugorna.
  3. I den sena eftermiddagen på dagen 9, ta bort alla nya flugor från injektions flaskorna och retur flaskor till inkubator.
    Notera: några vuxna bör börja att eclose så tidigt som den nionde dagen; kasta dessa flugor gör det möjligt att samla in ett maximalt antal synkroniserade flugor, undvika vårdslös urval av tidiga framväxande.
  4. 16-24 senare, överföra de vuxna flugor (1 dag gamla) av båda könen i fyra grupper av 250 mL flaskor som innehåller AM mat kompletteras med tre olika EDC koncentrationer och en med spädnings vätskan ensam. Om det behövs, samla en annan batch nästa dag.
  5. Underhåll flugor vid 25 ° c i 2-3 dagar så att de kan para sig.
    Anmärkning: dagen för överföring till am-matflaskor motsvarar den första dagen i vuxen ålder.
  6. Efter två-tre dagar, sortera varje kohort av flugor efter kön i två grupper under lätta CO2 anesthetization. Slumpmässigt dela upp varje kön i fem flaskor per behandling med en densitet på 20 individer per injektions flaska, tills det finns tre replikat av 5 parallella injektions flaskor för varje kön per varje behandling.
    Anmärkning: Arbeta med små grupper av flugor för att förebygga eventuella långvariga hälso problem på grund av lång exponerings tid till CO2.
  7. Förbered en livstid kalkyl blad där antalet döda flugor subtrameras från antalet överlevande flugor till den tidigare överföringen, på ett sådant sätt att automatiskt få antalet överlevande vid varje överföring.
  8. Transfer flyger till nya flaskor som innehåller motsvarande mat var 3 dagar på samma gång och kontrol lera om döden.
    Obs: överföringen måste ske utan anestesi som kan ha en långsiktig negativ effekt på flylängd.
    1. Vid varje överföring, registrera åldern på flugor och antalet döda flugor.
      Obs: antalet överlevande flugor beräknas automatiskt i kalkyl bladet, men det rekommenderas att kontrol lera det visuellt. Flugor som av misstag både flyr eller dör under överföringen bör inte beaktas. Var noga med att inte räkna två gånger döda flugor transporteras till den nya injektions flaskan rapportera denna anteckning i kalkyl bladet.
    2. Upprepa steg 7,8 och 7.8.1 tills alla flugor dör.
  9. För varje behandlings grupp, skapa en överlevnads kurva som visas i figur 6, för att Visa överlevnads sannolikheten för en fluga vid en viss tidpunkt.
  10. Utföra tre oberoende experiment för varje behandlings grupp av flugor, genom att använda 100 nyligen eclosed flugor för varje experiment.
  11. Förbered en tabell för att rapportera den genomsnittliga livs längden (genomsnittliga överlevnads dagar för alla flugor för varje grupp), den halva döds tiden (tids period i dagar som krävs för att nå 50% dödlighet) och den maximala livs längden (maximalt antal dagar som behövs för att nå 90% dödlighet).
  12. Beräkna skillnaderna i procent mellan varje behandlings grupp med avseende på kontroll gruppen.
  13. Utför statistisk analys för att jämföra de olika behandlings grupperna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I detta avsnitt rapporteras de viktigaste stegen i ovanstående protokoll i form av förenklade system. Med tanke på att flugor tenderar att undvika obehagliga föreningar, är det första att göra för att assay smaken av den valda EDC. Detta kan göras genom att blanda en karamellfärg (till exempel, rött mat färg ämne nr. 40)35 med maten kompletterat med den utvalda EDC på olika doser eller med vätskan ensamt. Flugor som matas på dessa media unders öks under ett stereo mikroskopet och födo intaget uppskattas av deras buk färgning (figur 1). En typisk önskad situation visas i figur 1 med två vuxna Honor: en matas på medium som innehåller den valda EDC och en på medium som inte innehåller EDC, båda uppvisar samma färg i sin abdomens.

Det har varit allmänt accepterat att hormonerna, som naturliga hormoner, har effekter vid extremt låga doser och att det inte finns en enkel, linjär relation mellan dos och effekt29, med högre doser som inte nödvändigt vis har en större effekt36, på 37. I stället för en dos-responsmetod är det därför tillrådligt att använda fler doser, med utgångs punkt i relevanta koncentrationer för miljön eller för andra organismer, för att kunna bedöma deras effekter fullt ut. I varje fall är det viktigt att assay den EDC smaken vid varje Använd koncentration för att se till att flugor smälta jämförbara mängder av EDC i varje behandlings grupp (figur 2).

