Summary
Zika virüsü son salgını aşılar ve/veya terapötik stratejileri geliştirmek için ters genetik yaklaşımlar kurulması önemini vurgular. Burada, biz insan sitomegalovirus acil-erken Organizatör kontrolü altında bir bakteriyel yapay kromozom monte tam uzunlukta cDNA klon bir bulaşıcı rekombinant Zika virüsü kurtarmak için protokol tarif.
Abstract
Zika virüsü (zikv) enfeksiyonunun son dünya çapında salgını ve onaylı aşılar ve/veya antiviral eksikliği sırasında nörolojik komplikasyonlar ile ilişkisi ZIKV biyolojisinin incelenmesi ve terapötik ve/veya profilaktik yaklaşımların geliştirilmesi. Ancak, diğer flavivirüsler gibi, ZIKV tam uzunlukta bulaşıcı cDNA klonlar nesil bakterilerde amplifikasyon sırasında viral dizileri toksisitesi nedeniyle engel olmuştur. Bu sorunun üstesinden gelmek için, bakteriyel yapay kromozomların (BACs) kullanımına dayanan geleneksel olmayan bir yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşımı kullanarak, ZIKV gerilme Rio Grande do Norte Natal tam uzunlukta cDNA kopyası (ZIKV-RGN) dört sentetik DNA parçaları oluşturulur ve insan sitomegalovirus (CMV) kontrolü altında tek kopya pBeloBAC11 plazmid içine monte Hemen erken Organizatör. Birleştirilmiş BAC cDNA klon bakteri yayılma sırasında kararlı ve enfeksiyöz rekombinant (r) ZIKV BAC cDNA klon transfeksiyon sonra Vero hücrelerinde kurtarılır. Burada açıklanan protokol, ZIKV ve diğer pozitif iplikli RNA virüsleri de dahil olmak üzere flavivirüslerin bulaşıcı klonlar üretimi için güçlü bir teknik sağlar, özellikle bakteri sırasında istikrar problemleri olan büyük genomları olan yayılımı.
Introduction
ZIKV Şu anda küresel bir kamu sağlığı acil1teşkil flaviviridae ailesi içinde Flavivirus cins bir sivrisinek kaynaklı üyesidir. Diğer flavivirüsler gibi, ZIKV, pozitif bir anlam içeren icosahedral benzeri bir yapıya sahip bir zarflı RNA Virüsdür, yaklaşık 10,8 KB 'lik tek telli RNA molekülü (Şekil 1)2. Viral genom, viral ve hücresel proteinler tarafından üç yapısal proteinli (capsid [C], premembran/membran [prM/M] ve zarf [E]) tarafından işlenen yaklaşık 3.423 amino asitlerin büyük bir polyproteini kodlar ve oluşumunda yer alan viral parçacıklar ve yedi yapısal olmayan (NS) proteinleri (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, ve NS5) genom çoğaltma katılmak, virüs montajı, ve ev sahibi bağışıklık tepkisi kaçırma (Şekil 1)3.
Tarihsel olarak, zikv enfeksiyonu hafif bir febril hastalık ile ilişkilidir4,5. Ancak, Güney ve Orta Amerika, Güney Pasifik ve Karayip6,7,8ve Guillain-Barré sendromu oluşumu ile dernek boyunca zikv enfeksiyonların patlayıcı son pandemi ve mikrosefali9,10,11,12,13, tarihi algı değişti ve önemli bir insan patojen olarak zikv alaka potansiyeli. Bu anlamda, enfeksiyöz cDNA klonlar gibi moleküler araçların gelişimi, viral patogenezin incelenmesi ve genetik olarak tanımlanmış aşıların geliştirilmesi ve ZIKV enfeksiyonunun tedavisinde antiviral ilaçların tanımlanması konusunda kolaylaştıracaktır. Diğer flavivirüsler için açıklandığı gibi, zikv infeksiyonlu klonlar üreme sırasında toksik viral proteinlerin sızdırmaz ifade izin viral genom14 şifreli bakteriyel promotörler varlığı nedeniyle zordur Standart yüksek kopya numarası plazmids kullanarak bakterilerde cDNA klonlar15,16,17. Bu toksisite sorununun üstesinden gelmek için, son iki yıl içinde birkaç geleneksel olmayan yaklaşımlar başarıyla uygulandı18. Bu düşük kopya sayısı plazmids kullanımı dahil19,20, toksik bölgeleri bozmak için intronlar eklenmesi21,22,23, cDNA parçaları in vitro ligasyon 24 , 25, viral genom26,27, bulaşıcı subgenomic amplikonlar (ISA)28,29, Gibson derleme yöntemi30 şifreli bakteriyel Rehberleri mutasyonal susturma ve dairesel polimeraz uzatma reaksiyonu (CPER)31kullanımı.
Burada, biz bir tam uzunluklu cDNA klon Mühendislik için ayrıntılı protokol tarif ZIKV gerilme ZIKV-RGN13, toksisite sorunu aşmak IÇIN bir BAC kullanarak, ve enfeksiyöz rZIKV, doğrudan transfeksiyon tarafından Bac cDNA klon Vero içine hücreler32, insan aşıları33gelişimi Için gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanmış bir hücre hattı. Bu sistemde, viral genomun tam uzunluklu cDNA kopyası BAC plazmid pBeloBAC1134 (Şekil 2a), bir düşük kopya numarası plazmid (hücre başına bir-Iki kopya) Escherichia coli F-Factor35türetilmiştir, Hangi, bakterilerde yayılması sırasında Flavivirus dizileri toksisitesi en aza indirir. Zikv genomunun cDNA, pBeloBAC11 yılında insan CMV acil-erken Organizatör kontrolü altında monte edilir, viral (v) RNA 'ya Hücresel RNA polimeraz II ile transfekte hücrelerin çekirdeğinde ifade vermek ve 3 '-End hepatit tarafından çevrelenmiş Delta virüsü (HDV) kesen (RZ), ardından sığır büyüme hormonu dizileri (BGH) sonlandırma ve polyadenilation sinyalleri otantik 5 '-ve 3 '-uçları viral genom taşıyan sentetik Rnas üretmek için, sırasıyla (Şekil 2B). Bu cDNA-başlatılan sistem, bir in vitro transkripsiyon adıma gerek kalmadan bulaşıcı ZIKV kurtarma sağlayan, capped viral RNA hücre içi ifadesinde sonuçlanır. Bac yaklaşımı diğer flavivirüsler için istikrarlı ve tam fonksiyonel bulaşıcı cDNA klonlar oluşturmak için geçerli güçlü bir metodoloji sağlar, yanı sıra diğer pozitif-telli RNA virüsleri36,37, 38,39,40,41.
Protocol
1. bir BAC içinde bir ZIKV bulaşıcı cDNA klon inşaatı
Not: BACs içinde ZIKV montajı için strateji RGN gerinim13 (KATıLıM numarası KU527068) için açıklanmıştır (Şekil 2).
- Plazmid pBeloBAC11 içinde bulunmayan viral genomda uygun şekilde aralıklı benzersiz kısıtlama sitelerini seçin (Şekil 2a).
Not: ZIKV-RGN için, PML ı, AFE ı ve BstB I (sırasıyla genomik pozisyonlar 3.347, 5.969 ve 9.127) kısıtlama siteleri seçilmiştir. Herhangi bir uygun kısıtlama siteleri viral genom kullanılabilir durumda, cDNA parçası tasarımı sırasında viral genom sessiz nükjtid mutasyonları sunarak yeni kısıtlama siteleri oluşturmak. - 5 '-End ve HDV RZ, BGH sonlandırma ve polyadenilasyon dizileri 3 '-End ( Şekil 2B) CMV Organizatör tarafından çevrili tam uzunlukta genom (Z1-Z4) kapsayan kimyasal sentezleme dört cDNA parçaları tarafından üretir. Her parça seçilen kısıtlama siteleri (adım 1,1) tarafından çevrelenmiş olmalıdır.
Not: Fragment Z1, pBeloBac11 içindeki parçaların geri kalanını klonlamak için bir omurga olarak kullanılır. Bu amaçla, bu insan CMV Organizatör içermelidir ve 5 '-End apal ı (pBeloBAC11 içinde bu parça klon) ve ASC ı (viral genom yok) ile çevrili olmalıdır ve 3 '-son kısıtlama siteleri tarafından bulaşıcı klon montajı için seçilen (PML ı , AFE ı, ve BstB I) mlu ı (viral genom yok) ve BamH I (pBeloBAC11 içinde bu parçayı klonlamak için) izledi. Parça Z4, viral genomun sonuna kadar seçilen son kısıtlama sitesinden (BstB ı), HDV RZ, BGH sonlandırma ve polyadenilasyon dizileri ve mlu I kısıtlama sitesi (Şekil 2B) ile genom bölgesini içermelidir. Alternatif olarak, cDNA parçaları (Z1-Z4) standart ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonları (RT-PCRs) ve spesifik oligonükleotidler kullanarak çakışan PCRs kombinasyonu ile oluşturulabilir. - Z1 ile Z4 arasında pBeloBAC11 (Şekil 2B) parçacıklarının sıralı klonlanması Ile bulaşıcı cDNA klonunu birleştirin.
- PBeloBAC11 Plasmid ve Z1 parçası ApaL I ve BamH ı ile özettir. Bunun için, 2 μg pBeloBAC11 plazmid veya 1 μg Z1 parçası ile 10 μL 10X reaksiyon tamponu, 20 adet her enzim ve su 100 son hacmine ulaşır. 2 saat için 37 °C ' de Inkük.
- Karides alkalin fosfataz (SAP) kullanarak BAC vektörü dephosphorylate. Bu amaçla, sindirilmiş BAC için SAP 2,5 μL (2,5 birimleri) ekleyin ve 37 °C ' de 1 h için inkübasyon yapın. SAP tarafından 75 °C ' de 15 dakika ısı inaktive edilir.
- 10 KB 'den daha büyük olan DNA parçalarının arıtılması için optimize edilmiş ticari bir jel Temizleme Kiti kullanarak dephosphorylated Bac vektörünü ve parçası Z1 'yi agaroz jel elektroforezi ile arındırın ( malzeme tablosunabakın).
- Plasmid (p) BAC-Z1 oluşturmak için ligasyon reaksiyonu gerçekleştirin. Bu amaçla, mix 150 ng, 10 mM ATP, T4 DNA ligaz bir birim, ve 15 μL son hacmine su içeren 10X T4 DNA ligaz tamponu 1:3, 1,5 μL vektör-to-insert bir molar oranı kullanarak arıtılmış Ekle ile saf sindirilmiş BAC vektör.
- Ligasyon karışımını 16 °C ' de 20 saat boyunca inkübasyon yapın. Ligasyon reaksiyonu kontrolü olarak, ekleme yapmadan paralel bir ligasyon reaksiyonu gerçekleştirin. 65 °C ' de 15 dakika boyunca inkübasyon ile ligaz ısı-ınactivate.
Not: Künt uçlu DNAs durumunda, ligasyon reaksiyonu 14 °C ' de 20 saat boyunca inkübasyon yapın. BAC vektörünün büyük büyüklüğü nedeniyle (Şekil 2a), ligasyon verimliliğini artırmak için geleneksel plazmids kullanarak daha büyük miktarlarda vektör ve kesici uç kullanmak esastır. - 50 μL E. coli DH10B elektroyetkili hücreler ile 2 μL ligasyon reaksiyonu (Step 1.3.5) ile Elektroporasyon (25 μF kapasitans, 2,5 kV ve 100 Ω direnci) ile, 0,2 aralığında aralıklı elektrotlarla donatılmış Elektroporasyon küvetler kullanarak Transform cm, aşağıdaki standart protokoller.
- Hücreleri 1 mL SOC Orta (% 2 Tripton, 0,5% maya ekstresi, 0,05% NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mm MgSO4, 20 mm glikoz [pH 7,0]) ile polipropilen tüpüne aktarın ve 1 saat boyunca yumuşak sallama (200-250 rpm) ile 37 °c ' de onları kulyın. Hücreler, 12,5 μg/ml kloramfenikol içeren Luria suyu (lb) agar plakaları üzerine plaka ve 16 h için 37 °c ' de onları inkük.
- 8 ila 12 bakteriyel kolonileri seçin, 12,5 μg/mL chloramphenicol içeren yeni LB agar plakasında bir yineleme yapın ve belirli oligonükleotidler kullanarak doğrudan PCR analizi ile doğru kesici uç içerip içermediğini sınayın.
