Summary
Kliniskt, östrogenbrist hos menopausala kvinnor kan förvärra förekomsten av lipid störningar och åderförkalkning. Vi etablerade en in vivo östrogenbrist modell av bilaterala ovariektomi via en dubbel dorsal-lateral snitt i apoE-/- möss. Musmodellen är tillämplig för screening exogena östrogen behandlingar av kardiovaskulär dysfunktion efter klimakteriet.
Abstract
Postmenopausala kvinnor har större risk att drabbas av hjärt-kärlsjukdomar än premenopausala kvinnor. Honmöss ovariectomized (OVX) vid avvänjning Visa ökade aterosklerotiska lesioner i aorta jämfört med honmöss med intakt äggstocksfunktion. Emellertid, laboratorie modeller med östrogen-brist möss med åderförkalkning-benägen status saknas. Detta underskott är avgörande eftersom klinisk östrogenbrist hos menopausala kvinnor kan förvärra förekomsten av redan existerande eller pågående lipid störningar och åderförkalkning. I denna studie, vi etablera en in vivo östrogen-bristfällig musmodell av bilaterala ovariektomi via en dubbel dorsal-lateral snitt i apolipoprotein E (apoE)-/- möss. Vi jämför sedan effekterna av 17β-estradiol och pseudoprotodioscin (PPD) (en fytoöstrogen) peroralt administreras via hasselnöt sprids. Vi finner att även PPD utövar viss effekt på att minska den slutliga kroppsvikten och plasma TG i OVX apoE-/- möss, den har anti-aterosklerotisk och hjärt-skyddande kapacitet jämförbar med dess 17β-estradiol motsvarighet. PPD är en fytoöstrogen som har rapporterats att utöva anti-tumör egenskaper. Sålunda, den föreslagna metoden är tillämplig för screening fytoöstrogener via peroral administrering att ersätta traditionell hormonersättningsbehandling hos postmenopausala kvinnor, som har rapporterats ha potentiellt skadliga tumorigenetiska Kapacitet. Peroral administrering via hasselnöt sprids är noninvasiv, vilket gör den allmänt tillämplig på många patienter. Denna artikel innehåller steg-för-steg-demonstrationer av bilaterala ovariektomi via dubbel dorsala-laterala snittet i apoE-/- möss och peroral 17β-estradiol eller fytoöstrogen hormon Replacement via hasselnöt sprids. Plasma lipid-och kardiovaskulär funktion analyser med ekokardiografi följa.
Introduction
Epidemiologiska och kliniska studier har visat att postmenopausala kvinnor är betydligt större risk för hjärt-kärlsjukdom än premenopausala kvinnor1,2. Hormonersättningsbehandling (HRT) kan minska den relativa risken för hjärt-kärlsjukdom till 0,37-0,793. Bland andra komplikationer, åderförkalkning orsakad av hjärt-kärlsjukdomar är den vanligaste dödsorsaken i världen4. Emellertid, laboratorie modeller med östrogen-brist möss som uppvisar åderförkalkning liggande status saknas. Detta protokoll ger en in vivo östrogenbrist musmodell för screening exogena östrogen behandlingar av kardiovaskulär dysfunktion efter klimakteriet.
Tidigare studier visar att tillämpningen av OVX i aterosklerotiska gnagare matas en hög kolesterol diet kan efterlikna postmenopausala kvinnor som lider av åderförkalkning5,6,7,8. En reproducerbar och bekväm djurmodell som liknar det aterosklerotiska tillståndet hos kvinnor i klimakteriet är grunden för EXOGEN östrogen forskning. Här, en dubbel dorsala-laterala snitt av bilaterala ovariektomi tillämpades i åderförkalkning-benägna apolipoprotein E knockout (APOE-/-) möss9,10. Jämfört med mellersta buken eller dorsala snitt, dubbel dorsala-laterala snitt är en enklare, mindre tidskrävande metod som kan undvika svår bukhålan vidhäftning och inflammation. Peroral administrering via hasselnöt sprids (se tabell över material) är noninvasiv och bekväm, vilket gör den allmänt tillämplig som en långsiktig administration läge11. Långsam frisättning pellets implantation är också populärt6. Emellertid, implantat mayaggravate förekomsten av infektion särskilt hos möss som utsätts för OVX. Andra noninvasiv administration lägen, såsom muntliga sondrör och vatten administration, har också många nackdelar. Oral sonal vanligtvis stress möss och kan orsaka esofagus skada. Administrera hormonet via dricksvatten är mycket fördelaktigt; emellertid, tillsats av DMSO som ett emulgeringsmedel är oundvikligt som exogena östrogener är olösliga i vatten. Här, vi valde peroral 17β-estradiol eller fytoöstrogen hormon ersättare via hasselnöt sprids för långsiktig administrering.
Nyligen, den gynnsamma effekten av HRT på det kardiovaskulära systemet av postmenopausala kvinnor har ifrågasatts i Women ' s Health Initiative (WHI) prövningar12. Å ena sidan utövar exogena östrogen ensamt en gynnsam effekt på det kardiovaskulära systemet; å andra sidan, det kan kombinera med metohydroxiprogesteron acetat att öka risken för kardiovaskulära händelser. Mer allvarligt, HRT kan leda till bröst-och livmoder tumör progression, och denna effekt har markant begränsat dess användning13,14. Mer intresse har inriktats på de kardiovaskulära-skyddande effekterna av exogena östrogener som saknar mitotisk aktivitet i tumörceller15,16,17. Flera studier på människor och djur tyder på att fytoöstrogener med strukturer som liknar östrogener kan spela en gynnsam roll i kardiovaskulär skydd15,18.
Således är syftet med det nuvarande arbetet (i) att bygga en in vivo östrogenbrist musmodell av bilaterala ovariektomi via en dubbel dorsal-lateral snitt i apoE-/- möss och (II) att jämföra de kardiovaskulära skyddande effekterna av peroralt administreras 17β-estradiol och pseudoprotodioscin (PPD), via hasselnöt sprids. 17β-estradiol är en typ av EXOGEN östrogen som tillhör kvinnliga könshormoner6,11,19. PPD, en steroid saponin och fytoöstrogen från Dioscorea växter, har tidigare rapporterats att utöva anti-tumör egenskaper20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djuromsorg och experimentella protokoll godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén för den kinesiska akademin för medicinska vetenskaper och Peking union Medical College (tillstånd nr: SYXK (Peking) 2013-0023). Ursprunget till APOE-/- möss är C57BL/6j9,10.
1. bilateral ovariektomi via en dubbel dorsala-lateral snitt i apoE-/- möss
- Vid avvänjning (ålder 28 dagar), söva kvinnliga APOE-/- C57BL/6j möss med Avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitonealt).
Notera: 32 APOE-/- möss delades slumpmässigt in i 4 grupper: Sham, OVX, OVX/E2 och OVX/PPD Group (n = 8 per grupp). - Placera djuret i liggande position på en värmedyna. Applicera Eye smörjmedel för ögonskydd under anestesi.
- Behåll kroppstemperaturen inom 36 ± 0,5 ° c. Administrera 5 mg/kg kroppsvikt av den analgetiska karprofen subkutant till den laterala delen av musens hals.
- Raka en 3 x 5 cm2 mus område cefaliska från iliaca Crest. Innan att täcka djuret med en 3 x 5 cm2 bländare kirurgiskt ark, rengör det rakade området grundligt med jod och sedan 70% etanol. Använd sterila instrument och handskar under experimentet.
- Använd sax och pinkoppar för att göra ett snitt 1 cm i sidled till mittlinjen och 1 cm i sidled till den kustnära revbenen.
- Att rent ut dissekera den subkutana vävnaden med hjälp av pinps.
- Använd dissekera glasögon (se tabell över material) för att identifiera den vita fettvävnad i bukhålan.
- Använd mikrosax och microforceps att göra en 0.5-1 cm snitt genom fascian tills bukhålan är nådd.
Anmärkning: För den simulerade gruppen, Stäng såren direkt. Sutur muskellagret och huden separat med hjälp av en monofilament sutur. - När den vita fettvävnad i bukhålan kan ses, greppa fettvävnad med hjälp av microforceps och försiktigt dra ut den. En rosa mullbär-formad äggstock insvept av fettvävnad i bukhålan kan ses.
- Ligate 0,5-1 cm proximala kärlet och livmoder hornet med hjälp av en monofilament sutur. Ta bort äggstockarna med hjälp av mikrosax och placera resterande vävnad tillbaka i bukhålan.
Anmärkning: De viktigaste biverkningarna för OVX-operationen är uretär ligering vilket leder till hög dödlighet hos OVX-styrda möss. Detta kan undvikas genom att identifiera vävnader med hjälp av en dissekera goggle. - Stäng såren. Sutur muskellagret och huden separat med hjälp av en monofilament sutur.
- Använd saxar och pinkoppar för att göra ett annat snitt 1 cm i sidled till mittlinjen och 1 cm i sidled till den revbensspjäll på andra sidan. Upprepa ovanstående procedur (1,5 till 1,11).
- Låt djuret vakna från anestesi. Separat hålla musen på den första dagen efter operationen.
- Rengör eller Byt ut buren ofta under återhämtningsfasen.
- Cirka 24 h efter operationen, administrera ytterligare 5 mg/kg kroppsvikt av den analgetiska karprofen subkutant.
2. peroral administrering av 17β-estradiol eller PPD via hasselnöt sprids
- Grundligt lös 17β-estradiol eller PPD i sesamolja, och sedan blanda sesamoljan med hasselnöt sprids (se tabell över material). En daglig portion för varje 30 g mus innehåller 3 μg 17β-estradiol eller 15 μg PPD, 4 μL sesamolja, och 60 mg hasselnöt sprids. Förbered en placebo för varje 30 g mus innehåller 4 μL sesamolja och 60 mg hasselnöt sprids.
Anmärkning: Den dagliga administrationen delen av 17β-estradiol eller PPD baserades på tidigare studier6,11 och preliminära experiment. - En vecka efter OVX, mata möss med en hög-kolesterol diet (1,25% kolesterol, 0% cholate) för 12 veckor. Ett typiskt försöks behandlingssystem, som används i denna studie, illustreras i figur 1.
- 5 dagar före peroral administrering av hasselnöt sprids vid vecka 4, utbilda möss att äta placebo innehåller cirka 30 mg hasselnöt sprids för 2-5 möss för 5 dagar. Träna möss i grupper i deras hem burar under de första 3 dagarna. Placera möss i separata burar på fjärde och femte dagarna av träning och servera den dagliga delen att likna den experimentella situationen.
- Under de senaste 9 veckorna, placera möss i separata burar och sedan servera en daglig portion hasselnöt sprids portion för varje utfodring tillfälle.
Anmärkning: Servera en daglig portion innehållande 17β-estradiol (0,1 mg · kg-1) eller PPD (0,5 mg · kg-1) via hasselnöt sprids i OVX/E2 respektive OVX/PPD-gruppen; servera en daglig portion som innehåller hormon-fri hasselnöt sprids i bluff och OVX grupp.
3. bestämning av intima-Media tjocklek och hjärtdysfunktion med hjälp av en Microultrasound system
-
Ultrasonografisk biomikroskopi
- En dag före uppsägning, undersöka intima-Media tjocklek och hjärtdysfunktion med hjälp av en microultrasound system (se tabell över material) som tidigare beskrivits21.
- Före undersökning, ge varje mus en 200 mg/kg intraperitoneal injektion av Avertin (tribromoethanol) som anestesi (n = 8 möss per grupp).
- Raka halsen hår av varje mus noggrant. Applicera Warm ultraljud transmission gel rikligt för att säkerställa optimal bildkvalitet.
- Få baslinje ultrasonografiska bilder av aorta roten och stigande aorta med 30 MHz Scan Head vid en 12,7 mm fokus och en upplösning på 40 μm.
- Använd elektrokardiografi med en lead II-konfiguration för övervakning.
- Fånga rätt parasternal lång-axel bilder av aorta ascendens, aortabågen, och brachiocephalic artär gren i ett plan i Systole (figur 3).
-
Mätningar av intima-media och maximal plack tjocklek
- Justera avståndet mellan givaren och arteriell plats lätt att få tydliga bilder.
- Lagra en 10 s Cine loop digitalt för offline undersökning på ett bildanalys system.
- Välj en optimal frys ram ultraljud bild manuellt för ytterligare mätningar. Kontrollera bilderna i mindre krökning av aorta ascendens. Om plack i aorta ascendens kan ses, mäta maximal plack tjocklek. Om plack i aorta ascendens inte kan ses, mäta maximal IMT.
- Mät IMT (avståndet mellan den vaskulära Luminal-Intimal gränssnitt och mediala-adventitial gränssnitt). Mät den maximala plack tjocklek (det tjockaste avståndet mellan gränsen av vaskulära lumen och adventitial skikt).
- Genomsnittliga data från tre lesionssorter (figur 3).
-
Bestämning av hjärtdysfunktion med ekokardiografi
Anmärkning: Undersök hjärtfunktionen genom ekokardiografi med hjälp av ett microultrasound system, som tidigare beskrivits22.- Direkt en ultraljud stråle mot hjärtat, nära papillär musklerna.
- Uppnå tvådimensionell elektrokardiogram-baserade kilohertz visualisering.
- Utför in vivo transtorakal ekokardiografi av vänster kammare med hjälp av ett 30 MHz Scan Head.
- Mätparametrar associerade med hjärtats funktion digitalt från M-läge tracings.
- Genomsnittliga data från tre till fem hjärtcykler (tabell 1).
-
Variationer inom och mellan observatörer
- För validering av intraobserver variation, analysera data av en operatör vid två olika tillfällen.
- För utvärdering av interobserver variation, analysera data av en annan operatör.
4. mätning av kroppsvikt varje vecka och bestämning av total kolesterol i plasma (TC) och triglycerid (TG)
- Mätning av kroppsvikt varje vecka
- Mät kroppsvikter en gång i veckan från vecka-1 till vecka 12.
Anmärkning: n = 8 möss per grupp.
- Mät kroppsvikter en gång i veckan från vecka-1 till vecka 12.
- Plasma beredning
- Innan du samlar blodprov genom intrakardiell punktering, förbereda sprutor och rör. Använd EDTA som antikoagulantia. Tillsätt 10 μL 0,5 M EDTA till varje 2 mL spruta och tillsätt 8 μL 0,5 M EDTA till varje 1,5 mL-rör.
- Vid vecka 12, efter en övernattning snabbt, söva möss med Avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitonealt).
Anmärkning: n = 3 möss per grupp. - Förbered den ventrala bröstområdet med 70% etanol.
- Använd sax och pinps för att öppna brösthålan och skär revbenen tills det slog hjärtat är utsatt.
- Sätt i 25 G nålen i den högra ventrikeln. Aspirera långsamt tills blodet börjar flöda in i sprutan.
Anmärkning: Vi använder engångssprutor i sterilt skick med 25 G nålar (se tabell över material). - Fortsätt att aspirera med stadigt, jämnt tryck. Om inget blod ses, flytta nålen och upprepa aspiration.
- Håll möss djupt sövda innan du samlar in erforderlig blodvolym. Normalt kan upp till 1 mL blod samlas in. Euthanize möss av cervikal dislokation under denna djupa bedövningsmedel tillstånd.
- Pipettera blodprov i 1,5 mL-rör och Invertera blodet noggrant för att se till att EDTA blandas in i blodet. Placera sedan blodprov på isen omedelbart.
- Centrifugera prover för 20 min vid 400 x g vid 4 ° c inom 30 min av uppsamling.
- Samla supernatanten noggrant. Och förvara plasmaprover vid-80 ° c.
- Konstruera standardkurvor för TC-eller TG-innehållsmätning
- För TC standardkurvan, förbereda olika koncentrationer av kolesterol standarder: 0 mmol/L, 0,52 mmol/L, 1,03 mmol/L, 2,07 mmol/L, 4,14 mmol/L, 6,20 mmol/L, 8,27 mmol/L och 10,34 mmol/L. mått O.D. för varje kolesterol standard. Ange genomsnittlig O.D. för varje kolesterol standard. Som det lodräta (Y) axelvärdet anger du koncentration som det vågräta (X) axelvärdet. Skapa en standardkurva med hjälp av en statistisk programvara.
- För TG-standardkurvan, Bered olika koncentrationer av TG-standarder: 0 mmol/L, 0,45 mmol/L, 0,90 mmol/L, 1,81 mmol/L, 3,62 mmol/L, 5,42 mmol/L, 7,23 mmol/L och 9,04 mmol/L. mått O.D. för varje TG-standard. Ange genomsnittlig O.D. för varje TG-standard som det vertikala (Y) axelvärdet. Ange koncentration som det vågräta (X) axelvärdet. Skapa en standardkurva med hjälp av en statistisk programvara.
Anmärkning: En fyra-parameter Logistic Curve montering (4-pl) användes för standardkurvan konstruktion i den aktuella studien. Kontrollera standardkurvan innan du mäter plasmaproverna och se till att r2 är större än 0,995.
- Mätning av TC-innehåll
- Märk flaskan med färgreagens (25 mL) från TC-analyssatsen som "TC-arbetslösning".
- Virvel de kylda exemplaren kort. Bered spädningar: 20 μL plasma i 80 μL destillerat vatten. Kort Vortex utspädningar.
- Tillsätt 2,5 μL av kolesterol standarder (5,17 mmol/L) eller 2,5 μL utspädd plasma eller 2,5 μL destillerat vatten (blank) till lämpliga brunnar i en 96-well tallrik. Triplication rekommenderas.
- Tillsätt 250 μL av färginreagenset till alla brunnar.
- Inkubera vid 37 ° c i 10 min.
- Vrid mikroplattläsaren på och låt en 10 min värma upp.
- Ta bort plattan/plattorna från inkubatorn och Läs mikroplattläsaren på 510 nm. Se till att inga bubblor eller damm finns i mikrotiterbrunnar eller på botten av plattan, respektive.
- Beräkna TC-koncentrationen enligt följande:
TC forts. = kolesterol standarder forts. × (plasmaprov OD-blank O. D)/(kolesterol standarder O.D.-blank O. D)
- TG innehåll mätning
- Märk flaskan med färgreagens (25 mL) från TG-analyssatsen som "TG-arbetslösning".
- Virvel de kylda exemplaren kort.
- Tillsätt 2,5 μL av TG-standarderna (2,26 mmol/L) till eller 2,5 μL utspädd plasma eller 2,5 μL destillerat vatten (blankt) till lämpliga brunnar i en platta på 96-well. Triplication rekommenderas.
- Tillsätt 250 μL av färginreagenset till alla brunnar.
- Inkubera vid 37 ° c i 10 min.
- Vrid mikroplattläsaren på och låt en 10 min värma upp.
- Ta bort plattan/plattorna från inkubatorn och Läs mikroplattläsaren på 510 nm.
Anmärkning: Se till att inga bubblor eller damm finns i mikrotiterbrunnarna eller på botten av plattan. - Beräkna TG-koncentrationen enligt följande:
TG forts. = TG-standarder forts. × (plasmaprov O.D.-blank O. D)/(TG-standarder O.D.-blank O. D)
5. en ansikts analys av aortic aterosklerotiska lesioner
- Aorta isolering och excision
- Vid vecka 12, efter en övernattning snabbt, söva möss med Avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitonealt). Euthanize möss av cervikal dislokation under denna djupa bedövningsmedel tillstånd.
Anmärkning: Vi använde 3 möss per grupp. - Förbered den ventrala bröstområdet med 70% etanol. Använd sax och pinps för att öppna brösthålan och skär revbenen tills det slog hjärtat är utsatt.
- Fyll en 50 mL spruta med fosfatbuffrad saltlösning vid pH 7,4 (se tabell över material). Sätt in en 25 G nål i den vänstra ventrikeln och skär höger förmak för att undvika högt tryck från perfusion.
- Utför in situ perfusion med en flödeshastighet på 0,05-0,08 mL/min. absorbera perfusion vätska med vävnader.
- Ta bort revbenen och lungorna i brösthålan med sax och pinps. Öppna sedan bukhålan och ta bort organ inuti för en bättre bild av aorta.
- Ta bort aorta genom att hålla hjärtat med microforceps och separera aorta från ryggraden dorsalt med microscisssors tills iliaca bifurcation.
Anmärkning: När dissekera nära njurens förmaks grenar, skära djupt med hjälp av mikrosax för att undvika aorta skador. - Fixa hjärtat och aorta för 48 h i 4% PARAFORMALDEHYD. Förvara artärer i saltlösning vid rumstemperatur eller vid 2-8 ° c i några timmar.
Anmärkning: Detta förfarande kommer att underlätta rengöring.
- Vid vecka 12, efter en övernattning snabbt, söva möss med Avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitonealt). Euthanize möss av cervikal dislokation under denna djupa bedövningsmedel tillstånd.
- Beredning av aorta
- Ta bort hjärtat. Ta försiktigt bort adventitial vävnaderna från artärer med hjälp av microforceps och microscisssors under en stereomikroskop. Använd saltlösning för att hålla vävnaden fuktig under rengöringen.
Anmärkning: Var noga med att inte riva eller Nick aorta och några viktiga grenar, såsom Innominate artär, vänster gemensamma halspulsådern, och vänster subclavia. - Lämna 1 mm av Innominate och vänster gemensamma halspulsådern och skära av hela vänster subclavia.
- Klipp öppna den yttre krökningen genom Innominate artären, sedan till vänster gemensamma halspulsådern, och sedan till vänster subclavia.
- Klipp öppna längs den inre krökning av stigande del till botten av buken portion.
- Stift aorta platt på en svart plast plåt och tillämpa saltlösning för att hålla artärer från torkning.
- Ta bort hjärtat. Ta försiktigt bort adventitial vävnaderna från artärer med hjälp av microforceps och microscisssors under en stereomikroskop. Använd saltlösning för att hålla vävnaden fuktig under rengöringen.
- Bild av den intimans regionen aorta
- Ta bilder av en Face artärer med ett stereomikroskop. Inkludera en millimeterskallinjal i bilderna för att kalibrera mätningar.
- Inkludera bågen och bröstkorg regioner i samma bild och buken regionen i en annan. Spara bilder som JPEG eller TIFF.
Anmärkning: Bågen regionen är från korsningen av hjärtmuskeln till 3 mm distalt från vänster subclavia, bröstkorg regionen är 3 mm distalt till vänster subclavia till den sista interkostal artär, och buken regionen är den sista interkostal artär till iliaca Bifurkation.
- Kvantifiering av aterosklerotisk lesion-en ansikts metod
- Kalibrering
- Öppna bilden med bildanalysprogram (se tabell över material), gå till rumslig kalibrering och följ instruktionerna.
- Ändra referensenheter till mm genom att placera linjalen över linjen.
- Mätning
- Ställ in rätt kalibrering för varje bild.
- Mät 3 mm på linjalen.
- Arch och bröstkorg region mätning: skissera bågen regionen från korsningen av hjärtmuskeln till 3 mm distala från vänster subclavia och bröstkorg regionen från 3 mm distalt till vänster subclavia till den sista interkostal artär. Spår skador i bågen och bröstkorg regionen och titta på aorta genom mikroskopet.
- Buk region mätning: skissera buken regionen från slutet av bröstkorg regionen till iliaca bifurcation. Spår skador i buken regionen och titta på aorta genom mikroskopet.
- Beräkna lesion området i förhållande till den inre ytan av aorta.
- Kontrollera kvantifieringen genom en andra observatör som är blind för studiegrupperna.
- Kalibrering
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett typiskt försöks behandlingssystem, som används i denna studie, illustreras i figur 1. Vid avvänjning (ålder 28 dagar), kvinnliga apoE-/- C57BL/6j möss var sövda withavertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitonealt). Möss var bilateralt OVX eller simulerad drivs genom en 1 cm dorsala snitt. En vecka efter bilaterala OVX, möss matades en hög-kolesterol diet (1,25% kolesterol, 0% cholate) för 12 veckor. 17β-estradiol (0,1 mg · kg-1) eller PPD (0,5 mg · kg-1) administrerades peroralt parallellt via hasselnöt spridning under de senaste 9 veckorna av behandlingen. Alla möss vägdes veckovis. Som visas i figur 2, effekterna av både exogena östrogener (17β-ESTRADIOL och PPD) på plasma lipider och vecko kroppsvikt APOE-/- möss efter östrogenbrist utvärderades. Efter 12 veckor av en hög-kolesterol diet, OVX möss visade en anmärkningsvärd ökning av plasma TC och TG koncentrationer. OVX-möss peroralt administrerade med 17β-estradiol eller PPD via hasselnötsspridning uppvisade signifikant lägre plasmakoncentrationer av TC än simulerad mus (figur 2A). Plasma TG-nivåerna minskade hos OVX-möss peroralt administrerat med 17β-estradiol men inte med PPD (figur 2b). Som visas i figur 2C, medan en tendens till ökad kroppsvikt (BW) observerades hos OVX-möss jämfört med de simulerade möss, fick BW i OVX-möss peroralt administrerat med 17β-ESTRADIOL eller PPD via hasselnötsspridning efter en hög kolesterol diet visade en tendens motsats det i OVX möss. Emellertid, den sista kroppsvikten av möss i olika grupper visade inga signifikanta förändringar.
Kardiovaskulär funktion utvärderades med hjälp av ekokardiografi. Som visas i figur 3, mättes den maximala plack eller IMT i aorta ascendens i OVX möss peroralt administreras med 17β-estradiol eller PPD via hasselnöt sprids. Den aortabågen av hög-kolesterol-diet-Fed apoE-/- möss observerades av B-mode ekokardiografi. Representativa longitudinella bilder av stigande aorta fångades av ultrasonografiska biomicroscopy. De röda pilarna indikerar plaketter. OVX möss uppvisade ökad maximal plack eller IMT av aorta ascendens jämfört med Sham-operated möss. Efter peroral administrering av 17β-estradiol eller PPD via hasselnöt spridning, maximal plack eller IMT i aorta ascendens anmärkningsvärt minskade jämfört med den för OVX möss. (Figur 3). Vi observerade också hjärtdysfunktion som svar på OVX i apoE-/- möss efter en 12-veckors hög-kolesterol-diet utfodring (tabell 1). Hjärtfunktionen undersöktes genom ekokardiografi. Hos OVX-möss kan peroral administrering av 17β-estradiol eller PPD via hasselnötsspridning delvis dämpa parametrar som visar hjärtdysfunktion.
Nästa, vi använde en ansikts analys för att bestämma aorta aterosklerotiska lesioner. Som tidigare rapporterats, efter 12 veckor, en hög-kolesterol diet ledde till aterosklerotisk plack bildas på den luminala ytan av aorta. Som visas i figur 4, den genomsnittliga andelen aorta lesion område i förhållande till hela aorta området ökat signifikant i OVX möss. Efter peroral administrering med 17β-estradiol eller PPD via hasselnöt sprids, aorta lesion området anmärkningsvärt minskade jämfört med den för OVX möss motsvarighet. Detta resultat är förenligt med skyddet av 17β-estradiol eller PPD från utvecklingen av åderförkalkning presenteras i figur 3.
Sammanfattningsvis, det föreslagna förfarandet, som använder bilaterala ovariektomi via en dubbel dorsal-lateral snitt i apoE-/- möss, är tillämplig för screening noninvasiv EXOGEN östrogen behandlingar av kardiovaskulär dysfunktion efter klimakteriet. Det är också särskilt användbart för att undvika skadlig tumorigenetisk kapacitet.
Figur 1. Musens behandlingsschema. Vid avvänjning (ålder, 28 dagar), kvinnliga apoE-/- C57BL/6j möss var sövda med Avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitonealt). Möss var bilateralt ovariectomized (OVX) eller simulerad drivs genom en 1 cm dorsala snitt. En vecka efter OVX, möss matades en hög-kolesterol diet (1,25% kolesterol, 0% cholate) för 12 veckor. 17β-estradiol (0,1 mg · kg-1) eller PPD (0,5 mg · kg-1) administrerades peroralt parallellt via hasselnöt spridning under de senaste 9 veckorna av behandlingen. Alla möss vägdes varje vecka. Vid vecka 12 utvärderades kardiovaskulär funktionsanalys med ekokardiografi. Efter 12 veckor av en hög-kolesterol diet, alla möss var euthanized, och blodprov och vävnader skördades för vidare undersökning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Effekter av olika exogena östrogener på plasma lipider och vecko kroppsvikt i apoE-/- möss. Sham möss genomgick en mock operation och fick en hög-kolesterol diet. OVX möss genomgick bilaterala ovariektomi och sedan slumpmässigt delas in i följande grupper: den OVX-gruppen, som behandlades med en hög-kolesterol diet; den OVX/E2 (17β-estradiol) grupp, som fick en hög-kolesterol diet för 12 veckor plus 0,1 mg/kg E2 genom peroral administrering via hasselnöt sprids under de senaste 9 veckorna av behandlingen; och OVX/PPD gruppen, som fick en hög-kolesterol diet för 12 veckor plus 0,5 mg/kg PPD genom peroral administrering via hasselnöt sprids under de senaste 9 veckorna av behandlingen. De totala kolesterol-och triglyceridnivåerna i plasma mättes via enzymatiska metoder (a-B). Data uttrycks som medel ± SEM av n = 5 möss per grupp. Vecko kroppsvikter mättes från vecka-1 till vecka 12 (C). Data uttrycks som hjälpmedlet ± SEM av n = 8 möss per grupp. Enkelriktad ANOVA följt av Dunnetts post hoc-test genomfördes för flera jämförelser. *p < 0,05 jämfört med Sham-gruppen; # p < 0,05 jämfört med OVX-gruppen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. IMT eller maximal plack tjocklek mätningar i apoE-/- möss. B-läge bilder som visar aortabågen av apoE-/- möss presenteras. Den longitudinella bilder av stigande aorta erhölls genom ultraljud biomikroskopi. Maximal plack eller IMT i aorta uppstigande (mm) mättes. De ultrasonografiska bilderna visar plack i den mindre krökning av aorta ascendens; de röda pilarna indikerar plaketter. Data uttrycks som medelvärdet ± SEM av n = 8 möss per grupp. Enkelriktad ANOVA följt av Dunnetts post hoc-test genomfördes för flera jämförelser. *p < 0,05 jämfört med Sham-gruppen; # p < 0,05 jämfört med OVX-gruppen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. En ansikts analys av aorta aterosklerotiska lesioner i APOE-/- möss. Den genomsnittliga andelen aorta lesion område i förhållande till hela aorta området kvantifierades i alla grupper. Representativa mikrografer av de intiala lesioner (en ansikte) av aorta visas. Data uttrycks som medelvärdet ± SEM av n = 3 möss per grupp. Enkelriktad ANOVA följt av Dunnetts post hoc-test genomfördes för flera jämförelser. *p < 0,05 jämfört med Sham-gruppen; # P < 0,05 jämfört med OVX-gruppen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Bluff | OVX | OVX/E2 | OVX/PPD | |
| LVIDd (mm) | 3,72 ± 0,10 | 3,74 ± 0. 24 | 3,68 ± 0,16 | 3,88 ± 0,16 |
| LVIDs (mm) | 2,34 ± 0,11 | 2,16 ± 0,22 | 2,12 ± 0,13 | 2,55 ± 0,12# |
| IVSd (mm) | 0,83 ± 0,09 | 0,84 ± 0,07 | 0,91 ± 0,05 | 0,74 ± 0,06# |
| IVSs (mm) | 1,24 ± 0,02 | 1,35 ± 0,06 * | 1,45 ± 0,04# | 1,09 ± 0,04# |
| PWTd (mm) | 0,7 ± 0,10 | 0,68 ± 0,04 | 0,72 ± 0,07 | 0,58 ± 0,07# |
| PWTs (mm) | 1,10 ± 0,12 | 1,17 ± 0,08 | 1,24 ± 0,04 | 0,98 ± 0,08# |
| EDV (mm3) | 58,89 ± 3,74 | 59,88 ± 9,02 | 57,39 ± 5,79 | 65,11 ± 6,13 |
| ESV (mm3) | 18,86 ± 2,17 | 15,75 ± 4,00 | 14,85 ± 2,37 | 23,45 ± 2,64# |
| EF (%) | 67,84 ± 1,52 | 73,91 ± 3.63 * | 74,23 ± 1,50 | 63,91 ± 3,61# |
| FS (%) | 37,19 ± 1,53 | 42,22 ± 1,17 * | 42,36 ± 1,21 | 34,28 ± 2,69# |
| LVIDd = LV inre diameter under diastole; LVIDs = LV inre diameter under Systole; IVSd = inre ventrikulär septum under diastole; IVSs = inre ventrikulär septum under Systole; PWTd = bakre väggtjocklek under diastole; PWTs = bakre väggtjocklek under Systole; EF = ejektionsfraktion; FS = fraktionerad förkortning; EDV = änddiastolisk volym; ESV = systolisk volym. | ||||
Tabell 1: utvärdering av hjärtfunktionen med hjälp av ekokardiografi. Parametrar som associeras med hjärtfunktionen digitalt från M-mode-tracings kvantifierades i alla grupper. Data uttrycks som medelvärdet ± SEM av n = 8 möss per grupp. Enkelriktad ANOVA följt av Dunnetts post hoc-test genomfördes för flera jämförelser. *p < 0,05 jämfört med Sham-gruppen; # p < 0,05 jämfört med OVX-gruppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs här är en musmodell som liknar lipid störningar och åderförkalkning ses hos kvinnor i klimakteriet. Det är väl dokumenterat att östrogenbrist hos postmenopausala kvinnor kan förvärra incidensen av redan existerande eller pågående hyperkolesterolemi med successivt komplexa och utbredda aterosklerostiska lesioner1. För att efterlikna den åderförkalkning-benägen status i kliniken, APOE-brist möss, en reproducerbar och bekväm källa till djur som att studera aterogenes23,24,25, tillämpades. Som framgår i den aktuella studien, kvinnliga OVX apoE-/- möss vid avvänjning visade en ökning av aterosklerotiska lesioner i aorta jämfört med kvinnliga APOE-/- möss med intakt äggstocksfunktion. I detta djurmodell, Vi jämförde också effekten av olika exogena östrogen ersättare terapier på aterosklerotisk lesion storlek under en kontrollerad kosten skick.
Den dubbla dorsal-lateral snitt av bilaterala ovariektomi presenteras i denna artikel är tekniskt lättare, mindre tidskrävande, och säkrare jämfört med mitten dorsala-laterala snitt eller mellersta buken snitt av bilaterala ovariektomi i apoE-/- möss. Bilaterala ovariektomi via mellersta buken snittet presenterar en stor nackdel: det kan orsaka allvarliga bukhålan vidhäftning, vilket i sin tur kan påverka absorptionen av läkemedlet. Nya rapporter visar att peroral administrering av lågdos 17β-estradiol skyddar mot cerebral ischa26. Sålunda valde vi peroral administrering via hasselnöt sprids i den aktuella studien. Kommersiella slow-release pellets är ett vanligt förekommande administreringssätt för att testa farmakologiska effekter i en musmodell men kan orsaka skadliga cerebral skada27. Implantat är benägna att infektioner, särskilt om möss utsätts för bilaterala OVX via en dubbel dorsal-lateral snitt. Även noggrann desinfektion av huden innan snittet utförs, infektion är svårt att undvika. Vatten administration och oral Sonat är två mindre ofta använda metoder som har testats. Administrera hormonet via dricksvatten är mycket fördelaktigt på grund av dess är extremt noninvasiv eftersom nästan ingen djurhantering krävs. Emellertid, 17β-estradiol är inte löslig i vatten utan en emulgeringsmedel. Således använde vi DMSO vid en koncentration av mindre än 0,5% för att underlätta dess lösning i dricksvatten. Emellertid, detta tillvägagångssätt för långtidsadministrering av lågdos DMSO är svårt att kontrollera och giftiga för möss eller människor. Möss kan också dricka vatten under hela 24 h övervakning, vilket gör den faktiska drogkonsumtionen svårt att avgöra. En annan nackdel med detta tillvägagångssätt är att individens vattenintag är svårt att kontrollera. Den största nackdelen med oral sondanvändning är att det är stressande för djur och kan orsaka esofagus skada och påverka ätbeteende. I den metod som beskrivs här, en 5 dagars utbildning av att äta hormon-fri hasselnöt sprids före experimentet genomfördes. Ungefär mer än 95% av mössen kommer att acceptera hasselnöt sprids om de utbildas som det som nämns i protokollet avsnitt. När helt habituated, de flesta av möss kommer att konsumera det inom några sekunder. I enlighet med en tidigare studie6,11, minskade plasma E2-nivåerna hos OVX-möss jämfört med den simulerade motsvarigheten vid vecka 4 (data ej visad). Vid vecka 12 efter bestämning observerade vi livmoder atrofi i OVX-styrda möss. Emellertid, de cirkulerande östrogennivåerna övervakades inte efter OVX i den aktuella studien.
I avsaknad av detektion av aterosklerotiska lesioner i aorta ascendens, aorta IMT kan utvärderas genom att mäta avståndet mellan lumen-intimial gränssnitt och mediala-adventitial gränssnitt. Denna mätning är baserad på ett tidigare validerat protokoll i människa28. Genomsnittliga data från tre platser som är cirka 100 μm bortsett från varandra. Den hjärt-arbetsbelastning ökar efter OVX i apoE-/- möss kan på grund av kompenserande hypertrofisk tillväxt av enskilda kardiomyocyter som så småningom kan leda till ökad hjärt minut effekt (tabell 1). Vid peroral administrering av PPD under 9 veckor försvagades kompensatorisk hjärthypertrofi med en EF% jämförbar med den simulerade motsvarigheten. För validering av variationer inom eller mellan observatörer, analysera koefficienter för variation för aterosklerotisk tjocklek mätningar och parametrar i samband med hjärtfunktion av en operatör vid två olika tillfällen eller av en annan operatör.
Som presenterades i vår studie, OVX möss peroralt administreras med 17β-estradiol eller PPD via hasselnöt sprids tenderade att förhindra viktökning och minska östrogenbrist-associerade lipid störningar, även om inga signifikanta skillnader i sista kroppsvikt var Observerade. Tidigare studier har också visat att variation av lipidparametrar kan vara för liten för att förklara de antiaterosklerotiska effekterna av hormoner29. De positiva effekterna av östrogen är inte begränsade till förändringar i lipidproteinegenskaper. Vissa nonlipid effekter av östrogen30,31, såsom inflammation, endotelial dysfunktion, och hemodynamisk Stas, kan underlätta kardiovaskulär skydd i mänskliga sjukdomar. Med tanke på de resultat som observerats i den aktuella studien, skyddet av EXOGEN östrogen från åderförkalkning utveckling är delvis oberoende av systemiska lipidnivåer. I endotelceller hämmade PPD uttryck av adhesionsmolekylen och inflammatoriska mediatorer (data visas inte). Dessutom kan PPD undertrycka perivaskulär fettbildning som är nära korrelerad med endotelial anti-kontraktilitet. Således var effekten av PPD och 17β-estradiol annorlunda och den bakomliggande mekanismen ska undersökas ytterligare. Otvivelaktigt, överdriven konsumtion av energirika livsmedel, såsom hasselnöt sprids, kan orsaka viktökning. Men de små mängder hasselnöt sprids (200 mg · kg-1· dag-1) som nämns i den aktuella studien kunde endast vara ansvarig för mindre än 5% av djurens dagliga energiintag. Också, ingen uppenbar viktökning upptäcktes med hjälp av denna mängd hasselnöt sprids. Användningen av 17β-estradiol och PPD var främst för behandling av hjärt-kärlsjukdom. Eftersom, under utvecklingen av åderförkalkning i OVX-operated aopE-/- möss, från vecka 4 till vecka 12, 17β-ESTRADIOL eller PPD var peroralt administrerat.
En icke försumbar punkt av klinisk användning av HRT är dess skadliga biverkningar, som inkluderar äggstocks-och bröstcancer13,14. Den fytoöstrogen testas i den nuvarande studien är en steroid saponin förening som finns i Dioscorea växter. PPD har rapporterats ha en hämmande effekt på vissa cancer cellinjer20. PPD visar dessutom antiaterosklerotiska egenskaper som är jämförbara med dem för 17β-estradiol. Den modell vi presenterar här kan hjälpa Screen potentiella kandidat föreningar, inklusive fytoöstrogen, som utövar en minimal effekt på tumörproliferation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81202526 till J.X.), National Natural Science Foundation i Kina (81302769 till BS), Beijing Municipal Natural Science Foundation (47144226 till BS), den kinesiska postdoktorala Science Foundation (20110490325 till J.X.), och Ph.D. program Stiftelsen för undervisningsministeriet i Kina (20121106120031 till BS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17β-estradiol, >98% | Sigma-Aldrich | E8875-250MG | Estrogen |
| Disposable syringes (with 25 G needles) | Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd | 0.5*19TWLB | Cardiac bleeding |
| High-cholesterol mouse diet | Huafukang Bio-Technology | N/A | 1.25% cholesterol, 0% cholate |
| High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System | VisualSonics | Vevo®770 | Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463-250ML | Preparation of avertin |
| Micro Dissecting forceps, Curved 8mm | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Micro Dissecting forceps, Straight 8 mm | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mm | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mm | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mm | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | R413 | Suture and ligation of the tissues |
| Nut cream (Nutella) | Ferrero | N/A | Medium for peroral 17β-estradiol or PPD |
| OptiVisor optical glass binocular magnifier | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | Assistant of identifying the tissues during ovariectomy |
| Phosphate-buffered saline at pH 7.4 | SIGMA | P3813 | Preparing 1 L saline |
| Pro MultiLabel Microplate Reader | Tecan | Infinite M1000 | Plasma TC and TG determination |
| Pseudoprotodioscin | Shanghai Winherb Medical S & T Development | W-0427 | CAS registry no. 102115-79-7 |
| Rimadyl, 50 mg/mL | Pfizer Pharma GmbH | 462986 | Postoperative analgesia after ovariectomy |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-1L | Dissolving the 17β-estradiol or PPD |
| Solcoseryl Eye-Gel | Menarini, Solco Basle Ltd. | Eye protection during anesthesia | |
| Stereo microscope | MCALON | MCL-6STV | Image of the intimal region of aorta |
| Table model high speed centrifuge | SIGMA | 1-14K | Preparation of plasma |
| Scissors, slight Curve (14 cm) | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Scissors, straight Flat (14 cm) | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm) | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm) | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-5G | Preparation of avertin |
| Triglycerides (TG) assay kit | Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering | A110-1 | Plasma TG determination |
| Total cholesterols (TC) assay kit | Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering | A111-1 | Plasma TC determination |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Packard, B. L. Cardiovascular health and disease in women. The New England Journal of Medicine. 329 (4), 247-256 (1993).
- Samaan, S. A., Crawford, M. H. Estrogen and cardiovascular function after menopause. Journal of the American College of Cardiology. 26 (6), 1403-1410 (1995).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420 (6917), 868-874 (2002).
- Tremollieres, F. A., et al. Effect of hormone replacement therapy on age-related increase in carotid artery intima-media thickness in postmenopausal women. Atherosclerosis. 153 (1), 81-88 (2000).
- Bourassa, P. A., Milos, P. M., Gaynor, B. J., Breslow, J. L., Aiello, R. J. Estrogen reduces atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (3), 10022-10027 (1996).
- Squadrito, F., et al. Genistein supplementation and estrogen replacement therapy improve endothelial dysfunction induced by ovariectomy in rats. Cardiovascular Research. 45 (2), 454-462 (2000).
- Wang, D., et al. Endothelial dysfunction and enhanced contractility in microvessels from ovariectomized rats: roles of oxidative stress and perivascular adipose tissue. Hypertension. 63 (5), 1063-1069 (2014).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous Hypercholesterolemia and Arterial Lesions in Mice Lacking Apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-Deficient Mice Develop Lesions of All Phases of Atherosclerosis Throughout the Arterial Tree. Arteriosclerosis and Thrombosis. 14 (1), 133-140 (1994).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. 64 (e4013), 1-4 (2012).
- Rossouw, J. E., et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results From the Women's Health Initiative randomized controlled trial. The Journal of the American Medical Association. 288 (3), 321-333 (2002).
- Kumle, M. Declining breast cancer incidence and decreased HRT use. Lancet. 372 (9639), 608-610 (2008).
- Jager, W., et al. A randomized comparison of triptorelin and tamoxifen as treatment of progressive ovarian cancer. Anticancer Research. 15 (6B), 2639-2642 (1995).
- Bhathena, S. J., Velasquez, M. T. Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition. 76 (6), 1191-1201 (2002).
- Wang, L., Qiu, X. M., Hao, Q., Li, D. J. Anti-inflammatory effects of a Chinese herbal medicine in atherosclerosis via estrogen receptor beta mediating nitric oxide production and NF-kappaB suppression in endothelial cells. Cell Death and Disease. 4 (e551), 1-13 (2013).
- Xiao, J., Wang, N. L., Sun, B., Cai, G. P. Estrogen receptor mediates the effects of pseudoprotodiocsin on adipogenesis in 3T3-L1 cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (1), C128-C138 (2010).
- Guivarc'h, E., et al. Predominant Role of Nuclear Versus Membrane Estrogen Receptor alpha in Arterial Protection: Implications for Estrogen Receptor alpha Modulation in Cardiovascular Prevention/Safety. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-17 (2018).
- Osako, M. K., et al. Estrogen inhibits vascular calcification via vascular RANKL system: common mechanism of osteoporosis and vascular calcification. Circulation Research. 107 (4), 466-475 (2010).
- Ivanova, A., et al. Screening of some saponins and phenolic components of Tribulus terrestris and Smilax excelsa as MDR modulators. In vivo. 23 (4), 545-550 (2009).
- Xiao, J., Zhu, T., Yin, Y. Z., Sun, B. Notoginsenoside R1, a unique constituent of Panax notoginseng, blinds proinflammatory monocytes to protect against cardiac hypertrophy in ApoE(-/-) mice. European Journal of Pharmacology. 833 (15), 441-450 (2018).
- Sun, B., Xiao, J., Sun, X. B., Wu, Y. Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction in endotoxemic mice: an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt signalling. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1758-1770 (2013).
- Adams, M. R., et al. Inhibition of coronary artery atherosclerosis by 17-beta estradiol in ovariectomized monkeys. Lack of an effect of added progesterone. Arteriosclerosis. 10 (6), 1051-1057 (1990).
- Keaney, J. F. Jr, et al. 17 beta-estradiol preserves endothelial vasodilator function and limits low-density lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic swine. Circulation. 89 (5), 2251-2259 (1994).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 14 (1), 133-140 (1994).
- Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. American Journal of Physiology- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (5), R1531-R1539 (2001).
- Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (3), 414-420 (2005).
- Pignoli, P., Tremoli, E., Poli, A., Oreste, P., Paoletti, R. Intimal plus medial thickness of the arterial wall: a direct measurement with ultrasound imaging. Circulation. 74 (6), 1399-1406 (1986).
- Hodgin, J. B., Maeda, N. Minireview: estrogen and mouse models of atherosclerosis. Endocrinology. 143 (12), 4495-4501 (2002).
- Bush, T. L., et al. Cardiovascular mortality and noncontraceptive use of estrogen in women: results from the Lipid Research Clinics Program Follow-up Study. Circulation. 75 (6), 1102-1109 (1987).
- Marsh, M. M., Walker, V. R., Curtiss, L. K., Banka, C. L. Protection against atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL receptor-deficient mice. Journal of Lipid Research. 40 (5), 893-900 (1999).
