Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

A In Vivo אסטרוגן מחסור בעכבר מודל עבור ההקרנה הטיפולים האסטרוגן אקסודוגני של בעיות לב וכלי דם אחרי גיל המעבר

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/59536
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute of Medicinal Plant Development (IMPLAD), Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Shandong University of Traditional Chinese Medicine

Summary

קלינית, מחסור באסטרוגן בנשים בגיל המעבר עלול להחמיר את השכיחות של שיבוש השומנים טרשת עורקים. הקמנו במודל למחסור באסטרוגן vivo על-ידי כריתת אופוקטומיה דו צדדית באמצעות חתך כפול-רוחבי-לרוחב ב-apoE-/- עכברים. מודל העכבר ישים לסינון טיפולי אסטרוגן אקסוגני של בעיות לב וכלי דם לאחר גיל המעבר.

Abstract

נשים שלאחר גיל המעבר נמצאים בסיכון גבוה יותר לפתח מחלות לב וכלי דם מאשר נשים טרום גיל המעבר. עכברים נקבה ovariectomized (OVX) בתצוגה הגמילה גדל נגעים טרשת עורקים העורקים בהשוואה לעכברים נקבה עם תפקוד השחלות שלמות. עם זאת, מעבדה מודלים מעורבים עכברים לקוי אסטרוגן עם מצב נוטה טרשת עורקים חסרים. גרעון זה הוא חיוני כי מחסור באסטרוגן קליני בנשים בגיל המעבר עלול להחמיר את השכיחות של שיבוש קיים מראש או מתמשך טרשת עורקים. במחקר זה, אנו להקים מודל vivo אסטרוגן לקוי של העכבר על ידי הניתוח הדו באמצעות שכפול באמצעות החתך הצדדי כפול ב אפוליפופרוטאין E (apoe)-/- עכברים. לאחר מכן נשווה את ההשפעות של 17β-estradiol ו פסבדו-הפסטודיסין (PPD) (פיטואסטרוגן) המנוהל באמצעות כפולת אגוזי לוז. אנו מוצאים כי למרות PPD מפעילה כמה השפעה על הפחתת משקל הגוף הסופי ופלזמה TG ב OVX apoE- עכברים, יש לו אנטי-טרשת עורקים ויכולות להגנה לב בדומה לעמיתו 17β-estradiol שלה. PPD הוא פיטואסטרוגן שדווחו להפעיל תכונות אנטי-סרטניים. כך, השיטה המוצעת ישימה לסינון פיטואסטרוגנים באמצעות המינהל הפראורלי להחליף עבור טיפול הורמונלי חלופי המסורתית בנשים לאחר גיל המעבר, אשר דווחו יש פוטנציאל למניעת השטרוגנטיות קיבולת. הממשל הפראורלי באמצעות כפולת אגוזי לוז אינו פולשני, והוא מהווה עיבוד נרחב לחולים רבים. מאמר זה מכיל צעד אחר צעד הפגנות של כריתת אושתנים דו צדדית דרך החתך כפול ולרוחב ב apoE-/- עכברים וperoral 17β-estradiol או החלפת הורמון האסטרוגן באמצעות התפשטות אגוזי לוז. השומנים פלזמה ניתוח תפקוד לב וכלי דם באמצעות האקו לעקוב.

Introduction

מחקרים אפידמיולוגיים וקליניים הראו כי נשים בגיל המעבר הם בסיכון גבוה במידה ניכרת של מחלות לב וכלי דם מאשר נשים טרום גיל1,2. טיפול הורמונלי החלפת (HRT) עשוי להפחית את הסיכון היחסי של מחלות לב וכלי דם 0.37-0.793. בין היתר סיבוכים, טרשת עורקים נגרמת על ידי מחלות לב וכלי דם היא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם4. עם זאת, מעבדה מודלים מעורבים עכברים לקוי הצגת מצב נטייה טרשת עורקים חסרים. פרוטוקול זה מספק מודל העכבר vivo מחסור באסטרוגן להקרנה טיפולי אסטרוגן אקסוגני של בעיות לב וכלי דם לאחר גיל המעבר.

מחקרים קודמים מראים כי היישום של ovx ב טרשת עורקים מכרסמים האכילו דיאטה כולסטרול גבוה יכול לחקות נשים בגיל המעבר הסובלים טרשת עורקים5,6,7,8. מודל בעלי חיים ונוח הדומה למצב הטרשת עורקים בנשים בגיל המעבר הוא הבסיס למחקר אסטרוגן אקסוגני. כאן, החתך כפול מראש לרוחב של כריתת האווליטומיה הדו הוחל בחוסר טרשת עורקים מועדים בנוקאאוט E (apoe-/-) עכברים9,10. לעומת באמצע הבטן או החתך העצמי, החתך כפול ולרוחב הוא קל, פחות זמן לגזול שיטה שיכולה למנוע הדבקה חמורה של חלל הבטן ודלקת. המינהל הפראורלי באמצעות התפשטות אגוזי לוז (ראה שולחן החומרים) אינו פולשני ונוח, והוא מתאים באופן נרחב למצב ניהול לטווח ארוך11. השתלת הגלולה לאט שחרור הוא גם פופולרי6. עם זאת, שתלים מחמירים את השכיחות של זיהום במיוחד עכברים נתון OVX. מצבי ניהול אחרים שאינם פולשני, כגון gavage אוראלי ומינהל המים, יש גם החסרונות רבים. אוראלי gavage בדרך כלל עכברים לחץ ועלול לגרום לפציעה בוושט. ניהול ההורמון באמצעות מי השתייה מועיל מאוד; עם זאת, הוספת DMSO כמו אמולסיה הוא בלתי נמנע כמו אסטרוגני אקסוגניים אינם מסיסים במים. כאן, בחרנו peroral 17β-estradiol או החלפת הורמון האסטרוגן באמצעות התפשטות אגוזי לוז לניהול לטווח ארוך.

לאחרונה, את ההשפעה המועילה של HRT על מערכת לב וכלי דם של נשים בגיל המעבר כבר התחרו ביוזמת בריאות הנשים () מבחנים12. מצד אחד, אסטרוגן אקסוגני לבדו מפעיל השפעה מועילה על מערכת לב וכלי דם; לעומת זאת, הוא יכול לשלב עם אצטט הידרו הפרוגסטרון מידי כדי להגביר את הסיכון לאירועי לב וכלי דם. ברצינות רבה יותר, HRT עלול להוביל התקדמות הגידול בשד והרחם, ואפקט זה הגביל במידה ניכרת את השימוש בו13,14. עניין רב יותר התמקד השפעות לב וכלי דם של אסטרוגני אקסוגניים חסר פעילות mitotic בתאים סרטניים15,16,17. מחקרים מרובים בבני אדם ובעלי חיים מראים כי פיטואסטרוגנים עם מבנים דומים לזה של אסטרוגנים יכולים לשחק תפקיד מועיל בהגנה על לב וכלי דם15,18.