- Kopya plaka pozitif bir koloni seçin, 100 mL LB içeren 12,5 μg/mL chloramphenicol içinde büyümek ve bir ticari Plasmid Midi kiti kullanarak BAC cDNA alkalin liziz yöntemi ile izole, büyük arıtma için öneri aşağıdaki düşük kopya plazmids ( malzeme tablosunabakın).
Not: Bu yöntemle hazırlanan BAC cDNA, bakteriyel genomik DNA 'nın% 30 ' a kadar kontamine olabilir, ancak kısıtlama analizini, sıralamayı ve klonlamayı gerçekleştirmek için kaliteye uygundur. BAC boyutuna bağlı olarak, BAC plazmid 4-6 μg verimleri elde edilebilir. - Klonlanmış cDNA 'nın genetik bütünlüğünü kısıtlama analizine göre doğrulayın. 1 h için 37 °C ' de ASC ı ve PML ı ile pBAC-Z1 Plasmid 500 ng, Z1 parçasının varlığını jel elektroforez ile teyit edin. Daha fazla istenmeyen mutasyonların tanıtılmadı onaylamak için, belirli oligonucleotides ile sıra ekleyin.
- Seçilen kısıtlama sitelerini (PML ı, AFE ı, BstB ı ve mlu ı) içeren Plasmid pBAC-Z1 ' d e k i başlayarak, tam uzunluklu bulaşıcı cDNA klon pBAC-ZIKV (Şekil 2B) oluşturmak için, benzer deneysel Bölüm Z1 (adımlar 1.3.1-1.3.10) için yukarıda açıklandığı gibi yaklaşımlar.
2. enfeksiyon rZIKV kurtarma için yüksek saflık pBAC-ZIKV hazırlanması
Not: Bir ultra saf pbac-zikv bulaşıcı klon, transfeksiyon ve bulaşıcı virüslerin kurtarma için uygun büyük ölçekli hazırlanması, özellikle Bac arıtma için geliştirilen bir ticari kiti ile alkalin lizis tarafından gerçekleştirilir ( tabloya bakın Malzemeler). Kit, bakteriyel genomik DNA kontaminasyonunu ortadan kaldıran ATP bağımlı bir eksonükleaz sindirim adımını içermelidir ve bu da sezyum klorür yöntemiyle elde edilen benzer bir saflık derecesi ile Bac cDNA izolasyonu sağlar.
- E. coli DH10B tek bir koloni büyütün pbac-zikv enfeksiyöz klon taşıyan 5 ml lb orta içeren 12,5 μg/ml kloramfenikol içinde 37 ° c için 8 h nazik sallayarak (200-250 rpm).
- 1 ml bakteriyel kültür ekleyin (adım 2,1) için 500 ml lb ile 12,5 μg/ml kloramfenikol içinde bir 2 L Flask ve hücreleri büyümek 37 °c için 14-16 h (bir od600 kadar 0.6-0.8).
Not: Harika broth (TB) gibi zengin suyu, son derece yüksek hücre yoğunlukları üretebilir, BAC cDNA daha düşük bir verim ve daha az saflık sonuçlanan. - Özellikle BAC arıtma için geliştirilen bir ticari Kit kullanarak alkalin liziz BAC bulaşıcı cDNA klon arındırmak, üreticinin özellikleri aşağıdaki ( malzeme tablosunabakın). Saflaştırılmış BAC cDNA 'yı 4 °C ' de tutun. Bac boyutuna bağlı olarak, 30 μg ultra saf Bac cDNA klon verimleri elde edilebilir.
Not: DNA pelsini 5 dakikadan fazla kurutmayın, aşırı kurutma BAC cDNA 'yı çözülmesini zorlaştırır. Bac cDNA klon büyük boyutu nedeniyle, Plasmid kesme önlemek için vortoklama veya pipetleme kaçının.
3., Vero hücrelerinin Transfection BAC cDNA klon gelen bulaşıcı rZIKV kurtarma
Not: Enfeksiyöz rZIKV, pBAC-ZIKV cDNA klon ile Vero hücrelerinin transfeksiyon tarafından kurtarılır, ticari bir katyonik lipid transfeksiyon reakajı kullanarak ( malzeme tablosunabakın; Şekil 3).
- Transfeksiyon önce bir gün, plaka 6-kuyu plakaları 5 x 105 Vero hücreleri/iyi büyüme ortamında (Dulbecco modifiye kartal orta [dmem] ile tamamlayıcı 5% fetal Sığır serum [FBS], 2 mm L-glutamin, ve 1% esansiyel olmayan amino asitler) antibiyotik olmadan transfeksiyon sırasında 90% confluent hücre monolayers yükseltmek için.
Not: Biz triplicates virüs kurtarıyor gerçekleştirme öneririz. -
Eşit serum-azaltılmış Orta (malzeme tablosuna bakın) Oda sıcaklığında ve her transfeksiyon numunesi için steril mikrofuge tüpleri transfeksiyon karışımları hazırlamak aşağıdaki gibidir.
- 250 μL içinde BAC cDNA klon 4 μg ekleyin serum-azaltılmış orta ve mix dikkatlice, Plasmid kesme önlemek için vormpleme kaçınarak.
- Ayrı bir tüpte, 12 μL transfeksiyon reakajının (1 mg/mL) seyreltilebilir ( malzeme tablosunabakın) 250 μL 'de serum-azaltılmış orta, vormıbe ile karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kulkarın.
- Seyreltilmiş Bac cDNA ve transfeksiyon reaktif (bir 1:3 oranı ile DNA: transfeksiyon reaktif), mix dikkatle voronyası kaçınarak, karıştırın ve oda sıcaklığında 20-30 dk için inküye birleştirin.
- BAC cDNA/transfeksiyon reaktifinin inkübasyon döneminde, antibiyotikler olmadan büyüme ortamı ile Wash Vero hücreleri ve antibiyotik olmadan taze orta 1 mL hücreleri bırakın.
Not: Transfeksiyon sürecinde antibiyotiklerin eklenmesi transfeksiyon verimliliğini azaltabilir. - BAC cDNA/transfection reaktif karışımının (adım 3.2.3) 500 μL 'ini Vero hücrelerine dağıtın, plakayı ileri geri sallayarak karıştırın ve hücreleri 6 h için 37 °C ' de% 5 CO2 nemlendirici inkükobilerde kuluçsa.
- Transfeksiyon ortamını çıkarın, antibiyotiklerle 2 mL taze büyüme ortamı ekleyin (100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomicin),% 5 CO2 nemlendirilmiş inkükodedeki hücreleri 37 °c ' de ele geçer ve her gün Sitopatik etki indüksiyonu için kontrol edın (CPE ).