Endokrina störningar påverkar många viktiga egenskaper hos Djurfysiologi såsom fertilitet, livs längd, och utveckling som därför är användbara endpoints för att testa hormonstörande ämnen. För ovanstående protokoll, som vi optimerat för att mäta EDC effekter på dessa Drosophila livs egenskaper, primära överväganden är att det är absolut nödvändigt att använda unga och friska flugor som bör vara korrekt manipuleras innan testning. Med detta i åtanke måste stor uppmärksamhet ägnas åt produktion, hantering och lagring av den använda maten. Dessutom bör man vara försiktig med att använda det bästa lösnings medlet för den valda EDC vid lämpliga slutliga koncentrationer (dvs. mindre än 1% för dimetylsulfoxid [DMSO] och mindre än 2% för etanol)30.

Fruktsamhet och fertilitet har använts för att utvärdera den reproduktiva framgången i D. melanogaster. Figur 3 visar ett schema för det använda protokollet. Fecundity mäts experimentellt som det totala antalet ägg som läggs, medan fruktsamheten mäts som total vuxen avkomma. Baserat på övervägandet att ägg produktionen under de första 10 dagarna av vuxen livet är en bra referens för hela vuxen livet ägg/avkomma produktion av en organism38,39, fertilitet och fruktsamhet analyser kan utföras i 10 dagar av med 4 dags gamla flugor som kläckts från de exponerade larverna. Det är viktigt att försöka få liknande värden i de parallella injektions flaskorna i varje grupp; annars skulle det vara svårt att föreställa sig vilket rör att ta bort från analysen. Så, det är tillrådligt att undersöka dagligen varje replikat injektions flaska för att undvika en stressande miljö, såsom torkad eller kondenserad mat; från 20 enstaka kors, rekommenderas att få minst 10 injektions flaskor i goda förhållanden där båda föräldrarna levde i 10 dagar. Antalet ägg och adulta avkomman som samlats in dagligen måste rapporteras på ett bord enligt figur 3 och användas för att beräkna medelvärdet av produktionen av ägg och vuxna avkomman i en fluga under 10 dagar. Sedan, den fruktsamhet/fertilitet förändring procent av EDC-behandlade flugor jämfört med kontroll flugor kan erhållas med tillämpning av följande formel: Fecundity/fertilitet förändring% = [(kontroll-behandling)/kontroll] x 100. Minst tre oberoende replikat måste erhållas för varje grupp.

Hormoner spela viktiga roller i utvecklings mässiga över gångar i livet av D. melanogaster40, för vilka det är troligt att dessa faser av tillväxt är särskilt sårbara för de negativa effekterna av hormonerna. Vid 25 ° c, både larv tillväxt och Pupp skede varje spännvidd cirka 4 dagar. Efter EDC-exponering kan den genomsnittliga varaktigheten för dessa stadier påverkas41. Baserat på detta övervägande, de utvecklings mässiga timing protokollen optimerades för att bestämma procent satsen och tiden för över gången från larver till puppor och från puppor till vuxna efter EDC exponering med avseende på obehandlade flugor. Två alternativa protokoll skulle kunna utföra denna analys. Båda var giltiga och baserade på EDC kronisk exponering för larver under en 4 dagars period. På grund val av denna larv behandling tog det första protokollet inte hänsyn till åldern på embryona, som samlades in under en 16-18 h-period (över natten). Den därav följande ålders variationen bland larverna bör dock finnas i alla injektions flaskor för varje behandling, vilket ökar variationen i under behandlingen, men utan att nämnvärt påverka uppskattningarna av utvecklings tidpunkter genom behandlingar. I stället använde det andra protokollet ett fast antal synkrona tidiga embryon, vilket gjorde det möjligt att utvärdera även de potentiella effekterna av den valda EDC under embryogenes42,43. För att minimera ålders skillnaderna mellan larverna minskade variabiliteten inom behandlingen och ökade förmågan att uppskatta de verkliga skillnaderna mellan behandlingarna. Figur 4 redovisar ett system för eclosion-analysen. I båda protokollen måste plattorna/flaskorna kontrol leras dagligen, och antalet både puppor och vuxna från exponerade och icke exponerade för EDC rapporterades separat på en tabell som i figur 4. Alla bildade puppor och adulta flugor måste räknas, oavsett om de är döda eller levande. Sedan användes dessa rå data för att beräkna procent satser och tidpunkter för över gång från larver till puppor och från puppor till vuxna och för att beräkna förändrings procenten av dessa värden för de EDC-behandlade flugorna jämfört med kontroll flugor. Efter EDC-exponeringen förväntades en övergripande utveckling eller försening med avseende på kontroll flugorna. Det valda protokollet måste utföras i tre exemplar för varje grupp av flugor. Det var tillrådligt att för eclosion assay protokoll 2, varje serie av en replikation för en given EDC koncentration var seedade med embryon från samma läggnings spår för att bibehålla tillförlitlighet och noggrannhet i embryonal iscensättning hela EDC koncentrationer.

