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Medicine

Modèle murine de la sténose veineuse centrale utilisant la fistule d'Aortocaval avec une stenose sortante

Published: July 11, 2019 doi: 10.3791/59540

Summary

Une fistule aortocaval a été créée en perforant l'aorte infra-rénale murine à travers les deux murs dans le cava vena inférieur et a été suivie par la création d'une sténose dans son écoulement par l'intermédiaire de la ligature partielle du cava vena inférieur. Ce modèle reproductible peut être utilisé pour étudier la sténose veineuse centrale.

Abstract

La sténose veineuse centrale est une entité importante contribuant à l'échec artériovenous de fistule (AVF). Un modèle aVF murine a été modifié pour créer une ligature partielle du cava inférieur de veine (IVC) dans le courant sortant de la fistule, imitant la sténose veineuse centrale. Les aspects techniques de ce modèle sont introduits. L'aorte et l'IVC sont exposés, suite à une incision abdominale. L'aorte infra-rénale et l'IVC sont disséqués pour le clampage proximal, et l'aorte distale est exposée pour la perforation. L'IVC au milieu entre la veine rénale gauche et la bifurcation aortique est soigneusement disséqué pour placer un 8-0 suture sous l'IVC. Après le clampage de l'aorte et de l'IVC, une AVF est créée en perforant l'aorte infra-rénale à travers les deux murs dans l'IVC avec une aiguille de 25 G, suivie d'une ligature d'un cathéter intra-veineux (IV) de 22 G et d'IVC ensemble. Le cathéter est ensuite enlevé, créant une sténose veineuse reproductible sans occlusion. L'aorte et l'IVC sont non-clamped après confirmation de l'hémostasie primaire. Ce nouveau modèle de sténose veinenelle centrale est facile à réaliser, reproductible, et facilitera les études sur l'échec de l'AVF.

Introduction

Les fistules artérioveineuses (AVF) sont les accès les plus communs pour l'hémodialyse, avec la patency supérieure et l'infection réduite comparée à d'autres accès tels que des greffes ou des cathéters veineux centraux. Cependant, jusqu'à 60% de l'AVF ne parviennent pas à mûrir1,2,3; un examen systématique récent a indiqué que les taux de patency primaire à 1 an étaient seulement 60%4. La sténose le long de l'écoulement veineux provoque principalement l'échec de la maturation AVF5,6. Il y a certains endroits caractéristiques enclins à la sténose proximale à la fistule : le segment de balancement juxtaanastomotic pour la fistule radiocéphalique, la région céphalique d'arc pour la fistule brachiocéphalique et la veine centrale pour la fistule avec précédemment placé ipsilateral subclavian ou interne cathéters de veine jugulaire7,8.

La sténose veineuse centrale est souvent asymptomatique dans les patients sans AVF, mais peut causer l'oiséème d'extrémité ipsilateral par l'hypertension veineuse aussi bien que l'échec de la maturation de fistule une fois défié par le fluxdefistule 9. La pathophysiologie de la sténose veineuse centrale est très probablement liée à l'inflammation et à la cascade activée de coagulation après le placement de dispositif. En outre, le mouvement constant de la pointe du cathéter ainsi que l'écoulement accru de la fistule peuvent altérer le stress de cisaillement, ayant pour résultat le dépôt de plaquette et l'épaississement de mur veineux10. Pour comprendre les mécanismes de base sous-jacents à l'échec de la VVA causée par la sténose veineuse centrale, un modèle animal imitant la sténose veineuse centrale avec une AVF est nécessaire.

Nous avons établi un modèle de fistule d'aortocaval murine qui est facile à exécuter et maître et récapitule le cours clinique de l'AVF humaine. 11 Nous avons appliqué les concepts et la technique de plusieurs modèles murins précédemment établis pour créer un modèle murine nouveau d'AVF avec la sténose veineuse. Nous introduisons un modèle de fistule aortocavale murine avec une sténose IVC dans la fistule de sortie qui peut être employée pour l'étude de la sténose veineuse centrale.

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Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées avec l'approbation du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Yale (IACUC).

1. Anesthésie et procédures préopératoires

  1. Stériliser tous les instruments et matériaux chirurgicaux en autoclantant. Activez le dispositif de support thermique pour être certain qu'il est chaud (40 à 42 oC).
  2. Placez une souris C57BL/6 de 9 à 11 semaines dans une chambre d'induction acrylique et anesthésiez-la avec de l'isoflurane vaporisé de 2,5 % et de l'oxygène de 0,8 L/min. L'induction de l'anesthésie prend environ 3 min.
  3. Retirez la souris de la chambre. Confirmer un plan profond d'anesthésie par une pincée d'orteil, une pince d'oreille et un pincement de queue. Placez la souris en position de supine sur la zone chirurgicale et livrez 2,5% isoflurane en utilisant un masque en silicone. Fournir de la buprénorphine à 0,1 mg/kg analgésique et appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux.
  4. Retirez la fourrure du côté ventral du cou vers le bas-ventre à l'aide de Nair, un décapant à cheveux.
  5. Nettoyer et désinfecter le site chirurgical à l'aide d'un gommage en deux étapes avec 10% povidone-iode et 70% d'isopropanol. Appliquer un drapé chirurgical.

2. Procédures opérationnelles

  1. Exposition des sites de pince et de perforation
    1. Préparez des instruments stériles et portez des gants stériles pour maintenir la stérilité tout au long de la chirurgie.
    2. Faire une incision abdominale de milieu de la peau profonde avec un scalpel du niveau du bord inférieur du foie à juste au-dessus du pubis. Couper à travers la musculature avec des ciseaux pour ouvrir la cavité abdominale.
    3. Insérez un rétracteur dans l'abdomen et retirez les entrailles du côté droit. Gardez-les humides en les enveloppant dans une gaze imbibée de salin. Retreive la vessie et les vésicules séminales (chez les souris mâles) et les retirer sur le côté caudal. Disséquer le mésenterie entre le rectum et le rétroperitoneum avec un support de micro-aiguille pour obtenir une vue complète de l'aorte et de l'IVC.
    4. Disséquer l'aorte infra-rénale et ivC en bloc des tissus rétropéritonés environnants et latéraux et dorsal avec un support micro-aiguille pour les croiser ensemble.
    5. Disséquer les tissus environnants pour exposer le site de perforation aortique à environ les trois quarts de la distance de la veine rénale gauche à la bifurcation aortique.
  2. Dissection IVC
    1. Disséquer entre l'IVC infra-rénal et l'aorte immédiatement distal à la veine rénale gauche. Étendre la dissection distale distally à la moitié entre la veine rénale gauche et la bifurcation aortique, de sorte que l'IVC infra-rénal, à la fois en amont et en aval de la sténose, peut être observée postopératoirement.
      REMARQUE : La dissection émoussée entre l'IVC et l'aorte devrait être exécutée de immédiatement distale à la veine rénale gauche où le tissu conjonctif entre l'IVC et l'aorte est relativement lâche.
    2. Faire une fenêtre pour séparer l'IVC de l'aorte à ce niveau et disséquer l'IVC du tissu environnant. Placer un 8-0 suture monofilament polyamide d'abord sous l'IVC et l'aorte (Figure 1A), puis positionner la suture sous seulement l'IVC (Figure 1B) en tirant l'extrémité de suture à travers la fenêtre.
      REMARQUE : Puisque l'IVC est fragile, disséquer le long de l'aventitia aortique est utile pour faire une fenêtre pour empêcher l'IVC aussi bien que de petites branches IVC ou aortiques d'être endommagées. En cas de saignement, il est susceptible d'être incontrôlable. Si l'IVC a des branches latérales distinctes, placez un 8-0 suture distally aux branches.
  3. Création AVF
    1. Pliez une aiguille de 25 G à un angle de 45 à 60 degrés à un point de 4 mm de l'extrémité de l'aiguille.
    2. Clamp l'aorte infra-rénale et IVC en appliquant un clip microchirurgical.
    3. Faites pivoter l'aorte médially et caudally en saisissant le tissu conjonctif entourant la bifurcation pour exposer le site de perforation de l'aorte étiré légèrement sur le côté ventral.
    4. Tenir l'aorte dans une position appropriée, perforer l'aorte dans l'IVC à l'aide de l'aiguille 25 G préparée (Figure 1C).
    5. Relâchez l'aorte et couvrez le site de perforation avec le tissu environnant tirant vers le haut du côté gauche de l'aorte. Sortez l'aiguille et appuyez doucement sur le site de perforation à l'aide d'un écouvillon à pointe de coton pour l'hémostase.
  4. Création de la sténose IVC
    1. Placez une pointe d'un cathéter 22 G IV (voir la Table des Matériaux) sur l'IVC longitudinalement. Ligate le cathéter IV et IVC avec un 8-0 (Figure1D),puis retirez le cathéter IV.
    2. Confirmer l'hémostase primaire (figure1E) puis déserrer l'aorte et l'IVC. Couvrir le site de perforation 1 min de plus pour assurer l'hémostase.
      REMARQUE: Ne pas serrer trop longtemps afin d'éviter la thrombose IVC distale à la sténose.
    3. Remettre les organes à leur position d'origine et fermer l'abdomen avec des sutures 6-0.

3. Procédures postopératoires

  1. Après la fermeture de la blessure abdominale, discontinué l'inhalation d'isoflurane. Placez la souris dans une cage individuelle sans literie et placez la cage sur un dispositif de soutien thermique pour prévenir l'hypothermie.
    REMARQUE : La souris est observée jusqu'à ce qu'elle atteigne et maintienne une charge sternale. Appliquer les soins postopératoires, y compris l'analgésie et les soins des plaies, conformément aux recommandations de l'IACUC locale. Pour l'analgésie nous utilisons la buprénorphine à 0.1 mg/kg intrasmusculairement toutes les 12 h pendant 48 h suivant les procédures chirurgicales et par la suite au besoin.
  2. Confirmer la patency AVF postopératoirement en utilisant l'échographie Doppler (voir le tableau des matériaux). De plus, mesurez les autres caractéristiques du navire et du débit au besoin.

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Representative Results

Les souris mâles ont subi l'opération mentionnée ci-dessus pour créer une AVF et une sténose ivC. Les souris témoins n'ont subi que la laparotomie et la dissection des tissus entourant l'IVC, par exemple, une procédure fictive, ou seulement la création d'une sténose IVC sans création simultanée d'une AVF.

L'IVC a été observé avec l'échographie doppler le jour 7 après l'intervention chirurgicale (figure 2). Les zones de fistule et de sténose de l'IVC ont été facilement détectées dans la vue longitudinale (Figure 2C, E). L'IVC entre la fistule et la sténose a été dilatée chez les souris ayant une AVF avec la sténose. Les formes d'onde ultrasons ont été examinées dans le CIV au point de la sténose (Figure 2D,F). Chez les souris porteuses d'une sténose seule, sans AVF, le segment de la sténose a montré une forme d'onde veineuse avec un élargissement plus spectral que les souris opérées par faux, mais sans beaucoup de pulsatilité. Cependant, chez les souris ayant une AVF ainsi qu'une sténose, le segment de la sténose a montré une forme d'onde pulsatile en plus de l'élargissement spectral. La vitesse maximale moyenne du débit à la sténose chez les souris ayant une AVF avec sténose était significativement plus élevée que les souris ayant la sténose seule (tableau 1).

Le mode ultrason B Doppler a été utilisé dans les vues transversales pour évaluer l'IVC le jour sept après la chirurgie (tableau 1). Le diamètre moyen d'IVC à la sténose chez les souris ayant la sténose seule était semblable aux souris ayant une AVF aussi bien que la sténose (tableau 1). Le pourcentage de sténose de l'IVC a été calculé selon la méthode NASCET12. En utilisant le segment en amont ou le segment en aval comme référence, le pourcentage de sténose était significativement plus élevé chez les souris ayant une AVF en plus de la sténose (tableau 1).

Figure 1
Figure 1. Photos opérationnelles du modèle d'AVF murine avec la sténose veineuse. (A) Placez un 8-0 suture sous l'IVC (pointes de flèche selles bleues) et l'aorte (pointes de flèche selles rouges) à mi-chemin entre la veine rénale gauche (pointes de flèche selles jaunes) et la bifurcation aortique, distally à toutes les grandes branches IVC si présent. (B) Placez la suture sous l'IVC seulement. (C) Après le clampage proximal, perforer l'aorte à travers les deux murs et dans l'IVC. (D) Attachez une pointe d'un cathéter 22 G IV et l'IVC avec la suture placée. (E) Retirez le cathéter et déterrez. Le flux sanguin artériel par la sténose IVC peut être observé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2. Résultats d'ultrason le jour 7 après l'intervention chirurgicale. Haut: images représentatives de souris avec une procédure bidon. (A) L'image en mode B montre IVC dans la vue longitudinale. Le côté gauche est le côté crânien. (B) Forme d'onde de l'IVC infraréréréréré. Moyen : images représentatives de souris atteintes d'une sténose seule. (C) L'image en mode B montre IVC incluant la sténose (astérisque jaune) dans la vue longitudinale. Le côté gauche est le côté crânien. (D) Forme d'onde dans la zone de la sténose. En bas : Images représentatives de souris ayant AVF avec la sténose. (E) L'image en mode B montre IVC comprenant la fistule (astérisque blanc) et la sténose. Le côté gauche est le côté crânien. (F) Forme d'onde dans la zone de la sténose. La barre d'échelle blanche représente 1 mm. La barre d'échelle jaune représente 100 ms. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Sténose ouais ouais Valeur P
Avf non ouais
Vitesse maximale moyenne (mm/s) 180 annonces 878 Annonces 0,0023
Diamètre de la sténose (mm) 0,62 à 0,01 0,63 à 0,01 0,3558
% de sténose (vapeur d'upsteam) 43% 66 % 0,0159
% de sténose (vapeur descendante) 42% 56% 0,0006 Annonces

Tableau 1. Mesure d'ultrason à la zone de sténose d'IVC de chaque groupe. Mesures dérivées d'ultrason à la zone de sténose d'IVC des souris ayant la sténose seule et des souris ayant AVF avec la sténose le jour 7 après chirurgie. %sténose (en amont) ( 1 - [diamètre à la sténose / diamètre au segment de référence en amont]) x 100%. %sténose (en aval) ( 1 - [diamètre à la sténose / diamètre au segment de référence en aval]) x 100%. Dilation en %% (diamètre sur le jour postopératoire 7 / diamètre préopératoire au même segment) x 100%. Les valeurs P sont basées sur les t-tests de l'étudiant, n ' 4-6.