Not: ZIKV CPE oldukça Vero hücrelerinde telaffuz edilir ve ayırmak ve doku kültürü supernatant float yuvarlak ve birefringent hücrelerin varlığı ile karakterize edilir. - Vero hücre dokusu-kültür süpernatanlarında (adım 3,5) her 24 saat (100 μL) toplamak plakaya, taze Vero hücrelerde standart bir plak tahlil kullanarak zikv varlığını değerlendirerek virüs kurtarma verimliliğini belirlemek için (Şekil 4A).
- Transfeksiyon dört ila altı gün sonra, CPE yaklaşık% 50-75% (Şekil 4b), 15 ml konik tüplerde doku kültürü süpernatanlarında toplamak ve 4 °c ' de 10 dakika için 2.000 x g Santrifüjlü hücresel enkaz kaldırmak için.
- Rzikv içeren süpernatanlarında hasat ve hücre Pellet atın. Cryotubes içinde süpernatant aliquot ve onları saklamak-80 °c daha da kurtarılan rzikv varlığını onaylamak için.
4. kurtarılan rZIKV titrasyon
- Bir gün önce Titrasyon, tohum 12-kuyu plakaları 2,5 x 105 Vero hücreleri/iyi büyüme ortamında yükseltmek için 90% confluent hücre monolayers titrasyon zaman.
Not: Biz triplicates içinde kurtarılan rZIKV titrasyon gerçekleştirme öneririz. - Dondurucudan süpernatant bir kısım çıkarın (adım 3,8) ve FBS olmadan büyüme ortamında seri 10 kat dilüsyonlar yapmak.
- Wash Vero hücreleri 2x fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ve eklemek 200 μL/Well her virüs seyreltme triplicate içinde. 37 °C ' de% 5 CO2 nemlendirici inkükote yer plakaları ve 90 dk adsorpsiyon dönemi için her 15 dakikada bir kaya.
- Viral inoculum çıkarın, 2% FBS, 1% DEAE-dextran ve 0,6% agar Noble içeren büyüme orta iki mL ile hücreleri bindirme ve 37 °C altında% 5 Co2 için 3-4 gün içinde inkübe.
Not: Agarose, metilselüloz veya diğer kaplama ortamını kullanmak mümkündür. Uygun plak oluşumu için zaman kullanılan bindirme ve ZIKV gerilme bağlı olarak değişecektir. -
1 mL/iyi% 4 formaldehit ile ZIKV enfekte hücreleri düzeltin 1 h için oda sıcaklığında PBS seyreltilmiş, bindirme kaldırmak ve% 0,1 kristal menekşe ile onları boyama tarafından viral plaklar görselleştirin% 20 oda sıcaklığında metanol 15 dakika.
- Kristal menekşe atın, su ile 3x yıkayın, plakaları kurumasına izin ve elle plakları saymak (Şekil 4c, sol panel). Viral titresi mililitre başına plak şekillendirme birimleri olarak hesaplanır (PFU/ml).
-
Alternatif olarak, viral plaklar Pan-Flavivirus E protein fare monoklonal antikor (mAb) 4G2 (Şekil 4c, sağ panel) ile immünostasyon ile görselleştirilebilir.
- ZIKV plakları immünostasyon ile değerlendirmek için, yukarıda açıklandığı gibi kaplama agar sabitleme ve kaldırılması sonra (adım 4,5), PBS ile hücreleri 2x yıkayın ve PBS 200 μL/iyi% 0,5 Triton-X100 ile inkübasyon ile onları geçirdürücü oda sıcaklığında 15 dakika.
- Geçirgen solüsyonu çıkarın, hücreleri 3x PBS ile yıkayın ve 200 μL/Well engelleme çözeltisi ile engelleyin (PBS 'de% 10 FBS) Oda sıcaklığında 1 saat.
Not: Diğer standart engelleme çözümleri (örn., PBS 'de% 2,5 BSA) Bu adımda kullanılabilir. - Engelleme çözümünü çıkarın ve 200 μL/Well ile hücreleri inküt et-Flavivirus E protein mAb 4G2 engelleme çözeltisi (1 μg/mL) için 37 °C ' de 1 saat seyreltilmiş.
Not: Diğer MAB veya poliklonal antikorlar (PAB) immünostasyon ve viral plaklar tespiti için 4g2 yerine kullanılabilir. - Hücreleri 3x PBS ile yıkayın ve 200 μL biyotinlenmiş Anti-Mouse ikincil antikor seyreltilmiş (üreticinin tavsiyesi sonrasında) 1 h için 37 °c ' de engelleme çözeltisi ile inküye.
- İkincil antikor çıkarın, hücreleri 4X PBS ile yıkayın ve üreticinin özellikleri aşağıdaki bir avidin/biotin tabanlı peroksidaz kiti kullanarak viral plakları görselleştirin ( malzeme tablosunabakın).
5. başarılı rZIKV kurtarma onayı
Not: Kurtarılan virüsün kimliğini daha da onaylamak için, zikv e protein ifadesi, ZIKV E protein (Şekil 4d) için özel fare mab 1176-56 kullanarak immünofluorescence tarafından analiz edilir. Bu mAb ZIKV E protein için özeldir, Pan-Flavivirus E protein mAb 4G2 (adım 4.6.3) durumunun aksine. Alternatif olarak, virüs kimliği sıralama tarafından teyit edilebilir.
- İmmünofloresan analizinden bir gün önce, 24-kuyu plakaları 1 x 105 Vero hücreleri/iyi büyüme ortamında% 90 confluent hücre monolayers enfeksiyon sırasında yükseltmek için içeren tohum Cover,.
- Hücreleri 2x PBS ile yıkayın ve enfeksiyon bir çokluğu ile bulaştırmak (MOı) 0,5 PFU/hücre FBS olmadan büyüme ortamında kurtarılan virüsü (100 μL/Well) triplicate. 37 ° c 'de plakaları 90 dakika boyunca inküye.
- Viral adsorpsiyon sonra, viral inoculum çıkarın,% 2 FBS ile taze büyüme orta 0,5 mL ekleyin ve 48 h için 37 °C ' de% 5 CO2 nemlendirilmiş kuluçte hücreleri inkük.
