Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

A في فيفيفو نقص الإستروجين نموذج الماوس لفحص علاجات الإستروجين الخارجية من خلل القلب والأوعية الدموية بعد انقطاع الطمث

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/59536
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute of Medicinal Plant Development (IMPLAD), Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Shandong University of Traditional Chinese Medicine

Summary

سريريا, نقص الإستروجين في النساء في سن اليأس قد تفاقم حدوث اضطراب الدهون وتصلب الشرايين. أنشأنا نموذج نقص الإستروجين في الجسم الحي عن طريق استئصال المبيض الثنائي عن طريق شق مزدوج الظهر الجانبي في apoE-/- الفئران. نموذج الماوس ينطبق على فحص علاجات الإستروجين الخارجية من خلل القلب والأوعية الدموية بعد انقطاع الطمث.

Abstract

النساء بعد سن اليأس أكثر عرضة للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية من النساء قبل سن اليأس. الفئران الإناث المبيضين (OVX) في عرض الوهن زيادة الآفات تصلب الشرايين في الأبهر مقارنة مع الفئران الإناث مع وظيفة المبيض سليمة. ومع ذلك، تفتقر النماذج المختبرية التي تنطوي على الفئران التي تعاني من نقص الإستروجين مع حالة عرضة لتصلب الشرايين. هذا العجز أمر بالغ الأهمية لأن نقص الإستروجين السريري في النساء في سن اليأس قد تفاقم حدوث اضطراب الدهون الموجودة من قبل أو الجارية وتصلب الشرايين. في هذه الدراسة، نقوم بإنشاء نموذج ماوس في الجسم الحي ناقص الإستروجين عن طريق استئصال المبيض الثنائي عن طريق شق مزدوج الظهر الجانبي في apolipoprotein E (apoE)-/- الفئران. ثم نقارن آثار 17β-استراديول والزائفة (PPD) (فيتوستروجين) تدار بشكل حول المحيط بالعين البورعنا عن طريق انتشار البندق. نجد أنه على الرغم من أن PPD يمارس بعض التأثير على الحد من وزن الجسم النهائي والبلازما TG في OVX apoE-/- الفئران، لديها قدرات مضادة للتصلب الشرايين والقلب واقية مقارنة مع نظيره 17β-استراديول. PPD هو فيتوستروجين التي تم الإبلاغ عنها لممارسة خصائص مضادة للورم. وهكذا، فإن الطريقة المقترحة تنطبق على فحص phytoestrogens عن طريق الإدارة البرفيلة لتحل محل العلاج بالهرمونات البديلة التقليدية في النساء بعد سن اليأس، والتي أفيد أن لديها يحتمل أن تكون ضارة الورم القدرات. إدارة البيروال عن طريق انتشار البندق غير الغازية، مما يجعلها قابلة للتطبيق على نطاق واسع لكثير من المرضى. تحتوي هذه المقالة على المظاهرات خطوة بخطوة من استئصال المبيض الثنائي عن طريق شق مزدوج الظهرالجانبي في أبو-/- الفئران وperoral 17β-استراديول أو استبدال هرمون الإستروجين النباتي عن طريق انتشار البندق. تتبع تحليلات وظيفة الدهون في البلازما والقلب والأوعية الدموية باستخدام تخطيط صدى القلب.

Introduction

وقد أظهرت الدراسات الوبائية والسريرية أن النساء بعد سن اليأس هي في خطر أكبر بكثير من أمراض القلب والأوعية الدموية من النساء قبل سن اليأس1،2. العلاج بالهرمونات البديلة (HRT) قد يقلل من المخاطر النسبية لأمراض القلب والأوعية الدموية إلى 0.37-0.793. من بين المضاعفات الأخرى، تصلب الشرايين الناجمعن أمراض القلب والأوعية الدموية هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم4. ومع ذلك، تفتقر النماذج المختبرية التي تنطوي على الفئران التي تعاني من نقص الإستروجين التي تعرض حالة عرضة لتصلب الشرايين. يوفر هذا البروتوكول في الجسم الحي نقص الإستروجين نموذج الماوس لفحص علاجات الإستروجين الخارجية من خلل القلب والأوعية الدموية بعد انقطاع الطمث.

الدراسات السابقة تبين أن تطبيق OVX في القوارض تصلب الشرايين تغذية نظام غذائي عالي الكولسترول يمكن أن يحاكي النساء بعد سن اليأس الذين يعانون من تصلب الشرايين5،6،7،8. نموذج حيواني قابل للاستنساخ ومريحة تشبه حالة تصلب الشرايين في النساء في سن اليأس هو أساس أبحاث الإستروجين الخارجية. هنا، تم تطبيق شق مزدوج الظهرالجانبي من استئصال المبيض الثنائي في تصلب الشرايين المعرضة للتصلب apolipoprotein E بالضربة القاضية (apoE-/-) الفئران9،10. بالمقارنة مع شق في البطن الأوسط أو الظهري، شق الظهرية الجانبية المزدوجة هو أسهل، وسيلة أقل استهلاكا للوقت التي يمكن تجنب التصاق تجويف البطن الشديد والتهاب. إدارة بيروال عن طريق انتشار البندق (انظر جدولالمواد) غير الغازية ومريحة، مما يجعلها قابلة للتطبيق على نطاق واسع كأسلوب إدارة على المدى الطويل11. بطيئة الإفراج عن زرعبيليه هو أيضا شعبية 6. ومع ذلك، قد تؤدي الغرسات إلى تفاقم حدوث العدوى خاصة في الفئران التي تتعرض لـ OVX. وسائط الإدارة غير الغازية الأخرى، مثل اللقاحات عن طريق الفم وإدارة المياه، لديها أيضا العديد من العيوب. عادة ما الإجهاد اللقاحات عن طريق الفم الفئران ويمكن أن يسبب إصابة المريء. إدارة الهرمون عن طريق مياه الشرب مفيد للغاية; ومع ذلك، فإن إضافة DMSO كمستحلب أمر لا مفر منه كما الإستروجين الخارجية غير قابلة للذوبان في الماء. هنا, اخترنا peroral 17β-استراديول أو استبدال هرمون الإستروجين النباتي عن طريق انتشار البندق للإدارة على المدى الطويل.

في الآونة الأخيرة، تم الطعن في التأثير المفيد لHRT على نظام القلب والأوعية الدموية للنساء بعد سن اليأس في التجارب مبادرة صحة المرأة (WHI)12. من ناحية, الإستروجين الخارجية وحدها تمارس تأثير مفيد على نظام القلب والأوعية الدموية; من ناحية أخرى, فإنه يمكن الجمع بين مع خلات metohydroxyprogesterone لزيادة خطر أحداث القلب والأوعية الدموية. وبشكل أكثر خطورة، HRT قد يؤدي إلى تطور ورم الثدي والرحم، وهذا التأثير قد حد بشكل ملحوظ استخدامه13،14. وقد تركز المزيد من الاهتمام على الآثار الواقية للقلب والأوعية الدموية من هرمون الاستروجين الخارجي تفتقر إلى النشاط الميتوتيك في الخلايا السرطانية15,16,17. دراسات متعددة في البشر والحيوانات تشير إلى أن phytoestrogens مع هياكل مماثلة لتلك التي من هرمون الاستروجين يمكن أن تلعب دورا مفيدا في حماية القلب والأوعية الدموية15,18.