Slutligen visar figur 5 de viktigaste stegen för att mäta livs längden. För detta protokoll var det viktigt att alla flugor under analys var synkrona av ålder och kön, tillsammans, och hålls i en densitet tillräckligt låg för att möjliggöra fri omsättning. Det är viktigt att utföra livs längds experiment i båda könen separat eftersom det är välkänt att det finns betydande skillnader i livs längd mellan män och kvinnor44.

Mat måste bytas var tredje dag för att bibehålla en hälsosam befolkning, och dödligheten måste bedömas också var 3 dagar. På ett livs längds kalkyl blad, som i figur 5, rapporterades antalet döda flugor, och det antalet skulle automatiskt dras från antalet överlevande flugor från den tidigare överföringen. För varje EDC-koncentration och för enbart lösnings medlet plottas det kumulativa överlevare jämfört med de förflutna dagarna för att få livs längds kurvor. En typisk överlevnads kurva redovisas i figur 6. efter en lång initial period då överlevnads kurvan förblev relativt hög sjönk den exponentiellt efter ca 60 dagar. Efter EDC-exponering kan överlevnads kurvan för de behandlade flugorna påverkas avsevärt. För att avgöra om denna effekt beror på den valda EDC, var det tillrådligt att genomföra minst två, eller ännu bättre, tre oberoende, noncontemporore replikera experiment.

I vart och ett av ovanstående protokoll var det möjligt att ha avvikande injektions flaskor (till exempel utan ägg eller avvikande dödsfall); dessa injektions flaskor kunde ha sitt ursprung av olika orsaker, såsom dålig livsmedels kvalitet eller infektion, och skulle kunna förändra åtgärdernas värden avsevärt. Det bästa sättet att hantera dessa avvikande situationer var att undvika dem genom god experimentell praxis. Så, det måste betonas att för alla ovanstående protokoll, stort och noggrant arbete krävdes för att replikera flaskorna, hålla flugor friska, och i hanteringen flugor som, när de utsätts för en EDC, kan bli känsliga, vilket ökar risken för döden när Manipulerade.

