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Immunology and Infection

एक जीवाणु कृत्रिम क्रोमोसोम CDNA क्लोन से रिकॉमबिनेंट जिका वायरस का बचाव

Published: June 24, 2019 doi: 10.3791/59537
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center, 2Department of Molecular and Cell Biology, Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Campus Universidad Autónoma de Madrid

Summary

जिका वायरस की हाल ही में महामारी टीकों और/या चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण स्थापित करने के महत्व पर प्रकाश डाला गया। यहाँ, हम एक पूर्ण लंबाई cDNA क्लोन मानव साइटोमेगागोवायरस तत्काल-early प्रमोटर के नियंत्रण में एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र में इकट्ठे से एक संक्रामक रिकॉमबिनेंट जिका वायरस को बचाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन.

Abstract

हाल ही में दुनिया भर में फैलने के दौरान स्नायविक जटिलताओं के साथ जिका वायरस (जेडआईकेवी) संक्रमण के सहयोग और अनुमोदित टीकों की कमी और / जेडआईकेवी जीव विज्ञान का अध्ययन और चिकित्सीय और/या रोगनिरोधी दृष्टिकोणों का विकास। हालांकि, अन्य flaviviruses के साथ की तरह, बैक्टीरिया में इसके प्रवर्धन के दौरान वायरल दृश्यों की विषाक्तता के कारण जेडआईकेवी पूर्ण लंबाई संक्रामक cDNA क्लोन की पीढ़ी बाधित किया गया है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों (बीएसी) के उपयोग के आधार पर एक गैर-पारंपरिक दृष्टिकोण विकसित किया है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, IKV तनाव रियो ग्रांडे Norte नेटाल (ज़िकेवी-RGN) की पूर्ण लंबाई cDNA प्रतिलिपि चार सिंथेटिक डीएनए टुकड़े से उत्पन्न होता है और मानव साइटोमेगागोवायरस (CMV) के नियंत्रण में एकल प्रतिलिपि pBeloBAC11 प्लाज्मिड में इकट्ठे तत्काल-पूर्व प्रमोटर. इकट्ठे BAC cDNA क्लोन बैक्टीरिया में संचरण के दौरान स्थिर है, और संक्रामक पुनः संयोजक (आर) जेडआईकेवी बीएसी cDNA क्लोन के transfection के बाद वेरो कोशिकाओं में बरामद किया जाता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल flaviviruses के संक्रामक क्लोन की पीढ़ी के लिए एक शक्तिशाली तकनीक प्रदान करता है, सहित ]IKV, और अन्य सकारात्मक खिंचाव आरएनए वायरस, विशेष रूप से बड़े जीनोम के साथ उन है कि जीवाणु के दौरान स्थिरता की समस्या है संचरण|

Introduction

$iKV Flaviviridae परिवार है कि वर्तमान में एक वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य आपातकालीन1का गठन के भीतर Flavivirus जीनस के एक मच्छर जनित सदस्य है. अन्य फ्लेवीवायरस की तरह, जेडीकेवी एक लिफाफावाला आरएनए वायरस है जिसकी एक मूर्ति-जैसे संरचना होती है जिसमें लगभग 10.8 केबी का एक सकारात्मक अर्थ होता है, एकल-संक्षिप्त आरएनए अणु (चित्र 1)2। वायरल जीनोम लगभग 3,423 एमिनो एसिड का एक बड़ा पॉलीप्रोटीन को एन्कोड करता है जिसे वायरल और सेलुलर प्रोटीज़ द्वारा तीन संरचनात्मक प्रोटीनों में संसाधित किया जाता है (कैप्सिड [सी], प्रीमेम्ब्रेन/मेम्ब्रेन [पीआरएम/एम], और लिफाफा [ई]) जो कि के गठन में शामिल हैं वायरल कणों और सात nonstructural (एनएस) प्रोटीन (NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, और NS5) कि जीनोम प्रतिकृति में भाग लेने, वायरस विधानसभा, और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की चोरी (चित्र 1)3.

ऐतिहासिक रूप से, जेडीकेवी संक्रमण एक हल्के febrile बीमारी के साथ जुड़ा हुआ है4,5. हालांकि, दक्षिण और मध्य अमेरिका, दक्षिण प्रशांत, और कैरेबियन 6,7,8, और Guillain-Barr] सिंड्रोम की घटना के साथ अपने सहयोग भर में $iKV संक्रमण के विस्फोटक हाल ही में महामारी और माइक्रोसेफेली9,10,11, 12,13, ऐतिहासिक धारणा को बदल दिया है और एक महत्वपूर्ण मानव रोगज़नक़ के रूप में जेडीकेवी की प्रासंगिकता को शक्तिशाली किया है । इस अर्थ में, संक्रामक सीडीएनए क्लोन जैसे आणविक उपकरणों के विकास से वायरल रोगजनन के अध्ययन और आनुवंशिक रूप से परिभाषित टीकों के विकास और जेडआईकेवी संक्रमण के उपचार के लिए एंटीवायरल दवाओं की पहचान की सुविधा होगी। के रूप में अन्य flaviviruses के लिए वर्णित है, वायरल जीनोम14 में गुप्त जीवाणु प्रमोटरों की उपस्थिति के कारण जीआईकेवी संक्रामक क्लोन की पीढ़ी मुश्किल है कि के प्रचार के दौरान विषाक्त वायरल प्रोटीन की लीक अभिव्यक्ति की अनुमति cDNA बैक्टीरिया में क्लोन मानक उच्च प्रतिलिपि संख्या प्लाज्मिड15,16,17का उपयोग कर . इस विषाक्तता की समस्या को दूर करने के लिए पिछलेदो वर्षों में कई गैर-परंपरागत दृष्टिकोणों को सफलतापूर्वक कार्यान्वित किया गया है। इनमें कम कॉपी-नंबर प्लाज्मिड19,20, विषाक्त क्षेत्रों को बाधित करने के लिए इनट्रॉन्स की प्रविष्टि21,22,23, सी डीएनए टुकड़ों के इनविट्रो लिगेशन का उपयोग शामिल है। 24 , 25, वायरल जीनोम में मौजूद गुप्त जीवाणु प्रमोटरों के उत्परिवर्तन मौन26,27, संक्रामक subgenomic amplicons (ISA )28,29, गिब्सन विधानसभा विधि30 और गोल बहुलक विस्तार अभिक्रिया (सीईईआर)31का उपयोग।

इसमें, हम एक पूर्ण लंबाई cDNA क्लोन की इंजीनियरिंग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन ]IKV तनाव ]IKV-RGN13, एक बीएसी का उपयोग करने के लिए विषाक्तता की समस्या पर काबू पाने के लिए, और BAC CDNA क्लोन के प्रत्यक्ष transfection द्वारा संक्रामक r$IKV के बचाव Vero में कोशिकाओं32, मानव टीकों के विकास के लिए खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित एक सेल लाइन33. इस प्रणाली में, वायरल जीनोम की पूर्ण लंबाई cDNA प्रतिलिपि बीएसी प्लाज्मिड pBeloBAC1134 में इकट्ठा किया जाता है (चित्र 2A), एक कम प्रतिलिपि संख्या प्लाज्मिड (एक से दो प्रतियां प्रति सेल) Escherichia कोलाई एफ कारक35से व्युत्पन्न , जो बैक्टीरिया में इसके प्रसार के दौरान flavivirus दृश्यों की विषाक्तता को कम करता है. $IKV जीनोम के cDNA मानव CMV तत्काल-early प्रमोटर के नियंत्रण में pBeloBAC11 में इकट्ठा किया जाता है, सेलुलर आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय द्वारा transfected कोशिकाओं के नाभिक में वायरल (v)RNA की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए, और हेपेटाइटिस द्वारा 3'अंत में flanked डेल्टा वायरस (HDV) ribozyme (आरजेड), गोजातीय वृद्धि हार्मोन के दृश्यों के बाद (BGH) समाप्ति और polyadenylation संकेतों के लिए सिंथेटिक RNAs असर प्रामाणिक 5'- और वायरल जीनोम के 3'-ends, क्रमशः (चित्र 2B) . इस cDNA शुरू प्रणाली छाया हुआ वायरल आरएनए के intracellular अभिव्यक्ति में परिणाम है, एक इन विट्रो प्रतिलेखन कदम के लिए आवश्यकता के बिना संक्रामक जेडआईकेवी की वसूली की अनुमति. बीएसी दृष्टिकोण अन्य flaviviruses के लिए स्थिर और पूरी तरह कार्यात्मक संक्रामक cDNA क्लोन के निर्माण के लिए लागू एक शक्तिशाली पद्धति प्रदान करता है, साथ ही अन्य सकारात्मक फंसे आरएनए वायरस36,37, 38,39,40,41.

Protocol

1. एक बीएसी में एक $IKV संक्रामक cDNA क्लोन का निर्माण

नोट: BACs में $IKV के विधानसभा के लिए रणनीति RGN तनाव13 के लिए वर्णित है (अभिगम संख्या KU527068) (चित्र 2) .

  1. वायरल जीनोम में उचित रूप से स्थान वाली अद्वितीय प्रतिबंध स्थलों का चयन करें जो प्लाज्मिड pBeloBAC11 में अनुपस्थित हैं (चित्र 2A) .
    नोट: $IKV-RGN के लिए, प्रतिबंध साइटों Pml मैं, Afe मैं, और BstB मैं (भूगर्भीय पदों 3,347, 5,969, और 9,127, क्रमशः) का चयन किया गया. मामले में है कि कोई उचित प्रतिबंध साइटों वायरल जीनोम में उपलब्ध हैं, CDNA टुकड़ा डिजाइन के दौरान वायरल जीनोम में मूक न्यूक्लिओटाइड उत्परिवर्तनशुरू द्वारा नए प्रतिबंध साइटों उत्पन्न करते हैं.
  2. रासायनिक संश्लेषण द्वारा उत्पन्न चार cDNA टुकड़े पूर्ण लंबाई जीनोम फैले ($ 1 से $4), CMV प्रमोटर द्वारा flanked 5'-end और HDV आरजेड, BGH समाप्ति, और polyadenylation दृश्यों पर 3'-end (चित्र 2B)। प्रत्येक टुकड़ा चयनित प्रतिबंध साइटों (चरण 1.1) द्वारा flanked किया जाना चाहिए.
    नोट: टुकड़े ]1 pBeloBac11 में टुकड़े के बाकी क्लोन करने के लिए एक रीढ़ की हड्डी के रूप में प्रयोग किया जाता है। कि अंत के लिए, यह मानव CMV प्रमोटर शामिल होना चाहिए और ApaL मैं द्वारा 5'अंत में flanked होना चाहिए (pBeloBAC11 में इस टुकड़े क्लोन करने के लिए) और Asc मैं (वायरल जीनोम में अनुपस्थित), और 3'-अंत में संक्रामक क्लोन की विधानसभा के लिए चयनित प्रतिबंध साइटों द्वारा (पीएमएल मैं , Afe मैं, और BstB मैं) Mlu मैं (वायरल जीनोम में अनुपस्थित) और BamH मैं (pBeloBAC11) में इस टुकड़े क्लोन के बाद. खंड [4 पिछले प्रतिबंध साइट से जीनोमिक क्षेत्र शामिल होना चाहिए (BstB I) वायरल जीनोम के अंत करने के लिए, HDV आर के बाद, BGH समाप्ति, और polyadenylation दृश्यों, और Mlu मैं प्रतिबंध साइट (चित्र 2B). वैकल्पिक रूप से, cDNA टुकड़े (जेड 1-जेड 4) मानक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज पॉलिमरेज श्रृंखला प्रतिक्रियाओं (आरटी-पीसीआर) और विशिष्ट ओलिगोन्यूक्लिओटाइड का उपयोग कर के ओवरलैपिंग पीसीआर के संयोजन से उत्पन्न किया जा सकता है।
  3. संक्रामक सीडीएएन क्लोन को खंडों के अनुक्रमिक क्लोनन द्वारा इकट्ठा करें जो कि pBeloBAC11में से $4 तक है (चित्र 2ख) ।
    1. pBeloBAC11 प्लाज्मिड और ApaL I और BamH I के साथ $ 1 टुकड़ा डाइजेस्ट करें। इसके लिए, 10x प्रतिक्रिया बफर के 10 डिग्री सेल्सियस, प्रत्येक एंजाइम की 20 इकाइयों, और पानी के साथ pBeloBAC11 प्लाज्मिड या 1 डिग्री 1 डिग्री ग्रेफ का 2 डिग्री ग्राम मिश्रण करें, और पानी 100 डिग्री सेल्सियस की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए 2 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. झींगा क्षारीय फॉस्फेट (एसएपी) का उपयोग करके बीएसी वेक्टर को डिफॉस्फोरेट करें। इस उद्देश्य के लिए, SAP की 2.5 डिग्री सेल्सियस (2.5 इकाइयां) को पचाई गई बीएसी में जोड़ें और 1 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें. एसएपी को 15 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन द्वारा सक्रिय करें।
    3. 10 केबी से बड़े डीएनए टुकड़ों की शुद्धि के लिए अनुकूलित एक वाणिज्यिक जेल क्लीन-अप किट का उपयोग करके agarose जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा डेफॉस्फोरिलेटबीएसबीएस बीएसी वेक्टर और टुकड़ा को शुद्ध करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    4. प्लाज्मिड (च)बीएसी-जेड1 उत्पन्न करने के लिए लिगेशन प्रतिक्रिया करें। इसके लिए शुद्ध पाच बीघा के 150 एनजी को शुद्ध डालने वाले 1:3, 10x टी 4 डीएनए लिगेज बफर के 1.5 डिग्री सेल्सियस, 10 एमएम एटीपी, टी 4 डीएनए लिगाज़ की एक इकाई, और 15 डिग्री सेल्सियस के अंतिम खंड में पानी का उपयोग करके शुद्ध डालने के साथ मिश्रण करें।
    5. 16 डिग्री सेल्सियस पर 20 ज के लिए लिगेशन मिश्रण को इनक्यूबेट करें। लिगेशन अभिक्रिया के नियंत्रण के रूप में, सम्मिलित किए बिना समानांतर लिगेशन अभिक्रिया में कार्य करें। गर्मी 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा लिगे जटाको सक्रिय।
      नोट: कुंद-एंडेड डीएनए के मामले में, 14 डिग्री सेल्सियस पर 20 एच के लिए लिगेशन प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें। बीएसी वेक्टर के बड़े आकार के कारण (चित्र 2क) यह वेक्टर की बड़ी मात्रा का उपयोग करें और ligations से सम्मिलित करने के लिए आवश्यक है के लिए लिगेशन दक्षता बढ़ाने के लिए पारंपरिक plasmids का उपयोग कर.
    6. इलेक्ट्रोपोरेशन (25 जेडएफ धारिता, 2.5 केवीवी, और 100 डिग्री प्रतिरोध) द्वारा लिगेशन प्रतिक्रिया के 2 $L के साथ ई कोलाई DH10B विद्युत सक्षम कोशिकाओं के 50 डिग्री एल को रूपांतरित करें, 0.2 के अंतराल पर अंतरिक्ष इलेक्ट्रोड के साथ लगे इलेक्ट्रोपोरेशन cuvettes का उपयोग करते हुए सेमी, निम्नलिखित मानक प्रोटोकॉल.
    7. SOC मध्यम के 1 एमएल के साथ एक polypropylene ट्यूब के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित (2% tryptone, 0.5% खमीर निकालने, 0.05% NaCl, 2.5 एम एम KCl, 10 mMgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM ग्लूकोज [pH 7.0]) और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट के साथ 1 h h के लिए (200 00) के साथ h. लुरिया शोरबा (एलबी) आगर प्लेटों पर कोशिकाओं को प्लेट करें जिसमें 12.5 ग्राम/एमएल क्लोरैम्हेनिकोल होता है और उन्हें 16 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करता है।
    8. 8 से 12 जीवाणु कालोनियों उठाओ, एक ताजा LB agar प्लेट युक्त 12.5 ग्राम /एमएल chloramphenicol पर एक प्रतिकृति बनाने के लिए, और परीक्षण है कि क्या वे विशिष्ट oligonucleotides का उपयोग कर प्रत्यक्ष पीसीआर विश्लेषण द्वारा सही डालने होते हैं.
    9. प्रतिकृति प्लेट से एक सकारात्मक कॉलोनी उठाओ, यह LB के 100 एमएल में बढ़ने से युक्त 12.5 डिग्री/एमएल chloramphenicol के, और एक वाणिज्यिक प्लाज्मिड मिडी किट का उपयोग कर क्षारीय lysis विधि द्वारा बीएसी cDNA को अलग, बड़े की शुद्धि के लिए सिफारिश के बाद कम प्रतिलिपि प्लाज्मिड (सामग्री की तालिकादेखें )।
      नोट: इस विधि द्वारा तैयार बीएसी cDNA जीवाणु जीनोमिक डीएनए के 30% तक के साथ दूषित किया जा सकता है, लेकिन यह प्रतिबंध विश्लेषण, अनुक्रमण, और क्लोनिंग प्रदर्शन करने के लिए गुणवत्ता में उपयुक्त है। बीएसी आकार के आधार पर, बीएसी प्लाज्मिड के 4-6 डिग्री ग्राम की पैदावार प्राप्त की जा सकती है।
    10. प्रतिबंध विश्लेषण द्वारा क्लोन CDNA की आनुवंशिक अखंडता की पुष्टि करें. PBAC के 500 एनजी-जेड 1 प्लाज्मिड के साथ Asc I और Pml I पर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 ज और जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा $ 1 टुकड़ा की उपस्थिति की पुष्टि करें। आगे की पुष्टि करने के लिए कि अवांछित उत्परिवर्तनों शुरू नहीं किया गया है, विशिष्ट ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स के साथ डालने के अनुक्रम।
    11. चयनित प्रतिबंध साइटों (पीएमएल मैं, Afe I, BstB I, और Mlu I) युक्त प्लाज्मिड पीबीएसी-जेड1 से शुरू, क्रमिक रूप से क्लोन टुकड़े $2 से $ 4 के लिए पूर्ण लंबाई संक्रामक cBAC-ज़िकव (चित्रा 2B),इसी तरह के प्रयोगात्मक के बाद के रूप में दृष्टिकोण टुकड़ा के लिए ऊपर वर्णित $1 (चरण 1.3.1-1.3.10).

2. संक्रामक आरजेडआईकेवी के बचाव के लिए उच्च शुद्धता पीबीएसी-जेडआईकेवी की तैयारी

नोट: एक ultrapure pBAC-ज़िक संक्रामक क्लोन के बड़े पैमाने पर तैयारी, transfection और संक्रामक वायरस के बचाव के लिए उपयुक्त, विशेष रूप से बीएसी शुद्धि के लिए विकसित एक वाणिज्यिक किट के साथ क्षारीय lysis द्वारा किया जाता है (तालिका देखें सामग्री)। किट एक एटीपी पर निर्भर exonuclease पाचन कदम है कि बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए संदूषण को हटा शामिल करना चाहिए, बीएसी cDNA के अलगाव की अनुमति शुद्धता के एक ग्रेड के साथ कि सीजियम क्लोराइड विधि के साथ प्राप्त करने के लिए इसी तरह की.

  1. ई. कोलाई DH10B की एक एकल कॉलोनी ले जाने LB माध्यम के 5 एमएल में pBAC-ज़िकेवी संक्रामक क्लोन ले जाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर chloramphenicol के 12.5 g/एमएल युक्त कोमल मिलाते हुए (200-250 आरपीएम) के साथ 8 एच के लिए।
  2. जीवाणु संस्कृति के 1 एमएल जोड़ें (चरण 2.1) LB के 500 एमएल के साथ 12.5 डिग्री ग्राम /एमएल क्लोरैम्पेनिकॉल के एक 2 L फ्लास्क में जोड़ें और 14-16 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित करें (0.6-0.8 के एक OD600 तक)।
    नोट: इस तरह के भयानक ब्रोथ (टीबी) के रूप में अमीर शोरबा, अत्यंत उच्च सेल घनत्व का उत्पादन कर सकते हैं, एक कम उपज और बीएसी cDNA की कम शुद्धता में जिसके परिणामस्वरूप.
  3. निर्माता के विनिर्देशों का पालन करते हुए, विशेष रूप से बीएसी शुद्धि के लिए विकसित एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके क्षारीय lysis द्वारा बीएसी संक्रामक cDNA क्लोन को शुद्ध करें (सामग्री की तालिकादेखें)। शुद्ध बीएसी सीडीएएनको चार डिग्री सेल्सियस पर रखें। बीएसी आकार के आधार पर, ultrapure BAC cDNA क्लोन के 30 डिग्री ग्राम की पैदावार प्राप्त की जा सकती है।
    नोट: 5 मिनट से अधिक के लिए डीएनए गोली सूखी नहीं है, के रूप में overdrying यह मुश्किल बीएसी cDNA भंग करने के लिए कर देगा। बीएसी cDNA क्लोन के बड़े आकार के कारण, प्लाज्मिड कतरनी को रोकने के लिए भंवर या पाइपिंग से बचें।

3. वेरो सेल के ट्रांसफेक्शन द्वारा बीएसी सीडीएनए क्लोन से संक्रामक आरजेडआईकेवी का बचाव

नोट: संक्रामक r$IKV PBAC-ज़िकवी cDNA क्लोन के साथ वेरो कोशिकाओं के transfection द्वारा बरामद किया जाता है, एक वाणिज्यिक धनायनिक लिपिड ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक का उपयोग कर (सामग्री की तालिकादेखें; चित्र 3) .

  1. transfection से पहले एक दिन, 6-वेल प्लेट पर प्लेट 5 x 105 Vero कोशिकाओं / अच्छी तरह से विकास के माध्यम में (Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम [DMEM] 5% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक [FBS], 2 एम एम एल-glutamine, और 1% गैर जरूरी एमिनो एसिड) एंटीबायोटिक दवाओं के बिना transfection के समय तक 90% confluent सेल मोनोलेयर्स जुटाने के लिए.
    नोट: हम trilicates में वायरस बचाव प्रदर्शन की सलाह देते हैं.
  2. समान सीरम कम मध्यम (सामग्री की तालिका देखें) कमरे के तापमान पर और बाँझ microfuge ट्यूबों में transfection मिश्रण तैयार प्रत्येक transfection नमूना के लिए इस प्रकार है.
    1. रेशम कम मध्यम के 250 डिग्री एल में बीएसी cDNA क्लोन के 4 डिग्री ग्राम जोड़ें और ध्यान से मिश्रण, भद्दा कतरनी को रोकने के लिए भंवर से बचने.
    2. एक अलग ट्यूब में, ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक (1 मिलीग्राम/एमएल) के 12 डिग्री सेल्सियस को पतला करें (सामग्री की सारणीदेखें) सीरम-कम मध्यम के 250 डिग्री एल में, भ्रमिल द्वारा मिश्रण, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    3. पतला BAC cDNA और transfection अभिकर्मक का मिश्रण (डीएनए के एक 1:3 अनुपात के साथ: transfection अभिकर्मक), ध्यान से मिश्रण जबकि भंवर से बचने, और 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट.
  3. बीएसी सी डीएनए/ट्रांसफेलेशन रिएजेंट मिश्रण की ऊष्मायन अवधि के दौरान, एंटीबायोटिक दवाओं के बिना विकास माध्यम के साथ वेरो कोशिकाओं को धोएं और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना ताजा माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को छोड़ दें।
    नोट: ट्रांसफेलेशन प्रक्रिया के दौरान एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा transfection दक्षता कम हो सकती है।
  4. बाल्क सी डी एन ए/ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक मिश्रण (चरण 3.2.3) के 500 डिग्री सेल्सियल को वेरो कोशिकाओं पर वितरित करें, प्लेट को आगे-पीछे हिलाकर मिलादें, और कोशिकाओं को 5% सीओ2 आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 6 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलादें।
  5. ट्रांसफेक्शन माध्यम निकालें, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ ताजा विकास माध्यम के 2 एमएल जोड़ें (100 U/mL पेनिसिलिन और 100 डिग्री सेल्सियस स्ट्रेप्टोमाइसिन), 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 आर्द्र इनक्यूबीकृत इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, और साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) के प्रेरण के लिए हर दिन की जांच करें ).
    नोट: $IKV सीपीई वेरो कोशिकाओं में काफी स्पष्ट है और यह गोल और birefringent कोशिकाओं है कि अलग और ऊतक संस्कृति supernatant में नाव की उपस्थिति की विशेषता है.
  6. वेरो सेल ऊतक-संस्कृति supernatants के alicuots (100 $L) ले लीजिए (चरण 3.5) हर 24 एच ताजा वेरो कोशिकाओं पर एक मानक पट्टिका परख का उपयोग करके वायरस वसूली की क्षमता का निर्धारण करने के लिए (चित्र 4A)।
  7. चार से छह दिनों के ट्रांसफक्शन के बाद, जब सीपीई लगभग 50%-75% (चित्र 4बी) है , तो 15 एमएल शंकुट्यूबों में ऊतक संस्कृति सुपरनेट्स और सेंट्रीफ्यूज को 2,000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इकट्ठा करके सेलुलर मलबे को हटादें।
  8. आरजेडीकेवी वाले सुपरनेट्स को फसल में भरें और सेल छर्रों को त्याग दें। Alicot cryotubes में supernatant और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए आगे बचाया r$IKV की उपस्थिति की पुष्टि करें.

4. बरामद आरजेडआईकेवी का टीइटेशन

  1. अनुमापन से एक दिन पहले, 12-वेल प्लेटों पर बीज 2.5 x 105 वेरो कोशिकाओं/
    नोट: हम trilicates में बरामद आरजेडआईकेवी के अनुमापन का आयोजन करने की सलाह देते हैं।
  2. फ्रीजर (चरण 3.8) से supernatant के एक alicot निकालें और FBS के बिना विकास के माध्यम में सीरियल 10 गुना कमजोर पड़ने बनाते हैं।
  3. वेरो कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफरेड नमकीन (पीबीएस) के साथ 2x धोएं और ट्रिप्लिकेट में प्रत्येक वायरस कमजोर पड़ने के 200 डिग्री सेल्सियस/ 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% ब्व्2 आर्द्र इनक्यूबेटर में प्लेटें रखें और 90 मिनट अधिशोषण अवधि के लिए हर 15 मिनट में रॉक करें।
  4. वायरल इनोकुलम निकालें, 2% एफबीएस, 1% डीईए-डेक्सट्रान, और 0.6% आगर नोबल, और 3-4 दिनों के लिए 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस में इनक्यूबेट वाले विकास माध्यम के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को ओवरले करें।
    नोट: यह agarose, मिथाइलसेलुलोस, या अन्य ओवरले मीडिया का उपयोग करने के लिए संभव है। उचित पट्टिका गठन के लिए समय इस्तेमाल ओवरले और जेडआईकेवी तनाव के आधार पर अलग-अलग होगा।
  5. 1 h के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस में पतला 4% formaldehyde के साथ 1 एमएल /अच्छी तरह से के साथ $IKV-संक्रमित कोशिकाओं को ठीक करें, ओवरले को हटा दें, और उन्हें 0.1% क्रिस्टल बैंगनी के साथ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 20% मेथनॉल के साथ धुंधला करके वायरल प्लेक कल्पना।
    1. क्रिस्टल बैंगनी छोड़ें, पानी के साथ 3x धोने, प्लेटों को सूखने की अनुमति है, और मैन्युअल रूप से प्लेक गिनती (चित्र 4C, बाएँ पैनल). वायरल टिटर की गणना प्रति मिलीलीटर (पीएफयू/एमएल) के रूप में प्लेक बनाने वाली इकाइयों के रूप में की जाती है।
  6. वैकल्पिक रूप से, वायरल प्लेक को पैन-फ्लैविवायरस ई प्रोटीन माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) 4जी2 (चित्र 4 सी, दाएं पैनल) के साथ इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा कल्पना की जा सकती है।
    1. इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा जेडआईकेवी प्लेक का मूल्यांकन करने के लिए, ऊपर वर्णित ओवरले आगर को ठीक करने और हटाने के बाद (चरण 4.5 में), पीबीएस के साथ कोशिकाओं 2x को धोएं और उन्हें पीबीएस में 200 डिग्री सेल्सियस/अच्छी तरह से 200 डिग्री एल/वेल के साथ पीबीएस में 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर।
    2. permebilization समाधान निकालें, PBS के साथ 3x कोशिकाओं को धोने, और उन्हें ब्लॉक के साथ 200 $L /
      नोट: अन्य मानक अवरुद्ध समाधान (उदा., PBS में 2.5% बीएसए) इस चरण में इस्तेमाल किया जा सकता है.
    3. अवरुद्ध समाधान निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए पैन-फ्लाविवायरस ई प्रोटीन mAb 4G2 पतला समाधान (1 डिग्री जी /
      नोट: अन्य mAb या polyclonal एंटीबॉडी (pAb) के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है 4G2 के इम्यूनोस्टेनिंग और वायरल प्लेक का पता लगाने के लिए.
    4. पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें, और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में बायोटिनलेटिड एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी पतला (निर्माता की सिफारिश का पालन करते हुए) के 200 डिग्री सेल्सियस के साथ इनक्यूबेट करें।
    5. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें, पीबीएस के साथ कोशिकाओं 4x धोने, और निर्माता के विनिर्देशों के बाद एक avidin/बायोटिन आधारित peroxidase किट का उपयोग कर वायरल प्लेक कल्पना (सामग्री की तालिकादेखें).।

5. सफल आरजेडआईकेवी बचाव की पुष्टि

नोट: बचाया वायरस की पहचान की पुष्टि करने के लिए, $iKV ई प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रतिरक्षा प्रवाह द्वारा विश्लेषण किया जाता है माउस mAb 1176-56 के लिए विशिष्ट का उपयोग कर [iKV ई प्रोटीन (चित्र 4D)। यह mAb $iKV ई प्रोटीन के लिए विशिष्ट है, पैन-flavivirus ई प्रोटीन mAb 4G2 (कदम 4.6.3) की स्थिति के विपरीत. वैकल्पिक रूप से, वायरस पहचान अनुक्रमण द्वारा पुष्टि की जा सकती है।

  1. इम्यूनोफ्लोरेसींस विश्लेषण से एक दिन पहले, संक्रमण के समय तक 90% अनुकूल सेल मोनोलेयर्स को बढ़ाने के लिए विकास माध्यम में 1 x 105 वेरो कोशिकाओं/
  2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं 2x धो लें और उन्हें पीबीएस (100 जेडएल/अच्छी तरह से) के बिना विकास माध्यम में बचाया वायरस के 0.5 PFU/सेल के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता के साथ संक्रमित करें। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. वायरल अधिशोषण के बाद, वायरल इनोकुलम को हटा दें, 2% एफबीएस के साथ ताजा विकास माध्यम के 0.5 एमएल जोड़ें, और कोशिकाओं को 5% सीओ2 नम इनक्यूबीड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 डिग्री सेल्सियस में इनक्यूबेट करें।
  4. ऊतक संस्कृति supernatant निकालें, कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde के 150 $L/अच्छी तरह से कोशिकाओं को ठीक, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 150 $L/अच्छी तरह से कोशिकाओं permebilize.
  5. permeabilization समाधान को हटाने और पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धोने के बाद, कमरे के तापमान पर 1 एच के दौरान समाधान अवरुद्ध के 150 डिग्री सेल्सियस/
    नोट: सेल स्कैन वैकल्पिक अवरुद्ध समाधान (उदा., PBS में 2.5% बीएसए) के साथ अवरुद्ध किया जा सकता है।
  6. अवरुद्ध समाधान निकालें और 100 डिग्री सेल्सियस/अच्छी तरह से mAb 1176-56 के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, $IKV ई प्रोटीन के लिए विशिष्ट, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए समाधान (1 डिग्री जी/
  7. पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें, उन्हें कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए 100 डिग्री सेल्सियस/ उन्हें 150 डिग्री सेल्सियस/वेल के साथ 4',6'-diamidino-2-फेनिलिनोल (डीएपीआई; 1 मिलीग्राम/एमएल) के साथ कक्ष के तापमान पर 1:200 पतला 10 मिनट के लिए।
  8. पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें, एक एंटीफेड बढ़ते माध्यम पर कवरलिप माउंट (सामग्री की तालिकादेखें), और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत नमूनों का विश्लेषण करें।
    नोट: लंबी अवधि के भंडारण के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने की दुकान, प्रकाश से संरक्षित.

6. प्रवर्धन और वायरल स्टॉक्स की पीढ़ी

नोट: एक बार बचाया वायरस की पहचान की पुष्टि की है (अनुभाग 5), Vero कोशिकाओं पर वायरस बढ़ाना और आगे के अध्ययन के लिए वायरल स्टॉक उत्पन्न करते हैं.

  1. 100 मिमी x 21 मिमी प्लेटों में 90% संगम पर वेरो कोशिकाओं को बढ़ाएं और उन्हें पहले वर्णित के रूप में 0.1 PFU/सेल के एक MOI के साथ संक्रमित करें।
  2. जब सीपीई लगभग 75% (लगभग 48-72 एच postinfection) है, तो सेलुलर मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर 50 एमएल शंकु ट्यूब और अपकेंद्रण में ऊतक संस्कृति supernatant इकट्ठा।
  3. सुपरनेंट जिसमें आरजेडीकेवी होता है, उसे छान न दें और सेल गोली को त्याग दें। Alicot क्रायोट्यूब में supernatant और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  4. फ्रीजर से एक वायरस alicot निकालें और पहले वर्णित के रूप में पट्टिका परख द्वारा वायरल titer निर्धारित (अनुभाग 4).

Representative Results

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल कई flaviviral दृश्यों के साथ जुड़े विषाक्तता समस्याओं को कम करने के लिए एक बीएसी का उपयोग कर स्थिर ]IKV पूर्ण लंबाई cDNA संक्रामक क्लोन की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है. बीएसी सीडीएनए क्लोन से संक्रामक आरजेडआईकेवी की कुशल वसूली अतिसंवेदनशील वेरो कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन के बाद आसानी से प्राप्त की जा सकती है (चित्र2)। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम क्रमिक रूप से बीएसी प्लाज्मिड pBeloBAC1134 पारंपरिक क्लोनिंग तरीकों और अद्वितीय का उपयोग कर चार ओवरलैपिंग cDNA टुकड़े क्लोनिंग द्वारा एक स्थिर पूर्ण लंबाई cDNA क्लोन उत्पन्न किया है वायरल जीनोम में मौजूद प्रतिबंध स्थल (चित्र 2)। पूर्ण लंबाई cDNA क्लोन 5'अंत में मानव CMV प्रमोटर द्वारा flanked था transfected कोशिकाओं के नाभिक में vRNA की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए, और 3'-अंत में HDV आरजेड द्वारा पीछा BGH polyadenylation और समाप्ति दृश्यों द्वारा, आरएनए युक्त उत्पादन करने के लिए वायरल जीनोम का सटीक 3'-अंत (चित्र 2)। उत्पन्न बीएसी cDNA क्लोन के बैक्टीरिया में स्थिरता, मानक पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकियों का उपयोग कर अपने आसान हेरफेर के साथ, स्थिर पूर्ण लंबाई cDNA क्लोन के तेजी से और विश्वसनीय पीढ़ी के लिए बीएसी cDNA दृष्टिकोण की क्षमता पर प्रकाश डाला गया अस्थिर वायरल जीनोम के साथ अन्य flaviviruses या सकारात्मक-संक्षिप्त आरएनए वायरस।