وهكذا، فإن أهداف العمل الحالي هي '1' بناء نموذج الماوس نقص الإستروجين في الجسم الحي عن طريق استئصال المبيض الثنائي عن طريق شق مزدوج الردور الجانبي في apoE-/- الفئران و '2' لمقارنة الآثار الواقية القلب والأوعية الدموية من قبل الجميع تدار 17β-استراديول والزائفة (PPD)، عن طريق انتشار البندق. 17β-استراديول هو نوع واحد من الإستروجين الخارجي الذي ينتمي إلى الهرمونات الجنسية الأنثوية6,11,19. PPD, الصابونين الستيرويد وphytoestrogen من النباتات Dioscorea, وقد أفيد سابقا لممارسة خصائص مضادة للورم20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات المتعلقة برعاية الحيوانات والبروتوكولات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة للأكاديمية الصينية للعلوم الطبية وكلية الطب في اتحاد بكين (إذن رقم: SYXK (بكين) 2013-0023). أصل apoE-/- الفئران هو C57BL/6J9،10.

1. استئصال المبيض الثنائي عن طريق شق مزدوج الظهرية الجانبية في apoE-/- الفئران

  1. في الوض (العمر 28 يوما)، والتخدير الإناث apoE-/- C57BL/6J الفئران مع avertin (ثلاثي البروم الإيثانول؛ 200 ملغ / كغ؛ داخل اقصاق).
    ملاحظة: تم تقسيم 32 apoE-/- الفئران عشوائياً إلى 4 مجموعات: الشام، OVX، OVX/E2، ومجموعة OVX/PPD (n = 8 لكل مجموعة).
  2. وضع الحيوان في موقف عرضة على وسادة التدفئة. تطبيق زيوت التشحيم العين لحماية العين أثناء التخدير.
  3. الحفاظ على درجة حرارة الجسم في غضون 36 ± 0.5 درجة مئوية. إدارة 5 مغ/كغ وزن الجسم من carprofen مسكن تحت الجلد إلى الجانب الجانبي من عنق الماوس.
  4. حلاقة 3 × 5 سم2 منطقة الماوس cephalic من قمة الحرقفي. قبل تغطية الحيوان مع ورقة جراحية 3 × 5 سم2 فتحة، وتنظيف المنطقة حلق تماما مع اليود ثم 70٪ الإيثانول. استخدام الأدوات المعقمة والقفازات أثناء التجربة.
  5. استخدام مقص وملقط لجعل شق 1 سم الجانبية إلى خط الوسط و 1 سم الجانبية إلى الأضلاع كوستال.
  6. تشريح بصراحة الأنسجة تحت الجلد باستخدام ملقط.
  7. استخدام نظارات تشريح (انظر جدولالمواد) لتحديد الأنسجة الدهنية البيضاء في تجويف البطن.
  8. استخدام مقص دقيق وmicroforceps لجعل شق 0.5-1 سم من خلال اللفافة حتى يتم الوصول إلى تجويف البطن.
    ملاحظة: للمجموعة التي تعمل بالشام، أغلق الجروح مباشرة. خياطة طبقة العضلات والجلد بشكل منفصل باستخدام خياطة حيدة.
  9. عندما يمكن رؤية الأنسجة الدهنية البيضاء في تجويف البطن، والاستيلاء على الأنسجة الدهنية باستخدام microforceps وسحب بلطف بها. يمكن رؤية المبيض الوردي على شكل التوت ملفوفة بأنسجة الدهنية في تجويف البطن.
  10. قم بإنزال الأوعية القريبة من 0.5-1 سم وقرن الرحم باستخدام خياطة حيدة. إزالة المبيض باستخدام مقص صغير ووضع الأنسجة المتبقية مرة أخرى في تجويف البطن.
    ملاحظة: الأعراض السلبية الرئيسية لعملية OVX هو ربط الحالب الذي يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات في الفئران التي تعمل بـ OVX. ويمكن تجنب ذلك عن طريق تحديد الأنسجة باستخدام الغبطة تشريح.
  11. أغلق الجروح خياطة طبقة العضلات والجلد بشكل منفصل باستخدام خياطة حيدة.
  12. استخدام مقص وملقط لجعل شق آخر 1 سم الجانبية إلى خط الوسط و 1 سم الجانبية إلى الأضلاع الساحلية على الجانب الآخر. كرر الإجراء أعلاه (1.5 إلى 1.11).
  13. دع الحيوان يستيقظ من التخدير. الاحتفاظ بالماوس بشكل منفصل في اليوم الأول بعد الجراحة.
  14. تنظيف أو استبدال القفص في كثير من الأحيان خلال مرحلة الانتعاش.
  15. ما يقرب من 24 ساعة بعد الجراحة، وإدارة آخر 5 ملغ / كغ من وزن الجسم من carprofen مسكن تحت الجلد.

2. إدارة بيروال من 17β-استراديول أو PPD عن طريق انتشار البندق

  1. إذابة 17 β-استراديول أو PPD في زيت السمسم، ثم اخلط زيت السمسم مع انتشار البندق (انظر جدولالمواد). جزء يومي لكل 30 غرام ماوس يحتوي على 3 ميكروغرام من 17β-استراديول أو 15 ميكروغرام من PPD، 4 ميكرولتر من زيت السمسم، و 60 ملغ من انتشار البندق. إعداد وهمي لكل 30 غرام الماوس يحتوي على 4 ميكرولتر من زيت السمسم و 60 ملغ من انتشار البندق.
    ملاحظة: ويستند الجزء الإداري اليومي من 17β-استراديول أو PPD على الدراسات السابقة6و11 والتجارب الأولية.
  2. بعد أسبوع واحد من OVX، تغذية الفئران مع اتباع نظام غذائي عالي الكولسترول (1.25٪ الكولسترول، 0٪ cholate) لمدة 12 أسبوعا. ويتضح في الشكل 1مخطط علاجي تجريبي نموذجي، كما هو مستخدم في هذه الدراسة.
  3. قبل 5 أيام من انتشار البندق في الأسبوع 4، تدريب الفئران لتناول الدواء الوهمي الذي يحتوي على ما يقرب من 30 ملغ انتشار البندق لمدة 2-5 الفئران لمدة 5 أيام. تدريب الفئران في مجموعات في أقفاص منازلهم خلال الأيام الثلاثة الأولى. وضع الفئران في أقفاص منفصلة في اليومين الرابع والخامس من التدريب وخدمة الجزء اليومي لتشبه الوضع التجريبي.
  4. خلال الأسابيع ال9 الماضية، ضع الفئران في أقفاص منفصلة ثم يقدم جزء ًا يوميًا من جزء انتشار البندق لكل مناسبة تغذية.
    ملاحظة: تقديم جزء يومي يحتوي على 17β-استراديول (0.1 ملغ·كغ-1)أو PPD (0.5 ملغ·كغ-1)عن طريق انتشار البندق في مجموعة OVX/E2 وOVX/PPD على التوالي؛ خدمة جزء يومي يحتوي على انتشار البندق خالية من الهرمونات في شام ومجموعة OVX.

3. تحديد سمك Intima-وسائل الإعلام وخلل القلب باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية

  1. الفحص المجهري الحيوي فائق السونوغرافيا
    1. قبل يوم واحد من الإنهاء، فحص سمك intima-وسائل الإعلام وخلل القلب باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية الدقيقة (انظر جدولالمواد) كما سبق وصفه21.
    2. قبل الفحص، إعطاء كل فأر حقن ة داخل الستابية 200 ملغ/كغ من avertin (ثلاثي بروموإيثانول) كتخدير (ن = 8 فئران لكل مجموعة).
    3. حلاقة شعر الرقبة من كل فأر بعناية. تطبيق هلام انتقال الموجات فوق الصوتية الدافئة بحرية لضمان جودة الصورة المثلى.
    4. احصل على صور أحادية الخط فائقة السونوغرافيا للجذر الأبهري والأبهر الصاعد مع رأس المسح الضوئي 30 ميغاهرتز عند تركيز 12.7 مم ودقة 40 ميكرومتر.
    5. استخدام تخطيط القلب الكهربائي مع تكوين الرصاص الثاني للرصد.
    6. التقاط الصور اليمنى ذات المحور الطويل للأبهر الصاعد، والقوس الأبهري، وفرع الشريان البشوقفي فيمستوى واحد في systole (الشكل 3).
  2. قياسات من [إينتيما-مديا] و [مإكسلل] لوح سماكة
    1. ضبط المسافة بين محول والموقع الشرياني بسهولة للحصول على صور واضحة.
    2. تخزين حلقة السينما 10 s رقميا لفحص حاليا على نظام تحليل الصور.
    3. اختر صورة فائقة الموجات فوق الصوتية مثالية للتجميد يدويًا لمزيد من القياسات. تحقق من الصور في انحناء طفيفة من الأبهر الصاعد. إذا كان يمكن رؤية البلاك في الأبهر الصاعد، وقياس سمك البلاك القصوى. إذا كان لا يمكن رؤية اللوحة في الأبهر الصاعد، وقياس الاتصالات المتنقلة الدولية القصوى.
    4. قياس الاتصالات المتنقلة الدولية (المسافة بين واجهة الأوعية الدموية الإنارة والواجهة الوسيطة- السبتية). قياس سمك البلاك القصوى (المسافة الأكثر سمكا بين حدود تجويف الأوعية الدموية والطبقة السبتية).
    5. متوسط البيانات من ثلاثةمواقع الآفات (الشكل 3).
  3. تحديد خلل القلب باستخدام تخطيط صدى القلب
    ملاحظة:     فحص وظيفة القلب من خلال تخطيط صدى القلب باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية الدقيقة، كما سبق وصفه22.
    1. توجيه شعاع الموجات فوق الصوتية نحو القلب، بالقرب من العضلات الشعرية.
    2. تحقيق ثنائي الأبعاد تخطيط القلب القائم على كيلوهرتز التصور.
    3. أداء في الجسم الحي عبر الصدر تخطيط صدى البطين الأيسر باستخدام رأس المسح الضوئي 30 ميغاهيرتز.
    4. قياس المعلمات المرتبطة وظيفة القلب رقميا من تتبع وضع M.
    5. متوسط البيانات من ثلاث إلى خمسدورات القلب (الجدول 1).
  4. التباين داخل المراقبين وداخلهم
    1. للتحقق من التباين داخل المراقبين، قم بتحليل البيانات من قبل عامل تشغيل واحد في مناسبتين مختلفتين.
    2. لتقييم التباين بين المراقبين، قم بتحليل البيانات من قبل مشغل مختلف.

4. قياس وزن الجسم الأسبوعي والبلازما مجموع الكوليسترول (TC) والدهون الثلاثية (TG) تحديد

  1. قياس وزن الجسم الأسبوعي
    1. قياس أوزان الجسم مرة واحدة في الأسبوع من الأسبوع -1 إلى الأسبوع 12.
      ملاحظة: n = 8 فئران لكل مجموعة.
  2. إعداد البلازما
    1. قبل جمع عينات الدم من خلال ثقب داخل القلب، وإعداد المحاقن والأنابيب. استخدام EDTA كمضاد للتخثر. إضافة 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA إلى كل حقنة 2 مل، وإضافة 8 ميكرولتر من 0.5 M EDTA إلى كل أنبوب 1.5 مل.
    2. في الأسبوع 12، بعد الصيام بين عشية وضحاها، والتخدير الفئران مع avertin (ثلاثي البروم الإيثانول؛ 200 ملغ / كغ؛ داخل اقحام).
      ملاحظة: n = 3 فئران لكل مجموعة.
    3. إعداد منطقة الصدر البطني مع الإيثانول 70٪.
    4. استخدام مقص وملقط لفتح تجويف الصدر وقطع الأضلاع حتى يتعرض القلب النابض.
    5. أدخل إبرة 25 G في البطين الأيمن. يستنشق ببطء حتى يبدأ الدم في التدفق إلى الحقنة.
      ملاحظة: نحن نستخدم المحاقن التي يمكن التخلص منها في حالة معقمة مع إبر G 25 (انظر جدولالمواد).
    6. استمر في الإستنكب مع الضغط المستمر، وحتى. إذا لم يتم رؤية أي دم، تغيير موضع الإبرة وتكرار الطموح.
    7. الحفاظ على الفئران التخدير العميق قبل جمع حجم الدم المطلوب. عادة، يمكن جمع ما يصل إلى 1 مل من الدم. قتل الفئران عن طريق خلع عنق الرحم تحت هذه الحالة المخدرة العميقة.
    8. عينات الدم ماصة في أنابيب 1.5 مل وعكس الدم تماما لضمان خلط EDTA في الدم. ثم وضع عينات الدم على الجليد على الفور.
    9. عينات الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 400 × ز في 4 درجة مئوية في غضون 30 دقيقة من جمع.
    10. جمع supernatant بعناية. Aliquot وتخزين عينات البلازما في -80 درجة مئوية.
  3. إنشاء منحنيات قياسية لقياس محتوى TC أو TG
    1. بالنسبة لمنحنى TC القياسي، قم بإعداد تركيزات مختلفة من معايير الكوليسترول في الدم: 0 مليمول/لتر، 0.52 مليمول/لتر، 1.03 مليمول/لتر، 2.07 مل/لتر، 4.14 مليمول/لتر، 6.20 مليمول/لتر، 8.27 مليمول/لتر و10.34 مليمول/لتر. تعيين متوسط O.D. لكل معيار الكولسترول. كقيمة المحور العمودي (ص)، قم بتعيين التركيز كقيمة المحور الأفقي (X). إنشاء منحنى قياسي باستخدام برنامج إحصائي.
    2. بالنسبة للمنحنى القياسي TG، قم بإعداد تركيزات مختلفة من معايير TG: 0 مليمول/لتر، 0.45 مليمول/لتر، 0.90 مليمول/لتر، 1.81 مل/لتر، 3.62 مليمول/لتر، 5.42 مليمول/لتر، 7.23 مل/لتر و9.04 مل/لتر. تعيين متوسط O.D. لكل معيار TG كقيمة المحور العمودي (Y) ; تعيين التركيز كقيمة المحور الأفقي (X). إنشاء منحنى قياسي باستخدام برنامج إحصائي.
      ملاحظة: وقد استُخدم في هذه الدراسة تركيب منحنى لوجستي رباعي المعلمات (4-pl) في بناء المنحنى القياسي. تحقق من المنحنى القياسي قبل قياس عينات البلازما وتأكد من أن r2 أكبر من 0.995.
  4. قياس محتوى TC
    1. تسمية زجاجة من الكاشف اللون (25 مل) من TC اختبار عدة باسم "TC حل العمل".
    2. دوامة العينات المبردة لفترة وجيزة. إعداد التخفيفات: 20 ميكرولتر من البلازما في 80 ميكرولتر من الماء المقطر. لفترة وجيزة دوامة تخفيفات.
    3. إضافة 2.5 ميكرولتر من معايير الكوليسترول (5.17 مليمول / لتر) أو 2.5 ميكرولتر من البلازما المخففة أو 2.5 ميكرولتر من الماء المقطر (فارغة) إلى الآبار المناسبة من لوحة 96 جيدا. يوصى بثلاثة أضعاف.
    4. إلى جميع الآبار، إضافة 250 درجة مئوية من الكاشف اللون.
    5. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    6. تشغيل قارئ ميكروبليت والسماح للتسخين 10 دقيقة.
    7. إزالة لوحة (ق) من الحاضنة وقراءة قارئ ميكروبليت في 510 نانومتر. تأكد من عدم وجود فقاعات أو غبار في آبار ميكروتيدر أو في الجزء السفلي من اللوحة، على التوالي.
    8. حساب تركيز TC على النحو التالي:
      TC cont. = معايير الكوليسترول في الدم cont. × (عينة البلازما O.D.-فارغة O.D)/ (معايير الكوليسترول O.D.-فارغة O.D)
  5. قياس محتوى TG
    1. تسمية زجاجة من الكاشف اللون (25 مل) من TG اختبار عدة باسم "TG حل العمل".
    2. دوامة العينات المبردة لفترة وجيزة.
    3. إضافة 2.5 ميكرولتر من معايير TG (2.26 مليمول/لتر) إلى أو 2.5 ميكرولتر من البلازما المخففة أو 2.5 ميكرولتر من الماء المقطر (فارغ) إلى الآبار المناسبة للوحة 96 بئر. يوصى بثلاثة أضعاف.
    4. إلى جميع الآبار، إضافة 250 درجة مئوية من الكاشف اللون.
    5. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    6. تشغيل قارئ ميكروبليت والسماح للتسخين 10 دقيقة.
    7. إزالة لوحة (ق) من الحاضنة وقراءة قارئ ميكروبليت في 510 نانومتر.
      ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات أو غبار في آبار ميكروتيدر أو في الجزء السفلي من اللوحة.
    8. حساب تركيز TG على النحو التالي:
      TG cont. = TG المعايير cont. × (عينة البلازما O.D.-فارغة O.D) / (TG المعايير O.D.-فارغة O.D)

5. تحليل الوجه من الآفات الأبهري تصلب الشرايين

  1. عزل وختان الأبهر
    1. في الأسبوع 12، بعد الصيام بين عشية وضحاها، والتخدير الفئران مع avertin (ثلاثي البروم الإيثانول؛ 200 ملغ / كغ؛ داخل اقحام). قتل الفئران عن طريق خلع عنق الرحم تحت هذه الحالة المخدرة العميقة.
      ملاحظة: استخدمنا 3 فئران لكل مجموعة.
    2. إعداد منطقة الصدر البطني مع الإيثانول 70٪. استخدام مقص وملقط لفتح تجويف الصدر وقطع الأضلاع حتى يتعرض القلب النابض.
    3. ملء حقنة 50 مل مع الفوسفات المخزنة المالحة في الحموضة 7.4 (انظر جدولالمواد). أدخل 25 غ من الإبرة في البطين الأيسر واقطع الأذين الأيمن لتجنب الضغط العالي من التسريب.
    4. أداء التسريب في الموقع بمعدل تدفق من 0.05-0.08 مل / دقيقة.
    5. إزالة الأضلاع والرئتين في تجويف الصدر مع مقص وملقط. ثم، فتح تجويف البطن وإزالة الأعضاء داخل لعرض أفضل من الشريان الأبهري.
    6. إزالة الأبهر عن طريق عقد القلب مع microforceps وفصل الأبهر من الظهرية العمود الفقري مع microscisssors حتى الانقسام الحرقفي.
      ملاحظة: عند تشريح بالقرب من الفروع الأذينية الكلوية، قطع بعمق باستخدام مقص صغير لتجنب تلف الأبهر.
    7. إصلاح القلب والأبهر لمدة 48 ساعة في 4٪ بارافورماليدهايد. تخزين الأبهر في المالحة في درجة حرارة الغرفة أو في 2-8 درجة مئوية لبضع ساعات.
      ملاحظة: هذا الإجراء سوف يسهل التنظيف.
  2. إعداد الأبهر
    1. إزالة القلب. إزالة بعناية الأنسجة السبتية من الأبهر باستخدام microforceps وmicroscissorss تحت مجهر مجسم. استخدام المالحة للحفاظ على الأنسجة رطبة أثناء التنظيف.
      ملاحظة: كن حذراً من عدم المسيل للدموع أو شق الشريان الأبهر وبعض الفروع الهامة، مثل الشريان innominat، غادر الشريان السباتي المشترك، والشريان تحت الترقوة الأيسر.
    2. اترك 1 مم من الشرايين السباتية الشائعة وتتركها وتقطع الشريان تحت الترقوة الأيسر بأكمله.
    3. قطع انحناء الخارجي من خلال الشريان الداخلي، ثم إلى الشريان السباتي الشائع الأيسر، ثم إلى الشريان تحت الترقوة الأيسر.
    4. قطع مفتوحة على طول انحناء الداخلية للجزء التصاعدي إلى الجزء السفلي من الجزء البطني.
    5. ضعي الأبهر المسطح على ورقة بلاستيكية سوداء وطبقي ملحًا للحفاظ على الأبهر من التجفيف.
  3. صورة للمنطقة الألفة من الأبهر
    1. التقاط صور من الأبهر الوجه مع المجهر ستيريو. قم بتضمين مسطرة مقياس ملليمتر في الصور لمعايرة القياسات.
    2. إدراج مناطق القوس والصدر في نفس الصورة ومنطقة البطن في آخر. حفظ الصور كـ JPEG أو TIFF.
      ملاحظة: المنطقة القوسية هي من تقاطع عضلة القلب إلى 3 مم القاصي من الشريان تحت الترقوة الأيسر، والمنطقة الصدرية هي 3 ملم من البعد إلى الشريان تحت الترقوة الأيسر إلى الشريان الوربي الأخير، ومنطقة البطن هي الشريان الأوربي الأخير إلى الإليافية التشعب.
  4. قياس كمية من طريقة الوجه الآفة تصلب الشرايين
    1. المعايره
      1. افتح الصورة باستخدام برنامج تحليل الصور (راجع جدولالمواد)، انتقل إلى المعايرة المكانية واتبع التعليمات.
      2. تغيير الوحدات المرجعية إلى مم عن طريق وضع المسطرة فوق الخط.
    2. قياس
      1. تعيين المعايرة الصحيحة لكل صورة.
      2. قياس 3 ملم على المسطرة.
      3. قياس القوس والمنطقة الصدرية: قم بتخطيط المنطقة القوسية من تقاطع عضلة القلب إلى 3 مم من الشريان تحت الترقوة الأيسر والمنطقة الصدرية من 3 مم إلى الشريان تحت الترقوة الأيسر إلى الشريان الأوربي الأخير. تتبع الآفات في منطقة القوس والصدر وننظر إلى الأبهر من خلال المجهر.
      4. قياس منطقة البطن: مخطط منطقة البطن من نهاية المنطقة الصدرية إلى الانقسام الحرقفي. تتبع الآفات في منطقة البطن وننظر إلى الشريان الأبهري من خلال المجهر.
      5. حساب منطقة الآفة بالنسبة إلى السطح الداخلي للأبهر.
      6. تحقق من القياس الكمي من خلال مراقب ثان أعمى للجان الدراسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويتضح في الشكل 1مخطط علاجي تجريبي نموذجي، كما هو مستخدم في هذه الدراسة. في الوض (العمر 28 يوماً)، تم التخدير الإناث apoE-/- C57BL/6J الفئران معavertin (ثلاثي بروموثانول؛ 200 ملغ /كغ؛ داخل اقبية). كانت الفئران ثنائيا OVX أو الشام تعمل من خلال شق الظهر 1 سم. بعد أسبوع واحد من OVX الثنائية، تم تغذية الفئران اتباع نظام غذائي عالي الكوليسترول (1.25٪ الكولسترول، 0٪ cholate) لمدة 12 أسبوعا. 17β-استراديول (0.1 ملغ ·كغ-1)أو PPD (0.5 ملغ ·كغ-1)كان تدار بشكل مبيّر بالتوازي عن طريق انتشار البندق خلال الأسابيع ال9 الأخيرة من العلاج. جميع الفئران كانت تزن أسبوعيا. كما هو مبين في الشكل 2, تم تقييم آثار كل من هرمون الاستروجين الخارجي (17β-استراديول وPPD) على الدهون في البلازما ووزن الجسم الأسبوعي للفئران apoE-/- بعد نقص الإستروجين. بعد 12 أسبوعا من اتباع نظام غذائي عالي الكولسترول، أظهرت الفئران OVX زيادة ملحوظة في تركيزات TC البلازما وTG. الفئران OVX تدار بشكل حول يبذير مع 17β-استراديول أو PPD عن طريق انتشار البندق أظهرت تركيزات TC البلازما أقل بكثير من الفئران التي تعمل بالشام (الشكل2A). انخفضت مستويات TG البلازما في الفئران OVX تدار بشكل حول يبج مع 17β-استراديول ولكن ليس مع PPD (الشكل2B). كما هو مبين في الشكل 2C، في حين لوحظ ميل نحو زيادة وزن الجسم (BW) في الفئران OVX مقارنة مع الفئران التي تعمل بالشام، BW في الفئران OVX تدار بشكل عمودي مع 17β-استراديول أو PPD عن طريق انتشار البندق بعد اتباع نظام غذائي عالي الكولسترول وأظهرت اتجاها عكس ذلك في الفئران OVX. ومع ذلك، فإن الوزن النهائي للفئران في مجموعات مختلفة لم تظهر أي تغييرات كبيرة.

