Summary
寨卡病毒最近的流行突出表明,必须建立反向遗传方法,以开发疫苗和/或治疗战略。在这里,我们描述了从全长cDNA克隆中拯救传染性重组寨卡病毒的协议,该克隆在人类细胞巨细胞病毒立即-早期启动子的控制下组装在细菌人工染色体中。
Abstract
寨卡病毒(ZIKV)感染与最近全球疫情期间的神经并发症有关,以及缺乏经批准的疫苗和/或抗病毒药物,这突出表明迫切需要开发ZIKV反向遗传系统,以促进研究ZIKV生物学和治疗和/或预防方法的发展。然而,与其他黄病毒一样,ZIKV全长传染性cDNA克隆的产生由于病毒序列在细菌扩增过程中的毒性而受阻。为了解决这个问题,我们开发了一种基于细菌人工染色体(BACs)的非传统方法。使用这种方法,ZIKV菌株的全长cDNA拷贝由四个合成DNA片段生成,并组装成人类巨细胞病毒(CMV)控制的单拷贝pBeloBAC11质粒立即-早期促进者。组装的BAC cDNA克隆在细菌繁殖过程中稳定,在BAC cDNA克隆转染后在Vero细胞中恢复传染性重组(r)ZIKV。此处描述的协议为产生传染性克隆的黄病毒(包括 ZIKV)和其他正链 RNA 病毒(尤其是具有大型基因组且在细菌过程中存在稳定性问题的病毒)提供了强大的技术传播。
Introduction
ZIKV是弗拉维维达家族中由蚊子传播的病毒属,目前构成全球公共卫生紧急情况1。像其他黄病毒一样,ZIKV是一种包络的RNA病毒,其结构类似类似子体,含有约10.8 kb的正义单链RNA分子(图1)2。病毒基因组编码约3,423个氨基酸的大多蛋白,由病毒和细胞蛋白酶处理成三种结构蛋白(辣椒[C],前膜/膜[prM/M])和包络[E]),参与形成参与基因组复制、病毒组装和逃避宿主免疫反应的病毒颗粒和七种非结构(NS2A、NS2B、NS3、NS3、NS4A、NS4B和NS5)的蛋白质(图1)3。
从历史上看,ZIKV感染与轻度发热病4,5。然而,最近在整个南美洲和中美洲、南太平洋和加勒比地区爆发性齐克感染大流行,6、7、8,其与吉兰-巴雷综合征的发生有关和小头症9,10,11,12,13,改变了历史观念,并有力地强调了ZIKV作为重要的人类病原体的相关性。从这个意义上说,分子工具的发展,如传染性cDNA克隆,将有助于研究病毒发病机制和开发基因定义的疫苗,并鉴定用于治疗ZIKV感染的抗病毒药物。正如其他黄病毒所描述的,ZIKV传染性克隆的产生是困难的,因为病毒基因组14中存在神秘的细菌促进剂,使得有毒病毒蛋白在传播过程中出现泄漏的表达。cDNA克隆在细菌中使用标准高拷贝数质粒15,16,17。为了克服这种毒性问题,过去两年中已经成功地实施了几种非传统方法。这些包括使用低拷贝数质粒19,20,插入内子破坏毒性区域21,22,23,cDNA片段的体外结扎24,25、突变沉默的隐秘细菌启动子存在于病毒基因组26,27,传染性亚基因组放大器(ISA)28,29,吉布森组装方法30,并使用圆形聚合酶延伸反应(CPER)31 。
本文介绍了ZIKV菌株ZIKV-RGN13全长cDNA克隆工程的详细方案,使用BAC克服了毒性问题,并通过将BAC cDNA克隆直接转染到Vero中来拯救传染性rZIKV细胞32,一种经美国食品和药物管理局(FDA)批准用于开发人类疫苗的细胞系33。在这个系统中,病毒基因组的全长cDNA副本组装在BAC质粒pBeloBAC1134(图2A)中,一个从大肠杆菌F因子35衍生的低拷贝数质粒(每个细胞一至两个拷贝),在细菌中繁殖时,将黄病毒序列的毒性降至最低。ZIKV基因组的cDNA在人类CMV立即早期启动子的控制下组装在pBeloBAC11中,允许通过细胞RNA聚合酶II在转染细胞细胞核中表达病毒(v)RNA,并在3'端被肝炎侧侧增量病毒 (HDV) 核糖体 (RZ), 其次是牛生长激素 (BGH) 终止和多基因化信号的序列,以产生合成 RNA 具有真正的病毒基因组的 5' 和 3' 端,分别 (图 2B)。这种由cDNA启动的系统产生封顶病毒RNA的细胞内表达,允许恢复传染性ZIKV,而无需体外转录步骤。BAC 方法提供了一种强大的方法,适用于构建稳定且功能齐全的传染性 cDNA 克隆,用于构建其他黄病毒以及其他阳性核糖核酸病毒36、37、 38,39,40,41.
Protocol
1. 在BAC中构建ZIKV传染性cDNA克隆
注:介绍了在BAC中组装ZIKV的策略,所述为RGN应变13(加入编号KU527068)(图2)。
- 选择在病毒基因组中适当间隔的唯一限制位点,在质粒pBeloBAC11中不存在(图2A)。
注:对于ZIKV-RGN,选择限制位点Pml I、Afe I和BstB I(基因组位置分别为3,347、5,969和9,127)。在病毒基因组中没有适当的限制位点的情况下,通过在cDNA片段设计期间在病毒基因组中引入沉默的核苷酸突变来生成新的限制位点。 - 通过化学合成生成四个跨越全长基因组(Z1 到 Z4)的 cDNA 片段,在 5'端的 CMV 启动子和 HDV RZ、BGH 端接和 3'端的聚dnadna 序列(图 2B) 的两侧。每个片段必须由选定的限制站点(步骤 1.1)两侧。
注:片段 Z1 用作主干,用于克隆 pBeloBac11 中其余片段。为此,它必须包含人类CMV启动子,并且必须在5'端由ApaL I(在pBeloBAC111中克隆这个片段)和Asc I(在病毒基因组中缺席),并在3'端由为传染性克隆的组装选择的限制位点(Pml I),Afe I 和 BstB I)随后是 Mlu I(病毒基因组中不存在)和 BamH I(在 pBeloBAC11 中克隆此片段)。片段Z4必须包含从最后一个选择的限制位点(BstB I)到病毒基因组末端的基因组区域,然后是HDV RZ、BGH终止和多基因化序列,以及Mlu I限制位点(图2B)。或者,cDNA片段(Z1-Z4)可以通过标准逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCRs)和使用特定寡核苷酸的重叠PCR的组合产生。 - 通过将片段Z1到Z4顺序克隆到pBeloBAC11(图2B),将传染性cDNA克隆组装在一起。
- 消化pBeloBAC11质粒和Z1片段与ApaL I和BamH I。为此,将2μg的pBeloBAC11质粒或1μg的Z1片段与10μL的10倍反应缓冲液、20个酶单位和水混合,最终体积达到100μL。在37°C下孵育2小时。
- 使用虾碱性磷酸酶(SAP)对BAC载体进行脱磷。为此,在消化的BAC中加入2.5μL(2.5单位)SAP,并在37°C孵育1小时。
- 使用商业凝胶清理试剂盒,使用用于纯化大于 10 kb 的 DNA 片段的商用凝胶清理试剂盒,通过抗胶凝胶电泳净化脱磷的 BAC 载体和片段 Z1(参见材料表)。
- 执行结扎反应以生成质粒(p)BAC-Z1。为此,使用1:3的载体与插入的摩尔比,将150 ng的纯化消化BAC载体与纯化插入物混合,将含有10 mM ATP、一个单位T4 DNA联结酶的10x T4 DNA结合液的1.5μL的摩尔比与水混合至15μL的最终体积。
- 在16°C下孵育结扎混合物20小时。作为结扎反应的控制,在不插入的情况下并行执行结扎反应。在65°C孵育15分钟,使利加酶热灭活。
注:在钝端DNA的情况下,在14°C下孵育结扎反应20小时。由于BAC载体的体积较大(图2A),因此有必要使用比传统质粒更多的载体和插入物来提高结扎效率。 - 使用电穿孔(25 μF电容、2.5 kV和100 Ω电阻)对2μL的结扎反应(步骤1.3.5)的大肠杆菌DH10B电容电池进行转化,使用装有电极的电穿孔比装,间隔间隔为0.2厘米,遵循标准协议。
- 将细胞转移到具有1mL的SOC培养基(2%胰胶,0.5%酵母提取物,0.05%NaCl,2.5 mM KCl,10 mM MgCl 2,10 mM MgSO4,20mM葡萄糖[pH 7.0])的聚丙烯管中,在37°C下孵育1小时,轻轻摇动(200-250 rpm)。将细胞板在含有12.5微克/mL氯霉素的Luria汤(LB)琼脂板上,并在37°C孵育16小时。
- 挑选8至12个细菌菌落,在含有12.5微克/mL氯霉素的新鲜LB琼脂板上制作复制品,并使用特定的寡核苷酸直接PCR分析测试它们是否含有正确的插入物。
- 从复制板中挑选一个正聚菌,将其生长在含有12.5微克/mL的12.5微克/mL的LB中,并使用商业质粒中粒试剂盒通过碱性莱沙法分离BAC cDNA,遵循大质粒纯化的建议低拷贝质粒(见材料表)。
注:该方法制备的BAC cDNA可受细菌基因组DNA的30%污染,但质量适用于进行限制性分析、测序和克隆。根据BAC大小,可以获得4-6μg的BAC质粒的产量。 - 通过限制性分析验证克隆cDNA的遗传完整性。用Asc I和Pml I在37°C下消化pBAC-Z1质粒500纳克1小时,并通过凝胶电泳确认Z1片段的存在。为了进一步确认未引入不需要的突变,请用特定的寡核苷酸对插入物进行测序。
- 从包含所选限制位点的质粒pBAC-Z1(Pml I、Afe I、BstB I和Mlu I)开始,依次克隆Z2到Z4片段,以生成全长传染性cDNA克隆pBAC-ZIKV(图2B),遵循类似的实验片段 Z1(步骤 1.3.1-1.3.10)的接近上述方法。
2. 为抢救传染性rZIKV准备高纯度pBAC-ZIKV
注:大规模制备一种适用于传染性病毒转染和抢救的超纯pBAC-ZIKV传染性克隆,通过碱性解毒与专门为BAC纯化开发的商业试剂盒进行(见表材料)。该试剂盒必须包括ATP依赖的外糖酶消化步骤,可去除细菌基因组DNA污染,从而分离具有纯度等级的BAC cDNA,其纯度等级与氯化氯化氯化氯化物方法的纯度相似。
- 在37°C下生长一个大肠杆菌DH10B菌群,携带pBAC-ZIKV传染性克隆体,在5mL的LB培养基中含有12.5微克/mL的氯霉素,持续8小时,轻轻摇动(200-250rpm)。
- 在 2 L 烧瓶中加入 1 mL 的细菌培养物(步骤 2.1)至 500 mL,加入 12.5 μg/mL 的氯霉素,并在 37°C 下生长细胞 14-16 小时(直到 OD600为 0.6-0.8)。
注:丰富的肉汤,如神奇肉汤(TB),可以产生极高的细胞密度,导致低产量和较低的纯度的BAC cDNA。 - 按照制造商的规格,使用专门为 BAC 纯化开发的商业套件,通过碱性莱沙来纯化 BAC 传染性 cDNA 克隆(参见材料表)。将纯化的BAC cDNA保持在4°C。根据BAC大小,可以获得30μg的超纯BAC cDNA克隆。
注:不要干燥DNA颗粒超过5分钟,因为过度干燥将使其难以溶解BAC cDNA。由于BAC cDNA克隆的尺寸较大,避免涡旋或移液,以防止质粒剪切。
3. 通过转染维罗细胞从BAC cDNA克隆中抢救传染性rZIKV
注:传染性rZIKV通过用pBAC-ZIKV cDNA克隆转染维罗细胞,使用商业阳离子脂转染试剂(见材料表);图 3.
- 转染前一天,6孔板5 x 105维罗细胞/生长培养基中的板(Dulbeco的改性Eagle的培养基[DMEM]补充5%胎儿牛血清[FBS],2 mM L-谷氨酰胺和1%非必需氨基酸),不含抗生素在转染时提高90%的结对细胞单层。
注:我们建议在三胞胎中执行病毒救援。 -
在室温下平衡血清减少介质(见材料表),并在无菌微液管中为每个转染样品制备转染混合物,如下所示。
- 在250μL血清减少的培养基中加入4μg的BAC cDNA克隆,并仔细混合,避免涡旋,防止质粒剪切。
- 在单独的管中,在250μL的血清减量培养物中稀释12μL转染试剂(1mg/mL)(见材料表),通过涡旋混合,在室温下孵育5分钟。
- 将稀释的BAC cDNA和转染试剂(DNA:转染试剂的1:3比例)混合,避免涡旋,在室温下孵育20-30分钟。
- 在BAC cDNA/转染试剂的潜伏期,用无抗生素的生长培养基清洗维罗细胞,使细胞处于1mL的新鲜培养基中,无需抗生素。
注:在转染过程中添加抗生素可能会降低转染效率。 - 将BAC cDNA/转染试剂混合物的500μL滴滴到Vero细胞上,通过来回摇动板混合,并在37°C的5%CO2加湿培养箱中孵育细胞6小时。
- 去除转染培养基,用抗生素(100 U/mL青霉素和100微克/mL链霉素)加入2mL新鲜生长培养基,在37°C的5%CO2加湿培养箱中孵育细胞,并每天检查细胞病导效应(CPE)).
注:ZIKV CPE在Vero细胞中相当明显,其特点是在组织培养上清液中分离和浮动的圆形和双增细胞的存在。 - 每24小时收集维罗细胞组织培养超定物(步骤3.5)的等分(100μL),通过使用新鲜维罗细胞的标准斑块测定评估ZIKV的存在来确定病毒恢复的效率(图4A)。
- 转染4至6天后,当CPE约为50%-75%时(图4B),在15mL锥形管中收集组织培养超生物,并在2000 x g下离心10分钟,在4°C下清除细胞碎片。
- 收获含有rZIKV的超生物,并丢弃细胞颗粒。将上清液放在冷冻管中,并将其储存在-80°C,以进一步确认获救的rZIKV的存在。
4. 恢复的 rZIKV 的滴定
- 滴定前一天,种子在12孔板2.5 x 105维罗细胞/井在生长培养基,以提高90%的交流细胞单层滴定时间。
注:我们建议在三胞胎中对回收的 rZIKV 进行滴定。 - 从冰箱中取出上清液的等分(步骤 3.8),并在生长培养基中连续进行 10 倍稀释,无需 FBS。
- 用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗Vero细胞2x,并在三联体中添加200μL/井。将板置于 37°C 的 5% CO2加湿培养箱中,每 15 分钟将岩石放入 90 分钟的吸附期。
- 去除病毒接种,用含有2%FBS、1%DEAE-dextran和0.6%Agar Noble的2mL生长培养基覆盖细胞,并在37°C以下的5%CO 2下孵育3-4天。
注:可以使用糖、甲基纤维素或其他覆盖介质。适当的斑块形成时间将因所使用的覆盖和 ZIKV 应变而异。 -
在室温下将1mL/井4%甲醛稀释在PBS中修复ZIKV感染细胞,去除覆盖层,并在室温下用20%甲醇中0.1%的结晶紫罗兰染色15分钟,使病毒斑块可视化。
- 丢弃水晶紫罗兰,用水清洗3次,让盘子干燥,并手动计数斑块(图4C,左侧面板)。病毒性牙点按每毫升(PFU/ml)的斑块形成单位计算。
-
或者,病毒斑块可以通过免疫染色与泛黄病毒E蛋白小鼠单克隆抗体(mAb)4G2(图4C,右面板)可视化。
- 要通过免疫染色评估ZIKV斑块,在修复和去除上述覆盖琼脂后(在步骤4.5中),用PBS清洗细胞2x,并在室温下用200μL/井的0.5%Triton-X100孵育细胞,15分钟。
- 去除渗透溶液,用PBS清洗细胞3x,并在室温下用200μL/井的阻滞溶液(PBS中10%FBS)将其阻断1小时。
注:此步骤中可以使用其他标准阻塞解决方案(例如,PBS 中的 2.5% BSA)。 - 取出阻断溶液,用200μL/井的泛黄病毒E蛋白mAb 4G2在阻断溶液(1微克/mL)中稀释,在37°C下孵育1小时。
注:其他mAb或多克隆抗体(pAb)可用于代替4G2进行病毒斑块的免疫染色和检测。 - 用PBS清洗细胞3x,并在37°C下用200μL的生物素化抗小鼠二级抗体稀释(按照制造商的建议)在阻断溶液中孵育1小时。
- 取出二级抗体,用PBS清洗细胞4x,并使用基于阿胶素/生物素的过氧化物酶试剂盒按照制造商的规格(参见材料表)可视化病毒斑块。
5. 确认成功 rZIKV 救援
注:为了进一步确认获救病毒的身份,ZIKV E蛋白表达通过免疫荧光分析,使用小鼠mAb 1176-56特异性用于ZIKV E蛋白(图4D)。此 mAb 是 ZIKV E 蛋白的特异性,与泛黄病毒 E 蛋白 mAb 4G2 的情况相反(步骤 4.6.3)。或者,病毒身份可以通过排序来确认。
- 在免疫荧光分析的前一天,24孔板中含有1 x 105 Vero细胞/生长培养基中的种子覆盖唇,在感染时可提高90%的交联细胞单层。
- 用PBS清洗细胞2x,并在生长培养基中感染0.5 PFU/细胞的多重感染(MOI),而不在三联体中感染FBS(100μL/孔)。在37°C下孵育板90分钟。
- 病毒吸附后,去除病毒接种,加入0.5 mL的新鲜生长培养基,用2%FBS,并在5%CO2加湿培养箱中孵育细胞,在37°C下孵育48小时。
- 去除组织培养液上清液,在室温下将150μL/井4%的甲醛固定在PBS中20分钟,并在室温下用150μL/井0.5%Triton-X100在PBS中渗透细胞15分钟。
- 去除渗透溶液,用PBS清洗细胞3x后,在室温下1小时用150μL/井的阻滞溶液阻断细胞。
注:细胞扫描被用替代阻断溶液阻断(例如,PBS 中的 2.5% BSA)。 - 去除阻滞溶液,用100μL/井mAb 1176-56孵育细胞,该细胞特异性用于ZIKV E蛋白,在阻滞溶液(1μg/mL)中稀释1小时,在37°C下。
- 用PBS清洗细胞3x,在室温下孵育1小时,用100μL/孔的Alexa Fluor 488结合抗小鼠二次抗体稀释(按照制造商的建议)在阻断溶液中,用PBS广泛清洗细胞,以及在室温下在PBS中稀释1:200,在室温下孵育150μL/孔4',6'-二酰胺-2-苯林多尔(DAPI;1mg/mL)。
- 用PBS清洗细胞3x,将盖玻片安装在防褪色安装介质上(见材料表),并在荧光显微镜下分析样品。
注:对于长期存储,将样品储存在 4°C 下,防止光线照射。
6. 病毒股的放大和生成
注:一旦获救病毒的身份得到确认(第5节),在Vero细胞上放大病毒并生成病毒,供进一步研究。
- 在 100 mm x 21 mm 的板中生长 Vero 细胞,在 90% 汇合时,用 MOI 0.1 PFU/细胞感染,如前所述。
- 当CPE约为75%(感染后约48-72小时)时,在50mL锥形管中收集组织培养上清液,并在2000 x g下离心10分钟,在4°C下清除细胞碎片。
- 收获含有rZIKV的上清液,并丢弃细胞颗粒。将上清液与冷冻管中并储存在-80°C。
- 从冰箱中取出病毒等分,并通过斑块测定确定病毒定位剂(第 4 节)。
Representative Results
此处描述的协议允许使用 BAC 生成稳定的 ZIKV 全长 cDNA 传染性克隆,以尽量减少与多个黄病毒序列相关的毒性问题。易感Vero细胞转染后,可轻松从BAC cDNA克隆中有效恢复传染性rZIKV(图2)。利用这个协议,我们使用传统的克隆方法和独特的方法,将四个重叠的cDNA片段连续克隆到BAC质粒pBeloBAC1134中,从而生成了ZIKV菌株RGN32的稳定全长cDNA克隆。病毒基因组中存在的限制性位点(图2)。全长cDNA克隆由人类CMV启动子在5'端侧侧,允许在转染细胞核中表达vRNA,在3'端由HDV RZ,然后是BGH多基因化和终止序列,产生含有RNA的RNA病毒基因组的确切3'结束(图2)。生成的 BAC cDNA 克隆的细菌稳定性,以及使用标准重组 DNA 技术轻松操作,凸显了 BAC cDNA 方法在快速、可靠地生成稳定全长 cDNA 克隆方面的潜力。ZIKV和其他黄病毒或阳性的RNA病毒与不稳定的病毒基因组。
一旦BAC cDNA克隆被组装(图2),传染性病毒可以很容易地恢复后,易感Vero细胞直接转染与BAC cDNA克隆使用阳离子脂体(图3)。这个由cDNA启动的系统允许封顶的vRNA的细胞内表达,允许感染病毒的恢复,而无需体外转录步骤。利用这种方法,我们能够在转染后5天用超过106 PFU/mL的吨位来拯救rZIKV-RGN(图4A)。此外,获救的病毒诱导了清晰的CPE(图4B),产生了约2毫米大小的同质斑块(图4C),其身份通过测序(未显示的数据)和免疫荧光分析使用mAb特异性得到确认。对于ZIKV E蛋白,1176-56 (图4D)。体外数据表明,恢复的rZIKV-RGN在Vero细胞中有效复制,与天然ZIKV分离物32相比,其水平有效(未显示数据)。总体而言,这些结果表明,传染性rZIKV可以从在BAC组装的全长cDNA克隆中拯救出来。
图 1:ZIKV基因组组织及病毒结构。(A) 基因组组织:ZIKV 包含正的单链RNA,可转换为单一多蛋白。翻译的多蛋白由病毒(箭头)和宿主(钻石)蛋白酶分裂,以产生结构蛋白辣椒(C,蓝色),基质(M,棕色)和包围(E,绿色)和七种非结构蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)。病毒基因组末端的5'和3'未翻译区域(UtRs)用黑线表示。(B) 病毒结构: ZIKV 病毒用 E 和 M 蛋白装饰,锚定在脂质双层中,具有类似胆碱的结构。在病毒包围下是由与病毒基因组RNA相关的C蛋白组成的病毒核囊。这个数字是从奥维拉-佩雷斯等人18。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:在BAC中组装ZIKV全长传染性cDNA克隆。(A) pBeloBAC11 BAC 的原理表:调节基因parA、parB、parC和repE、F因子复制源 (OriS)、氯霉素抗性基因 (Cmr)和乳酸Z基因被指示。用于组装传染性ZIKV cDNA克隆的相关限制点下划线。(B) 将ZIKV全长传染性cDNA克隆组装到pBeloBAC11 BAC:四个重叠的DNA片段(Z1-Z4),覆盖整个ZIKV基因组(图1),并由指示的限制位点两侧,由化学生成合成并连续克隆成pBeloBAC11,生成传染性ZIKV cDNA克隆pBAC-ZIKV。全长ZIKV传染性cDNA在人类巨细胞病毒立即-早期启动子(CMV)的控制下组装,在3'端由HDV核糖体(RZ)和牛生长激素(BGH)终止和多腺化序列侧侧。病毒基因和调控元素的缩写词如图1所示。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:从 BAC cDNA 克隆生成 rZIKV 的工作流。在90%的汇合处的维罗细胞在单层中转染ZIKV全长传染性cDNA克隆pBAC-ZIKV(图2),使用阳离子脂体。在转染后4-6天,当CPE明显时,收集并评估含有rZIKV的组织培养超生物是否存在病毒(图4),用于维罗细胞中的病毒扩增。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:rZIKV的恢复和体外表征。(A) 从BAC cDNA克隆中抢救传染性rZIKV:在90%的汇合(6孔板格式,三联体)处的Vero细胞被模拟转染或转染4微克/孔pBAC-ZIKV(图3),并在所述日期转染后,组织培养上腺中的病毒定子由斑块测定(PFU/mL)确定。误差条指示三个不同转染实验的标准偏差。点黑线表示检测限制 (50 PFU/mL)。(B) 病毒CPE:在90%汇合(6孔板格式,三联体)的病毒细胞被模拟感染(顶部)或感染(MOI为0.5 PFU/细胞)与rZIKV,并在感染后48小时,CPE的存在通过光显微镜评估。刻度条 = 100 μm. (C) 病毒斑块测定和免疫染色:90%汇合(12孔板格式)的Vero细胞感染了rZIKV,在感染后72小时,通过水晶紫斑(左)或免疫染色()来可视化病毒斑块右)使用泛黄病毒E蛋白mAb 4G2。刻度条 = 5 mm. (D) 免疫荧光:在 90% 汇合(24 孔板格式,三联体)处的维罗细胞被 rZIKV 感染 (MOI 为 0.5 PFU/细胞),在感染后 48 小时,使用 mAb 1176-56 进行免疫荧光分析,对 ZIKV 特异性E蛋白。细胞核被DAPI染色。显示了受ZIKV感染的Vero细胞的代表性合并图像。右上角的白色方块表示受ZIKV感染的Vero细胞的放大图像。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
传染性cDNA克隆是RNA病毒基础研究和疫苗开发和/或确定抗病毒策略的重要分子工具。然而,对于许多阳性的RNA病毒,包括黄病毒,传染性cDNA克隆的产生是困难的,因为克隆的cDNA的不稳定性,当在细菌中传播使用标准高拷贝数质粒时。在ZIKV和其他黄病毒的情况下,这种不稳定主要是由于病毒基因组14、15、16、17中来自神秘细菌启动子的有毒病毒蛋白的泄漏表达.在这里,我们描述了一种替代和强大的协议,以生成稳定的ZIKV全长传染性cDNA克隆作为单质粒,基于使用BAC质粒pBeloBAC1134(图2A)来克服毒性问题,使用CMV启动子允许转染细胞核中vRNA的表达,HDV RZ生成具有精确3'端的vRNA(图2B)。利用这种方法,我们成功地生成了ZIKV菌株RGN的完全稳定的传染性克隆,使易感Vero细胞直接转染后能够高效可靠地恢复传染性rZIKV(图3和图 4.
在过去几年中,为克服与ZIKV传染性cDNA克隆相关的不稳定问题作出了巨大努力,并成功实施了18种方法,包括cDNA片段的体外结扎24 ,25,低拷贝质粒19,20,通过引入沉默突变26,27,在创21,神秘细菌促进剂的失活22,23、吉布森装配方法30、ISA方法28、29、使用CPER31。虽然这些方法克服了毒性问题,并可用于生成 ZIKV 传染性 cDNA 克隆,但其中一些方法很费力,存在若干缺点,包括需要体外结扎和转录步骤来减少病毒恢复效率或引入大量无声突变,以灭活可能影响病毒适应性的神秘细菌促进剂,等等。该协议中描述的方法具有以下优点。 i) BAC 质粒 pBeloBAC1134具有严格控制的复制,每细胞保留一个或两个质粒副本,从而最大限度地减少毒性,并允许在不稳定 cDNA 细菌中稳定维持。ii) BAC质粒的传播和修饰几乎与传统质粒相似,考虑到本议定书中描述的略作修改,以操纵大尺寸BAC-DNA片段和低拷贝质粒。值得注意的是,BAC cDNA克隆也可以通过同源重组方式修改为大肠杆菌,使用红色重组系统42,43,44 .iii) 使用CMV启动子允许封顶ZIKV vRNA的细胞内表达和感染病毒的恢复,无需体外转录步骤。iv) 感染性rZIKV是在易感细胞(例如,Vero)与BAC cDNA克隆直接转染后产生的。由于哺乳动物细胞中的DNA转染比RNA转染更有效,因此BAC方法的病毒恢复效率高于使用RNA转录本观察到的病毒恢复效率,从而减少培养细胞中产生病毒库的通道数量,因此,限制通过细胞培养适应引入不需要的突变。
最后,BAC 方法的潜力得到了支持,它成功地使用这种方法(稍作修改)来设计其他黄病毒的传染性 cDNA 克隆,包括登革热病毒36和几个影响大的冠状病毒。人和动物健康,如可传播的肠胃炎冠状病毒37(TGEV),猫科感染性性性性性性性性性性性肠炎病毒38(FIPV),人类冠状病毒OC4339(HCoV-OC43),严重急性呼吸综合征冠状病毒40(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒41(MERS-CoV)等。
在此描述的协议中,应考虑两个关键步骤。一个重要的考虑因素是确定在BAC质粒中不存在的病毒基因组中适当的独特限制位点。如果没有适当的限制位点可用,则在克隆设计期间,通过引入无声核苷酸突变可以生成新的限制位点。另一个重要的问题是,BAC质粒每个细胞只存在于一个或两个拷贝中,因此,使用专为高和中等拷贝数质粒。利用大培养量和纯化BAC质粒,使用专门为BAC纯化开发的商业试剂盒,很容易克服这一潜在问题。
总之,我们开发了一个强大的ZIKV反向基因方法,基于BAC的使用,可以适应产生稳定和全功能传染性cDNA克隆的其他阳性的RNA病毒,以促进这些生物学的研究病毒和疫苗和/或促进抗病毒药物的识别。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢卡拉·戈麦斯在BAC cDNA克隆生成和斯涅扎娜·迪米特罗娃帮助制作视频方面给予的技术援助。这项工作部分得到了西班牙经济和竞争力部(MINECO,赠款号BFU2016-79127-R)向F.A.T.和国家卫生研究院(NIH,赠款号1R21AI120500)向L.M.S.和F.A.T提供的赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Molecular Biology Reagents | |||
| Afe I | New England BioLabs | R0652S | 10,000 Units/mL |
| AmpliTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | N8080161 | 5,000 Units/mL |
| ApaL I | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/mL |
| Asc I | New England BioLabs | R0558S | 10,000 Units/mL |
| BamH I | New England BioLabs | R0136S | 10,000 Units/mL |
| BstB I | New England BioLabs | R0519S | 20,000 Units/mL |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| ElectroMAX DH10B Cells | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 18290015 | Electocompetent DH10B cells |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm | Bio-Rad | 165-2086 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | Flamable |
| Isopropanol | Merck | 109634 | Flamable |
| Large-Construct Kit (10) | QIAGEN | 12462 | For high-purity BAC preparation |
| LB Broth | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 12780029 | Can be homemade as well |
| LB with Agar | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 22700041 | Can be homemade as well |
| Methanol | Merck | 106009 | Flamable |
| Mlu I | New England BioLabs | R0198S | 10,000 Units/mL |
| Oligonucleotides | IDT | N/A | |
| Plasmid pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
| Plasmid Midi Kit (25) | QIAGEN | 12143 | For midle-scale preparation of BAC plasmids |
| Pml I | New England BioLabs | R0532S | 20,000 Units/mL |
| Polypropylene tubes (10 mL) | DeltaLab | 175724 | Other commercial sources are acceptable |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (150) | QIAGEN | 20021 | Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb |
| Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 Units/mL |
| SOC Medium | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 15544034 | Can be homemade as well |
| Synthesis of cDNA fragments | Bio Basic | N/A | |
| T4 DNA Ligase | Sigma-Aldrich (Roche) | 10481220001 | 1,000 Units/mL |
| 2. Cell Culture Reagents | |||
| 6-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 140675 | |
| 12-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 150628 | |
| 24-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 142485 | |
| Agar Noble | VWR | 214230 | |
| Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody | Varies | N/A | |
| Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody | Varies | N/A | |
| Cell Culture Dishes (100 mm x 21 mm) | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 172931 | |
| Conical Tubes (15 mL) | VWR | 525-0150 | |
| Conical Tubes (50 mL) | VWR | 525-0155 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Toxic and carcinogenic |
| DEAE-Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11995065 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific (HyClone)) | SV30160.03 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Toxic and carcinogenic |
| L-Glutamine | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 25030081 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 11668019 | Transfection reagent |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11140035 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 31985070 | Transfection medium |
| Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 | BEI Resources | NR-50327 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | Toxic and carcinogenic |
| PBS | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 14190144 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 15140122 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | P10144 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories Inc | PK-4010 | Avidin/biotin-based peroxidase kit |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | |
| ZIKV E Protein mAb 1176-56 | BioFront Technologies | BF-1176-56 | |
| 3. Equipment | |||
| Agarose Gel Electrophoresis System | Bio-Rad | 1704468 | Other commercial sources are acceptable |
| Class II Biosafety CO2 Cabinet | Varies | N/A | Other commercial sources are acceptable |
| Desktop Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| Fluorescence Microscope | Varies | N/A | |
| High-speed Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | Other machines are acceptable |
| SimpliAmp Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | A24811 | Other machines are acceptable |
| Vortexer | Varies | N/A |
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