Figure 1
Figur 1: Utfodringsanalys. Adulta flugor i injektions flaskor innehåll ande CM/Dye kompletterat med en utvald EDC (topp) eller spädnings vätska (botten) lämnas till foder för 24 h. Två flugor matas på medium kompletteras med en EDC (topp) eller lösnings medel ensam (botten) visar liknande färg på deras abdomens. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: dosering av EDC. Schematisk av EDC administration till Drosophila genom diet. Adulta flugor från ett isogent bestånd exponeras för olika koncentrationer av en EDC (topp) eller lösnings medel ensamt (botten). N = referens koncentrationen av EDC. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: fertilitets analys. Schematisk av protokollet, som skildrar stegen från flyga tillväxt i lämpliga medier till jungfru kollektionen och upp till enstaka kors. Steg 1: vuxna (10 injektions flaskor med åtta honor och fyra hanar vardera) från en ISOGEN stam överförs till injektions flaskor med CM/EDC (topp) eller CM/spädnings vätska ensamt (botten). (Observera att systemet, för enkelhetens skull, avser bara en av de tre flaskorna.) Steg 2: efter 4 dagar, vuxna kasseras, och som ägg lämnas att utveckla för 9 dagar tills vuxen stadiet. Steg 3: nyligen eclosed vuxna sorteras efter kön och samlas i injektions flaskor (max. 20 hanar/injektions flaska och 10 Virgin-Honor/vial). Steg 4: vuxna är kvar att åldras för 4 dagar på motsvarande medium av larv tillväxt. Steg 5: setup av 40 enkel kors för EDC-behandlade flugor i CM-tomat medium utan EDC, 20x en EDC-behandlad hane med en kontroll hona och 20x en kontroll hane med en EDC-behandlad hona (topp); inställning av 20 enda kors för kontroll flugor, 20x en kontroll hane med en kontroll hona (botten). Gult medium är en CM kompletterad med en EDC (topp) eller lösnings medel som kontroll (botten), och rött medium är en tomat/CM utan en EDC eller lösnings medel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: utveckling av timing (eclosion-analysprotokoll 2). Till vänster, visar denna siffra ett system av samlings bur där vuxna (ca 150 kvinnor och 50 hanar) är placerade för att vänja och para sig i mörkret innan nedfallet steg (se protokollet). Efter 2 dagar, den gamla skjutbrickan ersätts med en med färsk mat, och äggen avsattes i nästa 1 h kasseras eftersom de är asynkrona. Härefter samlas äggen in varje 2 h på en ny glidande bricka, räknas, och placeras på rätter som innehåller tomat/CM kompletteras med en EDC eller med lösnings medel ensam. Data (totalt ägg, hemlig ägg, puppor och eclosed vuxna) redovisas på en serie av utvecklings mässiga timing kalkyl blad (höger). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: livs längds analys. En dag synkroniserade flugor överförs till en 250 mL flaska med vuxen mat (AM) kompletteras med en EDC (topp) eller lösnings medel (botten) som kontroll, för att möjliggöra utfodring (vänster i systemet). Efter 2-3 dagar, är flugorna sorteras efter kön och överförs till fem flaskor (som innehåller motsvarande medium av start flaskan) för varje kön, i grupper om 20 individer/injektions flaska. Var tredje dag överförs de vuxna till färska injektions flaskor tills de inte längre är nödvändiga (den centrala delen av systemet). Till höger finns ett schema över tabellen där uppgifterna registreras för varje dag. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: livs längds kurvor. Till vänster rapporteras en representativ tabell där antalet döda flugor har registrerats var tredje dag, både för behandlings gruppen (medium + EDC [0,05 mM EE2]) och för kontroll gruppen (medel + spädnings vätska) under hela försöks perioden. Den genomsnittliga livs längden för varje grupp har beräknats med hjälp av Matrix Sum. Av produkten; den behandlade gruppen förkortade den genomsnittliga livs längden jämfört med kontroll gruppen. Till höger visas en typisk överlevnads kurva över manliga flugor som matas med medium innehåll ande EE2 (0,05 mM) eller endast etanol för kontroll. Överlevnads kurvan sjönk snabbare för behandlade flugor än för kontroll gruppen, med en tidigare vänd punkt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Frukt flugan D. melanogaster har i stor utsträckning använts som ett in vivo-modellsystem för att undersöka de potentiella effekterna av miljö-edcs såsom DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-op29, MP30, EP31, 32, DEHP33och EE234. Flera anledningar har lett till dess användning som förebild inom detta forsknings område. Bortsett från dess obestridda fördelar som ett modell system, delar Drosophila en hög grad av gen bevarande med människor, för vilka Drosophila EDC analyser kan hjälpa till att förutsäga eller föreslå potentiella effekter för människors hälsa. Dessutom tillhör Drosophila de ryggradslösa djuren, som är allmänt representerade i alla eko system och kräver större skydds åtgärder mot de skadliga effekterna av hormonerna. Ryggradslösa djur är belägna vid basen av närings kedjan och utföra mycket viktiga funktioner för de miljöer där de lever. Det har rapporter ATS att flera hormonstörande ämnen som släpps ut i miljön kan ha en skadlig inverkan på utvecklingen och mångfaldigandet av flera djur arter. Drosophila erbjuder den extra fördelen av att användas i laboratoriet, där de faktorer som kan påverka utveckling, reproduktion och livs längd får hållas under kontroll för att tillskriva varje variant av ämnet som skall testas.

Här ger vi detaljerade protokoll för att studera effekterna av EDC exponering i detta modell system på hormonellt reglerade livs egenskaper såsom fruktsamhet/fertilitet, utvecklings takt, och livs längd. Vi har optimerat dessa protokoll som gjorde det möjligt att undersöka effekterna av EE234, BPA, och bpaf (opublicerade data) exponering, men de kan enkelt anpassas för att studera effekterna av andra hormonerna. I synnerhet kan dessa analyser användas för att undersöka både rena hormonproducerande ämnen och kombinationer av olika hormonerna, vilket i högre grad återger vad som sker i naturen. Även tydligen, de kan tyckas som enkla tillväxt analyser, är det viktigt att arbeta enligt lämpliga rikt linjer, säkerställa noggrannhet och reproducerbarhet45. Det är väl känt att fertilitet, utveckling timing, och livs längd i D. melanogaster kan påverkas av yttre och inre faktorer. Dessa kritiska faktorer, inklusive foto period, temperatur, fuktighet, nutrition, befolknings täthet, genetisk struktur, och ålder, måste noggrant kontrol leras för resultatet av de rapporterade protokollen. För att minimera komponenten av genetisk variation bör en ISOGEN stam användas. Denna stam måste vara omsorgsfullt uppfödda i en fuktad, temperaturkontrollerad inkubator, med en naturlig 12 h ljus: 12 h mörk foto period vid 25 ° c.

Förutom att upprätthålla en kontrollerad miljö måste larv och flyga överbeläggning undvikas. Det har rapporter ATS att larv överbeläggning kan påverka utvecklingen timing och framkalla uttryck för flera gener, inklusive värme chock eller immunitetsrelaterade gener, som påverkar den totala konditionen för vuxna flugor46. Också, vuxna flugor måste upprätthållas på en tillräckligt låg densitet för att möjliggöra fri rörlighet för att minimera vuxna stress. Vidare är det viktigt att se till att flugor konsumerar jämförbara mängder av EDC i varje behandlings grupp, med hänsyn till smaken av föreningen vid olika koncentrationer, eftersom flugorna tenderar att undvika obehagliga livsmedel. En annan viktig aspekt av dessa protokoll är livsmedels kvalitet. maten måste också se bra ut, saknar bubblor, bakterier sprickor, och så vidare47,48. Vidare är det nödvändigt att hålla i åtanke synkronisering, parnings status, och kön samlevnad för flugor som ska testas. I alla rapporterade protokoll är det viktigt att de parallella injektions flaskorna som analyseras måste vara mycket likartade. annars skulle det vara svårt att förstå vilka som ska kasseras så att maximal uppmärksamhet och god experimentell praxis krävs. Slutligen, genom att använda dessa protokoll för att utvärdera de endokrina effekterna av utvalda hormonstörande ämnen, är det viktigt att ta hänsyn till eventuella interaktioner med andra EDCs som finns i mediet, såsom metyl-4-hydroxibensoat eller BPA av plastampuller. I denna mening, det kan vara bra att ändra antimykotika, använda glas flaskor, eller utföra pilot analyser både med och utan möjliga föroreningar.

De rapporterade Drosophila analyserna kan vara mycket effektiva för bedömning av kemikalier eller blandningar av kemikalier, såsom hormonstörande ämnen, genom att utvärdera de potentiella effekterna på hormonellt reglerade livs egenskaper, såsom reproduktion, utveckling, och livs längd. Dessa analyser kan dock inte användas för att tydligt identifiera den endokrina mekanismen som är ansvarig för EDC: s negativa effekter. För att övervinna denna begränsning är det möjligt att utföra samma protokoll genom att använda referens-hormonstörande ämnen som framkallar svar som är representativa för ett visst verknings sätt på insekternas endokrina system (t. ex. tredje generationens insekticider som fungerar som JH eller ecdysteroid agonist/antagonist)22. Alternativt är det också möjligt att använda molekyl ära endpoints, genomföra molekylär analys på specifika gener som är hormonellt reglerade och som anses vara prediktiva och specifika bio markörer för endokrina störningar34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar Orsolina Petillo för teknisk support. Författarna tackar Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) för bibliografiska stöd. Författarna tackar Dr Gustavo Damiano Mita för att införa dem till EDC världen. Författarna tackar Leica Microsystems och Pasquale Romano för deras hjälp. Denna forskning stöddes av Project PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie orientera alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica i Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 KAMPANIEN; Projekt PO FESR Kampanien 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17α-Ethinylestradiol Sigma E4876-1G
Agar for Drosophila medium BIOSIGMA 789148
Bisphenol A Sigma 239658-50G
Bisphenol AF Sigma 90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl ether Sigma
Drosophila Vials BIOSIGMA 789008 25 mm x 95 mm
Drosophila Vials BIOSIGMA 789009 29 mm x 95 mm
Drosophila Vials Kaltek 187 22 mm x 63 mm
Embryo collection cage Crafts Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol FLUKA 2860
Etherizer Crafts cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle 250 mL Bottles
Glass Vials Microtech ST 10024 Flat bottom tube 100 x 24
Hand blender Pimmy Ariete food processor
Instant Success yeast ESKA Powdered yeast
Laying tray Crafts plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate SIGMA H5501
Petri Dish Falcon 351016 60x5
Red dye no. 40 SIGMA 16035
Stereomicroscope with LED lights Leica S4E
Sucrose HIMEDIA MB025
Tomato sauce Cirio