تم تقييم وظيفة القلب والأوعية الدموية باستخدام تخطيط صدى القلب. كما هو مبين في الشكل 3، تم قياس البلاك الأقصى أو IMT من الأبهر الصاعد في الفئران OVX تدار بشكل حول يبذير مع 17β-استراديول أو PPD عن طريق انتشار البندق. وقد لوحظ القوس الأبهري من ارتفاع الكولسترول الغذائي تغذية apoE-/- الفئران من قبل تخطيط القلب B.. تم التقاط الصور الطولية التمثيلية للأبهر الصاعد بواسطة الفحص المجهري الحيوي فائق السونوغرافيا. تشير الأسهم الحمراء إلى اللوحات. وأظهرت الفئران OVX زيادة البلاك القصوى أو IMT من الأبهر الصاعد مقارنة مع الفئران التي تعمل شام. بعد إعطاء البلوري من 17β-استراديول أو PPD عن طريق انتشار البندق، لوحة قصوى أو IMT من الأبهر الصاعد انخفض بشكل ملحوظ بالمقارنة مع أن من الفئران OVX. (الشكل3). كما لاحظنا خلل القلب استجابة لOVX في apoE-/- الفئران بعد 12أسبوعا تغذية عالية الكولسترول النظام الغذائي (الجدول 1). تم فحص وظيفة القلب من خلال تخطيط صدى القلب. في الفئران OVX، يمكن أن الإدارة البلوريل من 17β-استراديول أو PPD عن طريق انتشار البندق تخفيف المعلمات جزئيا تظهر خلل القلب.

بعد ذلك، استخدمنا تحليل الوجه لتحديد الآفات الأبهرية. كما ذكر سابقا، بعد 12 أسبوعا، أدى اتباع نظام غذائي عالي الكولسترول إلى تشكيل البلاك تصلب الشرايين على السطح الإنارة من الأبهر. كما هو مبين في الشكل 4، ارتفع متوسط النسبة المئوية لمنطقة الآفة الأبهرية بالنسبة إلى المنطقة الأبهرية بأكملها زيادة كبيرة في الفئران OVX. بعد إعطاء بيروال مع 17β-استراديول أو PPD عن طريق انتشار البندق، انخفضت منطقة الآفة الأبهرية بشكل ملحوظ بالمقارنة مع نظيره الفئران OVX. هذه النتيجة تتفق مع حماية 17β-استراديول أو PPD من تطوير تصلب الشرايين المعروضة في الشكل 3.

في الختام، فإن الإجراء المقترح، الذي يستخدم استئصال المبيض الثنائي عن طريق شق مزدوج الظهرالجانبي في apoE-/- الفئران، ينطبق على فحص علاجات الإستروجين الخارجية غير الغازية من خلل القلب والأوعية الدموية بعد انقطاع الطمث. كما أنها مفيدة بشكل خاص لتجنب القدرة الضارة الورمية الوراثية.

Figure 1
الشكل 1 نظام معالجة الماوس. في الوض (العمر، 28 يوماً)، تم التخدير الإناث apoE-/- C57BL/6J الفئران مع avertin (ثلاثي بروموثانول؛ 200 ملغ /كغ؛ داخل اقبولة). كانت الفئران ثنائيا المبيض (OVX) أو الشام تعمل من خلال شق الظهر1 سم. بعد أسبوع واحد من OVX، تم تغذية الفئران اتباع نظام غذائي عالي الكوليسترول (1.25٪ الكولسترول، 0٪ cholate) لمدة 12 أسبوعا. 17β-استراديول (0.1 ملغ ·كغ-1)أو PPD (0.5 ملغ ·كغ-1)كان تدار بشكل مبيّر بالتوازي عن طريق انتشار البندق خلال الأسابيع ال9 الأخيرة من العلاج. كل الفئران كانت تزن كل أسبوع في الأسبوع 12، تم تقييم تحليل وظيفة القلب والأوعية الدموية باستخدام تخطيط صدى القلب. بعد 12 أسبوعا من اتباع نظام غذائي عالي الكولسترول، تم قتل جميع الفئران، وتم حصاد عينات الدم والأنسجة لمزيد من التحقيق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 آثار الإستروجين الخارجية المختلفة على الدهون في البلازما ووزن الجسم الأسبوعي في apoE-/- الفئران. خضعت فئران الشام لعملية وهمية وتلقت نظام غذائي عالي الكوليسترول. خضعت فئران OVX لاستئصال المبيض الثنائي ثم قسمت بشكل عشوائي إلى المجموعات التالية: مجموعة OVX، التي عولجت بنظام غذائي عالي الكوليسترول. مجموعة OVX/E2 (17β-estradiol)، التي تلقت نظام غذائي عالي الكوليسترول لمدة 12 أسبوعًا بالإضافة إلى 0.1 ملغم/كغم من E2 من خلال الإدارة البيوروالية عن طريق انتشار البندق خلال الأسابيع الـ 9 الأخيرة من العلاج؛ ومجموعة OVX/PPD، التي تلقت نظام غذائي عالي الكوليسترول لمدة 12 أسبوعا بالإضافة إلى 0.5 ملغ / كغ PPD من خلال إدارة البيوروال عن طريق انتشار البندق لآخر 9 أسابيع من العلاج. تم قياس مستويات الكوليسترول والدهون الثلاثية من البلازما عن طريق الطرق الأنزيمية(A-B). يتم التعبير عن البيانات كوسيلة ± SEM من ن = 5 الفئران لكل مجموعة. تم قياس أوزان الجسم الأسبوعية من الأسبوع-1 إلى الأسبوع 12 (C). يتم التعبير عن البيانات كوسيلة ± SEM من ن = 8 الفئران لكل مجموعة. في اتجاه واحد ANOVA تليها اختبار ما بعد مخصص دونيت أجريت لمقارنات متعددة. *p < 0.05 مقارنة مع مجموعة الشام; # p < 0.05 مقارنة مع مجموعة OVX. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 قياسات سمك البلاك IMT أو اللمعة القصوى في الفئران apoE-/- الفئران. يتم تقديم الصور B-وضع تظهر القوس الأبهري من apoE-/- الفئران. تم الحصول على الصور الطولية للأبهر الصاعد عن طريق الفحص المجهري الحيوي فائق السونوغرافي. تم قياس اللوحة القصوى أو IMT من الأبهر الصاعد (مم). تظهر الصور السونوغرافية البلاك في انحناء طفيف من الأبهر الصاعد. تشير الأسهم الحمراء إلى اللويحات. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM من ن = 8 الفئران لكل مجموعة. في اتجاه واحد ANOVA تليها اختبار ما بعد مخصص دونيت أجريت لمقارنات متعددة. *p < 0.05 مقارنة مع مجموعة الشام; # p < 0.05 مقارنة مع مجموعة OVX. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 تحليل الوجه من الآفات الأبهرية في apoE-/- الفئران. تم تحديد متوسط النسبة المئوية لمنطقة الآفة الأبهرية بالنسبة للمنطقة الأبهرية بأكملها كمياً في جميع المجموعات. وتظهر الميكروغرافيا التمثيلية للآفات التيت من الأبهر . يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM من ن = 3 الفئران لكل مجموعة. في اتجاه واحد ANOVA تليها اختبار ما بعد مخصص دونيت أجريت لمقارنات متعددة. *p < 0.05 مقارنة مع مجموعة الشام; # P < 0.05 مقارنة مع مجموعة OVX. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشام OVX OVX/E2 OVX/PPD
LVIDd (مم) 3.72 ± 0.10 3.74 ± 0. 24 3.68 ± 0.16 3.88 ± 0.16
LVIDs (مم) 2.34 ± 0.11 2.16 ± 0.22 2.12 ± 0.13 2.55 ± 0.12#
IVSd (مم) 0.83 ± 0.09 0.84 ± 0.07 0.91 ± 0.05 0.74 ± 0.06#
IVSs (مم) 1.24 ± 0.02 1.35 ± 0.06* 1.45 ± 0.04# 1.09 ± 0.04#
PWTd (مم) 0.7 ± 0.10 0.68 ± 0.04 0.72 ± 0.07 0.58 ± 0.07#
PWTs (مم) 1.10 ± 0.12 1.17 ± 0.08 1.24 ± 0.04 0.98 ± 0.08#
EDV (مم3) 58.89 ± 3.74 59.88 ± 9.02 57.39 ± 5.79 65.11 ± 6.13
ESV (مم3) 18.86 ± 2.17 15.75 ± 4.00 14.85 ± 2.37 23.45 ± 2.64#
إي أف (بالنسبة المئوية) 67.84 ± 1.52 73.91 ± 3.63* 74.23 ± 1.50 63.91 ± 3.61#
خ م (بالنسبة المئوية) 37.19 ± 1.53 42.22 ± 1.17* 42.36 ± 1.21 34.28 ± 2.69#
LVIDd = قطر LV الداخلي أثناء الديالوة؛ LVIDs = قطر LV الداخلي أثناء systole; IVSd = الحاجز البطيني الداخلي أثناء الديالوة؛ IVSs = الحاجز البطيني الداخلي أثناء systole؛ PWTd = سمك الجدار الخلفي خلال diastole; PWTs = سمك الجدار الخلفي خلال systole; EF = كسر الإخراج; FS = تقصير كسري؛ EDV = حجم الانبساطي النهائي؛ ESV = وحدة التخزين الانقباضية النهائية.

الجدول 1: تقييم وظائف القلب باستخدام تخطيط صدى القلب. تم تحديد المعلمات المرتبطة بوظيفة القلب رقمياً من تتبع النمط M في جميع المجموعات. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM من ن = 8 الفئران لكل مجموعة. في اتجاه واحد ANOVA تليها اختبار ما بعد مخصص دونيت أجريت لمقارنات متعددة. *p < 0.05 مقارنة مع مجموعة الشام; # p < 0.05 مقارنة مع مجموعة OVX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المنهجية الموصوفة هنا هو نموذج الماوس تشبه اضطراب الدهون وتصلب الشرايين ينظر في النساء في سن اليأس. ومن الموثق جيدا أن نقص الإستروجين في النساء بعد سن اليأس يمكن أن تفاقم حدوث ارتفاع الكوليسترول في الدم الموجودة من قبل أو الجارية مع الآفات التصلبية المعقدة تدريجيا وعلى نطاق واسع1. لتقليد حالة تصلب الشرايين المعرضة في العيادة ، تم تطبيق الفئران التي تعاني من نقص في apoE ، وهي مصدر قابل للاستنساخ ومريحة من الحيوانات التي لدراسة atherogenesis23،24،25. كما هو مبين في هذه الدراسة، أظهرت الإناث OVX apoE-/- الفئران في الوهن زيادة في الآفات تصلب الشرايين في الأبهر مقارنة مع الإناث apoE-/- الفئران مع وظيفة المبيض سليمة. في هذا النموذج الحيواني، قارنا أيضا تأثير مختلف العلاجات استبدال الإستروجين الخارجية على حجم الآفة تصلب الشرايين تحت حالة غذائية تسيطر عليها.

الشق المزدوج للدمرحلة الأورسية الجانبية لاستئصال المبيض الثنائي ة الواردة في هذه المقالة أسهل من الناحية الفنية، وأقل استهلاكا ً للوقت، وأكثر أماناً مقارنة بالشق الجانبي الردوري الأوسط أو شق البطن الأوسط لاستئصال المبيض الثنائي في apoE-/- الفئران. يمثل استئصال المبيض الثنائي عن طريق شق البطن الأوسط عيبًا كبيرًا: فقد يسبب تصاقًا شديدًا في تجويف البطن، والذي قد يؤثر بدوره على امتصاص الدواء. وتظهر التقارير الأخيرة أن إعطاء بيروال من جرعة منخفضة 17β-استراديول يحمي ضد نقص التروية الدماغية26. وهكذا، اخترنا الإدارة البيروالية عن طريق انتشار البندق في هذه الدراسة. الكريات التجارية بطيئة الإصدار هي وضع الإدارة المستخدمة في كثير من الأحيان لاختبار الآثار الدوائية في نموذج الماوس ولكن قد يسبب ضررا دماغيا ضارا27. الغرسات عرضة للعدوى، خاصة إذا تعرضت الفئران لـ OVX ثنائي عن طريق شق مزدوج الظهري الجانبي. على الرغم من أن التطهير الدقيق للجلد قبل إجراء الشق الجراحي يتم إجراؤه، فمن الصعب تجنب العدوى. إدارة المياه وgavage عن طريق الفم هما طريقتان أقل استخداما التي تم اختبارها. إدارة الهرمون عن طريق مياه الشرب مفيد للغاية نظراً لكونه غير الغازية للغاية لأنه مطلوب ما يقرب من أي التعامل مع الحيوانات. ومع ذلك، 17β-استراديول غير قابل للذوبان في الماء دون مستحلب. وهكذا، استخدمنا DMSO في تركيز أقل من 0.5٪ لتسهيل حلها في مياه الشرب. ومع ذلك، فإن هذا النهج للإدارة طويلة الأجل لDMSO جرعة منخفضة من الصعب السيطرة والسامة للفئران أو البشر. الفئران قد تشرب أيضا الماء على كامل 24 ساعة من المراقبة، مما يجعل من الصعب تحديد الاستهلاك الفعلي للمخدرات. وثمة عيب آخر في هذا النهج هو أنه من الصعب السيطرة على مدخول الفرد من المياه. العيب الأكبر من اللقاحات عن طريق الفم هو أنه مرهق للالحيوانات، ويمكن أن يسبب إصابة المريء وتؤثر على سلوك الأكل. في المنهجية الموصوفة هنا، تم إجراء تدريب لمدة 5 أيام لتناول البندق خالية من الهرمونات قبل التجربة. ما يقرب من 95٪ من الفئران سوف تقبل انتشار البندق إذا تم تدريبهم كما ذكر في قسم البروتوكول. مرة واحدة معتادة تماما، فإن معظم الفئران تستهلك في غضون ثوان. تمشيا مع دراسة سابقة6،11، انخفضت مستويات البلازما E2 في الفئران OVX مقارنة مع نظيره الشام التي تعمل في الأسبوع 4 (البيانات لم تظهر). في الأسبوع 12 بعد التحديد، لاحظنا ضمور الرحم في الفئران التي تعمل بـ OVX. ومع ذلك, لم يتم رصد مستويات الإستروجين المتداولة بعد OVX في هذه الدراسة.

في غياب الكشف عن الآفات تصلب الشرايين في الأبهر الصاعد، يمكن تقييم الاتصالات المتنقلة الدولية الأبهرية من خلال قياس المسافة بين واجهة التجويف والميل والواجهة الوسيطة- السبتية. ويستند هذا القياس على بروتوكول تم التحقق من صحتها سابقا في البشر28. متوسط البيانات من ثلاثة مواقع التي هي ما يقرب من 100 ميكرومتر بعيدا عن بعضها البعض. يزيد عبء العمل القلبي بعد OVX في apoE-/- الفئران قد يرجع ذلك إلى النمو الضخاميالتعويضي لخلايا القلب الفردية التي قد تؤدي في نهاية المطاف إلى زيادة إنتاج القلب (الجدول 1). في حين، عند إعطاء بيروال من PPD لمدة 9 أسابيع، تم تخفيف تضخم القلب التعويضي مع EF٪ مماثلة لنظيره وهمية. للتحقق من التباين داخل أو فيما بين المراقبين، تحليل معاملات التباين لقياسات سمك تصلب الشرايين والمعلمات المرتبطة بوظيفة القلب من قبل مشغل واحد في مناسبتين مختلفتين أو من قبل مشغل مختلف.

كما هو معروض في دراستنا، الفئران OVX تدار بشكل حول يبصراحة مع 17β-استراديول أو PPD عن طريق انتشار البندق تميل إلى منع زيادة وزن الجسم والحد من نقص الإستروجين المرتبطة باضطراب الدهون، على الرغم من عدم وجود اختلافات كبيرة في وزن الجسم النهائي كانت لاحظ. وقد أظهرت الدراسات السابقة أيضا أن اختلاف المعلمات الدهون قد تكون طفيفة جدا لشرح الآثار المضادة للتصلب الشرايين من الهرمونات29. الآثار المفيدة للاستروجين لا تقتصر على التغيرات في خصائص البروتين الدهني. بعض الآثار غير الدهنية من الإستروجين30،31، مثل التهاب ، الخلل البطانية ، والركيزة الهيمودينامية ، يمكن أن تسهل حماية القلب والأوعية الدموية في الأمراض البشرية. وبالنظر إلى النتائج التي لوحظت في هذه الدراسة, حماية الإستروجين الخارجي من تطوير تصلب الشرايين مستقلة جزئيا عن مستويات الدهون النظامية. في الخلايا البطانية، منع PPD تعبيرات جزيء التصاق والوسطاء الالتهابيين (البيانات غير مبينة). وعلاوة على ذلك، يمكن أن يقمع PPD تشكيل الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية التي ترتبط ارتباطا وثيقا مع البطانة المضادة للانقانت. وهكذا، كان عمل PPD و17β-estradiol مختلفاً، ومن المقرر مواصلة استكشاف الآلية الأساسية. ومما لا شك فيه أن الاستهلاك المفرط للأغذية الغنية بالطاقة، مثل انتشار البندق، يمكن أن يسبب زيادة في الوزن. ومع ذلك، فإن كميات صغيرة من انتشار البندق (200 mg·kg-1·day-1)كما هو مذكور في هذه الدراسة يمكن أن تكون مسؤولة فقط عن أقل من 5٪ من استهلاك الحيوانات من الطاقة اليومية. أيضا، لم يتم الكشف عن زيادة الوزن واضحة باستخدام هذا المبلغ من انتشار البندق. وكان استخدام 17β-استراديول وPPD أساسا لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية. لأنه، أثناء تطور تصلب الشرايين في الفئران التي تعمل بـ OVX- من الأسبوع 4 إلى الأسبوع 12، تم إعطاء 17β-estradiol أو PPD بشكل عن طريق الفم.

نقطة واحدة لا تذكر من الاستخدام السريري لHRT هو آثاره الجانبية الضارة، والتي تشمل سرطان المبيض والثدي13،14. فيتوستروجين اختبارها في هذه الدراسة هو مركب الصابونين الستيرويد وجدت في النباتات Dioscorea. وقد أفيد PPD أن يكون لها تأثير مثبط على بعض خطوط الخلايا السرطانية20. وبالإضافة إلى ذلك، يظهر PPD خصائص مضادة للتصلب مماثلة لتلك التي من 17β-استراديول. النموذج الذي نقدم هنا يمكن أن تساعد في فحص المركبات المرشحة المحتملة, بما في ذلك فيتوستروجين, الذي يمارس تأثير الحد الأدنى على انتشار الورم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81202526 إلى J.X.)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81302769 إلى B.S.)، ومؤسسة العلوم الطبيعية لبلدية بكين (47144226 إلى B.S.)، وشهادة الدكتوراه الصينية مؤسسة العلوم (20110490325 إلى J.X.)، ومؤسسة برامج الدكتوراه التابعة لوزارة التعليم في الصين (20121106120031 إلى B.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-250MG Estrogen
Disposable syringes (with 25 G needles) Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd 0.5*19TWLB Cardiac bleeding
High-cholesterol mouse diet Huafukang Bio-Technology N/A 1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System VisualSonics Vevo®770 Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463-250ML Preparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mm Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd R413 Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella) Ferrero N/A Medium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifier Dohegan Optical Company Inc. N/A Assistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4 SIGMA P3813 Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate Reader Tecan Infinite M1000 Plasma TC and TG determination
Pseudoprotodioscin Shanghai Winherb Medical S & T Development W-0427 CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-Gel Menarini, Solco Basle Ltd. Eye protection during anesthesia
Stereo microscope MCALON MCL-6STV Image of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifuge SIGMA 1-14K Preparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-5G Preparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A110-1 Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A111-1 Plasma TC determination

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  2. Packard, B. L. Cardiovascular health and disease in women. The New England Journal of Medicine. 329 (4), 247-256 (1993).
  3. Samaan, S. A., Crawford, M. H. Estrogen and cardiovascular function after menopause. Journal of the American College of Cardiology. 26 (6), 1403-1410 (1995).
  4. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420 (6917), 868-874 (2002).
  5. Tremollieres, F. A., et al. Effect of hormone replacement therapy on age-related increase in carotid artery intima-media thickness in postmenopausal women. Atherosclerosis. 153 (1), 81-88 (2000).
  6. Bourassa, P. A., Milos, P. M., Gaynor, B. J., Breslow, J. L., Aiello, R. J. Estrogen reduces atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (3), 10022-10027 (1996).
  7. Squadrito, F., et al. Genistein supplementation and estrogen replacement therapy improve endothelial dysfunction induced by ovariectomy in rats. Cardiovascular Research. 45 (2), 454-462 (2000).
  8. Wang, D., et al. Endothelial dysfunction and enhanced contractility in microvessels from ovariectomized rats: roles of oxidative stress and perivascular adipose tissue. Hypertension. 63 (5), 1063-1069 (2014).
  9. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous Hypercholesterolemia and Arterial Lesions in Mice Lacking Apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  10. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-Deficient Mice Develop Lesions of All Phases of Atherosclerosis Throughout the Arterial Tree. Arteriosclerosis and Thrombosis. 14 (1), 133-140 (1994).
  11. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. 64 (e4013), 1-4 (2012).
  12. Rossouw, J. E., et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results From the Women's Health Initiative randomized controlled trial. The Journal of the American Medical Association. 288 (3), 321-333 (2002).
  13. Kumle, M. Declining breast cancer incidence and decreased HRT use. Lancet. 372 (9639), 608-610 (2008).
  14. Jager, W., et al. A randomized comparison of triptorelin and tamoxifen as treatment of progressive ovarian cancer. Anticancer Research. 15 (6B), 2639-2642 (1995).
  15. Bhathena, S. J., Velasquez, M. T. Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition. 76 (6), 1191-1201 (2002).
  16. Wang, L., Qiu, X. M., Hao, Q., Li, D. J. Anti-inflammatory effects of a Chinese herbal medicine in atherosclerosis via estrogen receptor beta mediating nitric oxide production and NF-kappaB suppression in endothelial cells. Cell Death and Disease. 4 (e551), 1-13 (2013).
  17. Xiao, J., Wang, N. L., Sun, B., Cai, G. P. Estrogen receptor mediates the effects of pseudoprotodiocsin on adipogenesis in 3T3-L1 cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (1), C128-C138 (2010).
  18. Guivarc'h, E., et al. Predominant Role of Nuclear Versus Membrane Estrogen Receptor alpha in Arterial Protection: Implications for Estrogen Receptor alpha Modulation in Cardiovascular Prevention/Safety. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-17 (2018).
  19. Osako, M. K., et al. Estrogen inhibits vascular calcification via vascular RANKL system: common mechanism of osteoporosis and vascular calcification. Circulation Research. 107 (4), 466-475 (2010).
  20. Ivanova, A., et al. Screening of some saponins and phenolic components of Tribulus terrestris and Smilax excelsa as MDR modulators. In vivo. 23 (4), 545-550 (2009).
  21. Xiao, J., Zhu, T., Yin, Y. Z., Sun, B. Notoginsenoside R1, a unique constituent of Panax notoginseng, blinds proinflammatory monocytes to protect against cardiac hypertrophy in ApoE(-/-) mice. European Journal of Pharmacology. 833 (15), 441-450 (2018).
  22. Sun, B., Xiao, J., Sun, X. B., Wu, Y. Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction in endotoxemic mice: an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt signalling. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1758-1770 (2013).
  23. Adams, M. R., et al. Inhibition of coronary artery atherosclerosis by 17-beta estradiol in ovariectomized monkeys. Lack of an effect of added progesterone. Arteriosclerosis. 10 (6), 1051-1057 (1990).
  24. Keaney, J. F. Jr, et al. 17 beta-estradiol preserves endothelial vasodilator function and limits low-density lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic swine. Circulation. 89 (5), 2251-2259 (1994).
  25. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 14 (1), 133-140 (1994).
  26. Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. American Journal of Physiology- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (5), R1531-R1539 (2001).
  27. Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (3), 414-420 (2005).
  28. Pignoli, P., Tremoli, E., Poli, A., Oreste, P., Paoletti, R. Intimal plus medial thickness of the arterial wall: a direct measurement with ultrasound imaging. Circulation. 74 (6), 1399-1406 (1986).
  29. Hodgin, J. B., Maeda, N. Minireview: estrogen and mouse models of atherosclerosis. Endocrinology. 143 (12), 4495-4501 (2002).
  30. Bush, T. L., et al. Cardiovascular mortality and noncontraceptive use of estrogen in women: results from the Lipid Research Clinics Program Follow-up Study. Circulation. 75 (6), 1102-1109 (1987).
  31. Marsh, M. M., Walker, V. R., Curtiss, L. K., Banka, C. L. Protection against atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL receptor-deficient mice. Journal of Lipid Research. 40 (5), 893-900 (1999).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 150، استئصال المبيض، تصلب الشرايين، شق مزدوج في الصديكون الجانبي، الإدارة الربورالية، سمك الوسائط intima، تخطيط صدى القلب
A في فيفيفو نقص الإستروجين نموذج الماوس لفحص علاجات الإستروجين الخارجية من خلل القلب والأوعية الدموية بعد انقطاع الطمث
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, B., Yin, Y. z., Xiao, J. An In… More

Sun, B., Yin, Y. z., Xiao, J. An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause. J. Vis. Exp. (150), e59536, doi:10.3791/59536 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter