Summary
主动脉瘘瘘是通过两面壁将马氏肾主动脉刺穿到劣质的vena卡瓦中,然后通过劣质vena卡瓦的部分结扎在流出中产生狭窄。这种可重现的模型可用于研究中央静脉狭窄。
Abstract
中静脉狭窄是导致动脉瘘 (AVF) 衰竭的重要实体。修改了鼠AVF模型,在瘘管流中创建劣质vena Cava(IVC)的部分结扎,模仿中央静脉狭窄。介绍了该模型的技术方面。主塔和IVC在腹部切口后暴露。对肾上腺主数和IVC进行解剖进行近端夹紧,并暴露远端主塔进行穿刺。左肾静脉和主动脉分叉之间的中点的IVC被仔细解剖,放置一个8-0缝合下IVC。夹紧主盘和IVC后,通过25G针将肾上腺主盘穿过两壁,将22G静脉内(IV)导管和IVC连在一起,从而形成AVF。然后,导管被移除,创建一个可重复的静脉狭窄,没有遮挡。主数和IVC在确认原发性赫利塞后未夹紧。这种新型的中央静脉狭窄模型易于执行,可重现,有利于对AVF故障的研究。
Introduction
与移植物或中央静脉导管等其他途径相比,动脉瘘 (AVF) 是血液透析最常见的访问途径,具有卓越的治疗率和减少感染。然而,高达60%的AVF不能成熟1,2,3;最近一项系统检讨报告,1年一级的评分率只有60%4。静脉流出的狭窄主要导致AVF成熟5、6的失效。有一些特征位置容易狭窄接近瘘管:并列的摆动段为放射性头瘘,头拱区域为胸脑直管瘘和中央静脉的瘘管与以前放置 ipsi侧子克隆或内静脉导管7,8。
中静脉狭窄往往是无症状的患者没有AVF,但可能导致静脉高血压的侧肢水肿,以及瘘管成熟失败时,挑战瘘管9。中央静脉狭窄的病理生理学最有可能与炎症和设备放置后激活凝血级联有关。此外,导管尖端的恒定运动以及瘘管流增加会改变剪切应力,导致血小板沉积和静脉壁变厚10。为了理解由中央静脉狭窄引起的AVF故障的基本机制,需要一种动物模型来模仿AVF的中央静脉狭窄。
我们建立了一个马腔瘘模型,易于执行,掌握和重述人类AVF的临床过程。11我们应用了几种先前建立的鼠模型的概念和技术,创建了具有静脉狭窄的新型鼠AVF模型。我们引入了一个在流出瘘中带有 IVC 狭窄的鼠主动脉瘘模型,可用于研究中央静脉狭窄。
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Protocol
所有实验都是经耶鲁大学动物护理和使用委员会(IACUC)批准进行的。
1. 麻醉和术前程序
- 通过高压灭菌来消毒所有手术器械和材料。打开热支持装置,确保其温度(40~42 °C)。
- 将一只9-11周的旧C57BL/6小鼠放入丙烯酸感应室,用蒸发的2.5%等值胶和0.8升/分钟氧气将其麻醉。麻醉诱导大约需要3分钟。
- 将鼠标从造型室中取出。通过脚趾捏、耳捏和尾部捏合确认深层麻醉。将鼠标置于手术区域的苏西位置,并使用硅胶面膜提供 2.5% 的子胶。以0.1毫克/千克镇痛剂提供丁丙诺啡,并在眼睛上涂抹眼药膏。
- 使用 Nair(脱发剂)从颈部腹侧到下腹部去除毛皮。
- 使用两步磨砂,使用 10% 的波维酮碘和 70% 异丙醇清洁和消毒手术部位。应用手术窗帘。
2. 操作程序
-
夹具和穿刺部位的暴露
- 准备无菌仪器并戴上无菌手套,以保持整个手术的不育性。
- 用手术刀从下肝边缘到正上方的下肝边缘,做一个皮肤深的中线腹部切口。用剪刀切开肌肉,打开腹腔。
- 将缩回器插入腹部,将肠子拉出右侧。用盐水浸泡的纱布包裹,保持湿润。夺回膀胱和精囊(在雄性小鼠),并把它们拉到牛侧。用微针支架在直肠和腹膜之间解剖,以获得主塔和IVC的完整视图。
- 用微针支架将肾内侧主数和IVC结合在侧和背周围的反光组织中分离,将它们交叉夹在一起。
- 解剖周围的组织,在从左肾静脉到主动脉分叉的大约四分之三的距离内暴露主动脉穿刺部位。
-
IVC 解剖
- 在肾上腺IVC和主肠之间分离,立即向左肾静脉远端。将解剖分离扩展到左肾静脉和主动脉分叉之间的中间,以便术后可以观察到肾内膜IVC,无论是上肾还是下游的狭窄。
注:IVC和主方之间的模糊解剖应从紧邻到左肾静脉进行,其中IVC和主塔之间的结缔组织相对松散。 - 制作一个窗口,将 IVC 与该级别的主塔分离,并将 IVC 与周围组织分离。放置一个8-0聚酰胺单丝缝合首先位于IVC和主塔(图1A)下方,然后通过拉缝合线端穿过窗口,将缝合线置于IVC(图1B)下方。
注:由于 IVC 是脆弱的,沿主动脉新奇的解剖是有用的窗口,以防止 IVC 以及小型 IVC 或主动脉分支损坏。如果出血发生,很可能是无法控制的。如果 IVC 具有不同的侧分支,则放置 8-0缝合不中树枝。
- 在肾上腺IVC和主肠之间分离,立即向左肾静脉远端。将解剖分离扩展到左肾静脉和主动脉分叉之间的中间,以便术后可以观察到肾内膜IVC,无论是上肾还是下游的狭窄。
-
AVF 创建
- 将 25 G 针弯至 45°60° 角,距离针尖 4 mm。
- 通过应用显微手术夹夹夹紧住肾上腺主数和IVC。
- 通过抓住分叉周围的结缔组织,以均匀和方式旋转主塔,以暴露主塔的穿刺部位,使其稍微拉伸到腹侧。
- 将主塔放在适当的位置,使用准备好的 25 G 针穿过主塔进入 IVC(图 1C)。
- 释放主塔并覆盖穿刺部位,周围组织从主塔左侧向上拉。拿出针头,用棉签拭子轻轻按压穿刺部位进行防穿。
-
创建 IVC 狭窄
- 将 22 G IV 导管的尖端(参见材料表)纵向放置到 IVC 上。将 IV 导管和 IVC 与 8-0 一起拉闸道缝合(图1D),然后取出IV导管。
- 确认初级质性质性正位性(图1E),然后松开主数和IVC。再盖住穿刺部位1分钟,以确保穿孔。
注意:不要夹紧太久,以避免IVC血栓形成,远至狭窄。 - 将器官返回到其原始位置,用 6-0 缝合关闭腹部。
3. 术后程序
- 腹部伤口闭合后,停止异苯二苯的吸入。将鼠标放入单独的无床上用品笼中,并将笼子放在热支持装置上,以防止体温过低。
注:观察鼠标,直到它们达到并保持胸腔。根据当地IACUC的建议,应用术后护理,包括麻醉和伤口护理。对于肛门病,我们使用丁丙诺啡在0.1毫克/千克肌肉内每12小时48小时手术后,并随后根据需要。 - 使用多普勒超声确认AVF术后,请参见材料表。此外,根据需要测量其他容器和流量特性。
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Representative Results
雄性小鼠接受了上述手术,以产生AVF和IVC狭窄。对照小鼠只接受腹腔切除术和解剖IVC周围的组织,例如,假程序,或只创建IVC狭窄,而不同时创建AVF。
在手术后第7天,用多普勒超声波观察IVC(图2)。在纵向视图中很容易检测到 IVC 的瘘管和狭窄区域(图 2C,E)。瘘管和狭窄之间的IVC在具有AVF的具有狭窄性小鼠中扩张。在狭窄点的IVC中检查了超声波波形(图2D,F)。在没有AVF的情况下,仅患有狭窄症的小鼠,其狭窄部分显示出一个静脉波形,其光谱比假操作小鼠扩大更多,但脉动性不大。然而,在有AVF和狭窄小鼠,狭窄部分显示脉动波形,除了光谱扩大。有AVF的小鼠在狭窄时的平均最大流量明显高于单独有狭窄状态的小鼠(表1)。
多普勒超声B模式用于横向视图,以评估手术后第七天的IVC(表1)。单单有狭窄小鼠的狭窄处的平均IVC直径与有AVF的小鼠和狭窄相似(表1)。IVC的百分比狭窄是根据NASCET方法12计算的。使用上游段或下游段作为参考,除狭窄外,具有 AVF 的小鼠的狭窄百分比明显较大(表 1)。
图 1.带静脉狭窄功能的鼠AVF模型的操作照片。(A) 放置一个 8-0在左肾静脉(黄色箭头)和主动脉分叉的中间,在 IVC(蓝色箭头)和主动脉(红色箭头)的两半线下缝合,如果存在,则与任何大型 IVC 分支相分离。(B) 仅将缝合线置于 IVC 下方。(C) 近端夹紧后,刺穿主塔穿过两面墙并进入IVC。(D) 将 22 G IV 导管的尖端和 IVC 与放置的缝合线一起连接。(E) 拆下导管并松开夹紧。动脉血流通过IVC狭窄可以观察到。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.手术后第7天的超声波发现。顶部:具有假程序的小鼠的代表性图像。(A) B 模式图像在纵向视图中显示 IVC.左边是颅骨一侧。(B) 肾上腺IVC的波形。中间:仅有狭窄小鼠的代表性图像。(C) B 模式图像显示 IVC,包括纵向视图中的狭窄(黄色星号)。左边是颅骨一侧。(D) 狭窄区域的波形。底部:有AVF有狭窄症的小鼠的代表性图像。(E) B模式图像显示 IVC,包括瘘管 (白色星号) 和狭窄。左边是颅骨一侧。(F) 狭窄区域的波形。白色刻度条表示 1 mm。黄色刻度条表示 100 ms。请点击此处查看此图的较大版本。
| 狭窄 | 是的 | 是的 | P 值 |
| AVF | 不 | 是的 | |
| 时间平均最大速度(毫米/小时) | 180 | 878 | 0.0023 |
| 狭窄直径(毫米) | 0.62 × 0.01 | 0.63 ± 0.01 | 0.3558 |
| % 狭窄(蒸汽) | 43% | 66% | 0.0159 |
| % 狭窄(蒸汽) | 42% | 56% | 0.0006 |
表 1.在每个组的IVC狭窄区域进行超声波测量。在IVC狭窄区单独有狭窄和小鼠在手术后第7天有AVF有狭窄,超声波派生测量。%狭窄(上游) = (1 - [在狭窄处的直径 /在上游参考段的直径]) x 100%。%狭窄(下游) = (1 - [在狭窄处的直径 /在下游参考段处的直径]) x 100%。%扩张 = (术后第 7 天的直径 / 同一段的术前直径) x 100%。P值基于学生的 t 测试,n = 4-6。
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Discussion
鼠AVF模型已用于研究导致AVF成熟13、14的基本机制和分子事件。在这项研究中,我们修改了一个已建立的鼠AVF模型,以创建一个新的鼠主动脉瘘模型,在瘘管流出区有IVC狭窄。我们的结扎模型类似于之前使用血管连接的几个小鼠模型。使用30G针垫15的局部IVC结扎,建立了深静脉血栓形成鼠模型;我们使用更大的22G IV导管间隔器,以创建一个较小的狭窄,从而避免血栓性闭塞。采用部分胡萝卜动脉结扎的鼠模型诱导干扰流动,导致动脉粥样硬化16;我们的模型同样使用了部分静脉结扎,并相应地在IVC中演示了部分结扎区域的扰动流。
研究了瘘管静脉狭窄导致的AVF成熟失效的动因机制。包括剪切应力的干扰频率在内的血液动力学变化被证明是重要的因素17,18。计算流体动力学模拟显示静脉狭窄19处有干扰的流,尽管以前没有报告过带有静脉狭窄的AVF动物模型。这种改良的鼠肠瘘模型可用于研究具有中央静脉狭窄性的AVF。狭窄处的IVC直径在模型中变化较小,一致性更大;使用IV导管进行部分IVC结扎可增加该模型的可重复性。中心静脉狭窄临床症状和体征往往只在叶侧四肢9的瘘管形成后发展。在此模型中,具有部分 IVC 狭窄的小鼠(<50%)有正常流动,无症状,而添加AVF增加狭窄程度,可能导致症状的程度(>50%)(图2,表1)。这些结果模仿中央静脉狭窄表型;由于瘘管的存在,静脉流动增加可以揭示无症状的中央静脉狭窄的存在,导致静脉高血压和瘘管成熟失败。
有一些关键的步骤和要点,以提高成功率和过程的一致性。如果 IVC 具有不同的侧分支,则 8-0缝合线被不分(caud)放置在树枝上(图1)。在原始鼠AVF模型中,IVC的侧分支通常被忽略,因为树枝的更高的血管阻力阻止瘘管流进入分支。然而,如果IVC狭窄是接近于此模型中不同的侧枝创建的,瘘管流可能会由于新放置的缝合线而逸入支气管。为了避免大量出血,IVC解剖立即开始低于左肾静脉,并进一步进一步低于IVC被连接。这一步是这个手术最关键的部分;损坏的IVC或树枝出血可能是无法控制的。此外,为了避免在缝合线周围放置缝合线时接触 IVC,并且可能会撕裂它,8-0缝合最初放置在 IVC 和主塔周围,然后仅重新定位在 IVC 下方。最后,8-0的结缝合线被放置在IVC的一侧,而不是直接前,以防止任何可能影响术后超声检查的伪影。
本研究的一个潜在局限性是,该模型中的IVC狭窄是由外部机械压缩产生的;缝合和IVC切除引起的肠炎可能影响狭窄区域的静脉重塑。此外,该模型中的瘘管在主动脉和 IVC 之间制造,以便所有瘘管流都定向到 IVC 狭窄,而在人类上肢中产生的瘘管通常允许形成附属静脉,使狭窄无症状。此模型中未显示中央静脉狭窄的物理迹象,如远端水肿和附带形成。
总之,我们引入了一种新型的鼠肠瘘模型的协议,该模型具有IVC流出狭窄,易于执行和重现。我们期望这个模型将有用的研究血液动力学变化由中央静脉狭窄,可能会影响AVF成熟。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家卫生研究院(NIH)授予R01-HL128406的支持;美国退伍军人事务部生物医学实验室研究与发展计划优秀评审奖I01-BX002336;以及资源和设施的使用在VA康涅狄格州医疗保健系统,西黑文,CT。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-60 Mhz scan head | VisualSonics Inc. | RMV-704 | |
| 8-0 Sterile Micro Suture, 6mm (140 µ), 3/8 Circle, TAP Point Needle | AROSuture | T06A08N14-13 | polyamide monofilament sutures |
| Induction Chamber, 2 Liter 3.75"W x 9.00"D x 3.75"H |
VetEquip | 941444 | |
| Isoflo, Isoflurane liquid | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Mice, C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | |
| Pet Bed Microwave Heating Pad | Snuggle Safe | 6250 | |
| PrecisionGlide Needle 25G | BD | 305122 | |
| Surflo I.V. Catheter 22G | Terumo | SR-OX2225CA | 0.85mm outer diameter |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument | RS-5424 | |
| Vevo770 High Resolution Imaging System | VisualSonics Inc. | 770 |
References
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