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. Kareiva, P. M., Marvier, M. , Roberts and Company Publishers. Greenwood Village, CO. 460-509 (2011).
  2. Zoeller, R. T., et al. Endocrine-disrupting chemicals and public health protection: a statement of principles from The Endocrine Society. Endocrinology. 153 (9), 4097-4110 (2012).
  3. Guillette, J., Gunderson, M. P. Alterations in development of reproductive and endocrine systems of wildlife populations exposed to endocrine-disrupting contaminants. Reproduction. 122, 857-864 (2001).
  4. Guillette, L. J. Endocrine disrupting contaminants-beyond the dogma. Environmental Health Perspectives. 114, 9-12 (2006).
  5. Liao, C. S., Yen, J. H., Wang, Y. S. Growth inhibition in Chinese cabbage (Brassica rapa var. chinensis) growth exposed to di-n-butyl phthalate. Journal of Hazardous Materials. 163, 625-631 (2009).
  6. Qiu, Z., Wang, L., Zhou, Q. Effects of Bisphenol A on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence in above-ground organs of soybean seedlings. Chemosphere. 90, 1274-1280 (2013).
  7. Wang, S., et al. Effects of Bisphenol A, an environmental endocrine disruptor, on the endogenous hormones of plants. Environmental Science and Pollution Research. 22, 17653-17662 (2015).
  8. Quesada-Calderón, S., et al. The multigenerational effects of water contamination and endocrine disrupting chemicals on the fitness of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 7, 6519-6526 (2017).
  9. Bergman, A., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. The State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012. , United Nations Environment Programme and the World Health Organization. (2013).
  10. Bachega, T. A. S. S., Verreschi, I. T., Frade, E. M. C., D’Abronzo, F. H., Lazaretti-Castro, M. The environmental endocrine disruptors must receive the attention of Brazilian endocrinologists. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 55, 175-176 (2011).
  11. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127, 204-215 (2011).
  12. Lee, S. B., Choi, J. Effects of Bisphenol A and Ethynyl estradiol exposure on enzyme activities, growth and development in the fourth instar larvae of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 68, 84-90 (2007).
  13. Vos, J. G., et al. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Critical Reviews in Toxicology. 20, 71-133 (2000).
  14. Costa, E. M. F., Spritzer, P. M., Hohl, A., Bachega, T. A. S. S. Effects of endocrine disruptors in the development of the female reproductive tract. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 58 (2), 153-161 (2014).
  15. Thummel, C. S. From embryogenesis to metamorphosis: the regulation and function of Drosophila nuclear receptor superfamily members. Cell. 83, 871-877 (1995).
  16. Schwedes, C. C., Carney, G. E. Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 58, 293-302 (2012).
  17. Flatt, T., Kawecki, T. J. Pleiotropic effects of methoprene-tolerant (Met), a gene involved in juvenile hormone metabolism, on life history traits in Drosophila melanogaster. Genetica. 122, 141-160 (2004).
  18. Nassel, D. R., Winther, A. M. E. Drosophila neuropeptides in regulation of physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 92, 42-104 (2010).
  19. Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annual Review of Entomology. 47, 467-500 (2002).
  20. Gáliková, M., Klepsatel, P., Senti, G., Flatt, T. Steroid hormone regulation of C. elegans and Drosophila aging and life history. Experimental Gerontology. 46, 141-147 (2011).
  21. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in Drosophila. Trends in Endocrinology & Metabolism. 11, 276-280 (2000).
  22. Weltje, L. Techniques for Measuring Endocrine Disruption in Insects. Endocrine Disrupters: Hazard Testing and Assessment Methods. Matthiessen, P. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 100-115 (2013).
  23. Zou, Z., et al. Juvenile hormone and its receptor, methoprene-tolerant, control the dynamics of mosquito gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), E2173-E2181 (2013).
  24. Zhao, W. L., et al. Methoprene-tolerant 1 regulates gene transcription to maintain insect larval status. Journal of Molecular Endocrinology. 53 (1), 93-104 (2014).
  25. Mangelsdorf, D. J., et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83, 835-839 (1995).
  26. Bate, M., Martinez Arias, A. Hormones and Drosophila development. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 899-939 (1993).
  27. Watts, M. M., Pascoe, D., Carroll, K. Chronic exposure to 17a-ethinylestradiol and bisphenol A-effects on development and reproduction in the freshwater invertebrate Chironomus riparius (Diptera: chironomidae). Aquatic Toxicology. 55, 113-124 (2001).
  28. Atli, E. The effects of dibutyl phthalate (DBP) on the development and fecundity of Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 93, 164-171 (2010).
  29. Atli, E. The effects of three selected endocrine disrupting chemicals on the fecundity of fruit fly, Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 9, 433-437 (2013).
  30. Gu, W., Xie, D. J., Hou, X. W. Toxicity and estrogen effects of methylparaben on Drosophila melanogaster. Food Science. 30, 252-254 (2009).
  31. Liu, T., Li, Y., Zhao, X., Zhang, M., Gu, W. Ethylparaben affects lifespan, fecundity, and the expression levels of ERR, EcR and YPR in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 71, 1-7 (2014).
  32. Chen, Q., Pan, C., Li, Y., Zhang, M., Gu, W. The Combined Effect of Methyl- and Ethyl-Paraben on Lifespan and Preadult Development Period of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 1-8 (2016).
  33. Cao, H., Wiemerslage, L., Marttila, P. S., Williams, M. J., Schioth, H. B. Bis-(2-ethylhexyl) Phthalate Increases Insulin Expression and Lipid Levels in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 119, 309-316 (2016).
  34. Bovier, T. F., Rossi, S., Mita, D. G., Digilio, F. A. Effects of the synthetic estrogen 17-α-ethinylestradiol on Drosophila T melanogaster: Dose and gender dependence. Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 625-632 (2018).
  35. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147, 433-437 (1982).
  36. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and non- monotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33, 378-455 (2012).
  37. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Mini Review: Drosophila melanogaster as a Promising Model Organism in Toxicological Studies. Archives of Basic and Applied. 1, 33-38 (2013).
  38. Yesilada, E. Genotoxic Activity of Vinasse and Its Effect on Fecundity and Longevity of Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 63, 560-566 (1999).
  39. Atli, E., Ünlü, H. The effects of microwave frequency electromagnetic fields on the fecundity of Drosophila melanogaster. Turkish Journal of Biology. 31, 1-5 (2007).
  40. Flatt, T., Tu, M., Tatar, M. Hormonal pleiotropy and the juvenile hormone regulation of Drosophila development and life history. BioEssays. 27, 999-1010 (2005).
  41. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental Toxicity Assays Using the Drosophila Model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1-27 (2015).
  42. Fletcher, J. C., Burtis, K. C., Hogness, D. S., Thummel, C. S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone. Development. 121, 1455-1465 (1995).
  43. Giordano, E., Peluso, I., Senger, S., Furia, M. minifly, A Drosophila Gene Required for Ribosome Biogenesis. The Journal of Cell Biology. 144 (6), 1123-1133 (1999).
  44. Tower, J., Arbeitman, M. The genetics of gender and life span. The Journal of Biology. 8, 38 (2009).
  45. Digilio, F. A., et al. Quality-based model for Life Sciences research guidelines. Accreditation and Quality Assurance. 21, 221-230 (2016).
  46. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. Journal of Insect Physiology. 47, 1301-1307 (2001).
  47. Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (71), e50068 (2013).
  48. Weltje He, Y., Jasper, H. Studying aging in Drosophila. Methods. 68, 129-133 (2014).

Tags

Utvecklings bio logi Drosophila melanogaster kemikalier för hormonstörande ämnen fruktsamhet fertilitet utveckling livs längd
Metoder för att testa endokrina störningar i <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovier, T. F., Cavaliere, D.,… More

Bovier, T. F., Cavaliere, D., Colombo, M., Peluso, G., Giordano, E., Digilio, F. A. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59535, doi:10.3791/59535 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter