Summary
Аортокавальная свища была создана путем прокола инфрапочечной аорты морин через обе стены в нижнюю полину вены, после чего возникла стеноз в ее оттоке через частичную перевязку нижней полы вены. Эта воспроизводимая модель может быть использована для изучения центрального венозного стеноза.
Abstract
Центральный венозный стеноз является важным фактором, способствующим артериовенозной фистулы (AVF) отказа. Модель murine AVF была модифицирована для создания частичной перевязки нижней полы вены (IVC) в оттоке свища, имитирующей центральный венозный стеноз. Вводятся технические аспекты этой модели. Аорта и IVC подвергаются воздействию, после разреза брюшной полости. Инфрапочечная аорта и IVC рассечены для проксимального зажима, а дистальная аорта подвергается проколу. IVC в средней точке между левой почечной вена и аортальной бифуркации тщательно расчленены, чтобы разместить 8-0 шов под IVC. После зажима аорты и IVC, AVF создается путем прокола инфрапочечной аорты через обе стены в IVC с 25 G иглы, а затем ligating 22 G внутривенных (IV) катетер и IVC вместе. Затем катетер удаляется, создавая воспроизводимый венозный стеноз без окклюзии. Аорта и IVC отменяются после подтверждения первичного гемостаза. Эта новая модель стеноза центральной вены проста в исполнении, воспроизводима и облегчит исследования по отказу AVF.
Introduction
Артериовенозные свищи (AVF) являются наиболее распространенными доступами для гемодиализа, с превосходной прокладкой и уменьшенной инфекцией по сравнению с другими доступными данными, такими как трансплантаты или центральные венозные катетеры. Тем не менее, до 60%AVF не созревают 1,2,3; недавний систематический обзор сообщил, что показатели первичной просачивания на 1 год были только 60%4. Стеноз вдоль венозного оттока преимущественно вызывает сбойсозревания AVF 5,6. Есть определенные характерные места, склонные к стенозу проксимальным к свищей: juxtaanastomotic сегмент качели для радиоцефалической фистулы, цефалическая область арки для брахиоцефалической свищи и центральной вены для свищей с ранее размещены ipsilateral субклавиана или внутренних яремных вен катетеров7,8.
Центральный венозный стеноз часто бессимптомно у пациентов без AVF, но может вызвать отек ипсилтеральной конечности ввенальной гипертензии, а также отказ созревания свищей, когда оспаривается поток свищей9. Патофизиология центрального венозного стеноза, скорее всего, связана с воспалением и каскадом активированной коагуляции после размещения устройства. Кроме того, постоянное движение кончика катетера, а также увеличение потока из свища может изменить напряжение сдвига, в результате чего осаждение тромбоцитов и венозной стенки утолщение10. Чтобы понять основные механизмы, лежащие в основе отказа AVF, вызванного центральным венозным стенозом, требуется модель животного, имитирующая центральный венозный стеноз с AVF.
Мы создали модель murine aortocaval свищей, которая проста в исполнении и осваивает и резюмирует клинический курс человека AVF. 11 Мы применили концепции и технику нескольких ранее созданных моделей мурин для создания новой модели murine AVF с венозным стенозом. Мы вводим модель морин-аортокаялсссса со стенозом IVC в свищей оттока, которая может быть использована для изучения центрального венозного стеноза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились с одобрения Комитета по институциональному уходу и использованию животных при йельском университете (IACUC).
1. Анестезия и предоперационные процедуры
- Стерилизовать все хирургические инструменты и материалы путем автоклавирования. Включите тепловую поддержку, чтобы быть уверенным, что оно теплое (40-42 градусов по Цельсию).
- Поместите 9-11-недельную мышь C57BL/6 в акриловую индукционную камеру и обезождените ее испаряемыми 2,5% изофлураном и 0,8 л/мин кислородом. Индукция анестезии занимает около 3 мин.
- Удалите мышь из камеры. Подтвердите глубокую плоскость анестезии по ноге щепотку, уха и хвост ущипнуть. Поместите мышь в положение на спине на хирургической области и доставить 2,5% изолюран с помощью силиконовой маски. Обеспечить бупренорфин на 0,1 мг/кг анальгетика и применять офтальмологическую мазь на глаза.
- Удалите мех с брюшной стороны шеи в нижнюю часть живота с помощью Nair, удаления волос.
- Очистите и дезинфицировать хирургическое место с помощью двухступенчатого скраб с 10% повид-йод и 70% изопропанол. Нанесите хирургическую драпировку.
2. Оперативные процедуры
-
Воздействие зажима и прокола сайтов
- Приготовьте стерильные инструменты и носите стерильные перчатки для поддержания бесплодия на протяжении всей операции.
- Сделайте кожу глубокой средней линии разреза брюшной полости с скальпелем от уровня нижней кромки печени чуть выше лобка. Вырезать через мускулатуру с ножницами, чтобы открыть брюшной полости.
- Вставьте втягиватель в брюшную полость и вытащите недра в правую сторону. Держите их влажными, обернув в солевой пропитанной марлей. Retreive мочевого пузыря и семенных пузырьков (у мышей мужского пола) и вытащить их на каудальной стороне. Вскрыть мезентерии между прямой кишкой и ретроперитонеум с микро-иглы держатель, чтобы получить полное представление о аорте и IVC.
- Вскрыть инфрапочечную аорту и IVC ан блок из боковой и пододнейающих окружающих ретроперитонеальных тканей с микро-иглы держатель для перекрестного зажима их вместе.
- Вскрыть окружающие ткани, чтобы разоблачить место прокола аорты примерно на трех четвертях расстояния от левой почечной вены до аортальной бифуркации.
-
Вскрытие IVC
- Вскрыть между инфра-почечной IVC и аорты сразу дистальвого в левую почечную вену. Расширить рассечение дистралино на полпути между левой почечной вены и аортальной бифуркации, так что инфра-почечной IVC, как вверх и вниз по течению до стеноза, можно наблюдать после операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блант вскрытие между IVC и аорты должно быть выполнено от немедленно дистальной к левой почечной вены, где соединительной ткани между IVC и аорты является относительно свободным. - Сделайте окно, чтобы отделить IVC от аорты на этом уровне и вскрыть IVC из окружающих тканей. Поместите 8-0 швы монофиламента полиамида во-первых под IVC и аорты(Рисунок 1A),а затем положение шов под только IVC (Рисунок 1B), потянув шов конца через окно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку IVC является хрупким, рассечение вдоль аорты адвентиции полезно сделать окно, чтобы предотвратить IVC, а также небольшие IVC или аорты ветви от повреждения. Если кровотечение происходит, это может быть неконтролируемым. Если IVC имеет различные боковые ветви, поместите 8-0 шов дистически ветви.
- Вскрыть между инфра-почечной IVC и аорты сразу дистальвого в левую почечную вену. Расширить рассечение дистралино на полпути между левой почечной вены и аортальной бифуркации, так что инфра-почечной IVC, как вверх и вниз по течению до стеноза, можно наблюдать после операции.
-
Создание AVF
- Согните иглу 25 G под углом 45–60 градусов в точке 4 мм от кончика иглы.
- Зажим инфрапочечной аорты и IVC, применяя микрохирургический клип.
- Поверните аорту медиально и caudally, захватив соединительной ткани, окружающие бифуркации подвергать прокол аорты растягивается его немного к брюшной стороне.
- Удерживая аорту в подходящем положении, проколчерез аорту в IVC с помощью подготовленной 25 G иглы(рисунок 1С).
- Отпустите аорту и накройте место прокола окружающими тканями, подтягивая с левой стороны аорты. Выняйте иглу и нажмите на место прокола осторожно с помощью ватного наконечником тампоном для гемостаза.
-
Создание стеноза IVC
- Поместите кончик 22 G IV катетера (см. таблицуматериалов) на IVC продольно. Ligate IV катетер и IVC вместе с 8-0 шов(рисунок 1D), а затем удалить IV катетер.
- Подтвердите первичный гемостаз(рисунок 1E), а затем отразите аорту и IVC. Обложка прокола сайт 1 мин больше, чтобы обеспечить гемостаз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не зажим слишком долго, чтобы избежать тромбоза IVC дисталь к стенозу. - Верните органы в исходное положение и закройте брюшную полость 6-0 швами.
3. Послеоперационные процедуры
- После закрытия раны брюшной полости прекратите ингаляцию изолюран. Положите мышь в отдельную клетку без постельных принадлежностей и поместите клетку на тепловой опорный прибор, чтобы предотвратить переохлаждение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь наблюдается до тех пор, пока они достигают и поддерживать суровый recumbency. Применяйте послеоперационный уход, включая анальгезию и уход за ранами в соответствии с рекомендациями местного IACUC. Для анальгезии мы используем бупренорфин на 0,1 мг/кг внутримышечно каждые 12 ч в течение 48 ч после хирургических процедур и после этого по мере необходимости. - Подтвердите прокладку AVF послеоперационно с помощью ультразвука Доплера (см. таблицу материалов). Кроме того, по мере необходимости измеряйте другие характеристики судна и потока.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мышей-мужчин прошли вышеупомянутую операцию по созданию как AVF, так и стеноза IVC. Контрольные мыши прошли только лапаротомию и рассечение тканей, окружающих IVC, например, фиктивную процедуру, или только создание стеноза IVC без одновременного создания AVF.
IVC наблюдался с узидовом Доплера на 7-й день после хирургической процедуры(рисунок 2). Области свищей и стенозов IVC были легко обнаружены в продольном представлении(рисунок2C,E). IVC между свищей и стенозом был расширен у мышей, имеющих AVF со стенозом. Ультразвуковые волновые формы были исследованы в IVC в точке стеноза(рисунок 2D, F). У мышей, несущих стеноз в одиночку, без AVF, сегмент стеноза показал венозной формы волны с более спектральной расширения, чем фиктивных мышей, но без особого пульсатии. Однако, в мышах, имеющих AVF, а также стеноз, сегмент стеноза показал пульсирующую форму волны в дополнение к спектральному расширению. Средняя скорость потока у стеноза у мышей, имеющих AVF со стенозом, была значительно выше, чем у мышей, имеющих только стеноз(Таблица1).
Режим УЗИ Доплера B был использован в поперечных представлениях для оценки IVC на седьмой день после операции(таблица 1). Средний диаметр IVC у стеноза у мышей, имеющих стеноз только был похож на мышей, имеющих AVF, а также стеноз (Таблица 1). Процентный стеноз IVC был рассчитан по методу NASCET12. Используя либо вверх по течению сегмента или вниз по течению сегмента в качестве ссылки, процент стеноз был значительно больше у мышей, имеющих AVF в дополнение к стенозу (Таблица 1).
Рисунок 1. Оперативные фотографии модели murine AVF с венозным стенозом. (A) Поместите 8-0 шов под IVC (синие наконечники стрел) и аорты (красные наконечники стрел) на полпути между левой почечной вена (желтые наконечники стрел) и аортальной бифуркации, в distally к любым большим ветвям IVC если присутствует. (B) Поместите шов только под IVC. (C) После проксимального зажима, прокола аорты через обе стены и в IVC. (D) Свяжите кончик катетера 22 G IV и IVC вместе с помещенным швом. (E) Удалите катетер и растлампы. Артериальный кровоток через стеноз IVC может наблюдаться. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Узи выводы на 7-й день после хирургической процедуры. Вверху: репрезентативные изображения мышей с фиктивной процедурой. (A) B-режим изображения показывает IVC в продольном представлении. Левая сторона - черепная сторона. (B) Волновая форма инфрагенного IVC. Середина: репрезентативные изображения мышей только со стенозом. (C) B-режим изображения показывает IVC в том числе стеноз (желтая звездочка) в продольном представлении. Левая сторона - черепная сторона. (D) Волновая форма в области стеноза. Внизу: Репрезентативные изображения мышей, имеющих AVF со стенозом. (E) B-режим изображения показывает IVC в том числе свищ (белая звездочка) и стеноз. Левая сторона - черепная сторона. (F) Волна в области стеноза. Белая панель масштаба представляет собой 1 мм. Бар желтой шкалы представляет 100 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Стеноз | Да | Да | Значение P |
| Avf | Нет | Да | |
| Средняя скорость (мм/с) | 180 г. | 878 год | 0,0023 |
| Диаметр стеноза (мм) | 0,62 х 0,01 | 0,63 и 0,01 | 0,3558 |
| % стеноз (upsteam) | 43% | 66% | 0,0159 |
| % стеноз (даунсомон) | 42% | 56% | 0.0006 |
Таблица 1. Ультразвуковое измерение в области стеноза IVC каждой группы. Ультразвуковые измерения в области стеноза IVC у мышей, имеющих только стеноз, и мышей, имеющих AVF со стенозом на 7-й день после операции. %стеноз (вверх по течению) - (1 - «диаметр при стенозе/диаметре в восходящем референсном сегменте» x 100%. %стеноз (вниз по течению) %дилатация (диаметр в послеоперационный день 7 / предоперационный диаметр в том же сегменте) x 100%. Значения P основаны на T-тестах студента, n 4-6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модель murine AVF была использована для изучения основных механизмов и молекулярных событий, ведущих к созреванию AVF13,14. В этом исследовании мы модифицировали установленную модель murine AVF для создания новой модели морин aortocaval свищей с стенозом IVC в урочище оттока свищей. Наша модель перевязки похожа на несколько ранее описанных моделей мурин, которые используют сосудистую перевязку. Модель тромна тромбоза глубоких вен была создана с использованием частичной перевязки IVC с 30 G иглой15; мы использовали больше 22 G IV катетер прокладка для создания меньшего стеноза и тем самым избежать тромботического окклюзии. Морин модель частичной перевязки сонной артерии была использована, чтобы вызвать нарушенный поток, что привело к атеросклерозу16; наша модель аналогичным образом использовала частичную венозную перевязку и, соответственно, продемонстрировала нарушенный поток в IVC в районе частичной перевязки.
Были изучены механизмы, лежащие в основе отказа созревания AVF, вызванного венозным стенозом свищей. Гемодинамические изменения, включая нарушенные частоты стресса сдвига были показаны, чтобы быть важными факторами17,18. Моделирование вычислительной жидкости показало нарушенный поток при венозном стенозе19,хотя о животных моделях AVF с венозным стенозом ранее не сообщалось. Эта модифицированная модель морин аортокаял свищей может быть использована для изучения AVF с центральным венозным стенозом. Диаметр IVC при стенозе имеет меньше вариаций и больше йенстенции в этой модели; частичная перевязка IVC с помощью IV катетера увеличивает воспроизводимость этой модели. Клинические симптомы и признаки стеноза центральной вены часто развиваются только после создания фистулы в ипсилатеральной конечности9. В этой модели мышей, имеющих частичный стеноз IVC (Злт;50%) имел нормальный поток и протекает бессимптомно, в то время как добавление AVF увеличило степень стеноза до такой степени, что могло вызвать симптомы (Зтт;50%) (Рисунок 2, Таблица 1). Эти результаты имитируют фенотип стеноза центральной вены; увеличение венозного потока из-за присутствия свища может раскрыть существование бессимптомного стеноза центрального вены, вызывая венозную гипертензию и срыв созревания свищ.
Есть некоторые важные шаги и моменты для улучшения успеха и последовательности процедуры. Если IVC имеет различные боковые ветви, 8-0 шов помещается distally (caudally) к ветвям(рисунок 1). В оригинальной модели murine AVF боковые ветви IVC обычно игнорируются, поскольку более высокое сосудистое сопротивление ветвей удерживает поток свищей от попадания в ветви. Однако, если стеноз IVC создается прокси-топово к различным боковых ветвях в этой модели, поток свищей может уйти в ветви из-за сосудистого сопротивления вновь размещенным швом. Чтобы избежать сильного кровотечения, вскрытие IVC начинается сразу же неполноценно к левой почечной вены и продлевается еще хуже до точки, где IVC должен быть ligated. Этот шаг является наиболее важной частью этой операции; кровотечения из поврежденных IVC или ветвей, вероятно, будет неконтролируемым. Кроме того, чтобы не касаться IVC при размещении шва вокруг него, и потенциально разрывая его, 8-0 шов сначала помещается вокруг IVC и аорты, а затем перемещается под только IVC. Наконец, узел 8-0 шов помещается на стороне IVC, а не непосредственно передним, чтобы предотвратить любой артефакт, который может повлиять на послеоперационное ультразвуковое обследование.
Потенциальным ограничением этого исследования является то, что стеноз IVC в этой модели создается внешним механическим сжатием; авантюрное воспаление, вызванное швом и вскрытием IVC потенциально может повлиять на венозную ремоделирование в области стеноза. Кроме того, свищ в этой модели производится между аортой и IVC так, что весь поток свищей направлен в стеноз IVC, в то время как свищ, созданный в верхней конечности человека часто позволяет залогвенных вен развиваться, сохраняя стеноз бессимптомным. Физические признаки центрального венозного стеноза, такие как дистальный отек и сопутствующее образование, в этой модели не показаны.
Таким образом, мы вводим протокол для новой модели murine aortocaval свищей с стенозом оттока IVC, который прост в исполнении и воспроизводим. Мы ожидаем, что эта модель будет полезна для изучения гемодинамических изменений с помощью центрального венозного стеноза, который может повлиять на созревание AVF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения США (NIH) Грант R01-HL128406; Департамент СОЕДИНЕННЫх Штатов по делам ветеранов биомедицинских лабораторных исследований и разработок Программа Заслуги Обзор премии I01-BX002336; а также с ресурсами и использованием объектов в В. А. Коннектикут системы здравоохранения, Уэст-Хейвен, Штат Коннектикут.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-60 Mhz scan head | VisualSonics Inc. | RMV-704 | |
| 8-0 Sterile Micro Suture, 6mm (140 µ), 3/8 Circle, TAP Point Needle | AROSuture | T06A08N14-13 | polyamide monofilament sutures |
| Induction Chamber, 2 Liter 3.75"W x 9.00"D x 3.75"H |
VetEquip | 941444 | |
| Isoflo, Isoflurane liquid | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Mice, C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | |
| Pet Bed Microwave Heating Pad | Snuggle Safe | 6250 | |
| PrecisionGlide Needle 25G | BD | 305122 | |
| Surflo I.V. Catheter 22G | Terumo | SR-OX2225CA | 0.85mm outer diameter |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument | RS-5424 | |
| Vevo770 High Resolution Imaging System | VisualSonics Inc. | 770 |
References
- Dember, L. M., et al. Effect of clopidogrel on early failure of arteriovenous fistulas for hemodialysis: a randomized controlled trial. JAMA. 299 (18), 2164-2171 (2008).
- Dixon, B. S. Why don't fistulas mature? Kidney International. 70 (8), 1413-1422 (2006).
- Wilmink, T., Hollingworth, L., Powers, S., Allen, C., Dasgupta, I. Natural History of Common Autologous Arteriovenous Fistulae: Consequences for Planning of Dialysis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 51 (1), 134-140 (2016).
- Al-Jaishi, A. A., et al. Patency rates of the arteriovenous fistula for hemodialysis: a systematic review and meta-analysis. American Journal of Kidney Diseases. 63 (3), 464-478 (2014).
- Rocco, M. V., Bleyer, A. J., Burkart, J. M. Utilization of inpatient and outpatient resources for the management of hemodialysis access complications. American Journal of Kidney Diseases. 28 (2), 250-256 (1996).
- Roy-Chaudhury, P., Sukhatme, V. P., Cheung, A. K. Hemodialysis vascular access dysfunction: a cellular and molecular viewpoint. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (4), 1112-1127 (2006).
- Quencer, K. B., Arici, M. Arteriovenous Fistulas and Their Characteristic Sites of Stenosis. AJR: American Journal of Roentgenology. 205 (4), 726-734 (2015).
- Kian, K., Asif, A. Cephalic arch stenosis. Semin Dial. 21 (1), 78-82 (2008).
- Agarwal, A. K. Central vein stenosis. American Journal of Kidney Diseases. 61 (6), 1001-1015 (2013).
- Glanz, S., et al. Axillary and subclavian vein stenosis: percutaneous angioplasty. Radiology. 168 (2), 371-373 (1988).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 305 (12), H1718-H1725 (2013).
- North American Symptomatic Carotid Endarterectomy Trial. Methods, patient characteristics, and progress. Stroke. 22 (6), 711-720 (1991).
- Kuwahara, G., et al. CD44 Promotes Inflammation and Extracellular Matrix Production During Arteriovenous Fistula Maturation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1147-1156 (2017).
- Protack, C. D., et al. Eph-B4 regulates adaptive venous remodeling to improve arteriovenous fistula patency. Scientific Reports. 7 (1), 15386 (2017).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. J Vis Exp. (130), (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
- Ene-Iordache, B., Remuzzi, A. Disturbed flow in radial-cephalic arteriovenous fistulae for haemodialysis: low and oscillating shear stress locates the sites of stenosis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (1), 358-368 (2012).
- Yamamoto, K., et al. Disturbed shear stress reduces Klf2 expression in arterial-venous fistulae in vivo. Physiological reports. 3, (2015).
- Remuzzi, A., Ene-Iordache, B. Novel paradigms for dialysis vascular access: upstream hemodynamics and vascular remodeling in dialysis access stenosis. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 8 (12), 2186-2193 (2013).