- Doku kültürü supernatant çıkarın, 150 μL/iyi PBS% 4 civarında formaldehite ile hücreler oda sıcaklığında 20 dakika ile düzeltmek ve PBS 150 μL/iyi% 0,5% Triton-X100 ile hücreleri geçirmezize oda sıcaklığında 15 dakika.
- Geçirgen solüsyonu kaldırdıktan ve PBS ile hücreleri 3x yıkama sonra, 150 μL/Well engelleme çözeltisi ile hücreleri blok 1 saat oda sıcaklığında.
Not: Hücre taraması alternatif engelleme çözümleriyle bloke edilir (örn.% 2,5 PBS 'de BSA). - Engelleme çözümünü çıkarın ve hücreleri 100 μL/kuyu mAb 1176-56 ile inkük, ZIKV E proteini için spesifik, engelleme çözeltisi (1 μg/mL), 37 °C ' de 1 h için seyreltilmiş.
- Hücreleri 3x PBS ile yıkayın, oda sıcaklığında 1 h ile 100 μL/Well Alexa Fluor 488-konjuate Anti-Mouse ikincil antikor seyreltilmiş (üreticinin tavsiyesi sonrasında) engelleme çözeltisi, geniş PBS ile hücreleri yıkayın ve 4 ', 6 '-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 mg/mL) 150 μL/kuyu ile 10 dk oda sıcaklığında PBS 'de 1:200 seyreltilebilir.
- Hücreleri 3x PBS ile yıkayın, bir antifade montaj ortamına coverflar monte ( malzeme tablosunabakın), ve floresan mikroskobun altında örnekleri analiz.
Not: Uzun süreli saklama için 4 °C ' de depolama örnekleri, ışıktan korunmaktadır.
6. viral stokların amplifikasyon ve üretimi
Not: Bir kez kurtarılan virüs kimliği teyit (Bölüm 5), Vero hücrelerinde virüs yükseltmek ve daha fazla çalışmalar için viral stokları oluşturmak.
- 100 mm x 21 mm plakalar içinde% 90 konfluence içinde Vero hücreleri büyümek ve daha önce açıklandığı gibi bir MOı 0,1 PFU/hücre ile onları bulaştırmak.
- Ne zaman CPE yaklaşık 75% (yaklaşık 48-72 h postenfeksiyon), bir 50 ml konik tüp içinde doku kültürü süpernatant toplamak ve Santrifüjü 2.000 x g 10 dk 4 °c ' de hücresel enkaz kaldırmak için.
- Rzikv içeren süpernatant hasat ve hücre Pellet atın. Cryotubes içinde süpernatant aliquot ve onları saklamak-80 °c.
- Dondurucu bir virüs kısım kaldırmak ve önce açıklandığı gibi plak tahlil tarafından viral titresi belirlemek (Bölüm 4).
Representative Results
Burada açıklanan protokol, birkaç flaviviral dizileri ile ilişkili toksisite sorunları en aza indirmek için bir BAC kullanarak istikrarlı ZIKV tam uzunlukta cDNA bulaşıcı klonlar nesil için izin verir. BAC cDNA klon gelen bulaşıcı rZIKV verimli kurtarma kolayca duyarlı Vero hücrelerin transfeksiyon sonra elde edilebilir (Şekil 2). Bu protokolü kullanarak, biz düzenli klonlama yöntemleri ve benzersiz kullanarak BAC plazmid pBeloBAC1134 içine ardışık dört çakışan cDNA parçaları klonlama tarafından zikv GERINIM rgn32 Istikrarlı bir tam uzunlukta cDNA klon oluşturdu viral genomda mevcut sınırlama siteleri (Şekil 2). Tam uzunluklu cDNA klon 5 '-End insan CMV Organizatör tarafından transfked hücrelerin çekirdeğinde vrna ifade izin tarafından çevrelenmiş ve 3 '-End HDV RZ tarafından takip BGH Poliadenilasyon ve sonlandırma dizileri, içeren Rnas üretmek için viral genomun tam 3 ' End (Şekil 2). Üretilen BAC cDNA klon bakterilerde istikrar, birlikte kendi kolay manipülasyon ile standart rekombinant DNA Teknolojileri, istikrarlı tam uzunlukta cDNA klonlar hızlı ve güvenilir nesil için BAC cDNA yaklaşımı potansiyelini vurgular ZIKV ve diğer flavivirüsler veya dengesiz viral genomlar ile pozitif telli RNA virüsleri.
Bac cDNA klon (Şekil 2) monte edildikten sonra, bulaşıcı virüs kolayca katyonik lipozomlar kullanarak Bac cDNA klon ile duyarlı Vero hücrelerin doğrudan transfeksiyon sonra kurtarılabilir(Şekil 3). Bu cDNA-başlatılan sistem capped Vrnahücre içi ifade izin, bir in vitro transkripsiyon adım gerek kalmadan bulaşıcı virüslerin kurtarma izin. Bu yaklaşımı kullanarak, rZIKV-RGN ' d e r 5 gün posttransfeksiyon (Şekil 4A) 106 PFU/ml 'den yüksek titrer ile kurtarabildik. Buna ek olarak, kurtarılan virüs net bir CPE (Şekil 4b), yaklaşık 2 mm boyutunda (Şekil 4c) homojen plaklar üretilen ve kimliği sıralamaya göre doğrulandı (veri gösterilmez) ve immünofluorescence analiz MAB özel kullanarak ZIKV E protein, 1176-56 (Şekil 4d) için. In vitro veri, kurtarılan rZIKV-RGN, Vero hücrelerinde verimli bir şekilde yinelendiğini ve doğal bir ZIKV izole32 (veri gösterilmez) ile karşılaştırıldığında seviyelere olduğunu gösterir. Genel olarak, bu sonuçlar bulaşıcı rZIKV BAC içinde monte tam uzunlukta cDNA klonlar kurtarılabilir olduğunu göstermektedir.
Şekil 1 : Zikv genom organizasyonu ve virion yapısı. (A) genom organizasyonu: zikv, tek bir polyprotein olarak çevrilmiş pozitif tek telli RNA içerir. Çevrilmiş polyprotein, viral (oklar) ve ev sahibi (elmas) proteinler tarafından yapısal proteinlerin kapsid (C, mavi), matris (M, kahverengi) ve zarf (E, yeşil) ve yedi yapısal olmayan proteinleri (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B ve NS5) üretmek için bölünmüşlerdir. Viral genom sonunda 5 ' ve 3 ' tercüme edilmemiş bölgeler (UTRs) siyah çizgiler ile belirtilir. (B) virion yapısı: zikv virions E ve M proteinleri ile dekore edilmiş, bir lipid fosfolipid bir icosahedral benzeri yapısı ile demirlemiş. Viral genomik RNA ile ilişkili C proteininden oluşan viral nükseokapsid virüs zarfında bulunuyordu. Bu rakam Ávila-Pérez ve al.18' den uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : BIR Bac içinde ZIKV tam uzunlukta bulaşıcı cDNA klon montajı. (A) pBeloBAC11 Bac şematik temsili: düzenleyici genler para, parb, parC, ve repe,F-Factor çoğaltma orijini (OriS), kloramfenikol dirençli geni (cmr), ve Lac Z geni belirtilir. Bulaşıcı ZIKV cDNA klon montajı için kullanılan ilgili kısıtlama siteleri altı çizilir. (B) pBeloBAC11 Bac IÇINE zikv tam uzunluklu bulaşıcı cDNA klon montaj: dört çakışan DNA parçaları (Z1-Z4), tüm zikv genomu kapsayan (Şekil 1) ve belirtilen kısıtlama siteleri ile çevrili, kimyasal tarafından oluşturulan sentezleme ve ardışık olarak pBeloBAC11 içine klonlanmış infeksiyonlu ZIKV cDNA klon pBAC-ZIKV oluşturmak için. Tam uzunluklu zikv bulaşıcı cDNA, insan sitomegalovirüsünün kontrolü altında hemen erken organizatör (CMV) ve HDV kesen (RZ) ve sığır büyüme hormonu (BGH) sonlandırma ve polyadenilasyon dizileri ile 3 ' End 'de çevrelenmiş olarak toplandı. Viral genler ve düzenleyici elemanlar için kısaltmalar Şekil 1' de açıklanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Iş akışı Bac cDNA klon gelen rZIKV oluşturmak için. Vero hücrelerinde% 90 konfluence KIV tam uzunluklu enfeksiyöz cDNA klon ile Tek tabakalı transfekte edildi pbac-zikv (Şekil 2) cationıc lipozomlar kullanarak. 4-6 gün sonra posttransfection, CPE belirgin olduğunda, rzikv içeren doku kültürü süpernatanlarında toplandı ve virüsün varlığı için değerlendirildi (Şekil 4) ve Vero hücrelerinde viral amplifikasyon için kullanılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : RZIKV iyileşme ve in vitro karakterizasyonu. (A) Bac cDNA Clone gelen enfeksiyöz rzikv kurtarma: Vero hücreleri% 90 konfluence (6-iyi plaka formatı, triplicates) sahte transfekte veya 4 μg/iyi pbac-zikv (Şekil 3) ile transfeksiyon, ve belirtilen günlerde posttransfection, doku kültürü süpernatanlarında virüs yazılar plak Assay (PFU/ml) tarafından belirlendi. Hata çubukları, üç farklı transfeksiyon denemelerinden standart sapmaları gösterir. Noktalı siyah çizgi algılama sınırını gösterir (50 PFU/mL). (B) VIRAL CPE: Vero hücreleri 90% konfluence (6-iyi plaka formatı, triplicates) Mock-enfekte (üst) veya enfekte (MOI, 0,5 PFU/Cell) rZIKV ile ve içinde 48 h postenfeksiyon, CPE varlığı ışık mikroskobu tarafından değerlendirildi. Ölçek çubukları = 100 μm. (C) viral plak assay ve Immünostasyon: Vero hücreleri 90% konfluence (12-kuyu plaka formatı) rZIKV ile enfekte edildi, ve içinde 72 h postenfeksiyon, viral plaklar kristal menekşe boyama tarafından görselleştirildi (sol) veya immünostasyon ( sağ) Pan-Flavivirus E protein mAb 4G2 kullanarak. Ölçek çubukları = 5 mm. (D) ımferofluorescence: Vero hücreleri 90% konfluence (24-iyi plaka formatı, triplicates) enfekte EDILDI (moı 0,5 PFU/Cell) rZIKV ile ve, at 48 h Postenfeksiyon, MAB kullanarak immünofluorescence tarafından analiz 1176-56, zikv için özel E proteini. Hücre çekirdekleri DAPı ile lekelendiler. ZIKV-enfekte Vero hücrelerinin bir temsilcisi birleştirilmiş görüntü gösterilir. Sağ üstteki beyaz kare, ZIKV enfekte Vero hücrelerinin büyütülmüş bir görüntüsünü temsil eder. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Discussion
Enfeksiyöz cDNA klonlar RNA virüslerinin temel araştırmaları ve aşıların gelişimi ve/veya antiviral stratejilerin tanımlanması için temel moleküler araçlar oluşturmaktadır. Ancak, flavivirüsler de dahil olmak üzere birçok pozitif telli RNA virüsü için, enfeksiyöz cDNA klonları üretimi, standart yüksek kopya numarası plazmids kullanılarak bakterilerde yayılan klonlanmış cDNAs 'ın istikrarsızlığına bağlı olarak zordur. Zikv ve diğer flavivirüsler durumunda, bu istikrarsızlık özellikle viral genoma mevcut şifreli bakteriyel promotörler toksik viral proteinlerin sızdıran ifadesi nedeniyle14,15,16,17 . Burada, tek bir Plasmid olarak istikrarlı bir ZIKV tam uzunlukta bulaşıcı cDNA klon oluşturmak için alternatif ve güçlü bir protokol açıklamak, BAC Plasmid pBeloBAC1134 (Şekil 2a) kullanımı dayalı toksisite sorunu aşmak için, kullanımı Nakledilmiş hücrelerin çekirdeğinde vRNA 'nın ifadesine izin vermek için CMV promotör ve HDV RZ, doğru 3 '-uçları (Şekil 2B) Ile vrnas üretmek için. Bu yöntemi kullanarak, biz başarıyla duyarlı Vero hücrelerin doğrudan transfeksiyon sonra bulaşıcı rZIKV verimli ve güvenilir kurtarma sağlayan ZIKV gerinim RGN tam istikrarlı bir bulaşıcı klon oluşturulan (Şekil 3 ve Şekil 4).
Son birkaç yılda ZIKV bulaşıcı cDNA klonlar ile ilgili istikrarsızlık sorunlarının üstesinden gelmek için büyük bir çaba yapılmıştır ve birkaç yaklaşım başarıyla18, cDNA parçaları in vitro ligasyon dahil olmak üzere uygulanmıştır24 ,25, düşük kopya plazmids19,20, Sessiz mutasyonlar giriş tarafından şifreli bakteriyel promotörler inaktivasyonu26,27, intron ekleme21, 22 , 23, Gibson Assembly yöntemi30, ISA yöntemi28,29ve cper31kullanımı. Bu yaklaşımlar toksisite sorunu aşmak ve ZIKV bulaşıcı cDNA klonlar oluşturmak için yararlı olmasına rağmen, bazıları zahmetli ve mevcut çeşitli dezavantajları vardır, içinde vitro ligasyon ve virüs azaltmak transkripsiyon adımlar için ihtiyaç de dahil olmak üzere kurtarma verimliliği veya viral Fitness etkileyebilir şifreli bakteriyel Organizatör devre dışı Sessiz mutasyonlar yüksek sayıda giriş, diğerleri arasında. Bu protokolde açıklanan yaklaşım aşağıdaki avantajları sunar. ı) Bac Plasmid pBeloBAC1134 , toksisite en aza indirir ve kararsız cdnas bakteri istikrarlı bakım sağlar hücre başına bir veya iki kopya, bir kesinlikle kontrollü çoğaltma vardır. ii) BAC plazmids yayılması ve değiştirilmesi, büyük boyutlu BAC-DNA parçaları ve düşük kopya plazmids işlemek için bu protokolde açıklanan hafif değişiklikler göz önüne alındığında, geleneksel plazmids neredeyse benzer. Özellikle, BAC cDNA klon da kırmızı rekombinasyon sistemi42,43,44. III kullanarak Homolog rekombinasyon ile E. coli içine değiştirilebilir) CMV Organizatör kullanımı sağlar capped ZIKV vRNA hücre içi ifade ve bir in vitro transkripsiyon adım gerektirmeden bulaşıcı virüslerin kurtarma. iv) enfeksiyöz rZIKV, BAC cDNA klon ile duyarlı hücrelerin doğrudan transfeksiyon (örneğin, Vero) sonra oluşturulur. Memeliler hücrelerinde DNA transfeksiyonunu RNA transfeksiyonuna göre daha verimli olduğundan, BAC yaklaşımı ile virüs kurtarma verimliliği RNA transkripsiyon kullanılarak gözlenen daha yüksektir, bir viral stok oluşturmak için kültür hücrelerinde pasajlar sayısını azaltarak ve, Sonuç olarak, hücre kültürü adaptasyon tarafından istenmeyen mutasyonların giriş sınırlandırılması.
Son olarak, BAC yaklaşımı potansiyeli bu yöntemin başarılı kullanımı ile desteklenmektedir (hafif değişiklikler ile) diğer flavivirüsler bulaşıcı cDNA klonlar mühendis için, Dang virüse36dahil, ve yüksek etkisi birkaç Coronaviruses insan ve hayvan sağlığı, gibi Trans, gastroenterit coronavirus37 (TGEV), kedi enfeksiyöz peritonit virüs38 (fıpv), insan coronavirus OC4339 (hcov-OC43), şiddetli akut solunum Sendromu Coronavirus40 (SARS-cov) ve Orta Doğu Solunum Sendromu Coronavirus41 (MERS-CoV), diğerleri arasında.
Burada açıklanan protokolde, dikkate alınmalıdır iki kritik adım vardır. Önemli bir göz BAC plazmid içinde bulunmayan viral genomda uygun benzersiz kısıtlama siteleri belirlemektir. Yeterli kısıtlama sitesi yoksa, klonlama tasarımı sırasında sessiz nükdesotid mutasyonları sunularak yeni kısıtlama siteleri oluşturulabilir. Bir başka önemli sorun da BAC plazmids hücre başına sadece bir veya iki kopya mevcut olmasıdır, ve bu nedenle, yüksek ve bakteriyel genomik DNA yüksek kontaminasyonu ile BAC plazmids düşük verim için tasarlanmış standart protokoller kullanılarak elde edilir Orta kopya-sayı plazmids. Bu potansiyel sorun kolayca büyük kültür hacimleri kullanarak aşmak ve Bac arıtma için özel olarak geliştirilen bir ticari kit ile BAC Plasmid arındırmak.
Özetle, biz bu Biyoloji çalışma kolaylaştırmak için diğer pozitif telli RNA virüslerin istikrarlı ve tam fonksiyonel bulaşıcı cDNA klonlar oluşturmak için adapte edilebilir bir BAC kullanımına dayalı güçlü bir ZIKV ters genetik yaklaşım geliştirdik virüsler ve aşıların gelişimi ve/veya antiviral ilaçların tanımlanması kolaylaştırmak için.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar, video hazırlığı ile ilgili yardım için BAC cDNA klon üretimi ve Snezhana Dimitrova 'daki teknik yardımları için Carla Gómez 'e teşekkür etmek ister. Bu çalışma, Ispanya ekonomi ve rekabet Bakanlığı (MINECO, Grant numarası BFU2016-79127-R) ve F.A.T. ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NıH, Grant Number 1R21AI120500) için L.M.S. ve F.A.T. tarafından hibe tarafından kısmen desteklenmektedir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Molecular Biology Reagents | |||
| Afe I | New England BioLabs | R0652S | 10,000 Units/mL |
| AmpliTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | N8080161 | 5,000 Units/mL |
| ApaL I | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/mL |
| Asc I | New England BioLabs | R0558S | 10,000 Units/mL |
| BamH I | New England BioLabs | R0136S | 10,000 Units/mL |
| BstB I | New England BioLabs | R0519S | 20,000 Units/mL |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| ElectroMAX DH10B Cells | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 18290015 | Electocompetent DH10B cells |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm | Bio-Rad | 165-2086 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | Flamable |
| Isopropanol | Merck | 109634 | Flamable |
| Large-Construct Kit (10) | QIAGEN | 12462 | For high-purity BAC preparation |
| LB Broth | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 12780029 | Can be homemade as well |
| LB with Agar | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 22700041 | Can be homemade as well |
| Methanol | Merck | 106009 | Flamable |
| Mlu I | New England BioLabs | R0198S | 10,000 Units/mL |
| Oligonucleotides | IDT | N/A | |
| Plasmid pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
| Plasmid Midi Kit (25) | QIAGEN | 12143 | For midle-scale preparation of BAC plasmids |
| Pml I | New England BioLabs | R0532S | 20,000 Units/mL |
| Polypropylene tubes (10 mL) | DeltaLab | 175724 | Other commercial sources are acceptable |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (150) | QIAGEN | 20021 | Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb |
| Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 Units/mL |
| SOC Medium | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 15544034 | Can be homemade as well |
| Synthesis of cDNA fragments | Bio Basic | N/A | |
| T4 DNA Ligase | Sigma-Aldrich (Roche) | 10481220001 | 1,000 Units/mL |
| 2. Cell Culture Reagents | |||
| 6-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 140675 | |
| 12-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 150628 | |
| 24-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 142485 | |
| Agar Noble | VWR | 214230 | |
| Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody | Varies | N/A | |
| Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody | Varies | N/A | |
| Cell Culture Dishes (100 mm x 21 mm) | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 172931 | |
| Conical Tubes (15 mL) | VWR | 525-0150 | |
| Conical Tubes (50 mL) | VWR | 525-0155 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Toxic and carcinogenic |
| DEAE-Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11995065 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific (HyClone)) | SV30160.03 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Toxic and carcinogenic |
| L-Glutamine | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 25030081 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 11668019 | Transfection reagent |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11140035 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 31985070 | Transfection medium |
| Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 | BEI Resources | NR-50327 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | Toxic and carcinogenic |
| PBS | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 14190144 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 15140122 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | P10144 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories Inc | PK-4010 | Avidin/biotin-based peroxidase kit |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | |
| ZIKV E Protein mAb 1176-56 | BioFront Technologies | BF-1176-56 | |
| 3. Equipment | |||
| Agarose Gel Electrophoresis System | Bio-Rad | 1704468 | Other commercial sources are acceptable |
| Class II Biosafety CO2 Cabinet | Varies | N/A | Other commercial sources are acceptable |
| Desktop Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| Fluorescence Microscope | Varies | N/A | |
| High-speed Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | Other machines are acceptable |
| SimpliAmp Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | A24811 | Other machines are acceptable |
| Vortexer | Varies | N/A |
References
- Friedrich, M. J. WHO Calls Off Global Zika Emergency. JAMA. 317 (3), 246 (2017).
- Sirohi, D., et al. The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 352 (6284), 467-470 (2016).
- Lindenbach, B. D., Murray, C. J., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer | Lippincott Williams & Wilkins. 712-748 (2013).
- Boeuf, P., Drummer, H. E., Richards, J. S., Scoullar, M. J., Beeson, J. G. The global threat of Zika virus to pregnancy: epidemiology, clinical perspectives, mechanisms, and impact. BMC Medicine. 14 (1), 112 (2016).
- Simpson, D. I. Zika virus infection in man. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Campos, G. S., Bandeira, A. C., Sardi, S. I. Zika Virus Outbreak, Bahia, Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1885-1886 (2015).
- Cao-Lormeau, V. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Costello, A., et al. Defining the syndrome associated with congenital Zika virus infection. Bulletin of the World Health Organization. 94 (6), 406-406A (2016).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
- do Rosario, M. S., et al. Guillain-Barre Syndrome After Zika Virus Infection in Brazil. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 95 (5), 1157-1160 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection during Pregnancy in Mice Causes Placental Damage and Fetal Demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. The New England Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
- Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome. PLOS ONE. 6 (3), e18197 (2011).
- Aubry, F., Nougairede, A., Gould, E. A., de Lamballerie, X. Flavivirus reverse genetic systems, construction techniques and applications: a historical perspective. Antiviral Research. 114, 67-85 (2015).
- Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. Journal of Virology. 85 (6), 2927-2941 (2011).
- Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Advances in Virus Research. 53, 183-207 (1999).
- Avila-Perez, G., Nogales, A., Martin, V., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetic Approaches for the Generation of Recombinant Zika Virus. Viruses. 10 (11), (2018).
- Annamalai, A. S., et al. Zika Virus Encoding Nonglycosylated Envelope Protein Is Attenuated and Defective in Neuroinvasion. Journal of Virology. 91 (23), (2017).
- Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host & Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
- Liu, Z. Y., et al. Characterization of cis-Acting RNA Elements of Zika Virus by Using a Self-Splicing Ribozyme-Dependent Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
- Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
- Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
- Deng, C. L., et al. Recovery of the Zika virus through an in vitro ligation approach. Journal of General Virology. 98 (7), 1739-1743 (2017).
- Widman, D. G., et al. A Reverse Genetics Platform That Spans the Zika Virus Family Tree. mBio. 8 (2), (2017).
- Munster, M., et al. A Reverse Genetics System for Zika Virus Based on a Simple Molecular Cloning Strategy. Viruses. 10 (7), (2018).
- Zhao, F., et al. Negligible contribution of M2634V substitution to ZIKV pathogenesis in AG6 mice revealed by a bacterial promoter activity reduced infectious clone. Scientific Reports. 8 (1), 10491 (2018).
- Atieh, T., Baronti, C., de Lamballerie, X., Nougairede, A. Simple reverse genetics systems for Asian and African Zika viruses. Scientific Reports. 6, 39384 (2016).
- Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497 (Supplement C), 157-162 (2016).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (1), (2017).
- Setoh, Y. X., et al. De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case. mSphere. 2 (3), (2017).
- Marquez-Jurado, S., et al. An Alanine-to-Valine Substitution in the Residue 175 of Zika Virus NS2A Protein Affects Viral RNA Synthesis and Attenuates the Virus In Vivo. Viruses. 10 (10), (2018).
- Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Wang, K., Boysen, C., Shizuya, H., Simon, M. I., Hood, L. Complete nucleotide sequence of two generations of a bacterial artificial chromosome cloning vector. BioTechniques. 23 (6), 992-994 (1997).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Research. 180, 12-22 (2014).
- Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5516-5521 (2000).
- Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. Journal of Virology. 86 (11), 6258-6267 (2012).
- St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. Journal of Virology. 80 (7), 3670-3674 (2006).
- Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. Journal of Virology. 80 (21), 10900-10906 (2006).
- Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. mBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
- Jamsai, D., et al. Targeted modification of a human beta-globin locus BAC clone using GET Recombination and an I-Scei counterselection cassette. Genomics. 82 (1), 68-77 (2003).
- Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73 (1), 56-65 (2001).
- Tischer, B. K., von Einem, J., Kaufer, B., Osterrieder, N. Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli. BioTechniques. 40 (2), 191-197 (2006).