एक बार BAC cDNA क्लोन इकट्ठा किया गया था (चित्र 2), संक्रामक वायरस आसानी से बीएसी cDNA क्लोन के साथ अतिसंवेदनशील वेरो कोशिकाओं के प्रत्यक्ष transfection के बाद ठीक किया जा सकता है cationic liposomesकाउपयोग (चित्र 3) . इस cDNA शुरू प्रणाली छाया हुआ vRNAके intracellular अभिव्यक्ति की अनुमति दी, एक इन विट्रो प्रतिलेखन कदम के लिए आवश्यकता के बिना संक्रामक वायरस की वसूली की अनुमति. इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम 5 दिनों के बाद (चित्र4क) पर 106 PFU/mL से अधिक titers के साथ r$IKV-RGN बचाव करने में सक्षम थे। इसके अलावा, बचाया वायरस एक स्पष्ट सीपीई प्रेरित (चित्र 4B),आकार में लगभग 2 मिमी के सजातीय प्लेक उत्पन्न (चित्र 4C), और इसकी पहचान अनुक्रमण द्वारा पुष्टि की गई थी (डेटा नहीं दिखाया) और इम्यूनोफ्लूरेंसी विश्लेषण mAb विशिष्ट का उपयोग कर के लिए $iKV ई प्रोटीन, 1176-56 (चित्र 4D)। इन विट्रो डेटा से संकेत मिलता है कि बरामद r$IKV-RGN कुशलतापूर्वक Vero कोशिकाओं में और स्तर के लिए एक प्राकृतिक ]IKV अलग32 (डेटा नहीं दिखाया) की तुलना में दोहराया. कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि संक्रामक r$IKV पूर्ण लंबाई cDNA क्लोन एक बीएसी में इकट्ठे से बचाया जा सकता है.

Figure 1
चित्र 1 : $IKV जीनोम संगठन और virion संरचना. (ए) जीनोम संगठन: जेडीकेवी में एक सकारात्मक एकल-स्लेडेड आरएनए होता है जिसका एकल पॉलीप्रोटीन के रूप में अनुवाद किया जाता है। अनुवादित पॉलीप्रोटीन को संरचनात्मक प्रोटीन कैप्सिड (सी, ब्लू), मैट्रिक्स (एम, ब्राउन) और एनवेलप (ई, हरे) और सात गैर-संरचनात्मक प्रोटीन (एनएस2बी, एनएस 2 ए, एनएस 2 बी, एनएस 4ए, एनएस4बी, और एनएस 5) का उत्पादन करने के लिए वायरल (तीर) और मेजबान (डायमंड) प्रोटीज़ द्वारा छोड़ दिया गया था। वायरल जीनोम के अंत में 5' और 3' untranslated क्षेत्रों (UTRs) काली लाइनों के साथ संकेत दिया जाता है. (बी) विरियन संरचना: $iKV virions ई और एम प्रोटीन के साथ सजाया गया था, एक icosahedral की तरह संरचना के साथ एक लिपिड bilayer में लंगर डाले. वायरल एनवेलोप के नीचे वायरल न्यूक्लिओकैप्सिड वायरल जीनोमिक आरएनए से जुड़े सी प्रोटीन से बना था। यह आंकड़ा से अनुकूलित किया गया है [विला-P]rez एट अल.18. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : एक बीएसी में जेडआईकेवी पूर्ण लंबाई संक्रामक cDNA क्लोन की विधानसभा। (ए ) pBeloBAC11 BAC: नियामक जीन पैराए, parB, parC, और repE,एफ कारक प्रतिकृति मूल (OriS), chloramphenicol प्रतिरोधी जीन (सीएमआर) के Schematic प्रतिनिधित्व , और लाख - जीन संकेत कर रहे हैं. संक्रामक जेडआईकेवी सीडीएनए क्लोन को इकट्ठा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रासंगिक प्रतिबंध स्थलों को रेखांकित किया गया है। (ख ) जिकेवी पूर्ण लंबाई के संक्रामक सीडीएनए क्लोन की विधानसभा pBeloBAC11 BAC: चार ओवरलैपिंग डीएनए टुकड़े ($1-$4), पूरे ]IKV जीनोम को कवर (चित्र 1) और संकेत प्रतिबंध साइटों द्वारा flanked, रासायनिक द्वारा उत्पन्न किए गए थे संश्लेषण और क्रमिक रूप से pBeloBAC11 में क्लोन संक्रामक ]IKV cDNA क्लोन PBAC-ज़िकेवी उत्पन्न करने के लिए। पूर्ण लंबाई ]IKV संक्रामक cDNA मानव cytomegagovirus तत्काल-early प्रमोटर (CMV) के नियंत्रण में इकट्ठा किया गया था और HDV ribozyme (आरजेड) और गोजातीय विकास हार्मोन (BGH) समाप्ति और polyadeny अनुक्रम द्वारा 3'अंत में flanked. वायरल जीनों और नियामक तत्वों के परिवर्णी शब्द चित्र 1में वर्णित हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : BAC cDNA क्लोन से r$IKV उत्पन्न करने के लिए कार्यप्रवाह. संगम के 90% पर वेरो कोशिकाओं को एक परत में स्थानांतरित कर दिया गया था जिसमें आईसीवी पूर्ण लंबाई संक्रामक सीडीएनए क्लोन पीबीएसी-जेडआईकेवी (चित्र 2) को कायनिक लिपोसोम का उपयोग करते हुए किया गया था. 4-6 दिनों के बाद, जब सीपीई स्पष्ट था, ऊतक संस्कृति supernatants युक्त r$IKV एकत्र किया गया और वायरस की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया गया (चित्र 4) और वेरो कोशिकाओं में वायरल प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : वसूली और इन विट्रो में r$IKV की विशेषता. (क) बीएसी सीडीएनए क्लोन से संक्रामक आरजेडआईकेवी का बचाव: संगम के 90% पर वेरो कोशिकाओं (6-वेल प्लेट प्रारूप, ट्रिपीलेट) कोनकली-ट्रांसफेक्टेड या 4 डिग्री/ ऊतक संस्कृति supernatants में वायरस titers पट्टिका परख (PFU/ त्रुटि पट्टियाँ तीन भिन्न transfection प्रयोगों से मानक विचलन इंगित करती हैं. डॉटेड काली रेखा का पता लगाने की सीमा (50 PFU/mL) इंगित करता है। (बी) वायरल सीपीई: 90% संगम (6-वेल प्लेट प्रारूप, ट्रिप्लिकेट्स) पर वेरो कोशिकाओं को नकली संक्रमित (ऊपर) या संक्रमित (एमओआई 0.5 PFU/सेल) के साथ आरजेडआईकेवी के साथ, और 48 एच पोस्टइंफ़ेस्ट पर, सीपीई की उपस्थिति का मूल्यांकन प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया था। स्केल बार ] 100 डिग्री सेल्सियस. (सी) वायरल पट्टिका परख और इम्यूनोस्टेनिंग: 90% संगम पर वेरो कोशिकाएं (12-वेल प्लेट प्रारूप) आरजेडीकेवी से संक्रमित थीं, और 72 एच postinfection पर, वायरल प्लेक क्रिस्टल बैंगनी धुंधला (बाएं) या इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा विज़ुअलाइज़ किए गए थे () दाएँ) पैन-फ्लाविवायरस ई प्रोटीन mAb 4G2 का उपयोग कर. स्केल बार ] 5 मिमी (डी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस: 90% संगम पर वेरो कोशिकाओं (24-वेल प्लेट प्रारूप, triplicates) संक्रमित थे (MOI 0.5 PFU/सेल) के साथ r$IKV और, 48 एच postinfection पर, mAb 1176-56 का उपयोग कर इम्यूनोफ्लुओरेंस द्वारा विश्लेषण किया गया, $IKV के लिए विशिष्ट ई प्रोटीन. सेल नाभिक DAPI के साथ दाग रहे थे. $IKV-संक्रमित वेरो कोशिकाओं का एक प्रतिनिधि मर्ज की गई छवि दिखाया गया है। ऊपर दाईं ओर सफेद वर्ग ]iKV संक्रमित वेरो कोशिकाओं की एक विस्तारित छवि का प्रतिनिधित्व करता है. स्केल बार्स ] 100 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

संक्रामक cDNA क्लोन आरएनए वायरस के बुनियादी अनुसंधान और टीकों के विकास के लिए आवश्यक आणविक उपकरण का गठन और / हालांकि, flaviviruses सहित कई सकारात्मक-संक्षिप्त आरएनए वायरस के लिए, संक्रामक cDNA क्लोन की पीढ़ी क्लोन सीडीएनए की अस्थिरता के कारण मुश्किल है जब मानक उच्च-कॉपी-संख्या प्लाज्मिड का उपयोग करके बैक्टीरिया में प्रचारित किया जाता है। जेडआईकेवी और अन्य फ्लेवीवायरस के मामले में, यह अस्थिरता मुख्य रूप से वायरल जीनोम14,15,16,17 में मौजूद गुप्त जीवाणु प्रमोटरों से विषाक्त वायरल प्रोटीन की लीक अभिव्यक्ति के कारण है . यहाँ, हम एक स्थिर और शक्तिशाली प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक स्थिर $IKV पूर्ण लंबाई संक्रामक cDNA क्लोन एक एकल प्लाज्मिड के रूप में उत्पन्न करने के लिए, बीएसी प्लाज्मिड pBeloBAC1134 के उपयोग के आधार पर (चित्र 2A) विषाक्तता समस्या को दूर करने के लिए, का उपयोग CMV प्रमोटर transfected कोशिकाओं के नाभिक में vRNA की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए, और HDV आर $ सटीक 3'-ends के साथ vRNAs उत्पन्न करने के लिए (चित्र 2B)। इस विधि का उपयोग करके, हमने सफलतापूर्वक जेडआईकेवी तनाव आरजीएन का एक पूरी तरह से स्थिर संक्रामक क्लोन उत्पन्न किया है जो अतिसंवेदनशील वेरो कोशिकाओं के प्रत्यक्ष ट्रांसफेक्शन के बाद संक्रामक आरजेडआईकेवी के कुशल और विश्वसनीय वसूली की अनुमति देता है (चित्र 3 औरचित्र 3 और चित्र 4) .

पिछले कुछ वर्षों में एक बड़ा प्रयास किया गया है कि $IKV संक्रामक cDNA क्लोन के साथ जुड़े अस्थिरता की समस्याओं को दूर करने के लिए, और कई दृष्टिकोण सफलतापूर्वक18लागू किया गया है , cDNA टुकड़े 24 के इन विट्रो लिगेशन सहित ,25, कम कॉपी प्लाज्मिड19,20, मूक उत्परिवर्तनों की शुरूआत से गुप्त जीवाणु प्रवर्तकों की निष्क्रियता26,27, इनट्रॉन प्रविष्टि21, 22 , 23, गिब्सन विधानसभा विधि30, ISA विधि28,29, और CPER31का उपयोग करें . हालांकि इन दृष्टिकोण विषाक्तता की समस्या को दूर करने और IKV संक्रामक cDNA क्लोन उत्पन्न करने के लिए उपयोगी होते हैं, उनमें से कुछ परिश्रमी हैं और कई नुकसान मौजूद हैं, इन विट्रो लिगेशन और प्रतिलेखन कदम है कि वायरस को कम करने के लिए की आवश्यकता सहित वसूली दक्षता या चुप उत्परिवर्तनों की एक उच्च संख्या की शुरूआत गुप्त जीवाणु प्रमोटर है कि वायरल फिटनेस को प्रभावित कर सकता है निष्क्रिय करने के लिए, दूसरों के बीच. इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण निम्न लाभ प्रस्तुत करता है। i) बीएसी प्लाज्मिड pBeloBAC1134 एक सख्ती से नियंत्रित प्रतिकृति है, सेल प्रति प्लाज्मिड के एक या दो प्रतियां रखते हुए, जो विषाक्तता को कम करता है और अस्थिर सीडीएए के बैक्टीरिया में स्थिर रखरखाव की अनुमति देता है। ii) बीएसी प्लाज्मिड का प्रचार और संशोधन लगभग पारंपरिक प्लाज्मिड के समान है, बड़े आकार के बीएसी-डीएनए टुकड़ों और कम प्रतिलिपि प्लाज्मिड में हेरफेर करने के लिए इस प्रोटोकॉल में वर्णित मामूली संशोधनों पर विचार करते हुए। विशेष रूप से, बीएसी cDNA क्लोन भी लाल पुनर्संयोजन प्रणाली42,43,44 का उपयोग कर के समजात पुनर्संयोजन द्वारा ई कोलाई में संशोधित किया जा सकता है ) CMV प्रमोटर के उपयोग की अनुमति देता है छाया हुआ जेडआईकेवी vRNA के intracellular अभिव्यक्ति और एक इन विट्रो प्रतिलेखन कदम की आवश्यकता के बिना संक्रामक वायरस की वसूली. iv) संक्रामक आरजेडआईवीबीएसईवी बीएसी सीडीएनए क्लोन के साथ अतिसंवेदनशील कोशिकाओं (उदा., वेरो) के प्रत्यक्ष संक्रमण के बाद उत्पन्न होता है। चूंकि स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए transfection आरएनए transfection की तुलना में अधिक कुशल है, बीएसी दृष्टिकोण के साथ वायरस वसूली दक्षता आरएनए प्रतिलिपि का उपयोग कर मनाया है कि अधिक से अधिक है, संस्कृति कोशिकाओं में मार्ग की संख्या को कम करने के लिए एक वायरल स्टॉक उत्पन्न करने के लिए और, फलस्वरूप, सेल संस्कृति अनुकूलन द्वारा अवांछित उत्परिवर्तनों की शुरूआत को सीमित.

अंत में, बीएसी दृष्टिकोण की क्षमता इस विधि के सफल उपयोग द्वारा समर्थित है (थोड़ा संशोधनों के साथ) डेंगू वायरस36सहित अन्य flaviviruses के संक्रामक cDNA क्लोन इंजीनियर करने के लिए, और में उच्च प्रभाव के कई कोरोनावायरस मानव और पशु स्वास्थ्य, जैसे ट्रांसमिसिबल गैस्ट्रोएंटराइटिस कोरोनावायरस37 (TGEV), बिल्ली संक्रामक पेरिटनिटिस वायरस38 (एफआईवी), मानव कोरोनावायरस OC4339 (HCoV-OC43), गंभीर श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस40 (SARS-CoV), और मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस41 (MERS-CoV), दूसरों के बीच.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में, वहाँ दो महत्वपूर्ण कदम है कि विचार किया जाना चाहिए रहे हैं. एक महत्वपूर्ण विचार वायरल जीनोम है कि बीएसी प्लाज्मिड में अनुपस्थित रहे हैं में उपयुक्त अद्वितीय प्रतिबंध साइटों की पहचान है. यदि कोई पर्याप्त प्रतिबंध साइटों उपलब्ध हैं, नए प्रतिबंध साइटों मूक न्यूक्लिओटाइड उत्परिवर्तनों की शुरूआत से क्लोनिंग डिजाइन के दौरान उत्पन्न किया जा सकता है. एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि बीएसी प्लाज्मिड प्रति सेल केवल एक या दो प्रतियों में मौजूद हैं, और इसलिए, बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए के उच्च संदूषण के साथ बीएसी प्लाज्मिड की कम पैदावार उच्च के लिए डिज़ाइन किए गए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त की जाती है- और मध्यम प्रतिलिपि संख्या प्लाज्मिड. इस संभावित समस्या को आसानी से बड़ी संस्कृति की मात्रा का उपयोग कर दूर है और एक वाणिज्यिक किट विशेष रूप से बीएसी शुद्धि के लिए विकसित के साथ बीएसी प्लाज्मिड शुद्ध.

संक्षेप में, हम एक बीएसी है कि स्थिर और पूरी तरह कार्यात्मक संक्रामक cDNA क्लोन अन्य सकारात्मक-संक्षिप्त आरएनए वायरस के उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के उपयोग के आधार पर एक शक्तिशाली ]iKV रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण विकसित किया है इन के जीव विज्ञान के अध्ययन की सुविधा के लिए वायरस और टीकों के विकास और /

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों को बीएसी cDNA क्लोन पीढ़ी और Snezhana Dimitrova वीडियो तैयार करने के साथ मदद करने के लिए में उसकी तकनीकी सहायता के लिए कार्ला Gemez शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम के भाग में स्पेन के अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धा मंत्रालय (MINCO, अनुदान संख्या BFU2016-79127-आर) F.A.T. और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (NIH, अनुदान संख्या 1R21AI120500) से एल.एम.एस.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Molecular Biology Reagents
Afe I New England BioLabs R0652S 10,000 Units/mL
AmpliTaq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) N8080161 5,000 Units/mL
ApaL I New England BioLabs R0507S 10,000 units/mL
Asc I New England BioLabs R0558S 10,000 Units/mL
BamH I New England BioLabs R0136S 10,000 Units/mL
BstB I New England BioLabs R0519S 20,000 Units/mL
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
ElectroMAX DH10B Cells  ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 18290015 Electocompetent DH10B cells
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm Bio-Rad 165-2086
Ethanol Merck 100983 Flamable
Isopropanol Merck 109634 Flamable
Large-Construct Kit (10) QIAGEN 12462 For high-purity BAC preparation
LB Broth ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 12780029 Can be homemade as well
LB with Agar ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 22700041 Can be homemade as well
Methanol Merck 106009 Flamable
Mlu I New England BioLabs R0198S 10,000 Units/mL
Oligonucleotides IDT N/A
Plasmid pBeloBAC11 New England BioLabs ER2420S (E4154S)
Plasmid Midi Kit (25) QIAGEN 12143 For midle-scale preparation of BAC plasmids
Pml I New England BioLabs R0532S 20,000 Units/mL
Polypropylene tubes (10 mL) DeltaLab 175724 Other commercial sources are acceptable
QIAEX II Gel Extraction Kit (150) QIAGEN 20021 Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb
Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) New England BioLabs M0371S 1,000 Units/mL
SOC Medium ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 15544034 Can be homemade as well
Synthesis of cDNA fragments Bio Basic N/A
T4 DNA Ligase Sigma-Aldrich (Roche) 10481220001 1,000 Units/mL
2. Cell Culture Reagents
6-Well Plates ThermoFisher Scientific (Nunc) 140675
12-Well Plates ThermoFisher Scientific (Nunc) 150628
24-Well Plates ThermoFisher Scientific (Nunc) 142485
Agar Noble VWR 214230
Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody Varies N/A
Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody Varies N/A
Cell Culture Dishes (100 mm x 21 mm) ThermoFisher Scientific (Nunc) 172931
Conical Tubes (15 mL) VWR 525-0150
Conical Tubes (50 mL) VWR 525-0155
Crystal Violet Sigma-Aldrich C6158
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Toxic and carcinogenic
DEAE-Dextran Sigma-Aldrich D9885
DMEM ThermoFisher Scientific (Gibco) 11995065
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific (HyClone)) SV30160.03
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Toxic and carcinogenic
L-Glutamine ThermoFisher Scientific (Gibco) 25030081
Lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific (Invitrogen) 11668019 Transfection reagent
Nonessential amino acids ThermoFisher Scientific (Gibco) 11140035
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific (Gibco) 31985070 Transfection medium
Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 BEI Resources NR-50327
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710-S Toxic and carcinogenic
PBS ThermoFisher Scientific (Gibco) 14190144
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific (Gibco) 15140122
ProLong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific (Invitrogen) P10144
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
Vectastain ABC Kit Vector Laboratories Inc PK-4010 Avidin/biotin-based peroxidase kit
Vero Cells ATCC CCL-81
ZIKV E Protein mAb 1176-56 BioFront Technologies BF-1176-56
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis System Bio-Rad 1704468 Other commercial sources are acceptable
Class II Biosafety CO2 Cabinet Varies N/A Other commercial sources are acceptable
Desktop Refrigrated Centrifuge Varies N/A
Fluorescence Microscope Varies N/A
High-speed Refrigrated Centrifuge Varies N/A
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100 Other machines are acceptable
SimpliAmp Thermal Cycler ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) A24811 Other machines are acceptable
Vortexer Varies N/A

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 148 Arbovirus flavivirus जिका वायरस रिवर्स आनुवंशिकी पूर्ण लंबाई cDNA संक्रामक क्लोन जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र cDNA transfection वायरस बचाव
एक जीवाणु कृत्रिम क्रोमोसोम CDNA क्लोन से रिकॉमबिनेंट जिका वायरस का बचाव
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Ávila-Pérez, G., Park, J.… More

Ávila-Pérez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazán, F., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone. J. Vis. Exp. (148), e59537, doi:10.3791/59537 (2019).

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