כך, מטרות העבודה הנוכחית הם (i) כדי לבנות מודל העכבר vivo מחסור באסטרוגן על ידי הניתוח הדו באמצעות לחיצה כפולה על גבי לרוחב כפול ב-apoE-/- עכברים ו-(ii) כדי להשוות את ההשפעות הגנה לב וכלי דם של perorally מנוהל 17β-estradiol ו פסבדו-דרך (PPD), באמצעות כפולת אגוזי לוז. 17β-estradiol הוא סוג אחד של אסטרוגן אקסוגני השייכת לנשים הורמונים מיניים6,11,19. PPD, סאפונין סטרואיד ופיטואסטרוגן מצמחים דיאוזורע , דווח בעבר להפעיל תכונות אנטי סרטניים20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל טיפול בעלי חיים ופרוטוקולים ניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של האקדמיה הסינית למדעי הרפואה והמכללה הרפואית של האיחוד בפקינג (הרשאה מספר: SYXK (בייג) 2013-0023). המקור של apoe- עכברים הוא C57BL/6j9,10.

1. כריתת אונוקטומיה דו צדדית באמצעות כפול-חתך לרוחב ב-apoE- עכברים

  1. בגמילה (גיל 28 ימים), מורדם נקבה apoE-/- C57BL/6j עכברים עם avertin (triרומטוזיס; 200 מ"ג/ק"ג; intraperitoneally).
    הערה: 32 apoe-/- עכברים חולקו באופן אקראי ל 4 קבוצות: מדמה, ovx, ovx/E2, ו ovx/PPD (n = 8 לכל קבוצה).
  2. מניחים את החיה בתנוחה מועדת על משטח חימום. החלת סיכה העין להגנת העין במהלך ההרדמה.
  3. לשמור על טמפרטורת הגוף בתוך 36 ± 0.5 ° c. ניהול 5 מ"ג/ק"ג משקל הגוף של carprofen תת-עורי משכך כאבים להיבט הרוחבי של הצוואר של העכבר.
  4. לגלח 3 x 5 ס מ2 העכבר באזור מתוך הרכס כסל. לפני כיסוי בעל החיים עם 3 x 5 ס מ2 כירורגי הצמצם גיליון, לנקות את האזור מגולח ביסודיות עם יוד ולאחר מכן 70% אתנול. השתמש בכלים ובכפפות סטריליים במהלך הניסוי.
  5. השימוש מספריים מלקחיים לעשות חתך 1 ס מ לרוחב לקו האמצע ו 1 ס מ לרוחב הצלעות הקוסטל.
  6. מנתחים את רקמת העור. בעזרת מלקחיים
  7. השתמש במשקפת מבתר (ראה טבלת חומרים) כדי לזהות את רקמת השומן הלבנה בחלל הבטן.
  8. השתמש מיקרו מספריים ומיקרולקחיים לעשות חתך של 0.5 1 ס מ דרך fascia עד חלל הבטן הוא הגיע.
    הערה: לקבוצה הפועלת באמצעות התחזות, סגרו את הפצעים ישירות. תפר את שכבת השריר ואת העור בנפרד באמצעות תפר מונופינט.
  9. כאשר ניתן לראות את רקמת השומן הלבנה בחלל הבטן, תפסו את רקמת השומן בעזרת מלקחיים ובעדינות משוך אותו החוצה. ניתן לראות שחלה ורודה בצורת תות עטוף ברקמת אדיפוז בחלל הבטן.
  10. ליגייט הספינה הארוכה ביותר של 0.5-1 ס מ וקרן הרחם באמצעות תפר מונופינט. הסר את השחלה באמצעות מיקרו מספריים ומניחים את הרקמה הנותרת בחזרה לחלל הבטן.
    הערה: התופעות השליליות העיקריות לפעולת ה-OVX היא הארכה של השופכה המובילה לתמותה גבוהה בעכברים מופעלים בOVX. ניתן להימנע מכך על ידי זיהוי רקמות באמצעות מבתר.
  11. . סגרו את הפצעים תפר את שכבת השריר ואת העור בנפרד באמצעות תפר מונופינט.
  12. השימוש מספריים מלקחיים לעשות עוד חתך 1 ס מ לרוחב לקו האמצע ו 1 ס מ לרוחב הצלעות הקוסטל בצד השני. חזור על ההליך הנ ל (1.5 עד 1.11).
  13. . תן לחיה להתעורר מהרדמה בנפרד לשמור על העכבר ביום הראשון לאחר הניתוח.
  14. נקה או החלף את הכלוב לעתים קרובות במהלך שלב ההחלמה.
  15. כ 24 שעות לאחר הניתוח, ניהול אחר 5 מ"ג/ק"ג משקל הגוף של carprofen תת-עורי משכך כאבים.

2. מינהל פרפה של 17β-אסטרדינול או PPD באמצעות ממרח אגוזי לוז

  1. מתמוסס ביסודיות 17β-estradiol או PPD בשמן שומשום, ולאחר מכן מערבבים את שמן הסומסום עם התפשטות אגוזי לוז (ראו טבלת חומרים). חלק יומי עבור כל 30 g העכבר מכיל 3 μg של 17β-estradiol או 15 μg של PPD, 4 μL של שמן שומשום, ו 60 מ ג של כפולת אגוזי לוז. להכין פלצבו עבור כל 30 g העכבר מכיל 4 μL של שמן שומשום ו 60 מ ג של כפולת אגוזי לוז.
    הערה: החלק היומי של המינהל של 17β-estradiol או PPD היה מבוסס על מחקרים קודמים6,11 וניסויים מוקדמים.
  2. שבוע לאחר OVX, להאכיל את העכברים עם דיאטה כולסטרול גבוה (1.25% כולסטרול, 0% המרה) עבור 12 שבועות. ערכת טיפול ניסיונית טיפוסית, כפי שהיא משמשת במחקר זה, מומחש באיור 1.
  3. 5 ימים לפני המינהל הפראורלי של התפשטות אגוזי לוז בשבוע 4, הרכבת עכברים לאכול את הפלצבו המכיל כ 30 מ ג לוז התפשטות עבור 2-5 עכברים עבור 5 ימים. הרכבת את העכברים בקבוצות בכלובים שלהם בבית במהלך 3 הימים הראשונים. מניחים את העכברים בכלובים נפרדים בימים הרביעי והחמישי של ההכשרה ומשרתים את החלק היומי כדי להידמות למצב הניסיוני.
  4. במהלך 9 השבועות האחרונים, מניחים את העכברים בכלובים נפרדים ולאחר מכן מגישים חלק יומי בחלק התפשטות אגוזי לוז עבור כל אירוע האכלה.
    הערה: מגישים חלק יומי המכיל 17β-estradiol (0.1 mg · ק"ג-1) או PPD (0.5 mg · ק"ג-1) באמצעות התפשטות אגוזי לוז ב ovx/E2 ו-ovx/בקבוצה PPD בהתאמה; מגישים חלק יומיומי המכיל התפשטות אגוזי לוז ללא הורמונים בקבוצת שאם ו-OVX.

3. קביעת אינטימה-עובי מדיה ותפקוד לב באמצעות מערכת מיקרוטרקול

  1. בדיקת אולטרה-גוניות
    1. יום אחד לפני סיום, לבחון את עובי התקשורת intima ותפקוד הלב באמצעות מערכת סאונד מיקרוטרקול (ראה טבלת חומרים) כפי שתוארה בעבר21.
    2. לפני בדיקה, לתת לכל עכבר 200 mg/ק"ג הזרקת הצפק של avertin (triרומטוזיס) כמו הרדמה (n = 8 עכברים לכל קבוצה).
    3. גלח בזהירות את שיער הצוואר של כל עכבר. החל ג'ל שידור חם אולטרסאונד ליבראלי כדי להבטיח איכות תמונה אופטימלית.
    4. לקבל תמונות ultrasonographic בסיסית של השורש אבי העורקים בסדר העורקים עם הראש 30 MHz לסרוק במוקד 12.7 מ"מ ברזולוציה של 40 μm.
    5. השתמש באלקטרוקרדיוגרפיה עם תצורה מובילה II לניטור.
    6. ללכוד את הזכות בתמונות ציר ארוך של אבי העורקים העולה, קשת אבי העורקים, וענף עורק העורקים בזרוע במטוס אחד סיסטולה (איור 3).
  2. מדידות של אינטימה-מדיה ועובי רובד מקסימלי
    1. להתאים את המרחק בין מתמר לאתר העורקים בקלות כדי לקבל תמונות ברורות.
    2. לאחסן לולאה של 10 s cine דיגיטלית עבור בדיקה לא מקוונת על מערכת ניתוח תמונה.
    3. בחרו תמונה מיטבית של מסגרת ההקפאה באולטרסאונד באופן ידני למדידות נוספות. בדוק את התמונות בעקמומיות המשנית של העורקים העולים. אם ניתן לראות את הפלאק במעלה העורקים העולה, למדוד את עובי הרובד המקסימלי. אם לא ניתן לראות את הפלאק במעלה העורקים העולה, למדוד את ה-IMT המקסימלי.
    4. למדוד את IMT (מרחק בין ממשק כלי הדם לומיאל לבין הממשק המדילי-האדוטי). מדידת עובי הרובד המקסימלי (המרחק העבה ביותר בין הגבול של לומן כלי הדם לבין השכבה האדוירית).
    5. ממוצע הנתונים מתוך שלושה אתרי הנגע (איור 3).
  3. קביעת תפקוד הלב לקוי באמצעות אקוקרדיוגרפיה
    הערה:     לבחון את תפקוד הלב באמצעות האקו באמצעות מערכת סאונד מיקרוטרקול, כפי שמתואר בעבר22.
    1. מכוונים קרן אולטרה סאונד לכיוון הלב, ליד שרירי הלסת.
    2. השג הדמיה דו-מימדית. מבוססת קילוהרץ
    3. לבצע בתוך האקו vivo החזה של החדר השמאלי באמצעות לסרוק 30 MHz הראש.
    4. למדוד את הפרמטרים המשויכים לתפקוד הלב באופן דיגיטלי מפני מדידת מצב M.
    5. ממוצע הנתונים מתוך שלושה עד חמישה מחזורי לב (שולחן 1).
  4. שינויים בפנים ובמתבונן
    1. לצורך אימות של השונות התוך-משקיף, לנתח את הנתונים על ידי אופרטור אחד בשני מקרים שונים.
    2. להערכת ההבדלים בין המתבונן, לנתח את הנתונים על ידי אופרטור אחר.

4. משקל גוף שבועי מדידה הכולל פלזמה כולסטרול (TC) וטריגליצרידים (TG) הגדרה

  1. מדידת משקל גוף שבועי
    1. מדידת משקולות הגוף פעם בשבוע משבוע -1 עד שבוע 12.
      הערה: n = 8 עכברים לכל קבוצה.
  2. הכנת פלזמה
    1. לפני איסוף דגימות דם דרך ניקוב תאיים, להכין מזרקים וצינורות. השתמש ב-EDTA כנוגד קרישה. הוסף 10 μL של 0.5 M EDTA ל 2 מזרק mL, ולהוסיף 8 μL של 0.5 M EDTA לכל 1.5 mL שפופרת.
    2. בשבוע 12, אחרי לילה מהיר, מורדם העכברים עם avertin (triרומטוזיס; 200 mg/ק"ג; intraperitoneally).
      הערה: n = 3 עכברים לכל קבוצה.
    3. הכינו את אזור החזה הגחוני. עם 70% אתנול
    4. השימוש במספריים ומלקחיים כדי לפתוח את חלל החזה ולחתוך את הצלעות עד שהלב הפועם נחשף.
    5. הכנס את המחט של 25 גרם לחדר הימני. מנושף לאט עד שהדם מתחיל. לזרום לתוך המזרק
      הערה: אנו משתמשים מזרקים חד פעמיים במצב סטרילי עם 25 גרם מחטים (ראה לוח חומרים).
    6. . המשך ללחוץ בזהירות, אפילו לחץ אם לא נראה דם, מקם מחדש את המחט ושאיפה חוזרת.
    7. השאר עכברים מורדם עמוקות לפני איסוף נפח הדם הנדרש. בדרך כלל, ניתן לאסוף עד 1 מ ל של דם. המתת החסד העכברים על ידי פריקה צוואר הרחם תחת זה מצב עמוק הרדמה.
    8. הפיפטה דגימות דם לתוך צינורות 1.5 mL ולהפוך את הדם ביסודיות כדי להבטיח ערבוב EDTA לתוך הדם. . ואז הצב דגימות דם על הקרח מיד
    9. דגימות צנטריפוגה עבור 20 דקות ב 400 x g ב 4 ° c בתוך 30 דקות של אוסף.
    10. אסוף את הסופרנטנט בזהירות. מחלקים ומאחסנים דגימות פלסמה ב-80 ° c.
  3. בניית עקומות סטנדרטיות למדידת תוכן TC או TG
    1. עבור עקומת התקן TC, להכין ריכוזים שונים של תקני כולסטרול: 0 ממול/L, 0.52 ממול/l, 1.03 mmol/L, 2.07 m מול/L, 4.14 mmol/L, 6.20 m מול/L, 8.27 m מול/L ו-10.34 mmol/L. מדידה מנת יתר עבור כל תקן כולסטרול. הגדרת מנת יתר ממוצעת עבור כל תקן כולסטרול. כערך הציר האנכי (Y), קבע את הריכוז כערך הציר האופקי (X). צור עקומה סטנדרטית באמצעות תוכנה סטטיסטית.
    2. עבור עקומת TG, הכינו ריכוזים שונים של תקני TG: 0 ממול/L, 0.45 ממול/l, 0.90 m מול/L, 1.81 m מול/L, 3.62 mmol/L, 5.42 m מול/L, 7.23 m מול/L ו-9.04 mmol/L. מדידה למנת יתר עבור כל תקן TG. הגדר מנת יתר ממוצעת עבור כל תקן TG כערך הציר האנכי (Y); קביעת הריכוז כערך הציר האופקי (X). צור עקומה סטנדרטית באמצעות תוכנה סטטיסטית.
      הערה: התאמת עקומה לוגיסטית בעלת ארבעה פרמטרים (4-pl) שימש לבניית העקומה הסטנדרטית במחקר הנוכחי. בדוק את עקומת התקן לפני מדידת דגימות פלזמה ולוודא r2 גדול מ 0.995.
  4. מדידת תוכן TC
    1. סמן את בקבוק מגיב הצבע (25 mL) מערכת שיטת TC בתור "פתרון עבודה TC".
    2. מערבולת את דגימות הקירור לזמן קצר. הכנת דילול: 20 μL של פלזמה ב-80 μL של מים מזוקקים. . לקצר את המערבולת
    3. הוסף 2.5 μL של תקני כולסטרול (5.17 mmol/L) או 2.5 μL של פלזמה מדולל או 2.5 μL של מים מזוקקים (ריק) לבארות המתאימות של צלחת 96-באר. מומלץ לTriplication.
    4. לכל הבארות, הוסף 250 μL של מגיב הצבע.
    5. מודקון ב 37 ° c עבור 10 דקות.
    6. הפוך את הקורא המיקרו-לוחית והרשה 10 דקות להתחמם.
    7. להסיר את הצלחת (ים) מן החממה ולקרוא את הקורא מיקרופלייט ב 510 nm. ודא כי שום בועות או אבק נמצאים בבארות microtiter או בתחתית הצלחת, בהתאמה.
    8. חשב את הריכוז TC כדלקמן:
      המשך TC = רמת כולסטרול × (דגימת פלזמה ממנת יתר)/(תקן כולסטרול למנת יתר-ריק O. D)
  5. מדידת תוכן TG
    1. סמן את בקבוק מגיב הצבע (25 מ ל) מערכת שיטת TG כ-"פתרון העבודה TG".
    2. מערבולת את דגימות הקירור לזמן קצר.
    3. הוסף 2.5 μL של התקנים TG (2.26 mmol/L) אל או 2.5 μL של פלזמה מדולל או 2.5 μL של מים מזוקקים (ריק) לבארות המתאימות של צלחת בגודל 96. מומלץ לTriplication.
    4. לכל הבארות, הוסף 250 μL של מגיב הצבע.
    5. מודקון ב 37 ° c עבור 10 דקות.
    6. הפוך את הקורא המיקרו-לוחית והרשה 10 דקות להתחמם.
    7. להסיר את הצלחת (ים) מן החממה ולקרוא את הקורא מיקרופלייט ב 510 nm.
      הערה: ודא כי הם לא בועות או אבק נמצאים בבארות microtiter או בתחתית הצלחת.
    8. חשב את הריכוז TG כדלקמן:
      המשך TG. = המשך התקנים של TG (דגימת פלזמה)/(תקן TG-למנת יתר)

5. En ניתוח פנים של הנגעים טרשת עורקים אבי העורקים

  1. בידוד וכריתה של העורקים
    1. בשבוע 12, אחרי לילה מהיר, מורדם העכברים עם avertin (triרומטוזיס; 200 mg/ק"ג; intraperitoneally). המתת החסד העכברים על ידי פריקה צוואר הרחם תחת זה מצב עמוק הרדמה.
      הערה: השתמשנו בשלושה עכברים לכל קבוצה.
    2. הכינו את אזור החזה הגחוני. עם 70% אתנול השימוש במספריים ומלקחיים כדי לפתוח את חלל החזה ולחתוך את הצלעות עד שהלב הפועם נחשף.
    3. ממלאים מזרק 50 mL עם מלוחים באגירה פוספט ב-pH 7.4 (ראה לוח חומרים). הוסף 25 גרם מחט לתוך החדר השמאלי לחתוך את האטריום הימני כדי למנוע לחץ גבוה מן perfusion.
    4. בצע את הפרזיה באתרו בקצב הזרימה של 0.05-0.08 mL/min. לקלוט נוזל היתוך עם רקמות.
    5. הסרת צלעות והריאות חלל החזה עם מספריים מלקחיים. ואז, לפתוח את חלל הבטן ולהסיר את האיברים בתוך לתצוגה טובה יותר של אבי העורקים.
    6. להסיר את העורקים על ידי החזקת הלב עם המיקרולקחיים והפרדת העורקים מעמוד השדרה.
      הערה: כאשר מבתר ליד הענפים פרפור הכליות, לחתוך עמוק באמצעות מיקרו מספריים כדי למנוע נזק העורקים.
    7. תקן את הלב ואת העורקים עבור 48 h ב 4% פאראמפורמלדהיד. אחסן את הaortas בתמיסת מלח בטמפרטורת החדר או ב-2-8 ° c למשך מספר שעות.
      הערה: הליך זה יקל על הניקוי.
  2. הכנת העורקים
    1. . תסיר את הלב הסירו בזהירות את הרקמות האדוaortas מתוך השימוש במיקרולקחיים ובמיקרומיקרוטרים מתחת לstereomicroscope. השתמש תמיסת מלח כדי לשמור על הרקמה לחות במהלך הניקוי.
      הערה: היזהר לא לקרוע או לגנוב את העורקים וכמה ענפים חשובים, כגון עורק בלתי מקובל, שמאל עורק הראש המשותף, והשאיר עורק ריחי.
    2. ולנתק את כל העורק. השמאלי של העורק
    3. חותכים את העקמומיות החיצונית דרך העורק החיצוני, ואז לעורק הראש המשותף השמאלי ולאחר מכן לעורק התת-ממדי השמאלי.
    4. לחתוך לפתוח לאורך העקמומיות הפנימית של החלק העולה לתחתית החלק הבטן.
    5. להצמיד את העורקים שטוח על גיליון פלסטיק שחור להחיל תמיסת מלח כדי לשמור על aortas מפני ייבוש.
  3. דימוי של אזור האינטימיות של העורקים
    1. צלם תמונות של aortas face עם מיקרוסקופ סטריאו. כלול סרגל קנה מידה מילימטר בתמונות כדי לכייל מדידות.
    2. כלול את השער ואת אזורי החזה באותה תמונה ואת אזור הבטן באחר. שמירת תמונות כ-JPEG או TIFF.
      הערה: אזור הקשת הוא מן הצומת של שריר הלב עד 3 מילימטר מעורק ריחי שמאל, אזור החזה הוא 3 מ"מ מעבר לעורק ריחי שמאל העורק האחרון, ואת אזור הבטן הוא עורק הבינקוסטל האחרון כדי כסל סתעפות.
  4. קוונפיקציה של הנגע טרשת עורקים-en השיטה הפנים
    1. כיול
      1. פתח את התמונה עם תוכנת ניתוח תמונה (ראה טבלת חומרים), עבור לכיול המרחבי ובצע את ההוראות.
      2. שנה את יחידות ההתייחסות ל-mm על-ידי מיקום הסרגל מעל הקו.
    2. דידה
      1. הגדר כיול נכון עבור כל תמונה.
      2. מדידת 3 מ"מ על הסרגל.
      3. קשת ואזור החזה מדידה: מתווה את אזור הקשת מהצומת של שריר הלב כדי 3 מ"מ מתוך העורק ריחי השמאלי ואת האזור החזה מ 3 מ"מ מעבר לעורק התת-ממדי השמאלי לעורק הבינקוסטל האחרון. מעקב אחר נגעים בקשת ובאזור בית החזה ולהסתכל על העורקים דרך המיקרוסקופ.
      4. מדידה באזור הבטן: מתווה את אזור הבטן מקצה אזור החזה ועד הביפריון כסל. מעקב אחר נגעים באזור הבטן ולהסתכל על אבי העורקים דרך המיקרוסקופ.
      5. לחשב את אזור הנגע יחסית למשטח הפנימי של העורקים.
      6. בדיקת קוונפיקציה דרך משקיף שני העיוור לקבוצות הלימוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ערכת טיפול ניסיונית טיפוסית, כפי שהיא משמשת במחקר זה, מומחש באיור 1. בגמילה (גיל 28 ימים), נקבה apoE-/- C57BL/6j עכברים היו מורדם withavertin (triרומטוזיס; 200 מ"ג/ק"ג; intraperitoneally). עכברים היו בקיעים OVX או הדמה מופעל דרך חתך 1 ס מ. שבוע לאחר OVX הדו, העכברים האכילו דיאטה כולסטרול גבוה (1.25% כולסטרול, 0% המרה) במשך 12 שבועות. 17β-Estradiol (0.1 mg · ק"ג-1) או PPD (0.5 mg · ק"ג-1) היה מנוהל במקביל באמצעות התפשטות אגוזי לוז במהלך 9 השבועות האחרונים של הטיפול. כל העכברים שקלו שבועי. כפי שמוצג באיור 2, ההשפעות של שניהם אסטרוגני אקסוגני (17β-estradiol ו-PPD) על שומנים פלזמה ומשקל גוף שבועי של apoe-/- עכברים לאחר מחסור באסטרוגן הוערכו. לאחר 12 שבועות של דיאטה גבוהה כולסטרול, העכברים OVX הראו עלייה יוצאת דופן ב-פלזמה TC ו TG ריכוזי. עכברים OVX מנוהל בעל פה עם 17β-estradiol או PPD באמצעות התפשטות אגוזי לוז הציגו באופן משמעותי ריכוז TC של פלזמה מאשר עכברים מופעלים המזויף (איור 2A). מפלס ה-TG של הפלזמה ירד ב-OVX עכברים שמנוהל באמצעות 17β-estradiol אך לא עם PPD (איור 2B). כפי שמוצג באיור 2C, בעוד נטייה כלפי משקל גוף מוגבר (bw) נצפתה בעכברים ovx לעומת העכברים מופעלים המזויף, BW ב-ovx עכברים מנוהל עם 17β-estradiol או PPD באמצעות התפשטות אגוזי לוז לאחר דיאטה גבוהה כולסטרול הראו נטייה מול זה ב-OVX עכברים. עם זאת, משקל הגוף הסופי של עכברים בקבוצות שונות לא הראה שינויים משמעותיים.

תפקוד לב וכלי דם הוערך באמצעות אקו-קרדיוגרפיה. כפי שניתן לראות באיור 3, הרובד המקסימלי או החוסר של העורקים העולה נמדד בעכברים מנוהלים עם 17β-estradiol או PPD באמצעות כפולת אגוזי לוז. הקשת של אבי העורקים של גבוהה-כולסטרול-דיאטה-האכלה apoE- עכברים נצפו על ידי אקו-מצב B. מייצגים תמונות האורך של העורקים העולה נתפסו על ידי ultrasonographic ביוקסגרפיות. . החיצים האדומים מצביעים על הפלאק העכברים OVX הציגו להגדיל את הרובד המקסימלי או IMT של העורקים העולה לעומת עכברים מופעלים המזויף. בעקבות הממשל האוראלי של 17β-estradiol או PPD באמצעות התפשטות אגוזי לוז, הרובד המקסימלי או IMT של העורקים העולה ירד במידה ניכרת לעומת זה של עכברי OVX. (איור 3). כמו כן הבחנו בתפקוד הלב בתגובה OVX ב apoE-/- עכברים לאחר 12-שבועות דיאטה-כולסטרול-תזונה (שולחן 1). תפקוד הלב נבדק. באמצעות אקו-לב ב-OVX עכברים, המינהל הפראורלי של 17β-estradiol או PPD באמצעות התפשטות אגוזי לוז עלול להחליש באופן חלקי פרמטרים המראים תפקוד לב.

בשלב הבא, השתמשנו בניתוח פנים. כדי לקבוע נגעים טרשת עורקים מאבי העורקים כפי שדווח בעבר, לאחר 12 שבועות, דיאטה גבוהה כולסטרול הוביל היווצרות טרשת עורקים פלאק על פני הלומיאל של העורקים. כפי שמוצג באיור 4, האחוז הממוצע של אזור הנגע אבי העורקים ביחס לאזור אבי העורקים כולו גדל באופן משמעותי בעכברי ovx. בעקבות מינהל שבעל פה עם 17β-estradiol או PPD באמצעות התפשטות אגוזי לוז, אזור הנגעים אבי העורקים ירד במידה ניכרת לעומת זה של המקבילה עכברים OVX. תוצאה זו היא עקבית עם ההגנה של 17β-estradiol או PPD מפיתוח טרשת עורקים המוצגת באיור 3.

לסיכום, ההליך המוצע, אשר משתמש בניתוח משתנים דו-צדדיים באמצעות חתך דו צדדי לרוחב ב-apoE-/- עכברים, הוא ישים עבור הקרנה טיפולים שאינם פולשנית אסטרוגן לקוי של בעיות לב וכלי דם לאחר גיל המעבר. היא גם שימושית במיוחד להימנעות מקיבולת מניעת הצורך.

Figure 1
איור 1. ערכת טיפול בעכבר. הגמילה (גיל 28 ימים), נקבה apoE-/- C57BL/6j עכברים היו מורדם עם avertin (triרומטוזיס; 200 מ"ג/ק"ג; intraperitoneally). עכברים היו בקיעים ovariectomized (OVX) או מופעל באמצעות חתך של 1 ס מ. שבוע לאחר OVX, העכברים ניזונו דיאטה כולסטרול גבוה (1.25% כולסטרול, 0% המרה) במשך 12 שבועות. 17β-Estradiol (0.1 mg · ק"ג-1) או PPD (0.5 mg · ק"ג-1) היה מנוהל במקביל באמצעות התפשטות אגוזי לוז במהלך 9 השבועות האחרונים של הטיפול. כל העכברים שקלו כל שבוע. בשבוע 12, ניתוח תפקודי לב וכלי דם הוערך באמצעות אקו-קרדיוגרפיה. לאחר 12 שבועות של דיאטה כולסטרול גבוה, כל העכברים היו מורדמים, ודגימות דם ורקמות נקצרו לחקירה נוספת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
. איור 2 השפעות אסטרוגנים שונים האקסוגניים על שומנים פלזמה ומשקל גוף שבועי ב-apoE-/- עכברים. העכברים האלה עברו ניתוח מבוים וקיבלו דיאטה בכולסטרול גבוה. העכברים OVX עברו כריתת האושתנים דו צדדית ולאחר מכן באופן אקראי לתוך הקבוצות הבאות: קבוצת OVX, אשר טופלה באמצעות דיאטה גבוהה כולסטרול; קבוצת OVX/E2 (17β-estradiol), אשר קיבלה דיאטה כולסטרול גבוה במשך 12 שבועות ובנוסף 0.1 מ"ג/ק"ג E2 באמצעות המינהל הפראורלי דרך התפשטות אגוזי לוז עבור 9 השבועות האחרונים של הטיפול; וקבוצת OVX/PPD, שקיבלה דיאטה ברמת כולסטרול גבוהה במשך 12 שבועות ועוד 0.5 מ"ג/ק"ג באמצעות המינהל הפראורלי באמצעות התפשטות אגוזי לוז ב -9 השבועות האחרונים של הטיפול. רמת הכולסטרול ורמות הטריגליצרידים של הפלזמה נמדדו באמצעות שיטות אנזימטיות (A-B). נתונים מבוטאים כאמצעי ± SEM של n = 5 עכברים לכל קבוצה. משקולות גוף שבועי נמדדו משבוע -1 עד שבוע 12 (ג). נתונים מבוטאים כאמצעי ± SEM של n = 8 עכברים לכל קבוצה. בכיוון אחד של ANOVA ואחריו נערך הבדיקה הפוסט-הוק של דנטו עבור השוואות מרובות. *p < 0.05 לעומת הקבוצה המזויף; # p < 0.05 לעומת קבוצת ovx. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
. איור 3 IMT או מדידות עובי הפלאק המקסימלי ב-apoE- עכברים. ב-מצב תמונות מראה את קשת אבי העורקים של apoE- עכברים מוצגים. את התמונות האורך של העורקים העולה הושגו על ידי ultrasonographic ביוקסוגרפיות. רובד מקסימלי או IMT של העורקים העולה (mm) נמדד. תמונות אולטרה-באולטרגרפיות מציגות פלאק בעקמומיות הקטנה של העורקים העולה; החיצים האדומים מציינים את הפלאק. נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM של n = 8 עכברים לכל קבוצה. בכיוון אחד של ANOVA ואחריו נערך הבדיקה הפוסט-הוק של דנטו עבור השוואות מרובות. *p < 0.05 לעומת הקבוצה המזויף; # p < 0.05 לעומת קבוצת ovx. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. En ניתוח פנים של נגעים טרשת עורקים אבי העורקים ב-apoE-/- עכברים. האחוז הממוצע של אזור הנגעים של אבי העורקים ביחס לאזור אבי העורקים כולו היה מכמת בכל הקבוצות. מיקרוגרפים מייצגים של נגעים האינטימיות (הפנים הצמודים) של העורקים מוצגים. נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM של n = 3 עכברים לכל קבוצה. בכיוון אחד של ANOVA ואחריו נערך הבדיקה הפוסט-הוק של דנטו עבור השוואות מרובות. *p < 0.05 לעומת הקבוצה המזויף; # P < 0.05 לעומת קבוצת OVX. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שאם בעלי מכבש OVX/E2 OVX/PPD
LVIDd (mm) 3.72 ± 0.10 3.74 ± 0. 24 3.68 ± 0.16 3.88 ± 0.16
LVIDs (mm) 2.34 ± 0.11 2.16 ± 0.22 2.12 ± 0.13 2.55 ±0.12
IVSd (mm) 0.83 ± 0.09 0.84 ± 0.07 0.91 ± 0.05 0.74 ±0.06
איוס (ממ) 1.24 ± 0.02 1.35 ± 0.06 * 1.45 ±0.04 1.09 ±0.04
PWTd (ממ) 0.7 ± 0.10 0.68 ± 0.04 0.72 ± 0.07 0.58 ±0.07
PWTs (ממ) 1.10 ± 0.12 1.17 ± 0.08 1.24 ± 0.04 0.98 ±0.08
EDV (mm3) 58.89 ± 3.74 59.88 ± 9.02 57.39 ± 5.79 65.11 ± 6.13
ESV (mm3) 18.86 ± 2.17 15.75 ± 4.00 14.85 ± 2.37 23.45 ±2.64
EF (%) 67.84 ± 1.52 73.91 ± 3.63 * 74.23 ± 1.50 63.91 ±3.61
FS (%) 37.19 ± 1.53 42.22 ± 1.17 * 42.36 ± 1.21 34.28 ±2.69
LVIDd = LV קוטר פנימי במהלך הדיאמייד; LVIDs = LV בקוטר פנימי במהלך systole; IVSd = מחיצת המוח הפנימית במהלך הדיאמטה; IVSs = מחיצת המוח הפנימית במהלך systole; PWTd = עובי הקיר האחורי במהלך דיאמגנב; PWTs = עובי הקיר האחורי במהלך systole; EF = שבר הוצאה; FS = קיצור השבר; EDV = נפח קצה-דיאסטולי; ESV = אמצעי אחסון בקצה הסיסטולי.

טבלה 1: הערכת תפקודי לב באמצעות אקוקרדיוגרפיה. פרמטרים המשויכים לתפקוד הלב באופן דיגיטלי מפני מקשר ממצב M הוככמת בכל הקבוצות. נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM של n = 8 עכברים לכל קבוצה. בכיוון אחד של ANOVA ואחריו נערך הבדיקה הפוסט-הוק של דנטו עבור השוואות מרובות. *p < 0.05 לעומת הקבוצה המזויף; # p < 0.05 לעומת קבוצת ovx.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המתודולוגיה המתוארת כאן היא מודל העכבר דמוי שיבוש השומנים טרשת עורקים לראות נשים בגיל המעבר. הוא מתועד היטב כי מחסור באסטרוגן בנשים בגיל המעבר יכול להחמיר את השכיחות של מראש קיים או מתמשך היפרכולסטרולמיה עם מורכבות בהדרגה atherosclerostic נגעים נפוצים1. כדי לחקות את המצב הנוטה טרשת עורקים במרפאה, עכברים לקוי, מקור הנוזלי ונוח של בעלי חיים שבהם ללמוד atherogenesis23,24,25, הוחלו. כפי שמוצג במחקר הנוכחי, נקבה OVX apoE- עכברים על הגמילה הציג גידול בנגעים טרשת עורקים ב אב העורקים לעומת הנקבה apoe- עכברים עם תפקוד השחלות ללא פגע. במודל בעלי חיים זה, אנחנו גם השוו את ההשפעה של טיפולים שונים החלפת אסטרוגן שונות על טרשת עורקים בגודל תחת במצב תזונתי מבוקרת.

החתך הכפול והרוחבי של הניתוח הדו המוצג במאמר זה הוא מבחינה טכנית קלה יותר, פחות זמן רב, ובטוח יותר לעומת החתך האמצעי-לרוחב או חתך הבטן האמצעי של כריתת הערמונית הדו ב-apoE- עכברים. כריתת ביניים דו-צדדית באמצעות חתך הבטן התיכונה מציג חיסרון משמעותי: זה עלול לגרום הדבקה חמורה בחלל הבטן, אשר, בתורו, עשוי להשפיע על ספיגת הסמים. דיווחים אחרונים מראים כי הממשל האוראלי של מינון נמוך 17β-estradiol מגן מפני איסכמיה מוחית26. לפיכך, בחרנו באדמיניסטרציה הפרו-אוראלית באמצעות התפשטות אגוזי לוז במחקר הנוכחי. כדורי מסחרי איטי-שחרור הם מצב ניהול לעתים קרובות עבור בדיקת אפקטים תרופתי במודל העכבר, אבל עלול לגרום נזק מוחי מזיק27. שתלים הם נוטים זיהומים, במיוחד אם העכברים חשופים OVX דו-צדדיים באמצעות חתך כפול-לרוחב. למרות חיטוי קפדני של העור לפני החתך מבוצע, זיהום קשה להימנע. מינהל המים וgavage אוראלי הם שתי שיטות לשימוש תכוף שנבדקו. ניהול ההורמון באמצעות מי השתייה הוא מועיל מאוד בשל היותו מאוד לא פולשני כי כמעט לא טיפול בבעלי חיים נדרש. עם זאת, 17β-estradiol אינו מסיסים במים ללא אמולסיה. כך, השתמשנו DMSO בריכוז של פחות מ 0.5% כדי להקל על הפתרון שלה במי השתייה. עם זאת, גישה זו לניהול ארוכת טווח של DMSO במינון נמוך הוא קשה לשלוט רעילים לעכברים או בני אדם. עכברים עשויים גם לשתות מים על כל 24 המעקב של מעקב, מה שהופך את צריכת הסמים בפועל קשה לקבוע. חיסרון נוסף של גישה זו הוא שקשה לשלוט בצריכת המים של האינדיבידואל. החיסרון הגדול ביותר של gavage אוראלי הוא כי היא מלחיצה על בעלי חיים עלול לגרום לפציעה בוושט ולהשפיע על התנהגות אכילה. במתודולוגיה המתוארת כאן, הכשרה של 5 ימים לאכילת כפולת אגוזי לוז ללא הורמונים לפני הניסוי בוצעו. בערך יותר מ 95% מהעכברים יקבלו את התפשטות האגוזים אם הם מאומנים כפי שהוזכר בסעיף הפרוטוקול. לאחר נובעת מלאה, רוב העכברים יצרוך אותו תוך שניות. בהתאם למחקר הקודם6,11, הרמות של פלזמה E2 ירד ב-ovx עכברים לעומת המקביל מופעל המזויף בשבוע 4 (נתונים לא מוצגים). בשבוע 12 לאחר הנחישות, הבחנו ניוון הרחם בעכברים מופעלים OVX. עם זאת, רמות האסטרוגן מחזורי לא מנוטרים לאחר OVX במחקר הנוכחי.

בהעדר גילוי של נגעים טרשת עורקים ב אבי העורקים עולה, IMT אבי העורקים ניתן להעריך באמצעות מדידת המרחק בין ממשק לומן לבין הממשק המדילי-האדולי. מדידה זו מבוססת על פרוטוקול שאומת בעבר בבני אדם28. נתונים ממוצעים משלושה אתרים הנמצאים כ-100 יקרומטר אחד מהשני. עומס העבודה הלב עולה לאחר OVX ב-apoE-/- עכברים עשויים בשל הצמיחה פיצוי יפרטרופית של הקרדיוציטים בודדים אשר עשוי בסופו של דבר להוביל להגדלת תפוקת הלב (שולחן1). לעומת זאת, על פי הממשל האוראלי של PPD במשך 9 שבועות, היפר-היתר של הלב הפיצוי החליש את הקשר עם ה-EF% הדומה לעמיתו המזויף. עבור אימות של השונות פנים או בין משקיף, לנתח מקדמים של וריאציה על מדידות עובי טרשת עורקים ופרמטרים הקשורים לתפקוד הלב על ידי אופרטור אחד בשני מקרים שונים או על ידי אופרטור אחר.

כפי שהוצג במחקר שלנו, עכברים OVX מנוהל בעל פה עם 17β-estradiol או PPD באמצעות התפשטות אגוזי לוז נטו למנוע עלייה במשקל הגוף ולהפחית מחסור באסטרוגן הקשורים הפרעות שומנים, אם כי אין הבדלים משמעותיים במשקל הגוף הסופי היו נצפו. מחקרים קודמים הראו גם כי וריאציה פרמטרים השומנים עשוי להיות קטין מדי כדי להסביר את ההשפעות antiatherosclerotic של הורמונים29. ההשפעות המועילות של האסטרוגן אינן מוגבלות לשינויים במאפייני החלבון השומנים. כמה אפקטים שאינם שומנים בדם של אסטרוגן30,31, כגון דלקת, בתפקוד אנדותל, ו הקפאה הומודינמית, יכול להקל על הגנת לב וכלי דם במחלה אנושית. בהתחשב בתוצאות שנצפו במחקר הנוכחי, ההגנה של אסטרוגן אקסוגני מפני פיתוח טרשת עורקים אינו תלוי חלקית ברמות השומנים הסיסטמית. בתאי האנדותל, PPD מעכבות ביטויים של מולקולת הדבקה ומגשרים דלקתיים (נתונים לא מוצגים). בנוסף, PPD יכול היה לדכא את היווצרות האדיפוז הפריסקולרית הקשורה באופן הדוק עם האנטי-כיווצי האנדותל. לפיכך, הפעולה של PPD ו-17β-estradiol הייתה שונה והמנגנון הבסיסי הוא לחקור עוד. ללא ספק, צריכת מוגזמת של מזון עשיר באנרגיה, כגון התפשטות אגוזי לוז, יכול לגרום לעלייה במשקל. עם זאת, כמויות קטנות של התפשטות אגוזי לוז (200 mg · ק"ג-1· יום-1) כפי שהוזכר במחקר הנוכחי יכול להיות אחראי רק על פחות מ 5% צריכת האנרגיה היומית של בעלי החיים. כמו כן, העלייה במשקל ברור התגלתה באמצעות כמות זו של כפולת אגוזי לוז. השימוש ב-17β-estradiol ו-PPD היה בעיקר לטיפול במחלות לב וכלי דם. בגלל, במהלך ההתקדמות של טרשת עורקים ב-OVX-מופעל aopE- עכברים, משבוע 4 עד שבוע 12, 17β-estradiol או PPD היה מנוהל בעל פה.

אחד נקודה לא זניח של השימוש הקליני של HRT הוא תופעות לוואי מזיקות, אשר כוללים סרטן השחלות השד13,14. הפיטואסטרוגן שנבדק במחקר הנוכחי הוא תרכובת לסטרואידים, שנמצאה במפעלי דיזורע . PPD דווח כי יש השפעה מעכבות על כמה שורות תאים סרטניים20. בנוסף, PPD מראה antiatherosclerotic נכסים הדומים לאלה של 17β-estradiol. המודל שאנו מציגים כאן יכול לסייע למסך תרכובות פוטנציאליות המועמדים, כולל פיטואסטרוגן, אשר מפעילה השפעה מינימלית על התפשטות הגידול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81202526 כדי J.X.), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81302769 ל-בולשיט), הקרן העירונית של מדעי הטבע של בייג (47144226 ל-בולשיט), הדוקטורט הסיני קרן המדע (20110490325 ל-J.X.) והקרן ללימודי משרד החינוך של סין (20121106120031-בולשיט).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-250MG Estrogen
Disposable syringes (with 25 G needles) Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd 0.5*19TWLB Cardiac bleeding
High-cholesterol mouse diet Huafukang Bio-Technology N/A 1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System VisualSonics Vevo®770 Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463-250ML Preparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mm Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd R413 Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella) Ferrero N/A Medium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifier Dohegan Optical Company Inc. N/A Assistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4 SIGMA P3813 Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate Reader Tecan Infinite M1000 Plasma TC and TG determination
Pseudoprotodioscin Shanghai Winherb Medical S & T Development W-0427 CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-Gel Menarini, Solco Basle Ltd. Eye protection during anesthesia
Stereo microscope MCALON MCL-6STV Image of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifuge SIGMA 1-14K Preparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-5G Preparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A110-1 Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A111-1 Plasma TC determination

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  2. Packard, B. L. Cardiovascular health and disease in women. The New England Journal of Medicine. 329 (4), 247-256 (1993).
  3. Samaan, S. A., Crawford, M. H. Estrogen and cardiovascular function after menopause. Journal of the American College of Cardiology. 26 (6), 1403-1410 (1995).
  4. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420 (6917), 868-874 (2002).
  5. Tremollieres, F. A., et al. Effect of hormone replacement therapy on age-related increase in carotid artery intima-media thickness in postmenopausal women. Atherosclerosis. 153 (1), 81-88 (2000).
  6. Bourassa, P. A., Milos, P. M., Gaynor, B. J., Breslow, J. L., Aiello, R. J. Estrogen reduces atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (3), 10022-10027 (1996).
  7. Squadrito, F., et al. Genistein supplementation and estrogen replacement therapy improve endothelial dysfunction induced by ovariectomy in rats. Cardiovascular Research. 45 (2), 454-462 (2000).
  8. Wang, D., et al. Endothelial dysfunction and enhanced contractility in microvessels from ovariectomized rats: roles of oxidative stress and perivascular adipose tissue. Hypertension. 63 (5), 1063-1069 (2014).
  9. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous Hypercholesterolemia and Arterial Lesions in Mice Lacking Apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  10. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-Deficient Mice Develop Lesions of All Phases of Atherosclerosis Throughout the Arterial Tree. Arteriosclerosis and Thrombosis. 14 (1), 133-140 (1994).
  11. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. 64 (e4013), 1-4 (2012).
  12. Rossouw, J. E., et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results From the Women's Health Initiative randomized controlled trial. The Journal of the American Medical Association. 288 (3), 321-333 (2002).
  13. Kumle, M. Declining breast cancer incidence and decreased HRT use. Lancet. 372 (9639), 608-610 (2008).
  14. Jager, W., et al. A randomized comparison of triptorelin and tamoxifen as treatment of progressive ovarian cancer. Anticancer Research. 15 (6B), 2639-2642 (1995).
  15. Bhathena, S. J., Velasquez, M. T. Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition. 76 (6), 1191-1201 (2002).
  16. Wang, L., Qiu, X. M., Hao, Q., Li, D. J. Anti-inflammatory effects of a Chinese herbal medicine in atherosclerosis via estrogen receptor beta mediating nitric oxide production and NF-kappaB suppression in endothelial cells. Cell Death and Disease. 4 (e551), 1-13 (2013).
  17. Xiao, J., Wang, N. L., Sun, B., Cai, G. P. Estrogen receptor mediates the effects of pseudoprotodiocsin on adipogenesis in 3T3-L1 cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (1), C128-C138 (2010).
  18. Guivarc'h, E., et al. Predominant Role of Nuclear Versus Membrane Estrogen Receptor alpha in Arterial Protection: Implications for Estrogen Receptor alpha Modulation in Cardiovascular Prevention/Safety. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-17 (2018).
  19. Osako, M. K., et al. Estrogen inhibits vascular calcification via vascular RANKL system: common mechanism of osteoporosis and vascular calcification. Circulation Research. 107 (4), 466-475 (2010).
  20. Ivanova, A., et al. Screening of some saponins and phenolic components of Tribulus terrestris and Smilax excelsa as MDR modulators. In vivo. 23 (4), 545-550 (2009).
  21. Xiao, J., Zhu, T., Yin, Y. Z., Sun, B. Notoginsenoside R1, a unique constituent of Panax notoginseng, blinds proinflammatory monocytes to protect against cardiac hypertrophy in ApoE(-/-) mice. European Journal of Pharmacology. 833 (15), 441-450 (2018).
  22. Sun, B., Xiao, J., Sun, X. B., Wu, Y. Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction in endotoxemic mice: an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt signalling. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1758-1770 (2013).
  23. Adams, M. R., et al. Inhibition of coronary artery atherosclerosis by 17-beta estradiol in ovariectomized monkeys. Lack of an effect of added progesterone. Arteriosclerosis. 10 (6), 1051-1057 (1990).
  24. Keaney, J. F. Jr, et al. 17 beta-estradiol preserves endothelial vasodilator function and limits low-density lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic swine. Circulation. 89 (5), 2251-2259 (1994).
  25. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 14 (1), 133-140 (1994).
  26. Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. American Journal of Physiology- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (5), R1531-R1539 (2001).
  27. Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (3), 414-420 (2005).
  28. Pignoli, P., Tremoli, E., Poli, A., Oreste, P., Paoletti, R. Intimal plus medial thickness of the arterial wall: a direct measurement with ultrasound imaging. Circulation. 74 (6), 1399-1406 (1986).
  29. Hodgin, J. B., Maeda, N. Minireview: estrogen and mouse models of atherosclerosis. Endocrinology. 143 (12), 4495-4501 (2002).
  30. Bush, T. L., et al. Cardiovascular mortality and noncontraceptive use of estrogen in women: results from the Lipid Research Clinics Program Follow-up Study. Circulation. 75 (6), 1102-1109 (1987).
  31. Marsh, M. M., Walker, V. R., Curtiss, L. K., Banka, C. L. Protection against atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL receptor-deficient mice. Journal of Lipid Research. 40 (5), 893-900 (1999).

Tags

ביוכימיה סוגיה 150 כריתת האוטינוקטומיה טרשת עורקים חתך לרוחב כפול ומלא מאוזן מינהל שבעל פה מדיה-עובי המדיה האקוקרדיוגרפיה
A In Vivo אסטרוגן מחסור בעכבר מודל עבור ההקרנה הטיפולים האסטרוגן אקסודוגני של בעיות לב וכלי דם אחרי גיל המעבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, B., Yin, Y. z., Xiao, J. An In… More

Sun, B., Yin, Y. z., Xiao, J. An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause. J. Vis. Exp. (150), e59536, doi:10.3791/59536 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter