Summary
Den nylige epidemi af Zikavirus fremhæver vigtigheden af at etablere omvendte genetiske tilgange til at udvikle vacciner og/eller terapeutiske strategier. Her beskriver vi protokollen til at redde en infektiøs rekombinant Zikavirus fra en fuld længde cDNA-klon samlet i et bakterielt kunstigt kromosom under kontrol af det humane Cytomegalovirus umiddelbare tidlige promotor.
Abstract
Sammenslutningen af zikavirus (ZIKV) infektion med neurologiske komplikationer under det seneste verdensomspændende udbrud og manglen på godkendte vacciner og/eller antivirale lægemidler har understreget det presserende behov for at udvikle ZIKV omvendte genetiske systemer for at lette undersøgelse af ZIKV biologi og udvikling af terapeutiske og/eller profylaktiske tilgange. Men, ligesom med andre flavivira, generation af ZIKV fuld længde infektiøse cDNA kloner er blevet hæmmet på grund af toksiciteten af virale sekvenser under dens forstærkning i bakterier. For at løse dette problem har vi udviklet en ikke-traditionel tilgang baseret på brugen af bakterielle kunstige kromosomer (BACs). Ved hjælp af denne fremgangsmåde genereres den fulde cDNA-kopi af ZIKV-stammen Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) fra fire syntetiske DNA-fragmenter og samles i en enkelt kopi pBeloBAC11 plasmid under kontrol af humant Cytomegalovirus (CMV) hurtig promotor. Den samlede BAC cDNA-klon er stabil under formering i bakterier, og infektiøs rekombinant (r) zikv genvindes i Vero-celler efter transfektering af BAC-cDNA-klonen. Den protokol, der er beskrevet her, giver en effektiv teknik til generering af infektiøse kloner af flavivira, herunder ZIKV, og andre positive-streng RNA-vira, især dem med store genomer, som har stabilitetsproblemer under bakterielle udbredelse.
Introduction
ZIKV er et myg-båret medlem af flavivirus slægten i Flaviviridae familien, som i øjeblikket udgør en global folkesundheds nødsituation1. Ligesom andre flavivira er ZIKV et kappebærende RNA-virus med en icosahedral-lignende struktur, der indeholder en positiv fornemmelse, enkeltstrenget RNA-molekyle på ca. 10,8 KB (figur 1)2. Det virale genom koder et stort polyprotein på ca. 3.423 aminosyrer, der behandles af virale og cellulære proteaser i tre strukturelle proteiner (capsid [C], premembran/membran [prM/M] og konvolut [E]), der er involveret i dannelsen af virale partikler og syv ikke-strukturelle (NS) proteiner (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B og NS5), der deltager i genom-replikation, virus samling og unddragelse af værts immunrespons (figur 1)3.
Historisk, zikv infektion har været forbundet med en mild febril sygdom4,5. Men den eksplosive nylige pandemi af zikv infektioner i hele syd-og Mellemamerika, det sydlige Stillehav, og Caribien6,7,8, og dets tilknytning til forekomsten af Guillain-Barré syndrom og microcephaly9,10,11,12,13, har ændret den historiske opfattelse og potenseret relevansen af zikv som en vigtig menneskelig patogen. I denne forstand vil udviklingen af molekylære værktøjer, såsom infektiøse cDNA-kloner, lette studiet af viral patogenese og udvikling af genetisk definerede vacciner og identifikation af antivirale lægemidler til behandling af ZIKV-infektion. Som beskrevet for andre flavivira er genereringen af ZIKV infektiøse kloner vanskelig på grund af tilstedeværelsen af kryptiske bakterie promotorer i det virale genom14 , der muliggør utætte ekspression af giftige virale proteiner under udbredelsen af cDNA kloner i bakterier ved hjælp af standard høj-kopi-nummer plasmider15,16,17. For at overvinde dette toksicitets problem er flere ikke-traditionelle tilgange blevet gennemført med succes i de sidste to år18. Disse omfatter brugen af lav-kopi-nummer plasmider19,20, indsættelse af introner til at forstyrre de giftige områder21,22,23, in vitro-ligationen af cDNA-fragmenter 24 , 25, Mutations hæmning af kryptiske bakterielle promotorer til stede i det virale genom26,27, infektiøse subgenomic amplikoner (ISA)28,29, den Gibson assembly metode30 , og brugen af cirkulær polymeraseforlængelses reaktion (CPER)31.
Heri beskriver vi den detaljerede protokol for konstruktion af en cDNA-klon i fuld længde af zikv-stammen zikv-RGN13ved hjælp af en BAC til at overvinde toksicitets problemet og redning af infektiøs rzikv ved direkte transfektering af BAC cDNA-klonen i Vero celler32, en cellelinje godkendt af Food and Drug Administration (FDA) til udvikling af humane vacciner33. I dette system samles cDNA-kopien af det virale genom i fuld længde i BAC plasmid pBeloBAC1134 (figur 2a), et plasmid med lav kopi (en til to kopier pr. celle) afledt af Escherichia coli F-faktor35. som minimerer toksiciteten af flavivirus sekvenser under dets udbredelse i bakterier. CDNA af zikv genom er samlet i pBeloBAC11 under kontrol af human CMV umiddelbar tidlig promotor, at tillade ekspression af viral (v) RNA i kernen af transficeret celler af cellulære RNA polymerase II, og flankeret ved 3 '-ende af hepatitis Delta virus (HDV) ribozymer (RZ), efterfulgt af sekvenser af kvæg væksthormon (BGH) opsigelse og polyadenylering signaler til fremstilling af syntetiske RNAs forsynet med autentiske 5 '-og 3 '-ender af det virale genom, henholdsvis (figur 2b). Dette cDNA-lancerede system resulterer i det intracellulære udtryk af udjævnet viral RNA, hvilket gør det muligt at inddrive infektiøs ZIKV uden behov for et in vitro transkriptionstrin. BAC-tilgangen giver en effektiv metodologi, der anvendes til at konstruere stabile og fuldt funktionelle infektiøse cDNA-kloner til andre flavivira, samt andre positive-strengede RNA-vira36,37, 38,39,40,41.
Protocol
1. opførelse af en ZIKV infektiøs cDNA-klon i en BAC
Bemærk: Strategien for samlingen af ZIKV i BACs er beskrevet for RGN stamme13 (tiltrædelses nummer KU527068) (figur 2).
- Vælg unikke restriktionssteder, der er passende fordelt i det virale genom, som er fraværende i plasmid-pBeloBAC11 (figur 2a).
Bemærk: For ZIKV-RGN blev restriktions stederne PML I, AFE I og BstB I (henholdsvis genompositionerne 3.347, 5.969 og 9.127) valgt. I tilfælde af, at der ikke findes passende begrænsnings steder i det virale genom, genereres der nye restriktionssteder ved at introducere tavse nukleotidmutationer i det virale genom under cDNA-Fragmentets design. - Generer ved kemisk syntese fire cDNA-fragmenter, som spænder over hele genomet (Z1 til Z4), flankeret af CMV-promotoren ved 5 '-enden og HDV RZ, BGH-opsigelsen og polyadenyleringsekvenser ved 3 '-enden ( figur 2b). Hvert fragment skal flankeres af de valgte restriktionssteder (trin 1,1).
Bemærk: Fragment Z1 bruges som rygraden til at klone resten af fragmenterne i pBeloBac11. Med henblik herpå skal den indeholde den humane CMV-promotor og skal flankeres ved 5 '-enden af ApaL I (for at klone dette fragment i pBeloBAC11) og ASC i (fraværende i det virale genom) og ved 3 '-enden af de restriktionssteder, der er udvalgt til samlingen af den infektiøse klon (PML i , AFE i og BstB i) efterfulgt af Mlu i (fraværende i det virale genom) og BamH I (for at klone dette fragment i pBeloBAC11). Fragment Z4 skal indeholde genomområdet fra det sidst valgte begrænsnings sted (BstB I) til slutningen af det virale genom, efterfulgt af HDV RZ, BGH-ophørs-og polyadenyleringsekvenser og Mlu I-restriktions stedet (figur 2b). Alternativt kan cDNA-fragmenterne (Z1-Z4) genereres ved en kombination af standard reverse transkriptase-polymerase-kædereaktioner (RT-PCRs) og overlappende PCRs ved hjælp af specifikke oligonukleotider. - Saml den infektiøse cDNA-klon ved sekventiel kloning af fragmenter Z1 til Z4 i pBeloBAC11 (figur 2b).
- Fordøje pBeloBAC11 plasmid og Z1-fragmentet med ApaL I og BamH I. For at blande 2 μg pBeloBAC11 plasmid eller 1 μg Z1 fragment med 10 μL 10x reaktionsbuffer, 20 enheder af hvert enzym og vand for at nå et endeligt volumen på 100 μL. Inkuber ved 37 °C i 2 timer.
- Dephosphorylate BAC-vektoren ved hjælp af rejer alkalisk fosfatase (SAP). Med henblik herpå tilsættes 2,5 μL (2,5 enheder) af SAP til den fordøjet BAC og Inkuber ved 37 °C i 1 time. varme-inaktivere SAP ved inkubation ved 75 °C i 15 min.
- Rens den defosforylerede BAC-vektor og fragment Z1 ved agrose gel-elektroforese ved hjælp af et kommercielt gel-oprydnings sæt, der er optimeret til rensning af DNA-fragmenter, der er større end 10 KB (Se tabellen over materialer).
- Udfør ligations reaktionen for at generere plasmid (p) BAC-Z1. Med henblik herpå blandes 150 ng af renset, fordøjet BAC-vektor med det oprensede skær ved hjælp af et molært forhold mellem vektor-til-indsættelse af 1:3, 1,5 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer indeholdende 10 mM ATP, en enhed af T4-DNA-ubiquitinligase og vand til et endeligt volumen på 15 μL.
- Inkubér ligations blandingen i 20 timer ved 16 °C. Som kontrol af ligations reaktionen udføres parallelt med en ligations reaktion uden indsættelse. Varme-inaktivér ligasen ved inkubation ved 65 °C i 15 min.
Bemærk: I tilfælde af uskarpe DNAs, Inkubér ligations reaktionen i 20 timer ved 14 °C. På grund af den store størrelse af BAC vektor (figur 2a), er det vigtigt at bruge større mængder af vektor og indsætte end ligationer ved hjælp af konventionelle plasmider for at øge forpligtelser effektiviteten. - Transformér 50 μL E. coli DH10B elektro kompetente celler med 2 μl af ligations reaktionen (trin 1.3.5) ved elektroporation (25 μf kapacitans, 2,5 kV og 100 Ω modstand) ved hjælp af elektro porterings kuvetter monteret med elektroderne fordelt med intervaller på 0,2 cm, efter standardprotokoller.
- Cellerne overføres til et polypropylen-rør med 1 mL SOC-medium (2% trypton, 0,5% gærekstrakt, 0,05% NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mm mgso4, 20 mm glucose [pH 7,0]) og Inkuber dem ved 37 °c i 1 time med blid omrystning (200-250 rpm). Cellerne på Luria bouillon (LB) agarplader indeholdende 12,5 μg/mL chloramphenicol og inkubateres ved 37 °C i 16 timer.
- Pick 8 til 12 bakterielle kolonier, lav en replika på en frisk LB agar plade indeholdende 12,5 μg/mL chloramphenicol, og test, om de indeholder den korrekte indsats ved direkte PCR analyse ved hjælp af specifikke oligonukleotider.
- Vælg en positiv koloni fra replikpladen, vokse den i 100 mL LB indeholdende 12,5 μg/mL chloramphenicol, og isolere BAC cDNA ved alkalisk lysis metode ved hjælp af en kommerciel plasmid MIDI kit, efter anbefaling til rensning af store lav-kopi plasmider (Se tabellen over materialer).
Bemærk: BAC cDNA fremstillet ved denne metode kan være forurenet med op til 30% af bakteriel genomisk DNA, men det er egnet i kvalitet til at udføre begrænsning analyse, sekventering, og kloning. Afhængigt af BAC-størrelsen kan der opnås et afkast på 4-6 μg BAC plasmid. - Kontrollere den genetiske integritet af det klonede cDNA ved begrænsnings analyse. Digest 500 ng af pBAC-Z1 plasmid med ASC I og PML I ved 37 °C i 1 time og bekræfter tilstedeværelsen af Z1-fragmentet ved gelelektroforese. For yderligere at bekræfte, at uønskede mutationer ikke er blevet introduceret, sekvens indsatsen med specifikke oligonukleotider.
- Startende fra plasmid pBAC-Z1, der indeholder de valgte restriktionssteder (PML I, AFE I, BstB I og Mlu I), klon fragmenterne Z2 til Z4 for at generere den infektiøse cDNA-klon pBAC-ZIKV i fuld længde (figur 2b) efter lignende eksperimentelle fremgangsmåder som beskrevet ovenfor for fragment Z1 (trin 1.3.1-1.3.10).
2. fremstilling af pBAC-ZIKV med høj renhed til redning af infektiøs rZIKV
Bemærk: Den store fremstilling af en ultrarent pbac-zikv infektiøs klon, der er egnet til transfektering og redning af infektiøse vira, udføres ved alkalisk lyse med et kommercielt kit specielt udviklet til Bac-rensning (Se tabellen over Materialer). Kittet skal omfatte et ATP-afhængigt exonuklease-nedbrydnings trin, der fjerner bakteriel genomisk DNA-kontaminering, hvilket gør det muligt at isolere BAC cDNA med en renhedsgrad svarende til den, der opnås med cæsium chloridmetoden.
- Vokse en enkelt koloni af E. coli DH10B transporterer pbac-zikv infektiøs klon i 5 ml af lb medium indeholdende 12,5 μg/ml chloramphenicol ved 37 °c i 8 timer med blid rystning (200-250 rpm).
- Der tilsættes 1 mL bakteriekultur (trin 2,1) til 500 mL LB med 12,5 μg/mL chloramphenicol i en 2 L kolbe, og cellerne vokser ved 37 °C i 14-16 h (indtil en OD600 på 0,6-0,8).
Bemærk: Rige bouillon, såsom fantastisk bouillon (TB), kan producere ekstremt høje celle tætheder, hvilket resulterer i et lavere udbytte og mindre renhed af BAC cDNA. - Du renser BAC-infektiøs cDNA-klon ved alkalisk lyse ved hjælp af et kommercielt sæt, der er specielt udviklet til BAC-rensning, efter producentens specifikationer (Se tabellen over materialer). Opbevar den rensede BAC cDNA ved 4 °C. Afhængigt af BAC-størrelsen kan der opnås udbytter på 30 μg ultrarent BAC cDNA-klon.
Bemærk: Du må ikke tørre DNA-pellet i mere end 5 minutter, da over tørring vil gøre det vanskeligt at opløse BAC-cDNA. På grund af den store størrelse af BAC cDNA klon, undgå vortexning eller pipettering for at forhindre plasmid klipning.
3. redning af infektiøs rZIKV fra BAC cDNA-klon ved Transfection af Vero-celler
Bemærk: Infektiøs rzikv genvindes ved transfektering af Vero-celler med pbac-zikv-cDNA-klonen ved hjælp af et kommercielt kationisk lipid-transfektering-reagens (Se tabellen over materialer; Figur 3).
- En dag før transfection, plade på 6-brønds plader 5 x 105 Vero celler/godt i vækstmedium (dulbecco's modificerede eagle's medium [DMEM] suppleret med 5% føtal kvægserum [FBS], 2 mm L-glutamin, og 1% ikke-essentielle aminosyrer) uden antibiotika at hæve 90% flydende Cell monolag på tidspunktet for transfektering.
Bemærk: Vi anbefaler at udføre virus redder i triplicates. -
Ækvibrere serum-reduceret medium (se tabellen over materialer) ved stuetemperatur og forberede transfektering blandinger i sterile mikrofuge rør for hver transfektering prøve som følger.
- Tilsæt 4 μg BAC cDNA-klonen i 250 μL serum-reduceret medium og bland forsigtigt, undgå vortexning for at forhindre plasmid klipning.
- I et separat rør fortyndes 12 μl transfektering reagens (1 mg/ml) (Se tabellen over materialer) i 250 μl serum-reduceret medium, blandes ved vortexing, og Inkubér ved stuetemperatur i 5 min.
- Kombiner den fortyndede BAC cDNA og transfektering reagens (med en 1:3 ratio af DNA: transfektering reagens), bland forsigtigt, mens du undgår vortexing, og Inkubér ved stuetemperatur i 20-30 min.
- I inkubationsperioden for BAC cDNA/transfection reagentblandingen skal du vaske Vero-celler med vækstmedium uden antibiotika og efterlade cellerne i 1 mL frisk medium uden antibiotika.
Bemærk: Tilsætning af antibiotika under transfektering processen kan nedsætte transfektering effektivitet. - Fordel dråbevis 500 μl af BAC cDNA/transfection reagens blandingen (af trin 3.2.3) på Vero-cellerne, bland dem ved at Rocking pladen frem og tilbage, og Inkuber cellerne i en 5% Co2 befuret inkubator ved 37 °c i 6 timer.
- Fjern transfektering mediet, tilsæt 2 ml frisk vækstmedium med antibiotika (100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin), Inkuber cellerne i en 5% Co2 befuret inkubator ved 37 °c, og kontroller hver dag for induktion af cytopatisk effekt (CPE ).
Bemærk: ZIKV CPE er ganske udtalt i Vero-celler, og det er karakteriseret ved tilstedeværelsen af afrundede og birefringerende celler, der løsnes og flyder i vævs kulturen supernatanten. - Der opsamles aliquoter (100 μL) af Vero-cellernes vævskultur supernatanter (trin 3,5) hver 24 h for at bestemme effektiviteten af virus genvinding ved at vurdere tilstedeværelsen af ZIKV ved hjælp af en standard plaque-analyse på friske Vero-celler (figur 4a).
- Efter fire til seks dages transfection, når CPE er omkring 50%-75% (figur 4b), indsamle væv kultur supernatanter i 15 ml koniske rør og centrifugeres ved 2.000 x g i 10 min ved 4 °c at fjerne cellulære snavs.
- Høst Supernatanterne indeholdende rZIKV og kassere celle pellets. Alikvot supernatanten i kryorør og opbevar dem ved-80 °C for yderligere at bekræfte tilstedeværelsen af reddet rZIKV.
4. titrering af genvundet rZIKV
- En dag før titrering, frø på 12-brønden plader 2,5 x 105 Vero celler/godt i vækstmedium til at hæve 90% flydende Cell monolag på tidspunktet for titrering.
Bemærk: Vi anbefaler at foretage titrering af den gendannede rZIKV i tre triplicater. - Fjern en alikvot af supernatanten fra fryseren (trin 3,8) og lav serie 10 gange fortyndinger i vækstmedium uden FBS.
- Du vasker Vero-cellerne 2x med fosfat-bufferet saltvand (PBS) og tilsættes 200 μL/brønd af hver virus fortynding i tre eksemplarer. Placer pladerne i en 5% CO2 befuret inkubator ved 37 °c og rock hver 15 min for en 90 min adsorptions periode.
- Fjern den virale inoculum, overlay cellerne med 2 mL vækstmedium indeholdende 2% FBS, 1% DEAE-dextran, og 0,6% agar Noble, og Inkubér ved 37 °C under 5% co2 for 3-4 dage.
Bemærk: Det er muligt at anvende agopstået, methylcellulose eller andre overlay-medier. Tiden for korrekt plaque dannelse vil variere afhængigt af den anvendte overlay og ZIKV stammen. -
Fix ZIKV-inficerede celler med 1 mL/brønd af 4% formaldehyd fortyndet i PBS ved stuetemperatur i 1 time, Fjern overlay, og Visualiser de virale plaques ved farvning dem med 0,1% krystalviolet i 20% methanol ved stuetemperatur i 15 min.
- Kassér krystalviolet, vask 3x med vand, lad pladerne tørre, og Tæl manuelt plaques (figur 4c, venstre panel). Viral titer beregnes som plaque dannende enheder pr. milliliter (PFU/ml).
-
Alternativt kan virale plaques visualiseres ved immun farvning med pan-flavivirus E protein Mouse monoklonale antistof (mAb) 4G2 (figur 4c, højre panel).
- For at evaluere ZIKV-plaques ved immun farvning efter fastgørelse og fjernelse af over lejrings agar som beskrevet ovenfor (i trin 4,5) vaskes cellerne 2x med PBS og permeabiliserer dem ved inkubation med 200 μL/brønd af 0,5% Triton-X100 i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern permeabiliserings opløsningen, vask cellerne 3x med PBS, og Bloker dem med 200 μL/brønd blokerende opløsning (10% FBS i PBS) i 1 time ved stuetemperatur.
Bemærk: Andre standard blokerings opløsninger (f. eks. 2,5% BSA i PBS) kan anvendes i dette trin. - Fjern blokerings opløsningen, og Inkuber cellerne med 200 μL/brønd af Pan-flavivirus E-protein mAb 4G2 fortyndet i blokerende opløsning (1 μg/mL) i 1 time ved 37 °C.
Bemærk: Andre mAb eller polyklonale antistoffer (pAb) kan anvendes i stedet for 4G2 til immun farvning og påvisning af virale plaques. - Cellerne 3x med PBS vaskes, og de inkubateres med 200 μL biotinyleret anti-mus sekundært antistof fortyndet (efter fabrikantens anbefaling) i blokerende opløsning i 1 time ved 37 °C.
- Fjern det sekundære antistof, vask cellerne 4X med PBS, og Visualiser de virale plaques ved hjælp af et Avidin/biotin-baseret peroxidase-kit efter fabrikantens specifikationer (Se tabellen over materialer).
5. bekræftelse af vellykket rZIKV redning
Bemærk: For yderligere at bekræfte identiteten af den reddede virus, ZIKV E protein ekspression analyseres ved immunofluorescens ved hjælp af mus mAb 1176-56 specifikke for ZIKV E protein (figur 4d). Denne mAb er specifik for ZIKV E protein, i modsætning til situationen for pan-flavivirus E protein mAb 4G2 (trin 4.6.3). Alternativt kan virus identiteten bekræftes ved sekvensering.
- En dag før immunofluorescens analyse, frødæksedler i 24-brønden plader indeholdende 1 x 105 Vero celler/godt i vækstmedium til at hæve 90% flydende Cell monolag på tidspunktet for infektion.
- Vask cellerne 2x med PBS og inficere dem med en mangfoldighed af infektion (MOI) af 0,5 PFU/celle af den reddede virus i vækstmedium uden FBS (100 μL/brønd) i tre eksemplarer. Pladerne inkubates ved 37 °C i 90 min.
- Efter viral adsorption fjernes viral inoculum, tilsættes 0,5 mL frisk vækstmedium med 2% FBS og Inkuber cellerne i en 5% CO2 -befuret inkubator ved 37 °c i 48 h.
- Fjern vævs kulturen supernatant, fastgør cellerne med 150 μL/godt af 4% PARAFORMALDEHYD i PBS i 20 minutter ved stuetemperatur, og permeabilize cellerne med 150 μL/brønd af 0,5% Triton-X100 i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Efter fjernelse af permeabiliserings opløsningen og vask af cellerne 3x med PBS, blokeres cellerne med 150 μL/brønd blokerende opløsning under 1 time ved stuetemperatur.
Bemærk: Celle scanning blokeres med alternative blokerende opløsninger (f. eks. 2,5% BSA i PBS). - Fjern blokerings opløsningen, og Inkuber cellerne med 100 μL/brønd af mAb 1176-56, specifik for ZIKV E-protein, fortyndet i blokerende opløsning (1 μg/mL) i 1 time ved 37 °C.
- Vask cellerne 3x med PBS, Inkuber dem ved stuetemperatur i 1 time med 100 μL/brønd af Alexa fluor 488-konjugeret anti-mus sekundært antistof fortyndet (efter fabrikantens anbefaling) i blokerende opløsning, vask cellerne i udstrakt grad med PBS, og inkubatér dem med 150 μL/brønd af 4 ', 6 '-diamidino-2-phenylindol (DAPI; 1 mg/mL) fortyndet 1:200 i PBS ved stuetemperatur i 10 min.
- Vask cellerne 3x med PBS, Monter dæksedlerne på et monterings medium med anti fade (Se tabellen over materialer), og analysér prøverne under et fluorescens mikroskop.
Bemærk: Ved langtidsopbevaring opbevares prøverne ved 4 °C beskyttet mod lys.
6. forstærkning og generering af virale bestande
Bemærk: Når identiteten af den reddede virus er bekræftet (afsnit 5), forstærke virus på Vero celler og generere virale bestande for yderligere undersøgelser.
- Grow Vero-celler i 100 mm x 21 mm plader ved 90% sammenløbet og inficere dem med en MOI på 0,1 PFU/celle som beskrevet før.
- Når CPE er omkring 75% (ca. 48-72 timer efter infektion), opsamles vævskultur supernatanten i et 50 mL konisk rør og centrifugeres ved 2.000 x g i 10 minutter ved 4 °c for at fjerne det cellulære snavs.
- Høst supernatanten indeholdende rZIKV og kassér celle pellet. Af supernatanten i kryorør og opbevar dem ved-80 °C.
- Fjern en virusalikvot fra fryseren og bestem viral titer ved plaque assay som beskrevet før (punkt 4).
Representative Results
Den protokol, der er beskrevet her, giver mulighed for generering af stabile ZIKV i fuld længde cDNA infektiøse kloner ved hjælp af en BAC for at minimere de toksicitets problemer, der er forbundet med flere flavivirale sekvenser. Effektiv genvinding af infektiøs rzikv fra BAC-cDNA-klonen kan let opnås efter transfektering af følsomme Vero-celler (figur 2). Ved hjælp af denne protokol, har vi genereret en stabil fuld længde cDNA klon af ZIKV stamme RGN32 ved sekventielt kloning fire overlappende cDNA FRAGMENTER i BAC plasmid pBeloBAC1134 ved hjælp af konventionelle kloning metoder og unikke til stede i det virale genom (figur 2). CDNA-klonen i fuld længde blev flankeret ved 5 '-enden af human CMV Promoter for at give mulighed for at ekspression af vrna i kernen af transficeret celler, og ved 3 '-enden af HDV RZ efterfulgt af BGH polyadenylering og termineringsekvenser, til fremstilling af RNAs indeholdende den nøjagtige 3 '-ende af det virale genom (figur 2). Stabiliteten i bakterier af den genererede BAC cDNA-klon, sammen med dens nemme manipulation ved hjælp af standard rekombinant DNA-teknologier, fremhæver potentialet i BAC cDNA-tilgangen til en hurtig og pålidelig generation af stabile cDNA-kloner i fuld længde af Af ZIKV og andre flavivira eller positive, strandede RNA-vira med ustabile virale genomer.
Når BAC cDNA-klonen blev samlet (figur 2), kunne infektiøs virus let inddrives efter direkte transfektering af modtagelige Vero-celler med BAC cDNA-klonen ved hjælp af kationiske Liposomer(figur 3). Dette cDNA-lancerede system tillod det intracellulære udtryk af det udjævnede Vrna, hvilket gjorde det muligt at inddrive infektiøse vira uden behov for et in vitro transkriptionstrin. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, vi var i stand til at redde rzikv-RGN med titre højere end 106 PFU/ml på 5 dage posttransfection (figur 4a). Desuden inducerede den reddede virus en klar CPE (figur 4b), genererede homogene plaques på ca. 2 mm (figur 4c), og dens identitet blev bekræftet ved sekvensering (data ikke påvist) og immunofluorescens analyse ved hjælp af Mab-specifikke for ZIKV E-protein, 1176-56 (figur 4d). In vitro-data indikerer, at den gendannede rZIKV-RGN replikeres effektivt i Vero-celler og til niveauer sammenlignet med et naturligt ZIKV-isolat32 (data ikke vist). Samlet set viser disse resultater, at infektiøs rZIKV kan reddes fra fuld længde cDNA kloner samlet i en BAC.
Figur 1 : Zikv genom organisation og virion struktur. A) genomorganisation: zikv indeholder et positivt enkeltstrenget RNA, der er oversat som et enkelt polyprotein. Det oversatte polyprotein blev kløvet af viral (pile) og Host (diamanter) proteaser til at producere de strukturelle proteiner kapsid (C, blå), matrix (M, brun), og omhylle (E, grøn), og syv materialer proteiner (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, og NS5). De 5 ' og 3 ' ikke-oversatte regioner (UTRs) ved slutningen af det virale genom er indikeret med sorte streger. (B) virion struktur: zikv virions blev dekoreret med E og M proteiner, forankret i en lipid-tolags med en icosahedral-lignende struktur. Under viral omhylle var viral nucleocapsis sammensat af det C-protein, der er forbundet med det virale genomiske RNA. Dette tal er blevet tilpasset fra Ávila-Pérez et al.18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Samling af ZIKV infektiøs cDNA-klon i fuld længde i en BAC. A) skematisk gengivelse af pBeloBAC11 BAC: de regulatoriske gener ParA, parb, ParCog Repe,F-faktor replikation oprindelse (OriS), chloramphenicol resistente gen (cmr), og Lac Z-genet er indiceret. De relevante begrænsnings steder, der anvendes til at samle den infektiøse ZIKV cDNA-klon, understreges. B) samling af zikv infektiøs cDNA-klon i fuld længde i pBeloBAC11 BAC: fire overlappende DNA-fragmenter (Z1-Z4), der dækker hele zikv-genomet (figur 1) og flankeret af de angivne restriktionssteder, blev genereret af kemiske syntese og sekventielt klonet i pBeloBAC11 til at generere den infektiøse ZIKV cDNA klon pBAC-ZIKV. Den fulde længde af ZIKV infektiøs cDNA blev samlet under kontrol af den humane Cytomegalovirus umiddelbare tidlige promotor (CMV) og flankeret ved 3 '-enden af HDV ribozymer (RZ) og bovin væksthormon (BGH) opsigelse og polyadenylering sekvenser. Akronymer for virus Gener og regulatoriske elementer er som beskrevet i figur 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Workflow til at generere rZIKV fra BAC cDNA klon. Vero-celler ved 90% af sammenløbet blev transficeret i enkeltlags med zikv infektiøs cDNA-klon pbac-zikv (figur 2) ved hjælp af kationiske Liposomer. Ved 4-6 dages posttransfection, hvor CPE var tydelig, blev vævskultur supernatanter indeholdende rzikv indsamlet og evalueret for forekomst af virus (figur 4) og anvendt til viral amplifikation i Vero-celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Nyttiggørelse og in vitro-karakterisering af rZIKV. A) redning af infektiøs rZIKV fra BAC cDNA-klon: Vero-celler ved 90% af sammenløbet (6-brønd plade format, triplicater) var mock-transficeret eller transficeret med 4 μg/brønd af PBAC-Zikv (figur 3), og på de angivne dage posttransfection, virus titre i vævskultur supernatanter blev bestemt ved plaque assay (PFU/ml). Fejllinjerne angiver standardafvigelser fra tre forskellige transfektering-eksperimenter. Den stiplede sorte linje angiver detektionsgrænsen (50 PFU/mL). B) viral CPE: Vero-celler ved 90% sammenløbet (6-brønd plade format, triplicater) var mock-inficerede (top) eller inficeret (MOI af 0,5 PFU/celle) med rZIKV, og ved 48 h post infektion blev tilstedeværelsen af CPE evalueret af let mikroskopi. Skala stænger = 100 μm.C) viral plaque-analyse og immunofarvning: Vero-celler ved 90% sammenløbet (12-brønd plade format) blev inficeret med rZIKV, og ved 72 h post infektion blev virale plaques visualiseret ved krystalviolet farvning (venstre) eller ved immun farvning ( højre) ved hjælp af Pan-flavivirus E protein mAb 4G2. Skala stænger = 5 mm.d) immunofluorescens: Vero-celler ved 90% sammenløbet (24-brønd plade format, triplicater) blev inficeret (MOI af 0,5 PFU/celle) med rZIKV og, ved 48 h post infektion, analyseret ved immunofluorescens ved hjælp af mab 1176-56, specifik for zikv E-protein. Cellekerner blev plettet med DAPI. Der vises et repræsentativt sammenflettet billede af ZIKV-inficerede Vero-celler. Den hvide firkant øverst til højre repræsenterer et forstørret billede af ZIKV-inficerede Vero-celler. Skala stænger = 100 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Infektiøse cDNA-kloner udgør essentielle molekylære værktøjer til grundforskning af RNA-vira og udvikling af vacciner og/eller identificering af antivirale strategier. Men for mange positive-strandede RNA-vira, herunder flavivira, er genereringen af infektiøse cDNA-kloner vanskelige på grund af ustabiliteten i de klonede Cdna'er, når de spredes i bakterier ved hjælp af standard plasmider af høj kopi-nummer. I tilfælde af zikv og andre flavivira skyldes denne ustabilitet hovedsagelig det utætte udtryk af giftige virale proteiner fra kryptiske bakterie promotorer, der er til stede i det virale genom14,15,16,17 . Her beskriver vi en alternativ og kraftfuld protokol til at generere en stabil ZIKV fuld længde infektiøs cDNA-klon som en enkelt plasmid, baseret på brugen af BAC plasmid pBeloBAC1134 (figur 2a) for at overvinde toksicitets problemet, brugen af CMV Promoter til at give mulighed for at ekspression af vrna i kernen af transficeret celler, og HDV RZ til at generere vrnas med nøjagtige 3 '-Ends (figur 2b). Ved hjælp af denne metode, har vi med succes genereret en fuldt stabil infektiøs klon af zikv stamme RGN, der giver mulighed for effektiv og pålidelig genopretning af infektiøs rzikv efter direkte transfektering af følsomme Vero celler (figur 3 og Figur 4).
En enorm indsats er blevet gjort i de sidste par år for at overvinde de ustabilitet problemer forbundet med zikv infektiøse cDNA kloner, og flere tilgange er blevet gennemført18, herunder in vitro-ligering af cDNA-fragmenter24 ,25, lav-kopi plasmider19,20, inaktivering af kryptiske bakterie promotorer ved indførelsen af tavse mutationer26,27, intron indsættelse21, 22 , 23, Gibson assembly metode30, ISA metode28,29, og brugen af cper31. Selv om disse tilgange overvinde toksiciteten problem og er nyttige til at generere zikv infektiøse cDNA kloner, nogle af dem er omstændelig og præsentere flere ulemper, herunder behovet for in vitro-ligering og transkriptionstrin, der reducerer virus nyttiggørelse effektivitet eller indførelsen af et stort antal tavse mutationer at inaktivere kryptiske bakteriel promotor, der kan påvirke viral fitness, blandt andre. Den fremgangsmåde, der er beskrevet i denne protokol, giver følgende fordele. i) BAC plasmid pBeloBAC1134 har en strengt kontrolleret replikation, der holder en eller to eksemplarer af plasmid pr. celle, hvilket minimerer toksicitet og muliggør stabil vedligeholdelse i bakterier af ustabile cdnas. II) formering og modifikation af BAC plasmider er næsten ligner dem af konventionelle plasmider, i betragtning af de små ændringer beskrevet i denne protokol til at manipulere store størrelse BAC-DNA-fragmenter og lav-kopi plasmider. Især kan BAC cDNA-klon også modificeres til E. coli ved homologe rekombination ved hjælp af det røde rekombinationsystem42,43,44. III) brugen af CMV Promoter gør det muligt at intracellulære udtryk af udjævnet ZIKV vRNA og genopretning af infektiøse vira uden at kræve et in vitro transkriptionstrin. IV) infektiøs rzikv genereres efter direkte transfektering af modtagelige celler (f. eks. Vero) med BAC-cDNA-klonen. Da DNA-transfektering i pattedyrsceller er mere effektivt end RNA-transfektering, er virus genvindingseffektiviteten med BAC-tilgangen højere end den, der observeres ved hjælp af RNA-udskrifter, hvilket reducerer antallet af passager i kultur celler for at generere en viral bestand, og derfor begrænse indførelsen af uønskede mutationer ved cellekultur tilpasning.
Endelig er potentialet i BAC-tilgangen understøttet af en vellykket anvendelse af denne metode (med mindre modifikationer) til at konstruere infektiøse cDNA-kloner af andre flavivira, herunder dengue-virus36, og flere coronaviruser med stor virkning i menneskers og dyrs sundhed, såsom overførbare gastroenteritis coronavirus37 (tgev), Feline infektiøs peritonitis virus38 (fipv), Human coronavirus OC4339 (hcov-OC43), svær Akut respiratorisk syndrom coronavirus40 (SARS-CoV), og Mellemøsten respiratorisk syndrom coronavirus41 (MERS-COV), blandt andre.
I den her beskrevne protokol er der to vigtige trin, der bør tages i betragtning. En vigtig overvejelse er at identificere passende unikke restriktionssteder i det virale genom, der er fraværende i BAC plasmid. Hvis der ikke findes nogen passende begrænsnings steder, kan der genereres nye begrænsnings steder under klonings designet ved at indføre tavse nukleotidmutationer. Et andet vigtigt spørgsmål er, at BAC-plasmiderne kun er til stede i en eller to eksemplarer pr. celle, og derfor opnås der lave udbytter af BAC-plasmider med en høj kontaminering af bakteriel genomisk DNA ved hjælp af standardprotokoller designet til høj-og medium-kopi-nummer Plasmids. Dette potentielle problem er let at overvinde ved hjælp af store kultur mængder og rense BAC plasmid med et kommercielt kit specielt udviklet til BAC rensning.
Sammenfattende har vi udviklet en kraftig ZIKV reverse genetisk tilgang baseret på brugen af en BAC, der kunne tilpasses til at generere stabile og fuldt funktionelle infektiøse cDNA-kloner af andre positive-strandede RNA-vira for at lette studiet af biologi af disse virus og udvikling af vacciner og/eller lette identifikationen af antivirale lægemidler.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Carla Gómez for hendes tekniske assistance i BAC cDNA Clone generation og Snezhana Dimitrova for at hjælpe med video forberedelsen. Dette arbejde blev delvis støttet af tilskud fra det spanske økonomi-og konkurrence ministerium (MINECO, Grant Number BFU2016-79127-R) til F.A.T. og de nationale institutter for sundhed (NIH, Grant nummer 1R21AI120500) til L.M.S. og F.A.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Molecular Biology Reagents | |||
| Afe I | New England BioLabs | R0652S | 10,000 Units/mL |
| AmpliTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | N8080161 | 5,000 Units/mL |
| ApaL I | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/mL |
| Asc I | New England BioLabs | R0558S | 10,000 Units/mL |
| BamH I | New England BioLabs | R0136S | 10,000 Units/mL |
| BstB I | New England BioLabs | R0519S | 20,000 Units/mL |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| ElectroMAX DH10B Cells | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 18290015 | Electocompetent DH10B cells |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm | Bio-Rad | 165-2086 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | Flamable |
| Isopropanol | Merck | 109634 | Flamable |
| Large-Construct Kit (10) | QIAGEN | 12462 | For high-purity BAC preparation |
| LB Broth | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 12780029 | Can be homemade as well |
| LB with Agar | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 22700041 | Can be homemade as well |
| Methanol | Merck | 106009 | Flamable |
| Mlu I | New England BioLabs | R0198S | 10,000 Units/mL |
| Oligonucleotides | IDT | N/A | |
| Plasmid pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
| Plasmid Midi Kit (25) | QIAGEN | 12143 | For midle-scale preparation of BAC plasmids |
| Pml I | New England BioLabs | R0532S | 20,000 Units/mL |
| Polypropylene tubes (10 mL) | DeltaLab | 175724 | Other commercial sources are acceptable |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (150) | QIAGEN | 20021 | Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb |
| Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 Units/mL |
| SOC Medium | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 15544034 | Can be homemade as well |
| Synthesis of cDNA fragments | Bio Basic | N/A | |
| T4 DNA Ligase | Sigma-Aldrich (Roche) | 10481220001 | 1,000 Units/mL |
| 2. Cell Culture Reagents | |||
| 6-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 140675 | |
| 12-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 150628 | |
| 24-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 142485 | |
| Agar Noble | VWR | 214230 | |
| Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody | Varies | N/A | |
| Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody | Varies | N/A | |
| Cell Culture Dishes (100 mm x 21 mm) | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 172931 | |
| Conical Tubes (15 mL) | VWR | 525-0150 | |
| Conical Tubes (50 mL) | VWR | 525-0155 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Toxic and carcinogenic |
| DEAE-Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11995065 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific (HyClone)) | SV30160.03 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Toxic and carcinogenic |
| L-Glutamine | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 25030081 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 11668019 | Transfection reagent |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11140035 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 31985070 | Transfection medium |
| Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 | BEI Resources | NR-50327 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | Toxic and carcinogenic |
| PBS | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 14190144 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 15140122 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | P10144 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories Inc | PK-4010 | Avidin/biotin-based peroxidase kit |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | |
| ZIKV E Protein mAb 1176-56 | BioFront Technologies | BF-1176-56 | |
| 3. Equipment | |||
| Agarose Gel Electrophoresis System | Bio-Rad | 1704468 | Other commercial sources are acceptable |
| Class II Biosafety CO2 Cabinet | Varies | N/A | Other commercial sources are acceptable |
| Desktop Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| Fluorescence Microscope | Varies | N/A | |
| High-speed Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | Other machines are acceptable |
| SimpliAmp Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | A24811 | Other machines are acceptable |
| Vortexer | Varies | N/A |
References
- Friedrich, M. J. WHO Calls Off Global Zika Emergency. JAMA. 317 (3), 246 (2017).
- Sirohi, D., et al. The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 352 (6284), 467-470 (2016).
- Lindenbach, B. D., Murray, C. J., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer | Lippincott Williams & Wilkins. 712-748 (2013).
- Boeuf, P., Drummer, H. E., Richards, J. S., Scoullar, M. J., Beeson, J. G. The global threat of Zika virus to pregnancy: epidemiology, clinical perspectives, mechanisms, and impact. BMC Medicine. 14 (1), 112 (2016).
- Simpson, D. I. Zika virus infection in man. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Campos, G. S., Bandeira, A. C., Sardi, S. I. Zika Virus Outbreak, Bahia, Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1885-1886 (2015).
- Cao-Lormeau, V. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Costello, A., et al. Defining the syndrome associated with congenital Zika virus infection. Bulletin of the World Health Organization. 94 (6), 406-406A (2016).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
- do Rosario, M. S., et al. Guillain-Barre Syndrome After Zika Virus Infection in Brazil. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 95 (5), 1157-1160 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection during Pregnancy in Mice Causes Placental Damage and Fetal Demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. The New England Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
- Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome. PLOS ONE. 6 (3), e18197 (2011).
- Aubry, F., Nougairede, A., Gould, E. A., de Lamballerie, X. Flavivirus reverse genetic systems, construction techniques and applications: a historical perspective. Antiviral Research. 114, 67-85 (2015).
- Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. Journal of Virology. 85 (6), 2927-2941 (2011).
- Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Advances in Virus Research. 53, 183-207 (1999).
- Avila-Perez, G., Nogales, A., Martin, V., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetic Approaches for the Generation of Recombinant Zika Virus. Viruses. 10 (11), (2018).
- Annamalai, A. S., et al. Zika Virus Encoding Nonglycosylated Envelope Protein Is Attenuated and Defective in Neuroinvasion. Journal of Virology. 91 (23), (2017).
- Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host & Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
- Liu, Z. Y., et al. Characterization of cis-Acting RNA Elements of Zika Virus by Using a Self-Splicing Ribozyme-Dependent Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
- Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
- Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
- Deng, C. L., et al. Recovery of the Zika virus through an in vitro ligation approach. Journal of General Virology. 98 (7), 1739-1743 (2017).
- Widman, D. G., et al. A Reverse Genetics Platform That Spans the Zika Virus Family Tree. mBio. 8 (2), (2017).
- Munster, M., et al. A Reverse Genetics System for Zika Virus Based on a Simple Molecular Cloning Strategy. Viruses. 10 (7), (2018).
- Zhao, F., et al. Negligible contribution of M2634V substitution to ZIKV pathogenesis in AG6 mice revealed by a bacterial promoter activity reduced infectious clone. Scientific Reports. 8 (1), 10491 (2018).
- Atieh, T., Baronti, C., de Lamballerie, X., Nougairede, A. Simple reverse genetics systems for Asian and African Zika viruses. Scientific Reports. 6, 39384 (2016).
- Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497 (Supplement C), 157-162 (2016).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (1), (2017).
- Setoh, Y. X., et al. De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case. mSphere. 2 (3), (2017).
- Marquez-Jurado, S., et al. An Alanine-to-Valine Substitution in the Residue 175 of Zika Virus NS2A Protein Affects Viral RNA Synthesis and Attenuates the Virus In Vivo. Viruses. 10 (10), (2018).
- Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Wang, K., Boysen, C., Shizuya, H., Simon, M. I., Hood, L. Complete nucleotide sequence of two generations of a bacterial artificial chromosome cloning vector. BioTechniques. 23 (6), 992-994 (1997).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Research. 180, 12-22 (2014).
- Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5516-5521 (2000).
- Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. Journal of Virology. 86 (11), 6258-6267 (2012).
- St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. Journal of Virology. 80 (7), 3670-3674 (2006).
- Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. Journal of Virology. 80 (21), 10900-10906 (2006).
- Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. mBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
- Jamsai, D., et al. Targeted modification of a human beta-globin locus BAC clone using GET Recombination and an I-Scei counterselection cassette. Genomics. 82 (1), 68-77 (2003).
- Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73 (1), 56-65 (2001).
- Tischer, B. K., von Einem, J., Kaufer, B., Osterrieder, N. Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli. BioTechniques. 40 (2), 191-197 (2006).
