Summary
La reciente epidemia del virus del Zika pone de relieve la importancia de establecer enfoques genéticos inversos para desarrollar vacunas y/o estrategias terapéuticas. Aquí, describimos el protocolo para rescatar un virus del Zika recombinante infeccioso de un clon de ADNc de longitud completa ensamblado en un cromosoma artificial bacteriano bajo el control del promotor inmediato-temprano del citomegalovirus humano.
Abstract
La asociación de la infección por el virus del Zika (ZIKV) con complicaciones neurológicas durante el reciente brote mundial y la falta de vacunas y/o antivirales aprobados han puesto de relieve la urgente necesidad de desarrollar sistemas genéticos inversos del ZIKV para facilitar la estudio de la biología ZIKV y el desarrollo de enfoques terapéuticos y/o profilácticos. Sin embargo, al igual que con otros flavivirus, la generación de clones infecciosos de ADNc infecciosos de longitud completa de ZIKV se ha visto obstaculizada debido a la toxicidad de las secuencias virales durante su amplificación en bacterias. Para superar este problema, hemos desarrollado un enfoque no tradicional basado en el uso de cromosomas artificiales bacterianos (BCC). Con este enfoque, la copia de ADNc de longitud completa de la cepa ZIKV Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) se genera a partir de cuatro fragmentos de ADN sintético y se ensambla en el plásmido pBeloBAC11 de una sola copia bajo el control del citomegalovirus humano (CMV) promotor inmediato-temprano. El clon de ADNC BAC ensamblado es estable durante la propagación en bacterias, y el recombinante infeccioso (r)ZIKV se recupera en las células de Vero después de la transfección del clon de BAC cDNA. El protocolo descrito aquí proporciona una técnica poderosa para la generación de clones infecciosos de flavivirus, incluyendo ZIKV, y otros virus de ARN de cadena positiva, particularmente aquellos con grandes genomas que tienen problemas de estabilidad durante las bacterias propagación.
Introduction
ZIKV es un mosquito portador del género Flavivirus dentro de la familia Flaviviridae que actualmente constituye una emergencia de salud pública global1. Al igual que otros flavivirus, ZIKV es un virus de ARN envuelto con una estructura similar al icosahedral que contiene un sentido positivo, molécula de ARN de una sola cadena de aproximadamente 10,8 kb (Figura1)2. El genoma viral codifica una gran poliproteína de aproximadamente 3.423 aminoácidos que es procesada por proteasas virales y celulares en tres proteínas estructurales (capsid [C], premembrana/membrana [prM/M], y envolver [E]) que participan en la formación de la partículas virales y siete proteínas no estructurales (NS) (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5) que participan en la replicación del genoma, el ensamblaje de virus y la evasión de la respuesta inmune del huésped (Figura1)3.
Históricamente, infección por ZIKV se ha asociado con una enfermedad febril leve4,5. Sin embargo, la pandemia reciente explosiva de infecciones por ZIKV en toda América del Sur y Central, el Pacífico Sur y el Caribe6,7,8, y su asociación con la aparición del síndrome de Guillain-Barré y la microcefalia9,10,11,12,13,han cambiado la percepción histórica y potenciado la relevancia del ZIKV como un importante patógeno humano. En este sentido, el desarrollo de herramientas moleculares, como los clones infecciosos de ADNc, facilitará el estudio de la patogénesis viral y el desarrollo de vacunas definidas genéticamente y la identificación de medicamentos antivirales para el tratamiento de la infección por ZIKV. Como se describe para otros flavivirus, la generación de clones infecciosos ZIKV es difícil debido a la presencia de promotores bacterianos crípticos en el genoma viral14 que permiten la expresión de fugas de proteínas virales tóxicas durante la propagación de la clones de ADNc en bacterias utilizando plásmidos estándar de alto número de copia15,16,17. Para superar este problema de toxicidad, varios enfoques no tradicionales se han implementado con éxito en los últimos dos años18. Estos incluyen el uso de plásmidos de bajo número de copia19,20, la inserción de intrones para interrumpir las regiones tóxicas21,22,23, la ligadura in vitro de fragmentos de ADNc 24 , 25, silenciamiento mutacional de promotores bacterianos crípticos presentes en el genoma viral26,27, amplificadores subgenómicos infecciosos (ISA)28,29, el método de montaje Gibson30 , y el uso de la reacción de extensión de la polimerasa circular (CPER)31.
Aquí, describimos el protocolo detallado para la ingeniería de un clon de ADNc de longitud completa de la cepa ZIKV ZIKV-RGN13, utilizando un BAC para superar el problema de toxicidad, y el rescate de rZIKV infeccioso por transfección directa del clon BAC cDNA en Vero células32, una línea celular aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para el desarrollo de vacunas humanas33. En este sistema, la copia de ADNader de longitud completa del genoma viral se ensambla en el plásmido BAC pBeloBAC1134 (Figura2A),un plásmido de bajo número de copia (de una a dos copias por célula) derivado del factor F35de Escherichia coli, que minimiza la toxicidad de las secuencias de flavivirus durante su propagación en bacterias. El ADNc del genoma ZIKV se ensambla en pBeloBAC11 bajo el control del promotor humano CMV inmediatamente temprano, para permitir la expresión del ARN viral (v)en el núcleo de las células transfectógenas por ARN polimerasa celular II, y flanqueado a las 3'-end por la hepatitis ribozyme del virus delta (HDV) (RZ), seguido de las secuencias de las señales de terminación de la hormona de crecimiento bovino (BGH) y poliadenilación para producir ARN sintéticos que llevan auténticos 5'- y 3'-extremos del genoma viral, respectivamente (Figura2B). Este sistema lanzado por cDNA da como resultado la expresión intracelular del ARN viral tapado, permitiendo la recuperación de ZIKV infeccioso sin necesidad de una etapa de transcripción in vitro. El enfoque BAC proporciona una metodología poderosa aplicable a la construcción de clones de ADNc infecciosos infecciosos estables y totalmente funcionales para otros flavivirus, así como otros virus de ARN de cadena positiva36,37, 38,39,40,41.
