Summary
Недавняя эпидемия вируса Зика подчеркивает важность разработки обратных генетических подходов к разработке вакцин и/или терапевтических стратегий. Здесь мы описываем протокол по спасению инфекционного рекомбинантного вируса Зика от полнометражного клона кДНК, собранного в бактериальной искусственной хромосоме под контролем человека цитомегаловируса немедленного раннего промоутера.
Abstract
Связь инфекции вируса Зика (ЗИКВ) с неврологическими осложнениями во время недавней всемирной вспышки и отсутствие одобренных вакцин и/или противовирусных препаратов подчеркнула настоятельную необходимость разработки обратных генетических систем ЗИКВ для облегчения изучение биологии ЗИКВ и развитие терапевтических и/или профилактических подходов. Однако, как и в других флавивирусов, генерации полнометражных инфекционных клонов кДНК ЗИК было затруднено из-за токсичности вирусных последовательностей во время его усиления в бактериях. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали нетрадиционный подход, основанный на использовании бактериальных искусственных хромосом (БАК). Используя этот подход, полноформатная копия cDNA штамма ЗиКВ Rio Grande do Norte Natal (ЗИКВ-РГН) генерируется из четырех фрагментов синтетической ДНК и собрана в однокопительную плазмиду pBeloBAC11, накоторойреню под контролем цитомегаловируса человека (CMV) немедленного раннего промоутера. Собранный клон BAC cDNA стабилен во время распространения бактерий, а инфекционный рекомбинантный (r) ЗИКВ восстанавливается в клетках Веро после трансфекции клона BAC cDNA. Описанный здесь протокол обеспечивает мощный метод для генерации инфекционных клонов флавивирусов, в том числе ЗИКВ, и других вирусов РНК с положительной нити, особенно с большими геномами, которые имеют проблемы со стабильностью во время бактериальных распространение.
Introduction
ЗИКВ является комарами, передаваемыми в род флавивирусов в семье Flaviviridae, которая в настоящее время представляет собой глобальную чрезвычайную ситуацию в области общественного здравоохранения1. Как и другие флавивирусы, ЗИКВ является окутанным вирусом РНК с icosahedral-подобной структуры, которая содержит положительный смысл, одноцепочечная молекула РНК около 10,8 кб (Рисунок 1)2. Вирусный геном кодирует большой полипротеин примерно 3423 аминокислот, которые обрабатываются вирусными и клеточными протеазами в три структурных белка (капсида ,C, premembrane/membrane »prM/M», и конверт (E) которые участвуют в формировании вирусных частиц и семи неструктурных (NS) белков (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5), которые участвуют в репликации генома, сборке вируса и уклонении от иммунного ответа хозяина(рисунок 1)3.
Исторически, инфекция ЗИКВ была связана с легкой лихорадочней4,5. Тем не менее, взрывоопасная недавняя пандемия инфекций ЗИКВ по всей южной и центральной Америке, южной части Тихого океана и Карибского бассейна6,7,8, и его связь с возникновением синдрома Гийена-Барре и микроцефалия9,10,11,12,13, изменили историческое восприятие и потенцировал актуальность ЗИКВ как важный человеческий патоген. В этом смысле разработка молекулярных инструментов, таких как инфекционные клоны кДНК, облегчит изучение вирусного патогенеза и разработку генетически определенных вакцин и выявление противовирусных препаратов для лечения инфекции ЗИКВ. Как описано для других флавивирусов, генерации инфекционных клонов ЗИКВ трудно из-за присутствия загадочных бактериальных промоутеров в вирусном геноме14, которые позволяют вытекающее выражение токсичных вирусных белков во время распространения клоны кДНК в бактериях с использованием стандартных плазмидов высокого количества копий15,16,17. Для решения этой проблемы токсичности, несколько нетрадиционных подходов были успешно реализованы в течение последних двух лет18. Они включают в себя использование низкой копии числа плазмиды19,20, вставка интронов нарушить токсичных областей21,22,23, в пробирке перевязки фрагментов кДНК 24 , 25, мутационное глушиние загадочных бактериальных промоутеров, присутствующих в вирусном геноме26,27, инфекционные субгеномные ампликоны (ISA)28,29, метод сборки Гибсона30 , и использование круговой реакции расширения полимеразы (CPER)31.
В этом виде мы описываем подробный протокол для разработки полнометражного клона кДНК штамма ЗИКВ ЗИКВ-RGN13, используя BAC для преодоления проблемы токсичности, и спасение инфекционных r'iKV путем прямого трансфекции клона BAC cDNA в Веро клетки32, клеточная линия, одобренная Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) для разработки вакцин для человека33. В этой системе, полнометражный cDNA копия вирусного генома собирается в BAC плазмид pBeBAC1111 34 (Рисунок 2A), с низким числом копий плазмида (от одного до двух копий на клетку), полученных от Escherichia coli F-фактор35, которая сводит к минимуму токсичность флавивирусных последовательностей во время его распространения в бактериях. КДНК генома ЗИКВ собирается в pBeloBAC11 под контролем человека CMV немедленного раннего промоутера, чтобы позволить выражение вирусной (v) РНК в ядре транс-инфицированных клеток клеточной РНК-полимеразы II, и в боком в 3'-конец гепатитом дельта-вирус (HDV) рибоцим (РЗ), а затем последовательности гормона роста крупного рогатого скота (BGH) прекращения и полиаденилационных сигналов для производства синтетических РНК подшипник подлинных 5'- и 3'-концы вирусного генома, соответственно (Рисунок 2B). Эта система, запущенная кДНК, приводит к внутриклеточному выражению закрытой вирусной РНК, что позволяет восстановить инфекционные ЗИКВ без необходимости в шаге транскрипции in vitro. Подход BAC обеспечивает мощную методологию, применимую к построению стабильных и полностью функциональных инфекционных клонов кДНК для других флавивирусов, а также других положительно-stranded РНК-вирусов36,37, 38,39,40,41.
Protocol
1. Строительство инфекционного клона КДН ЗИК в БАК
ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия сборки ЗИКВ в БАК описана для штамма RGN13 (номер присоединения KU527068)(рисунок 2).
- Выберите уникальные места ограничения надлежащим образом расположены в вирусном геноме, которые отсутствуют в плазмидном pBeBAC11(рисунок 2A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для ЗИКВ-РГН были выбраны сайты ограничения Pml I, Afe I и BstB I (геномные позиции 3347, 5969 и 9127 соответственно). В случае, если в вирусном геноме отсутствуют соответствующие места ограничения, создаются новые места ограничения, вводя в вирусный геном мутации нуклеотидов во время конструкции фрагмента кДНК. - Генерировать путем химического синтеза четыре фрагмента кДНК, охватывающих полнометражный геном (от 1 до No 4), в окружении промоутера CMV на 5'-конец и HDV РЗ, BGH прекращения, и полиаденилации последовательностей на 3'-конец ( Рисунок 2B). Каждый фрагмент должен быть окружен выбранными участками ограничения (шаг 1.1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагмент No1 используется в качестве костяка для клонирования остальных фрагментов в pBeloBac11. Для этого он должен содержать промоутер CMV человека и должен быть окружен в 5'end ApaL I (клонировать этот фрагмент в pBeloBAC11) и Asc I (отсутствует в вирусном геноме), а в 3'end по местам ограничения, выбранным для сборки инфекционного клона (Pml I , Afe I, и BstB I), а затем Mlu I (отсутствует в вирусном геноме) и BamH I (клонировать этот фрагмент в pBeBAC11). Фрагмент No4 должен содержать геномную область от последнего выбранного места ограничения (BstB I) до конца вирусного генома, за которым следуют HDV РЗ, прекращение BGH и последовательности полиаденилации, а также место ограничения Mlu I(рисунок 2B). Кроме того, фрагменты кДНК (No1-No4) могут быть получены путем сочетания стандартных реакций цепи полимеразы обратной транскриптазы (РТ-ПХР) и перекрывающихся ПХР с использованием специфических олигонуклеотидов. - Соберите инфекционный клон кДНК путем последовательного клонирования фрагментов No 1 до No 4 в pBeloBAC11 (Рисунок 2B).
- Дайджест pBeloBAC11 плазмида и фрагмент No 1 с ApaL I и BamH I. Для этого смешайте 2 мкг плазмиды pBeloBAC11 или 1 мкг фрагмента No1 с 10 qL 10x буфера реакции, 20 единиц каждого фермента, и вода, чтобы достичь окончательного объема 100 зЛ. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию на 2 ч.
- Дефосфорилат вектор BAC с использованием щелочной фосфатазы креветок (SAP). С этой целью добавьте 2,5 л (2,5 единицы) SAP к переваренных BAC и инкубировать при температуре 37 градусов по Цельсию на 1 ч. Тепло-инактивировать SAP путем инкубации при температуре 75 градусов по Цельсию в течение 15 мин.
- Очистите дефосфорилированный вектор BAC и фрагмент No1 агарозным гелем электрофоресисом с помощью коммерческого комплекта для очистки геля, оптимизированного для очистки фрагментов ДНК размером более 10 кб (см. ТаблицуМатериалов).
- Выполните реакцию перевязки для генерации плазмиды (p)BAC-No1. С этой целью смешайте 150 нг очищенного переваренного вектора BAC с очищенной вставкой с использованием молярного соотношения векторк-вставить 1:3, 1,5 л 10x T4 ДНК лигаз буфера, содержащего 10 мМ АТФ, одну единицу T4 ДНК лигаза, и воды до окончательного объема 15 ql.
- Инкубация перевязочной смеси в течение 20 ч при 16 градусах Цельсия. Как контроль реакции перевязки, выполнять параллельно перевязки реакции без вставки. Тепло инактивировать лигаза путем инкубации при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае тупых ДНЯ инкубировать реакцию перевязки в течение 20 ч при 14 градусах Цельсия. Из-за большого размера вектора BAC(рисунок 2A),важно использовать большие количества вектора и вставки, чем перевязки с использованием обычных плазмидов для того, чтобы увеличить эффективность перевязки. - Преобразование 50 кЛ электрокомпетентных клеток E. coli DH10B с 2 ql реакции перевязки (шаг 1.3.5) путем электропорации (25 кФ емость, 2,5 кВ, и 100 сопротивление), используя электропорации кювет, оснащенный электродами, расположенными с интервалом 0,2 см, следуя стандартным протоколам.
- Перенесите клетки в полипропиленовый трубу с 1 мл со средней soC (2% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,05% NaCl, 2,5 мМ ККЛ, 10 мкм MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкозы No 7,0) и нависают их при 37-C за 1 ст. 2000 000 г. Плита клетки на бульон Лурия (LB) агар пластины, содержащие 12,5 мкг /мл хлорамфеникол и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в течение 16 ч.
- Выберите от 8 до 12 бактериальных колоний, сделать реплику на свежей пластине Агар LB, содержащей 12,5 мкг/мл хлорамфеникол, и проверить, содержат ли они правильную вставку путем прямого анализа ПЦР с использованием конкретных олигонуклеотидов.
- Выберите положительную колонию из реплики пластины, вырастить его в 100 мл LB, содержащий 12,5 мкг/мл хлорамфеникол, и изолировать BAC cDNA методом щелочной лиза с использованием коммерческого плазмида миди комплект, следуя рекомендации по очистке больших плазмиды с низким уровнем копирования(см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: BAC cDNA, подготовленный этим методом, может быть загрязнен до 30% бактериальной геномной ДНК, но он подходит по качеству для выполнения анализа ограничений, секвенирования и клонирования. В зависимости от размера BAC, урожайность 4-6 мкг плазмида BAC может быть получена. - Проверить генетическую целостность клонированной кДНК путем анализа ограничений. Дайджест 500 нг pBAC-No 1 плазмида с Asc I и Pml I при 37 КК в течение 1 ч и подтвердите наличие фрагмента No1 с помощью геля электрофореса. Чтобы еще больше подтвердить, что нежелательные мутации не были введены, последовательность вставки с конкретными олигонуклеотидов.
- Начиная с плазмидного pBAC-No1, содержащего выбранные места ограничения (Pml I, Afe I, BstB I, и Mlu I), последовательно клонировать фрагменты От 2 до No 4 для создания полнометражных инфекционных клонов кДНК pBAC-IKV (Рисунок 2B), после аналогичных экспериментальных подходы, как описано выше для фрагмента No1 (шаги 1.3.1-1.3.10).
2. Подготовка высокой чистоты пБАК-ЗИКВ для спасения инфекционного рЗИКВ
ПРИМЕЧАНИЕ: Крупномасштабная подготовка ультрачистого инфекционного клона pBAC-IKV, пригодного для трансфекции и спасения инфекционных вирусов, осуществляется щелочным лизисом с коммерческим комплектом, специально разработанным для очистки BAC (см. таблицу Материалы). Комплект должен включать в себя АТФ-зависимый шаг пищеварения, который удаляет бактериальное геномное загрязнение ДНК, позволяя изоляцию BAC cDNA со сортом чистоты, аналогичной той, которая получена методом хлорида цезия.
- Выращивайте одну колонию E. coli DH10B, несущую инфекционный клон pBAC-ЗИКВ в 5 мл среды LB, содержащей 12,5 мкг/мл хлорамфеникола при 37 градусах по Цельсию на 8 ч с нежной тряской (200-250 об/мин).
- Добавьте 1 мл бактериальной культуры (шаг 2.1) до 500 мл LB с 12,5 мкг/мл хлорамфеникол в 2 l колбу и расти клетки на 37 градусов по Цельсию для 14-16 ч (до OD600 0,6-0,8).
ПРИМЕЧАНИЕ: Богатые broths, such as Потрясающий broth (TB), могут произвести весьма высокую плотность клетки, приводящ к в более низком выходе и меньше чистоте cDNA BAC. - Очистите BAC инфекционных клонков cDNA щелочной lysis с помощью коммерческого комплекта, специально разработанный для очистки BAC, в соответствии со спецификациями производителя (см. таблицу материалов). Держите очищенную кДНК BAC при 4 градусах Цельсия. В зависимости от размера BAC, урожайность 30 мкг ультрачистого клона BAC cDNA может быть получена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не сушите гранулы ДНК более 5 мин, так как пересыханка затруднит растворение кДНК BAC. Из-за большого размера клона BAC cDNA, избегайте вихря или пипетки, чтобы предотвратить плазмидное стрижку.
3. Спасение Инфекционного r'IKV от клона BAC cDNA путем трансфекции клеток Веро
ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекционные r'ЗИКВ восстанавливается трансфекцией клеток Веро с клоном pBAC-ЗИКВ cDNA, используя коммерческий катионный липидный трансфекционный реагент (см. ТаблицуМатериалов; Рисунок 3).
- За день до трансфекции тарелка на 6-колодцах 5 x 105 веро-клеток/хорошо в среде роста (модифицированная среда Орла DMEM, дополненная 5% фетальной сывороткой крупного рогатого скота ,FBS), 2 мМ L-глютамина и 1% несущественными аминокислотами) антибиотиками без антибиотиков поднять 90% конфлюентных клеточных монослойк к моменту трансфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем выполнять вирус спасает в триплиц. -
Равноагритная сыворотка-уменьшенная среда (см. таблицу материалов) при комнатной температуре и подготовка трансфекционных смесей в стерильных микрофуговых трубках для каждого образца трансфекции следующим образом.
- Добавьте 4 мкг клона BAC cDNA в 250 л сыворотки с пониженной среды и тщательно перемешайте, избегая вихря, чтобы предотвратить плазмидную стрижку.
- В отдельной трубке разбавить 12 л трансфекционного реагента (1 мг/мл) (см. таблицуматериалов) в 250 л сыворотки сниженной среде, перемешать путем вихря, и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Комбинат разбавленных BAC cDNA и трансфекционного реагента (с 1:3 соотношение ДНК: трансфекционный реагент), тщательно перемешать, избегая вихря, и инкубировать при комнатной температуре в течение 20-30 мин.
- Во время инкубационного периода BAC cDNA/трансфекционного реагента, мыть клетки Веро со средой роста без антибиотиков и оставить клетки в 1 мл свежей среды без антибиотиков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление антибиотиков в процессе трансфекции может снизить эффективность трансфекции. - Распределите dropwise 500 qL смеси РЕагента BAC cDNA/transfection (шага 3.2.3) на клетки Vero, смешайте их путем качая плиту назад и вперед, и инкубировать клетки в 5% CO2 увлажненный инкубатор при 37 C для 6h.
- Удалить трансфекционную среду, добавить 2 мл свежей среды роста с антибиотиками (100 U/mL пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина), инкубировать клетки в 5% CO2 увлажненный инкубатор при 37 градусов по Цельсию, и проверить каждый день для индукции цитопатический эффект (CPE ).
ПРИМЕЧАНИЕ: ЗИКВ CPE довольно выражен в клетках Веро и характеризуется наличием округлых и двухразовых клеток, которые отделяются и плавают в супернатанте тканевой культуры. - Сбор aliquots (100 qL) из Vero клеточной ткани культуры супернатантов (шаг 3,5) каждые 24 ч, чтобы определить эффективность восстановления вируса путем оценки присутствия ЗИКВ с помощью стандартного зубного налета анализ на свежих клетках Веро(Рисунок 4A).
- После четырех-шести дней трансфекции, когда CPE составляет около 50%-75%(Рисунок 4B), собирать ткани культуры супернационантов в 15 мл конических труб и центрифуги на 2000 х г в течение 10 мин при 4 кВ для удаления клеточного мусора.
- Урожай супернационантов, содержащих r'IKV и отбросить клеточные гранулы. Aliquot супернатант в криотрубах и хранить их при -80 градусах по Цельсию, чтобы еще больше подтвердить наличие спасенных рЗИКВ.
4. Титрация Восстановленного РЗИКВ
- За день до титрации, семена на 12-наилучшим истолковом пластинах 2,5 х 105 веро клеток / хорошо в среде роста, чтобы поднять 90% конфлюентных монослойных клеток к моменту титрования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуем проводить титрирование восстановленного рЗИКВ в триплицатах. - Удалите аликвот супернатанта из морозильной камеры (шаг 3.8) и сделайте серийные 10-кратные разбавления в среде роста без FBS.
- Вымойте клетки Vero 2x фосфат-буферизированным сольниковым раствором (PBS) и добавьте 200 Л/хорошо каждого разбавления вируса в тройном. Поместите тарелки в 5% CO2 увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия и рок каждые 15 минут в течение 90 минут адсорбции период.
- Удалить вирусный инокулум, наложить клетки с 2 мл среды роста, содержащей 2% FBS, 1% DEAE-dextran, и 0,6% Агар Благородный, и инкубировать при 37 КК под 5% CO2 в течение 3-4 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать агарозу, метилцеллюлозу или другие накладные носители. Время для правильного образования бляшек будет меняться в зависимости от используемой накладки и штамма ЗИКВ. -
Исправьте зиКВ-инфицированные клетки с 1 мл/коло 4% формальдегида, разбавленного в PBS при комнатной температуре в течение 1 ч, удалите накладку и визуализировать вирусные бляшки, окрашивая их 0,1% кристаллофийвой в 20% метанола при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Отбросьте кристаллфиолетовый, промойте 3x водой, дайте пластинам высохнуть и вручную подсчитайте бляшки(рисунок 4C,левая панель). Вирусный титр рассчитывается как бляшки, образующие единицы на миллилитр (PFU/ml).
-
Кроме того, вирусные бляшки могут быть визуализированы путем иммуно-спотовсирования с пан-флавивирус E белка мыши моноклональных антител (mAb) 4G2(Рисунок 4C, правая панель).
- Для оценки бляшек ЗИКВ путем иммуностоинга, после фиксации и удаления наложения агара, как описано выше (в шаге 4.5), мыть клетки 2x с PBS и permeabilize их инкубации с 200 Л / хорошо 0,5% Triton-X100 в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Удалите раствор пермяки, промойте клетки 3x с помощью PBS и заблокируйте их 200 Л/хорошо блокирующего раствора (10% FBS в PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие стандартные блокирующие решения (например, 2,5% BSA в PBS) могут быть использованы в этом шаге. - Удалите блокирующий раствор и инкубировать клетки с 200 Л/колодец панфлавивируса E белка mAb 4G2 разбавленного в блокирующем растворе (1 мкг/мл) в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие антитела mAb или поликлональные (pAb) могут быть использованы вместо 4G2 для иммуно-стирокирования и обнаружения вирусных бляшек. - Вымойте клетки 3x с PBS, и инкубировать их с 200 зл/л биотинилаированных анти-мышвторичных антител разбавленных (по рекомендации производителя) в блокирующем растворе в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия.
- Удалить вторичное антитело, мыть клетки 4x с PBS, и визуализировать вирусные бляшки с помощью авидуцина / биотина основе пероксидаза комплект следующие спецификации производителя (см. Таблица материалов).
5. Подтверждение успешного спасения РЗИКВ
ПРИМЕЧАНИЕ: Для дальнейшего подтверждения идентичности спасенного вируса, экспрессия белка ЗИКВ E анализируется иммунофлуоресценцией с помощью мыши mAb 1176-56, специфичного для белка ЗИКВ E (Рисунок 4D). Этот mAb специфичен для белка ЗИКВ E, в отличие от ситуации с панфлавивирусом E белка mAb 4G2 (шаг 4.6.3). Кроме того, личность вируса может быть подтверждена путем секвенирования.
- За день до иммунофлюоресценции анализа, семена охватывает в 24-ну хорошо пластин, содержащих 1 х 105 Vero клеток / хорошо в среде роста, чтобы поднять 90% слияние монослойных клеток к моменту инфекции.
- Вымойте клетки 2x с PBS и заразить их с множественностью инфекции (MOI) 0.5 PFU/cell спасенного вируса в среде роста без FBS (100 л/ну) в тройном. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в течение 90 мин.
- После вирусной адсорбции, удалить вирусный инокулум, добавить 0,5 мл свежей среды роста с 2% FBS, и инкубировать клетки в 5% CO2 увлажненный инкубатор при 37 градусов по Цельсию для 48 ч.
- Удалить ткань культуры супернатанта, исправить клетки с 150 Л / хорошо 4% параформальдегида в PBS в течение 20 мин при комнатной температуре, и permeabilize клеток с 150 Л / кололи 0,5% Тритон-X100 в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре.
- После удаления раствора пермяки и промывания клеток 3x с PBS, блокировать клетки с 150 Л / л / хорошо блокирующего раствора в течение 1 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сканирование клеток блокируется альтернативными блокирующими решениями (например, 2,5% BSA в PBS). - Удалите блокирующий раствор и инкубировать клетки с 100 л/колодец mAb 1176-56, специфический для белка ЗИКВ E, разбавленный в блокирующем растворе (1 мкг/мл) на 1 ч при 37 градусах Цельсия.
- Вымойте клетки 3x с PBS, инкубировать их при комнатной температуре в течение 1 ч с 100 л /хорошо Alexa Fluor 488-конъюгированных анти-мышь вторичного антитела разбавленной (после рекомендации производителя) в блокирующем растворе, мыть клетки широко с PBS, и инкубировать их с 150 Л/хорошо 4',6'-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; 1 мг/мл) разбавленной 1:200 в PBS при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Вымойте клетки 3x с PBS, установить крышки на антифадемонтаж монтажа среды (см. таблицу материалов), и анализ ировать образцы под флуоресцентным микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения храните образцы при 4 градусах Цельсия, защищенные от света.
6. Усиление и генерация вирусных запасов
ПРИМЕЧАНИЕ: После подтверждения личности спасенного вируса (раздел 5) усиливать вирус на клетках Веро и генерировать вирусные запасы для дальнейших исследований.
- Выращивайте клетки Vero в 100 мм х 21 мм пластин при 90% слиянии и заражайте их MOI 0,1 PFU/cell, как описано ранее.
- Когда CPE составляет около 75% (примерно 48-72 ч после инфекции), собирать ткани культуры супернатант в 50 мл конической трубки и центрифуги на 2000 х г в течение 10 минут при 4 кВ С, чтобы удалить клеточный мусор.
- Урожай супернатант, содержащий рЗИКВ и отбросить клеточные гранулы. Aliquot супернатант в криотрубах и хранить их при -80 градусах Цельсия.
- Удалить вирус aliquot из морозильной камеры и определить вирусный титр по налету, как описано ранее (раздел 4).
Representative Results
Описанный здесь протокол позволяет создать стабильные полноразмерные кДНК-инфекционные клоны С помощью BAC, чтобы свести к минимуму проблемы токсичности, связанные с несколькими флавивирными последовательностями. Эффективное восстановление инфекционного r'IKV от клона BAC cDNA может быть легко достигнуто после трансфекции восприимчивых клеток Веро(рисунок 2). Используя этот протокол, мы создали стабильный полноформатный клон кДНК штамма RGN32, последовательно клонируя четыре перекрывающихся фрагмента кДН в bac plasmid pBeloBAC1134 с использованием обычных методов клонирования и уникальных места ограничения, присутствующие в вирусном геноме(рисунок 2). Полнометражный клон cDNA был фланговым на 5'end человеческим промоутером CMV, чтобы позволить выражение vRNA в ядре трансинфицированных клеток, и в 3'-конце HDV РЗ, а затем BGH полиаденилации и прекращения последовательностей, для производства РНК, содержащих точный 3'-конец вирусного генома(рисунок 2). Стабильность бактерий генерируемого клона BAC cDNA, а также его легкая манипуляция с использованием стандартных рекомбинантных технологий ДНК, подчеркивает потенциал подхода BAC cDNA для быстрого и надежного поколения стабильных полноформатных клонов кДНК ЗИКВ и другие флавивирусы или положительно-мельные РНК-вирусы с нестабильными вирусными геномами.
После того, как клон BAC cDNA был собран(Рисунок 2), инфекционный вирус может быть легко восстановлен после прямого трансфекции восприимчивых клеток Веро с клоном BAC cDNA с использованием катионных липосом(Рисунок 3). Эта кДНК-запущенная система позволила внутриклеточное выражение ограниченv vRNA, что позволяет восстановление инфекционных вирусов без необходимости в пробирке транскрипции шаг. Используя этот подход, мы смогли спасти рЗИКВ-RGN с титрами выше, чем 106 PFU/mL на 5 дней послетрансфекции (Рисунок 4A). Кроме того, спасенный вирус индуцировал четкий CPE(Рисунок 4B),генерируемые однородные бляшки размером около 2 мм (рисунок4C),и его идентичность была подтверждена секвенированием (данные не показаны) и иммунофлюоресценции анализа с использованием mAb конкретных для белка ЗИКВ E, 1176-56(рисунок 4D). Данные In vitro показывают, что восстановленный рЗИКВ-РГН эффективно реплицируется в клетках Веро и до уровней, сравнимых с естественным изолятом ЗИКВ32 (данные не показаны). В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что инфекционные r'IKV могут быть спасены из полнометражных клонов кДНК, собранных в BAC.
Рисунок 1 : Организация генома ЗИКВ и структура вириона. (A) Организация генома: ЗИКВ содержит положительную одноцепочечную РНК, которая переводится как единый полипротеин. Переведенный полипротеин был расщепляется вирусными (стрелками) и протеазами-хозяевами (алмазами) для производства структурных белков капсида (C, синий), матрицы (M, коричневый) и окуна (E, green) и семи неструктурных белков (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5). 5' и 3' непереведенных регионов (UTRs) в конце вирусного генома указаны с черными линиями. (B) Вирион структуры: ЗиКВ virions были украшены E и M белков, закрепленных в липидный двуслойный с icosahedral-как структура. Под вирусной окуной находился вирусный нуклеокапсид, состоящий из белка С, связанного с вирусной геномной РНК. Эта цифра была адаптирована из Авила-Перес и др.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Сборка полноразмерного инфекционного клона кДНК В БАК. (A) Схематическое представление pBeloBAC11 BAC: Регулятивные гены parA, parB, parC, и repE,происхождение репликации F-фактора (OriS),устойчивый ген хлорамфеникол (Cmr),и лак Указано ген. Подчеркиваются соответствующие места ограничения, используемые для сборки инфекционного клона кДНК ЗИКВ. (B) Сборка полноразмерного инфекционного клона кДНК в pBeBAC11 BAC: Четыре перекрывающихся фрагментов ДНК (No1-No4), охватывающих весь геном ЗИКВ (рисунок1) и в окружении указанных мест ограничения, были созданы химическими синтез и последовательно клонированы в pBeloBAC11 для создания инфекционного клона qIN CDNA pBAC-IKV. Полнометражный инфекционная кДНК ЗИКВ была собрана под контролем человека цитомегаловируса немедленного раннего промоутера (CMV) и в окружении 3'end HDV рибозим (РЗ) и гормона роста крупного рогатого скота (BGH) прекращения и полиаденилаации последовательностей. Акронимы вирусных генов и регуляторных элементов описаны на рисунке 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Рабочий процесс для генерации r'iKV из клона BAC cDNA. Веро-клетки на 90% слияния были трансинфицированы в монослой с полнометражным инфекционным клоном кДНК pBAC-ЗИКВ (Рисунок 2) с использованием катионных липосом. В 4-6 дней посттрансфекции, когда CPE было очевидно, ткани культуры супернатанантов, содержащих r'ЗИКВ были собраны и оценены на наличие вируса(Рисунок 4) и используется для вирусного усиления в клетках Веро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Восстановление и экстракорпора характеристика РЗИКВ. (A) Спасение инфекционных r'ЗИКВ от клона BAC cDNA: Vero клетки на 90% слияния (6-ну хорошо пластины формата, трипликаты) были макет-трансинфицированы или трансфицированы с 4 мкг / хорошо пБАК-ЗИКВ (Рисунок 3), и в указанные дни посттрансфекции, вирус титры в ткани культуры супернациантов были определены доска анализ (PFU/mL). Бары ошибок указывают на стандартные отклонения от трех различных экспериментов трансфекции. Пунктирная черная линия указывает на предел обнаружения (50 PFU/mL). (B) Вирусные CPE: Веро клетки на 90% слияния (6-ну хорошо пластины формат, трипликатиты) были макет-инфицированных (вверху) или инфицированных (MOI 0,5 ПфУ / клетки) с r'iKV, и на 48 h послеинфекции, наличие CPE была оценена световой микроскопией. Шкала баров No 100 мкм. (C) Вирусный налет анализ и иммуно-пятно: Веро клетки на 90% слияния (12-ну хорошо пластины формате) были инфицированы r'IKV, и на 72 h после инфекции, вирусные бляшки были визуализированы кристаллно-фиолетовый окрашивания (слева) или иммунопятна ( справа) с помощью панфлавивируса E белка mAb 4G2. Шкала баров 5 мм. (D) Иммунофлуоресценция: Веро клетки на 90% слияния (24-ну хорошо пластины формата, трипликаты) были инфицированы (MOI 0,5 ПФУ / клетка) с r'iKV и, на 48 h послеинфекции, проанализированы иммунофлуоресценции с помощью mAb 1176-56, специфические для ЗИКВ E белок. Ядра клеток были окрашены DAPI. Отображается репрезентативное объединенное изображение инфицированных ЗИКВ клеток Веро. Белый квадрат в правом верхнем цвете представляет собой увеличенное изображение инфицированных ЗИКВ клеток Веро. Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Инфекционные клоны кДНК представляют собой важнейшие молекулярные инструменты для фундаментальных исследований РНК-вирусов и разработки вакцин и/или выявления противовирусных стратегий. Однако, для многих положительных-stranded РНК вирусов, в том числе флавивирусов, генерации инфекционных клонов кДНК трудно из-за нестабильности клонированных CDNAs при распространении в бактериях с использованием стандартных высокой копии числа плазмидов. В случае ЗИКВ и других флавивирусов, эта нестабильность в основном из-за вытекающей экспрессии токсичных вирусных белков от загадочных бактериальных промоутеров, присутствующих в вирусном геноме14,15,16,17 . Здесь мы описываем альтернативный и мощный протокол для создания стабильного полнометражного инфекционного клона кДНК ЗИК в виде единой плазмиды, основанной на использовании плазмидной плазмы BACp1134 (Рисунок 2A) для преодоления проблемы токсичности, использования CMV промоутер, чтобы выражение vRNA в ядре транс-инфицированных клеток, и HDV РЗ для генерации vRNAs с точными 3'-концы (Рисунок 2B). Используя этот метод, мы успешно создали полностью стабильный инфекционный клон штамма RGN, который позволяет эффективнои и надежное восстановление инфекционных r'ЗиКВ после прямого трансфекции восприимчивых клеток Веро (Рисунок 3 и Рисунок 4).
За последние несколько лет были предприняты огромные усилия для преодоления нестабильности, связанных с инфекционными клонами кДНК, и несколько подходов были успешно реализованы18,включая перевязку фрагментов кДН24 ,25, низкокопальные плазмиды19,20, инактивация загадочных бактериальных промоутеров путем введения молчаливых мутаций26,27, интрон вставка21, 22 Г. , 23, метод сборки Гибсон30, метод ISA28,29, и использование CPER31. Хотя эти подходы преодолевают проблему токсичности и полезны для генерации инфекционных клонов кДНК, некоторые из них являются трудоемкими и представляют ряд недостатков, включая необходимость перевязки и транскрипции, которые уменьшают вирус эффективность восстановления или введение большого количества молчаливых мутаций для инактивации загадочных бактериальных промоутер, которые могут повлиять на вирусный фитнес, среди других. Подход, описанный в этом протоколе, дает следующие преимущества. i) BAC плазмид pBeBAC1134 имеет строго контролируемую репликацию, сохраняя одну или две копии плазмида на клетку, что сводит к минимуму токсичность и позволяет стабильное обслуживание бактерий нестабильных cDNAs. ii) Распространение и модификация плазмидов BAC почти аналогичны обычным плазмидам, учитывая незначительные изменения, описанные в этом протоколе для манипулирования крупногабаритными фрагментами BAC-ДНК и низкокопированными плазмидов. Примечательно, что клон BAC cDNA также может быть изменен в e. coli с помощью красной рекомбинации системы42,43,44. iii) Использование CMV промоутер позволяет внутриклеточного выражения ограничена IKV vRNA и восстановления инфекционных вирусов, не требуя в пробирке транскрипции шаг. iv) Инфекционная рЗИКВ генерируется после прямого трансфекции восприимчивых клеток (например, Vero) с клоном BAC cDNA. Поскольку трансфекция ДНК в клетках млекопитающих более эффективна, чем трансфекция РНК, эффективность восстановления вируса с помощью подхода BAC выше, чем при использовании РНК-транскриптов, уменьшая количество проходов в клетках культуры для генерации вирусного запаса и, следовательно, ограничение введения нежелательных мутаций путем адаптации клеточной культуры.
Наконец, потенциал подхода BAC поддерживается успешным использованием этого метода (с небольшими изменениями) для разработки инфекционных клонов кДНК других флавивирусов, включая вирус денге36,и несколько коронавирусов с высоким воздействием в здоровье человека и животных, такие как трансмиссивный гастроэнтерит коронавирус37 (TGEV), кошачий инфекционный вирус перитонита38 (FIPV), коронавирус человека OC4339 (HCoV-OC43), тяжелый острый респираторный синдром коронавирус40 (SARS-CoV) и коронавирус ближневосточного респираторного синдрома41 (БВРС-КоВ), среди прочих.
В описанном здесь протоколе есть два важных шага, которые следует рассмотреть. Одним из важных соображений является выявление соответствующих уникальных мест ограничения в вирусном геноме, которые отсутствуют в плазмид BAC. Если отсутствуют адекватные места ограничения, новые места ограничения могут быть сгенерированы во время разработки клонирования путем введения бесшумных нуклеотидных мутаций. Другой важный вопрос заключается в том, что плазмиды BAC присутствуют только в одной или двух копиях на клетку, и, следовательно, низкие урожаи плазмидов BAC с высоким загрязнением бактериальной геномной ДНК получаются с помощью стандартных протоколов, предназначенных для высоко- и плазмиды среднего количества. Эта потенциальная проблема легко преодолена с помощью больших объемов культуры и очистки плазмида BAC с коммерческим комплектом, специально разработанным для очистки BAC.
Таким образом, мы разработали мощный обратный генетический подход ЗИКВ, основанный на использовании BAC, который может быть адаптирован для создания стабильных и полностью функциональных инфекционных клонов кДНК других положительно-stranded РНК-вирусов для облегчения изучения биологии этих вирусов и разработки вакцин и/или для содействия выявлению противовирусных препаратов.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Карлу Гомес за техническую помощь в генерации клонов BAC cDNA и Снежану Димитрова за помощь в подготовке видео. Эта работа была частично поддержана грантами от Министерства экономики и конкурентоспособности Испании (MINECO, грантовый номер BFU2016-79127-R) Ф.А.Т. и Национальных институтов здравоохранения (NIH, грант No 1R21AI120500) L.M.S. и F.A.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Molecular Biology Reagents | |||
| Afe I | New England BioLabs | R0652S | 10,000 Units/mL |
| AmpliTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | N8080161 | 5,000 Units/mL |
| ApaL I | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/mL |
| Asc I | New England BioLabs | R0558S | 10,000 Units/mL |
| BamH I | New England BioLabs | R0136S | 10,000 Units/mL |
| BstB I | New England BioLabs | R0519S | 20,000 Units/mL |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| ElectroMAX DH10B Cells | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 18290015 | Electocompetent DH10B cells |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm | Bio-Rad | 165-2086 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | Flamable |
| Isopropanol | Merck | 109634 | Flamable |
| Large-Construct Kit (10) | QIAGEN | 12462 | For high-purity BAC preparation |
| LB Broth | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 12780029 | Can be homemade as well |
| LB with Agar | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 22700041 | Can be homemade as well |
| Methanol | Merck | 106009 | Flamable |
| Mlu I | New England BioLabs | R0198S | 10,000 Units/mL |
| Oligonucleotides | IDT | N/A | |
| Plasmid pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
| Plasmid Midi Kit (25) | QIAGEN | 12143 | For midle-scale preparation of BAC plasmids |
| Pml I | New England BioLabs | R0532S | 20,000 Units/mL |
| Polypropylene tubes (10 mL) | DeltaLab | 175724 | Other commercial sources are acceptable |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (150) | QIAGEN | 20021 | Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb |
| Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 Units/mL |
| SOC Medium | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 15544034 | Can be homemade as well |
| Synthesis of cDNA fragments | Bio Basic | N/A | |
| T4 DNA Ligase | Sigma-Aldrich (Roche) | 10481220001 | 1,000 Units/mL |
| 2. Cell Culture Reagents | |||
| 6-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 140675 | |
| 12-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 150628 | |
| 24-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 142485 | |
| Agar Noble | VWR | 214230 | |
| Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody | Varies | N/A | |
| Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody | Varies | N/A | |
| Cell Culture Dishes (100 mm x 21 mm) | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 172931 | |
| Conical Tubes (15 mL) | VWR | 525-0150 | |
| Conical Tubes (50 mL) | VWR | 525-0155 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Toxic and carcinogenic |
| DEAE-Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11995065 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific (HyClone)) | SV30160.03 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Toxic and carcinogenic |
| L-Glutamine | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 25030081 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 11668019 | Transfection reagent |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11140035 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 31985070 | Transfection medium |
| Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 | BEI Resources | NR-50327 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | Toxic and carcinogenic |
| PBS | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 14190144 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 15140122 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | P10144 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories Inc | PK-4010 | Avidin/biotin-based peroxidase kit |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | |
| ZIKV E Protein mAb 1176-56 | BioFront Technologies | BF-1176-56 | |
| 3. Equipment | |||
| Agarose Gel Electrophoresis System | Bio-Rad | 1704468 | Other commercial sources are acceptable |
| Class II Biosafety CO2 Cabinet | Varies | N/A | Other commercial sources are acceptable |
| Desktop Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| Fluorescence Microscope | Varies | N/A | |
| High-speed Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | Other machines are acceptable |
| SimpliAmp Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | A24811 | Other machines are acceptable |
| Vortexer | Varies | N/A |
References
- Friedrich, M. J. WHO Calls Off Global Zika Emergency. JAMA. 317 (3), 246 (2017).
- Sirohi, D., et al. The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 352 (6284), 467-470 (2016).
- Lindenbach, B. D., Murray, C. J., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer | Lippincott Williams & Wilkins. 712-748 (2013).
- Boeuf, P., Drummer, H. E., Richards, J. S., Scoullar, M. J., Beeson, J. G. The global threat of Zika virus to pregnancy: epidemiology, clinical perspectives, mechanisms, and impact. BMC Medicine. 14 (1), 112 (2016).
- Simpson, D. I. Zika virus infection in man. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Campos, G. S., Bandeira, A. C., Sardi, S. I. Zika Virus Outbreak, Bahia, Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1885-1886 (2015).
- Cao-Lormeau, V. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Costello, A., et al. Defining the syndrome associated with congenital Zika virus infection. Bulletin of the World Health Organization. 94 (6), 406-406A (2016).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
- do Rosario, M. S., et al. Guillain-Barre Syndrome After Zika Virus Infection in Brazil. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 95 (5), 1157-1160 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection during Pregnancy in Mice Causes Placental Damage and Fetal Demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. The New England Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
- Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome. PLOS ONE. 6 (3), e18197 (2011).
- Aubry, F., Nougairede, A., Gould, E. A., de Lamballerie, X. Flavivirus reverse genetic systems, construction techniques and applications: a historical perspective. Antiviral Research. 114, 67-85 (2015).
- Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. Journal of Virology. 85 (6), 2927-2941 (2011).
- Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Advances in Virus Research. 53, 183-207 (1999).
- Avila-Perez, G., Nogales, A., Martin, V., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetic Approaches for the Generation of Recombinant Zika Virus. Viruses. 10 (11), (2018).
- Annamalai, A. S., et al. Zika Virus Encoding Nonglycosylated Envelope Protein Is Attenuated and Defective in Neuroinvasion. Journal of Virology. 91 (23), (2017).
- Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host & Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
- Liu, Z. Y., et al. Characterization of cis-Acting RNA Elements of Zika Virus by Using a Self-Splicing Ribozyme-Dependent Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
- Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
- Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
- Deng, C. L., et al. Recovery of the Zika virus through an in vitro ligation approach. Journal of General Virology. 98 (7), 1739-1743 (2017).
- Widman, D. G., et al. A Reverse Genetics Platform That Spans the Zika Virus Family Tree. mBio. 8 (2), (2017).
- Munster, M., et al. A Reverse Genetics System for Zika Virus Based on a Simple Molecular Cloning Strategy. Viruses. 10 (7), (2018).
- Zhao, F., et al. Negligible contribution of M2634V substitution to ZIKV pathogenesis in AG6 mice revealed by a bacterial promoter activity reduced infectious clone. Scientific Reports. 8 (1), 10491 (2018).
- Atieh, T., Baronti, C., de Lamballerie, X., Nougairede, A. Simple reverse genetics systems for Asian and African Zika viruses. Scientific Reports. 6, 39384 (2016).
- Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497 (Supplement C), 157-162 (2016).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (1), (2017).
- Setoh, Y. X., et al. De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case. mSphere. 2 (3), (2017).
- Marquez-Jurado, S., et al. An Alanine-to-Valine Substitution in the Residue 175 of Zika Virus NS2A Protein Affects Viral RNA Synthesis and Attenuates the Virus In Vivo. Viruses. 10 (10), (2018).
- Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Wang, K., Boysen, C., Shizuya, H., Simon, M. I., Hood, L. Complete nucleotide sequence of two generations of a bacterial artificial chromosome cloning vector. BioTechniques. 23 (6), 992-994 (1997).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Research. 180, 12-22 (2014).
- Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5516-5521 (2000).
- Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. Journal of Virology. 86 (11), 6258-6267 (2012).
- St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. Journal of Virology. 80 (7), 3670-3674 (2006).
- Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. Journal of Virology. 80 (21), 10900-10906 (2006).
- Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. mBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
- Jamsai, D., et al. Targeted modification of a human beta-globin locus BAC clone using GET Recombination and an I-Scei counterselection cassette. Genomics. 82 (1), 68-77 (2003).
- Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73 (1), 56-65 (2001).
- Tischer, B. K., von Einem, J., Kaufer, B., Osterrieder, N. Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli. BioTechniques. 40 (2), 191-197 (2006).