Protocol
1. Construcción de un clon de ADNc infeccioso ZIKV en un BAC
NOTA: La estrategia para el montaje de ZIKV en BACs se describe para la cepa RGN13 (número de adhesión KU527068) (Figura2).
- Seleccione sitios de restricción únicos debidamente espaciados en el genoma viral que están ausentes en el plásmido pBeloBAC11 (Figura 2A).
NOTA: Para ZIKV-RGN, se seleccionaron los sitios de restricción Pml I, Afe I y BstB I (posiciones genómicas 3.347, 5.969 y 9.127, respectivamente). En el caso de que no haya sitios de restricción apropiados disponibles en el genoma viral, genere nuevos sitios de restricción mediante la introducción de mutaciones de nucleótidos silenciosos en el genoma viral durante el diseño del fragmento de ADNc. - Generar por síntesis química cuatro fragmentos de ADNc que abarcan el genoma de longitud completa (Z1 a Z4), flanqueado por el promotor de CMV en el extremo 5'y el HDV RZ, la terminación BGH y las secuencias de poliadenilación en el extremo 3 '(Figura 2B). Cada fragmento debe estar flanqueado por los sitios de restricción seleccionados (paso 1.1).
NOTA: El fragmento Z1 se utiliza como columna vertebral para clonar el resto de los fragmentos en el pBeloBac11. Para ello, debe contener el promotor humano del CMV y debe ser flanqueado en el extremo 5 por ApaL I (para clonar este fragmento en pBeloBAC11) y Asc I (ausente en el genoma viral), y en el extremo 3'por los sitios de restricción seleccionados para el montaje del clon infeccioso (Pml I , Afe I, y BstB I) seguidos de Mlu I (ausente en el genoma viral) y BamH I (para clonar este fragmento en pBeloBAC11). El fragmento Z4 debe contener la región genómica desde el último sitio de restricción seleccionado (BstB I) hasta el final del genoma viral, seguido del HDV RZ, las secuencias de terminación BGH y poliadenilación, y el sitio de restricción Mlu I (Figura2B). Alternativamente, los fragmentos de ADNc (Z1-Z4) podrían ser generados por una combinación de reacciones en cadena de la transcriptasa polimerasa inversa estándar (RT-PCR) y PCR superpuestas utilizando oligonucleótidos específicos. - Ensamble el clon infeccioso de ADNC mediante la clonación secuencial de fragmentos Z1 a Z4 en pBeloBAC11 (Figura 2B).
- Digerir el plásmido pBeloBAC11 y el fragmento Z1 con ApaL I y BamH I. Para ello, mezcle 2 g de plásmido pBeloBAC11 o 1 g de fragmento de Z1 con 10 oL de tampón de reacción de 10x, 20 unidades de cada enzima y agua para alcanzar un volumen final de 100 ml. Incubar a 37 oC durante 2 h.
- Defosforilaelelel el vector BAC utilizando fosfatasa alcalina de camarón (SAP). Para ello, añada 2,5 ml (2,5 unidades) de SAP al BAC digerido e incubar a 37 oC durante 1 h. Inactivar el SAP mediante la incubación a 75 oC durante 15 minutos.
- Purificar el vector BAC desfosforilado y el fragmento Z1 por electroforesis de gel de agarosa utilizando un kit de limpieza de gel comercial optimizado para la purificación de fragmentos de ADN de más de 10 kb (ver la Tabla de Materiales).
- Realice la reacción de ligadura para generar el plásmido (p)BAC-Z1. Para ello, mezcle 150 ng de vector BAC digerido purificado con el inserto purificado utilizando una relación molar de vector a inserción de 1:3, 1,5 l de tampón de ligasa de ADN 10x T4 que contenga 10 mM de ATP, una unidad de ligasa de ADN T4 y agua a un volumen final de 15 ol.
- Incubar la mezcla de ligadura durante 20 h a 16oC. Como control de la reacción de ligadura, realice en paralelo una reacción de ligadura sin inserción. Inactivar la ligasa por incubación a 65oC durante 15 min.
NOTA: En el caso de los ANN de extremo romo, incubar la reacción de ligadura durante 20 h a 14 oC. Debido al gran tamaño del vector BAC (Figura2A),es esencial utilizar mayores cantidades de vector e inserción que las ligaduras utilizando plásmidos convencionales para aumentar la eficiencia de la ligadura. - Transformar 50 l de células electrocompetentes de E. coli DH10B con 2 l de reacción de ligación (paso 1.3.5) por electroporación (25 oF de capacitancia, 2,5 kV y 100o de resistencia), utilizando cubetas de electroporación equipadas con electrodos espaciados a intervalos de 0,2 cm, siguiendo los protocolos estándar.
- Transfiera las células a un tubo de polipropileno con 1 ml de medio SOC (2% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, 0,05% de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM mgCl2, 10 mM mgSO4, 20 mM de glucosa [pH 7,0]) e incubarlas a 37 oC durante 1 h con agitación suave (200-250 rpm). Placar las células en las placas de agar de luria (LB) que contienen 12,5 g/ml de cloramphenicol e incubarlas a 37 oC durante 16 h.
- Escoja de 8 a 12 colonias bacterianas, haga una réplica en una placa de agar LB fresca que contenga 12,5 g/ml de cloramphenicol, y pruebe si contienen el inserto correcto mediante análisis directo de PCR utilizando oligonucleótidos específicos.
- Escoge una colonia positiva de la placa de réplica, hazla crecer en 100 ml de LB que contenga 12,5 g/ml de cloramphenicol, y aísla el ADN BAC por el método de lisis alcalina utilizando un kit de plásmido comercial midi, siguiendo la recomendación para la purificación de grandes plásmidos de copia baja (véase la Tabla de Materiales).
NOTA: BAC cDNA preparado por este método puede ser contaminado con hasta 30% de ADN genómico bacteriano, pero es adecuado en calidad para realizar análisis de restricción, secuenciación, y clonación. Dependiendo del tamaño del BAC, se pueden obtener rendimientos de 4-6 g del plásmido BAC. - Verifique la integridad genética del ADNc clonado mediante el análisis de restricciones. Digerir 500 ng del plásmido pBAC-Z1 con Asc I y Pml I a 37oC durante 1 h y confirmar la presencia del fragmento Z1 por electroforesis de gel. Para confirmar aún más que no se han introducido mutaciones no deseadas, secuenciael inserto con oligonucleótidos específicos.
- A partir del plásmido pBAC-Z1 que contiene los sitios de restricción seleccionados (Pml I, Afe I, BstB I y Mlu I), clone secuencialmente fragmentos Z2 a Z4 para generar el clon infeccioso de ADNc pBAC-ZIKV (Figura2B),siguiendo el experimental similar los enfoques descritos anteriormente para el fragmento Z1 (pasos 1.3.1-1.3.10).
2. Preparación de pBAC-ZIKV de alta pureza para el rescate de rZIKV infeccioso
NOTA: La preparación a gran escala de un clon infeccioso ultrapuro pBAC-ZIKV, adecuado para la transfección y rescate de virus infecciosos, se realiza mediante lisis alcalina con un kit comercial desarrollado específicamente para la purificación del BAC (ver la Tabla de Materiales). El kit debe incluir un paso de digestión de exonucleasa dependiente de ATP que elimine la contaminación del ADN genómico bacteriano, permitiendo el aislamiento de BAC cDNA con un grado de pureza similar al obtenido con el método de cloruro de cesio.
- Cultivar una sola colonia de E. coli DH10B llevando el clon infeccioso pBAC-ZIKV en 5 ml de medio LB que contenga 12,5 g/ml de cloramphenicol a 37oC durante 8 h con agitación suave (200-250 rpm).
- Añadir 1 ml de cultivo bacteriano (paso 2.1) a 500 ml de LB con 12,5 g/ml de cloramphenicol en un matraz de 2 L y cultivar las células a 37oC durante 14-16 h (hasta un OD600 de 0,6-0,8).
NOTA: Los caldos ricos, como el caldo terrible (TB), pueden producir densidades celulares extremadamente altas, lo que resulta en un menor rendimiento y menos pureza del ADNC BAC. - Purificar el clon de ADNC infeccioso BAC mediante lisis alcalina utilizando un kit comercial desarrollado específicamente para la purificación del BAC, siguiendo las especificaciones del fabricante (ver la Tabla de Materiales). Mantener el ADNC BAC purificado a 4oC. Dependiendo del tamaño de BAC, se pueden obtener rendimientos de 30 g de clon de ADNC de BAC ultrapuro.
NOTA: No seque el pellet de ADN durante más de 5 minutos, ya que el secado excesivo dificultará la disolución del ADNC BAC. Debido al gran tamaño del clon BAC cDNA, evite el vórtice o el pipeteo para evitar la cizalladura de plásmido.
3. Rescate de rZIKV infecciosos del clon BAC cDNA por transfección de células Vero
NOTA: El rZIKV infeccioso se recupera mediante la transfección de células Vero con el clon pBAC-ZIKV cDNA, utilizando un reactivo de transfección de lípidos catiónico comercial (ver la Tabla de Materiales; Figura 3).
- Un día antes de la transfección, placa en placas de 6 pocillos 5 x 105 células Vero/bien en medio de crecimiento (medio de águila modificado de Dulbecco [DMEM] complementado con 5% de suero bovino fetal [FBS], 2 mM L-glutamina y 1% aminoácidos no esenciales) para elevar 90% monocapas de células confluentes en el momento de la transfección.
NOTA: Recomendamos realizar los rescates de virus en triplicados. -
Equilibrar el medio reducido en suero (ver la Tabla de Materiales) a temperatura ambiente y preparar mezclas de transfección en tubos de microfúgeo estériles para cada muestra de transfección de la siguiente manera.
- Añadir 4 g de clon de ADN cDNA BAC en 250 ml de medio reducido en suero y mezclar cuidadosamente, evitando el vórtice para evitar el cizallamiento plásmido.
- En un tubo separado, diluir 12 l de reactivo de transfección (1 mg/ml) (ver la Tabla de materiales)en 250 ml de medio reducido en suero, mezclar por vórtice e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Combine el ADNC BAC diluido y el reactivo de transfección (con una proporción de 1:3 de ADN: reactivo de transfección), mezcle cuidadosamente evitando el vórtice e incubar a temperatura ambiente durante 20-30min.
- Durante el período de incubación de la mezcla BAC cDNA/transfección, lavar las células de Vero con medio de crecimiento sin antibióticos y dejar las células en 1 ml de medio fresco sin antibióticos.
NOTA: La adición de antibióticos durante el proceso de transfección puede disminuir la eficiencia de la transfección. - Distribuya gotas los 500 ml de la mezcla de reactivos de BAC cDNA/transfección (del paso 3.2.3) sobre las células de Vero, mezcle las mezclando la placa de un lado a otro, e incubar las células en una incubadora humidificada al 5% de CO2 a 37 oC durante 6h.
- Retirar el medio de transfección, añadir 2 ml de medio de crecimiento fresco con antibióticos (100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina), incubar las células en una incubadora humidificada de CO2 al 5% a 37 oC, y comprobar cada día la inducción del efecto citopático (CPE ).
NOTA: ZIKV CPE es bastante pronunciado en las células de Vero y se caracteriza por la presencia de células redondeadas y birefringentes que se separan y flotan en el sobrenadante del cultivo de tejido. - Recoger alícuotas (100 l) de los sobrenatantes de cultivo de tejido de células de Vero (paso 3.5) cada 24 h para determinar la eficiencia de la recuperación del virus mediante la evaluación de la presencia de ZIKV utilizando un ensayo de placa estándar en células Vero frescas (Figura4A).
- Después de cuatro a seis días de transfección, cuando el CPE es alrededor de 50%-75% (Figura4B),recoger los sobrenatantes de cultivo de tejido en tubos cónicos de 15 ml y centrifugar a 2.000 x g durante 10 minutos a 4 oC para eliminar los desechos celulares.
- Cosecha los sobrenadores que contienen rZIKV y desecha los pellets celulares. Alísgue el sobrenadante en criotubos y guárdelo a -80 oC para confirmar aún más la presencia de rZIKV rescatado.
4. Valoración del rZIKV recuperado
- Un día antes de la valoración, semilla en placas de 12 pocillos 2.5 x 105 Células Vero/bien en medio de crecimiento para elevar 90% monocapas celulares confluentes en el momento de la valoración.
NOTA: Recomendamos realizar la valoración del rZIKV recuperado en triplicados. - Retire una alícuota del sobrenadante del congelador (paso 3.8) y haga diluciones seriales de 10 veces en medio de crecimiento sin FBS.
- Lave las células de Vero 2x con solución salina con fosfato (PBS) y agregue 200 l/bien de cada dilución de virus en triplicado. Coloque las placas en una incubadora humidificada de CO2 al 5% a 37 oC y mece cada 15 minutos durante un período de adsorción de 90 minutos.
- Retirar el inóculo viral, superponer las células con 2 ml de medio de crecimiento que contengan 2% DE FBS, 1% DEAE-dextran, y 0.6% Agar Noble, e incubar a 37 oC por debajo del 5% de CO2 durante 3-4 días.
NOTA: Es posible utilizar agarosa, metilcelulosa u otros medios de superposición. El tiempo para la formación adecuada de la placa variará dependiendo de la superposición utilizada y la tensión ZIKV. -
Arreglar las células infectadas por ZIKV con 1 mL/pozo de 4% de formaldehído diluido en PBS a temperatura ambiente durante 1 h, eliminar la superposición y visualizar las placas virales tensándolas con 0.1% de cristal violeta en 20% de metanol a temperatura ambiente durante 15 min.
- Deseche el cristal violeta, lave 3x con agua, deje que las placas se sequen y cuente manualmente las placas (Figura4C,panel izquierdo). El titador viral se calcula como unidades formadoras de placa por mililitro (PFU/ml).
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Alternativamente, las placas virales se pueden visualizar inmunomanchando con el anticuerpo monoclonal de ratón de proteína pan-flavivirus E (mAb) 4G2 (Figura4C,panel derecho).
- Para evaluar las placas ZIKV mediante inmunomancha, después de la fijación y eliminación del agar superpuesto como se describió anteriormente (en el paso 4.5), lavar las células 2veces con PBS y permeabilizarlas mediante incubación con 200 l/pozo de 0,5% de tritón-x100 en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Retire la solución de permeabilización, lave las células 3 veces con PBS y escóndalas con 200 l/pozo de solución de bloqueo (10% FBS en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: Otras soluciones de bloqueo estándar (por ejemplo, 2,5% BSA en PBS) se pueden utilizar en este paso. - Retirar la solución de bloqueo e incubar las células con 200 l/pozo de la proteína pan-flavivirus E mAb 4G2 diluida en solución de bloqueo (1 g/ml) durante 1 h a 37 oC.
NOTA: Se pueden utilizar otros anticuerpos mAb o policlonales (pAb) en lugar de 4G2 para la inmunomancha y detección de placas virales. - Lavar las células 3 veces con PBS, e incubarlas con 200 ml de anticuerpo secundario biotinilado antiratón diluido (siguiendo las recomendaciones del fabricante) en solución de bloqueo durante 1 h a 37 oC.
- Retire el anticuerpo secundario, lave las células 4 veces con PBS y visualice las placas virales utilizando un kit de peroxidasa a base de avidina/biotina siguiendo las especificaciones del fabricante (ver la Tabla de Materiales).
5. Confirmación del rescate rZIKV exitoso
NOTA: Para confirmar aún más la identidad del virus rescatado, la expresión de proteína ZIKV E se analiza mediante inmunofluorescencia utilizando el ratón mAb 1176-56 específico para la proteína ZIKV E (Figura 4D). Este mAb es específico para la proteína ZIKV E, contrariamente a la situación de la proteína pan-flavivirus E mAb 4G2 (paso 4.6.3). Alternativamente, la identidad del virus se puede confirmar mediante la secuenciación.
- Un día antes del análisis de inmunofluorescencia, las cubiertas de las semillas se enmarcen en placas de 24 pocillos que contienen 1 x 105 células Deo/bien en medio de crecimiento para elevar 90% monocapas celulares confluentes en el momento de la infección.
- Lavar las células 2 veces con PBS e infectarlas con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,5 PFU/célula del virus rescatado en medio de crecimiento sin FBS (100 l/pozo) en triplicado. Incubar las placas a 37oC durante 90 min.
- Después de la adsorción viral, eliminar el inóculo viral, añadir 0,5 ml de medio de crecimiento fresco con 2% de FBS e incubar las células en una incubadora humidificada de CO2 al 5% a 37 oC durante 48 h.
- Retire el sobrenadante del cultivo tisular, fije las células con 150 l/pozo de 4% de paraformaldehído en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente, y permeelice las células con 150 l/pozo de 0,5% de triton-x100 en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Después de retirar la solución de permeabilización y lavar las células 3 veces con PBS, bloquee las células con 150 l/pozo de solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: La exploración celular se bloquea con soluciones de bloqueo alternativas (por ejemplo, 2,5% BSA en PBS). - Retirar la solución de bloqueo e incubar las células con 100 l/pozo de mAb 1176-56, específico para la proteína ZIKV E, diluido en solución de bloqueo (1 g/ml) durante 1 h a 37 oC.
- Lavar las células 3veces con PBS, incubarlas a temperatura ambiente durante 1 h con 100 ol/bien de Anticuerpo secundario antiratón conjugado de Alexa Fluor 488 diluido (siguiendo las recomendaciones del fabricante) en solución de bloqueo, lavar las células extensamente con PBS, y incubarlos con 150 l/bien de 4',6'-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 1 mg/ml) diluido 1:200 en PBS a temperatura ambiente durante 10 min.
- Lavar las células 3x con PBS, montar los cubreobjetos en un medio de montaje antifade (ver la Tabla de Materiales), y analizar las muestras bajo un microscopio de fluorescencia.
NOTA: Para un almacenamiento a largo plazo, almacene las muestras a 4 oC, protegidos de la luz.
6. Amplificación y generación de acciones virales
NOTA: Una vez confirmada la identidad del virus rescatado (sección 5), amplificar el virus en las células de Vero y generar existencias virales para estudios posteriores.
- Cultivar células Vero en placas de 100 mm x 21 mm al 90% de confluencia e infectarlas con un MOI de 0.1 PFU/célula como se describió anteriormente.
- Cuando el CPE esté alrededor del 75% (aproximadamente 48-72 h después de la infección), recoja el sobrenadante de cultivo tisular en un tubo cónico de 50 ml y centrífuga a 2.000 x g durante 10 minutos a 4 oC para eliminar los desechos celulares.
- Cosecha el sobrenadante que contiene rZIKV y deseche el pellet celular. Alístra el sobrenadante en criotubos y guárdalos a -80oC.
- Retire una alícuota del virus del congelador y determine el títer viral mediante el ensayo de placa como se describió anteriormente (sección 4).
Representative Results
El protocolo descrito aquí permite la generación de clones infecciosos estables de ADNc cDNA de longitud completa utilizando un BAC para minimizar los problemas de toxicidad asociados con varias secuencias flavivirales. La recuperación eficiente del rZIKV infeccioso del clon BAC cDNA se puede lograr fácilmente después de la transfección de células Vero susceptibles (Figura2). Usando este protocolo, hemos generado un clon estable de ADNc de longitud completa de la cepa ZIKV RGN32 clonando secuencialmente cuatro fragmentos de ADC superpuestos en el plásmido BAC pBeloBAC1134 utilizando métodos de clonación convencionales y únicos sitios de restricción presentes en el genoma viral (Figura2). El clon de ADNc de longitud completa fue flanqueado en el extremo 5 por el promotor humano del CMV para permitir la expresión de ARNm en el núcleo de las células transfectóntes, y en el extremo 3 por el HDV RZ seguido de las secuencias de poliadenilación y terminación BGH, para producir ARN que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen RNA que contienen el extremo exacto de 3' del genoma viral (Figura2). La estabilidad en las bacterias del clon de ADNC BAC generado, junto con su fácil manipulación utilizando tecnologías estándar de ADN recombinante, pone de relieve el potencial del enfoque BAC cDNA para la generación rápida y confiable de clones estables de ADNc de cuerpo entero de ZIKV y otros flavivirus o virus de ARN de cadena positiva con genomas virales inestables.
Una vez ensamblado el clon BAC cDNA (Figura2), el virus infeccioso podría recuperarse fácilmente después de la transfección directa de células Vero susceptibles con el clon BAC cDNA utilizando liposomas catiónicos (Figura3). Este sistema lanzado por el ADNc permitió la expresión intracelular del ARNmtapado, permitiendo la recuperación de virus infecciosos sin necesidad de un paso de transcripción in vitro. Usando este enfoque, pudimos rescatar rZIKV-RGN con titulaciones superiores a 106 PFU/mL a los 5 días posteriores a la transfección (Figura4A). Además, el virus rescatado indujo un CPE claro (Figura4B),generó placas homogéneas de aproximadamente 2 mm de tamaño (Figura4C),y su identidad se confirmó mediante secuenciación (datos no mostrados) y análisis de inmunofluorescencia utilizando el mAb específico para la proteína ZIKV E, 1176-56 (Figura4D). Los datos in vitro indican que el rZIKV-RGN recuperado se replica batutamente en las células de Vero y con los niveles en comparación con un aislado32 natural de ZIKV (datos no mostrados). En general, estos resultados demuestran que el rZIKV infeccioso se puede rescatar de clones de ADNc de longitud completa ensamblados en un BAC.
Figura 1 : Organización del genoma ziKV y estructura virión. (A) Organización del genoma: ZIKV contiene un ARN positivo de una sola cadena que se traduce como una sola poliproteína. La poliproteína traducida fue lasinada por proteasas virales (flechas) y anfitrionas (diamantes) para producir las proteínas estructurales cápside (C, azul), matriz (M, marrón) y envolvente (E, verde), y siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5). Las regiones no traducidas de 5' y 3' al final del genoma viral están indicadas con líneas negras. (B) Estructura virión: Los viriones ZIKV fueron decorados con las proteínas E y M, anclados en una bicapa lipídica con una estructura icosahedral. Bajo el enlope viral estaba el nucleópsido viral compuesto por la proteína C asociada con el ARN genómico viral. Esta figura ha sido adaptada de la ciudad de ávila-Pérez ydel 18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Montaje del clon de ADNc infeccioso ziKV en un BAC. (A) Representación esquemática del BAC pBeloBAC11:Los genes reguladores parA, parB, parCy repE, el origen de replicación delfactor F (OriS), el gen resistente al cloranfenicol (Cmr) y el lac El gen Z está indicado. Se subrayan los sitios de restricción pertinentes utilizados para ensamblar el clon infeccioso de ADNc de ZIKV. (B) Montaje del clon infeccioso de ADNc infeccioso ZIKV en el pBeloBAC11 BAC:Cuatro fragmentos de ADN superpuestos (Z1-Z4), que abarcan todo el genoma de ZIKV (Figura1) y flanqueados por los sitios de restricción indicados, fueron generados por productos químicos síntesis y clonado secuencialmente en pBeloBAC11 para generar el infeccioso clon ZIKV cDNA pBAC-ZIKV. El ADNc infeccioso ZIKV de longitud completa fue ensamblado bajo el control del promotor inmediato del citomegalovirus humano (CMV) y flanqueado en el extremo 3 por las secuencias de terminación y poliadelación de la hormona de crecimiento bovina (RZ) y la hormona de crecimiento bovina (BGH). Las siglas de los genes virales y los elementos reguladores son las descritas en la Figura1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Flujo de trabajo para generar rZIKV a partir del clon BAC cDNA. Las células de Vero al 90% de la confluencia se transtrataron en monocapa con el clon infeccioso de ADNc infeccioso de longitud completa de ZIKV pBAC-ZIKV (Figura 2) utilizando liposomas catiónicos. A los 4-6 días posteriores a la transfección, cuando el CPE era evidente, se recogieron y evaluaron los sobrenatores de cultivo de tejido que contenían rZIKV para detectar la presencia de virus (Figura 4) y se utilizaron para la amplificación viral en las células de Vero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Recuperación y caracterización in vitro de rZIKV. (A) Rescate del rZIKV infeccioso del clon BAC cDNA: Las células de Vero al 90% de la confluencia (formato de placa de 6 pocillos, triplicados) fueron simuladas de transpiración o transfiguradas con 4 g/pozo de pBAC-ZIKV (Figura3),y en los días indicados después de la transfección, los lanzadores de virus en los sobrenatantes de cultivo de tejidos se determinaron mediante el ensayo de placa (PFU/ml). Las barras de error indican desviaciones estándar de tres experimentos de transfección diferentes. La línea negra punteada indica el límite de detección (50 PFU/ml). (B) CPE viral:Vero células con 90% de confluencia (formato de placa de 6 pocillos, triplicados) fueron infectadas por imitaciones (superior) o infectadas (MOI de 0,5 PFU/célula) con rZIKV, y a 48 h de postinfección, la presencia de CPE se evaluó mediante microscopía ligera. Barras de escala a 100 m. (C) Ensayo viral de placa e inmunomancha: Las células de Vero con una confluencia del 90% (formato de placa de 12 pocillos) se infectaron con rZIKV, y a 72 h después de la infección, las placas virales se visualizaron por tinción violeta cristalina (izquierda) o mediante inmunostaining ( derecha) utilizando la proteína pan-flavivirus E mAb 4G2. Barras de escala a 5 mm. (D) Inmunofluorescencia: Las células de Vero con una confluencia del 90% (formato de placa de 24 pocillos, triplicados) estaban infectadas (MOI de 0,5 PFU/célula) con rZIKV y, a 48 h de postinfección, analizadas por inmunofluorescencia utilizando el mAb 1176-56, específico para ZIKV Proteína E. Los núcleos celulares se teñieron con DAPI. Se muestra una imagen combinada representativa de las células Vero infectadas por ZIKV. El cuadrado blanco en la parte superior derecha representa una imagen ampliada de las células Vero infectadas por ZIKV. Barras de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Los clones infecciosos de ADNc constituyen herramientas moleculares esenciales para la investigación básica de los virus del ARN y el desarrollo de vacunas y/o la identificación de estrategias antivirales. Sin embargo, para muchos virus de ARN de cadena positiva, incluidos los flavivirus, la generación de clones infecciosos de ADNc es difícil debido a la inestabilidad de los CDNA clonados cuando se propagan en bacterias utilizando plásmidos estándar de alto número de copia. En el caso de ZIKV y otros flavivirus, esta inestabilidad se debe principalmente a la expresión filtrante de proteínas virales tóxicas de promotores bacterianos crípticos presentes en el genoma viral14,15,16,17 . Aquí, describimos un protocolo alternativo y potente para generar un clon estable de ADNC infeccioso de longitud completa ZIKV como un solo plásmido, basado en el uso del plásmido BAC pBeloBAC1134 (Figura2A) para superar el problema de toxicidad, el uso de la Promotor de CMV para permitir la expresión del arNM en el núcleo de las células transllenadas, y el HDV RZ para generar vRNAs con 3'-end precisos (Figura2B). Usando este método, hemos generado con éxito un clon infeccioso totalmente estable de la cepa ZIKV RGN que permite la recuperación eficiente y confiable de rZIKV infeccioso después de la transfección directa de células Vero susceptibles (Figura3 y Figura 4).
En los últimos años se ha hecho un gran esfuerzo para superar los problemas de inestabilidad asociados con los clones infecciosos de ADNc de ZIKV, y se han implementado con éxito varios enfoques18,incluida la ligadura in vitro de fragmentos de ADNc24 ,25, plásmidos de copia baja19,20, la inactivación de promotores bacterianos crípticos mediante la introducción de mutaciones silenciosas26,27, inserción intrón21, 22 , 23, el método de montaje Gibson30, el método ISA28,29, y el uso de CPER31. Aunque estos enfoques superan el problema de toxicidad y son útiles para generar clones infecciosos de ADNc ZIKV, algunos de ellos son laboriosos y presentan varias desventajas, incluyendo la necesidad de pasos de ligadura y transcripción in vitro que reducen el virus eficiencia de recuperación o la introducción de un alto número de mutaciones silenciosas para inactivar el promotor bacteriano críptico que podría afectar la aptitud viral, entre otros. El enfoque descrito en este protocolo presenta las siguientes ventajas. i) El plásmido BAC pBeloBAC1134 tiene una replicación estrictamente controlada, manteniendo una o dos copias de plásmido por célula, lo que minimiza la toxicidad y permite un mantenimiento estable en bacterias de cDNAs inestables. ii) La propagación y modificación de plásmidos BAC son casi similares a las de los plásmidos convencionales, teniendo en cuenta las ligeras modificaciones descritas en este protocolo para manipular fragmentos de ADN BAC de gran tamaño y plásmidos de copia baja. En particular, el clon BAC cDNA también puede ser modificado en E. coli por recombinación homóloga utilizando el sistema de recombinación roja42,43,44. iii) El uso del promotor CMV permite el promotor CMV permite el promotor CMV permite el promotor CMV permite el promotor CMV permite el promotor CMV permite el promotor CMV permite el expresión intracelular de ARNm ZIKV tapado y la recuperación de virus infecciosos sin necesidad de una etapa de transcripción in vitro. iv) El rZIKV infeccioso se genera después de la transfección directa de células susceptibles (por ejemplo, Vero) con el clon BAC cDNA. Dado que la transfección del ADN en células de mamíferos es más eficiente que la transfección de ARN, la eficiencia de recuperación del virus con el enfoque BAC es mayor que la observada utilizando transcripciones de ARN, reduciendo el número de pasajes en las células de cultivo para generar un stock viral y, consecuentemente, limitando la introducción de mutaciones no deseadas por adaptación al cultivo celular.
Por último, el potencial del enfoque bac está respaldado por el uso exitoso de este método (con ligeras modificaciones) para diseñar clones infecciosos de ADNc de otros flavivirus, incluyendo el virus del dengue36,y varios coronavirus de alto impacto en salud humana y animal, como el coronavirus de la gastroenteritis transmisible37 (TGEV), el virus de peritonitis infecciosa felina38 (FIPV), el coronavirus humano OC4339 (HCoV-OC43), el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus40 (SARS-CoV), y el síndrome respiratorio de Oriente Medio coronavirus41 (MERS-CoV), entre otros.
En el protocolo descrito aquí, hay dos pasos críticos que deben ser considerados. Una consideración importante es la identificación de sitios de restricción únicos apropiados en el genoma viral que están ausentes en el plásmido BAC. Si no hay sitios de restricción adecuados disponibles, se pueden generar nuevos sitios de restricción durante el diseño de clonación mediante la introducción de mutaciones de nucleótidos silenciosos. Otra cuestión importante es que los plásmidos BAC están presentes en sólo una o dos copias por célula, y por lo tanto, los bajos rendimientos de plásmidos BAC con una alta contaminación del ADN genómico bacteriano se obtienen utilizando protocolos estándar diseñados para plásmidos de número medio. Este problema potencial se supera fácilmente utilizando grandes volúmenes de cultivo y purificando el plásmido BAC con un kit comercial desarrollado específicamente para la purificación de BAC.
En resumen, hemos desarrollado un potente enfoque genético inverso ZIKV basado en el uso de un BAC que podría adaptarse para generar clones de ADNc infecciosos infecciosos estables y totalmente funcionales de otros virus de ARN de cadena positiva para facilitar el estudio de la biología de estos virus y el desarrollo de vacunas y/o para facilitar la identificación de medicamentos antivirales.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer a Carla Gómez por su asistencia técnica en la generación de clones de BAC cDNA y a Snezhana Dimitrova por ayudar con la preparación del video. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO, número de subvención BFU2016-79127-R) a F.A.T. y los Institutos Nacionales de Salud (NIH, número de concesión 1R21AI120500) a L.M.S. y F.A.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Molecular Biology Reagents | |||
| Afe I | New England BioLabs | R0652S | 10,000 Units/mL |
| AmpliTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | N8080161 | 5,000 Units/mL |
| ApaL I | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/mL |
| Asc I | New England BioLabs | R0558S | 10,000 Units/mL |
| BamH I | New England BioLabs | R0136S | 10,000 Units/mL |
| BstB I | New England BioLabs | R0519S | 20,000 Units/mL |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| ElectroMAX DH10B Cells | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 18290015 | Electocompetent DH10B cells |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm | Bio-Rad | 165-2086 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | Flamable |
| Isopropanol | Merck | 109634 | Flamable |
| Large-Construct Kit (10) | QIAGEN | 12462 | For high-purity BAC preparation |
| LB Broth | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 12780029 | Can be homemade as well |
| LB with Agar | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 22700041 | Can be homemade as well |
| Methanol | Merck | 106009 | Flamable |
| Mlu I | New England BioLabs | R0198S | 10,000 Units/mL |
| Oligonucleotides | IDT | N/A | |
| Plasmid pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
| Plasmid Midi Kit (25) | QIAGEN | 12143 | For midle-scale preparation of BAC plasmids |
| Pml I | New England BioLabs | R0532S | 20,000 Units/mL |
| Polypropylene tubes (10 mL) | DeltaLab | 175724 | Other commercial sources are acceptable |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (150) | QIAGEN | 20021 | Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb |
| Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 Units/mL |
| SOC Medium | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 15544034 | Can be homemade as well |
| Synthesis of cDNA fragments | Bio Basic | N/A | |
| T4 DNA Ligase | Sigma-Aldrich (Roche) | 10481220001 | 1,000 Units/mL |
| 2. Cell Culture Reagents | |||
| 6-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 140675 | |
| 12-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 150628 | |
| 24-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 142485 | |
| Agar Noble | VWR | 214230 | |
| Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody | Varies | N/A | |
| Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody | Varies | N/A | |
| Cell Culture Dishes (100 mm x 21 mm) | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 172931 | |
| Conical Tubes (15 mL) | VWR | 525-0150 | |
| Conical Tubes (50 mL) | VWR | 525-0155 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Toxic and carcinogenic |
| DEAE-Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11995065 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific (HyClone)) | SV30160.03 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Toxic and carcinogenic |
| L-Glutamine | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 25030081 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 11668019 | Transfection reagent |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11140035 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 31985070 | Transfection medium |
| Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 | BEI Resources | NR-50327 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | Toxic and carcinogenic |
| PBS | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 14190144 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 15140122 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | P10144 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories Inc | PK-4010 | Avidin/biotin-based peroxidase kit |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | |
| ZIKV E Protein mAb 1176-56 | BioFront Technologies | BF-1176-56 | |
| 3. Equipment | |||
| Agarose Gel Electrophoresis System | Bio-Rad | 1704468 | Other commercial sources are acceptable |
| Class II Biosafety CO2 Cabinet | Varies | N/A | Other commercial sources are acceptable |
| Desktop Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| Fluorescence Microscope | Varies | N/A | |
| High-speed Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | Other machines are acceptable |
| SimpliAmp Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | A24811 | Other machines are acceptable |
| Vortexer | Varies | N/A |
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