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Discussion

Le modèle aVF murine a été utilisé pour étudier les mécanismes de base et les événements moléculaires conduisant à la maturation AVF13,14. Dans cette étude, nous avons modifié un modèle aVF murine établi pour créer un nouveau modèle de fistule aortocaval murine avec une sténose IVC dans le tractus sortant de la fistule. Notre modèle de ligature est semblable à plusieurs modèles murins précédemment décrits qui emploient la ligature vasculaire. Un modèle murine de thrombose veineuse profonde a été créé en utilisant la ligature partielle ivC avec un espaceur d'aiguille de 30 G15; nous avons employé un plus grand espaceur de cathéter de 22 G IV pour créer une plus petite sténose et ainsi éviter l'occlusion thrombotic. Un modèle murin de la ligature partielle d'artère carotide a été employé pour induire le flux perturbé, menant à l'athérosclérose16; notre modèle a également utilisé une ligature veineuse partielle et a donc démontré le débit perturbé dans l'IVC à la zone de la ligature partielle.

Des mécanismes sous-jacents à l'échec de maturation d'AVF provoqués par la sténose veineuse de fistule ont été étudiés. Les changements hémodynamiques, y compris les fréquences perturbées du stress de cisaillement se sont avérés être des facteurs importants17,18. Une simulation computationnelle de dynamique de fluide a montré le flux perturbé à la sténose veineuse19,bien que les modèles animaux de AVF avec la sténose veineuse n'aient pas été précédemment rapportés. Ce modèle modifié de fistule d'aortocaval murine peut être employé pour étudier un AVF avec la sténose veineuse centrale. Le diamètre IVC à la sténose a moins de variation et plus de cohérence dans ce modèle; la ligature partielle d'IVC utilisant un cathéter IV augmente la reproductibilité de ce modèle. Les symptômes cliniques et les signes de la sténose centrale de veinese développent souvent seulement après la création de fistule dans l'extrémité ipsilateral 9. Dans ce modèle, les souris ayant une sténose IVC partielle (lt;50%) avait un débit normal et étaient asymptomatiques, tandis que l'ajout d'une AVF a augmenté le degré de sténose à un degré qui pourrait causer des symptômes (-gt;50%) (Figure 2, Tableau 1). Ces résultats imitent le phénotype de la sténose centrale de veine ; le flux veineux accru dû à la présence de la fistule peut dévouer l'existence de la sténose centrale asymptomatique de veine, causant l'hypertension veineuse et l'échec de la maturation de fistule.

Il y a quelques étapes et points critiques pour améliorer le taux de réussite et la cohérence de la procédure. Si l'IVC a des branches latérales distinctes, un 8-0 la suture est placée de façon distale (caudally) aux branches (figure 1). Dans le modèle original de La VA murine, les branches latérales de l'IVC sont généralement ignorées parce que la résistance vasculaire plus élevée des branches empêche le flux de fistule d'entrer dans les branches. Cependant, si la sténose IVC est créée de manière proximale à des branches latérales distinctes dans ce modèle, le flux de fistule peut s'échapper dans les branches en raison de la résistance vasculaire par la suture nouvellement placée. Pour éviter les saignements massifs, la dissection IVC est commencée immédiatement de façon inférieure à la veine rénale gauche et est étendue plus bas au point où l'IVC doit être ligaté. Cette étape est la partie la plus critique de cette chirurgie; les saignements de l'IVC ou des branches endommagées sont susceptibles d'être incontrôlables. En outre, pour éviter de toucher l'IVC lors de la pose de la suture autour d'elle, et potentiellement le déchirer, le 8-0 la suture est d'abord placée autour de l'IVC et de l'aorte, puis repositionnée sous seulement l'IVC. Enfin, le noeud du 8-0 la suture est placée sur le côté de l'IVC, pas directement antérieurement, pour empêcher n'importe quel artefact qui pourrait affecter l'examen postopératoire d'ultrason.

Une limitation potentielle de cette étude est que la sténose d'IVC dans ce modèle est créée par la compression mécanique externe ; L'inflammation adventitial provoquée par la dissection de suture et d'IVC pourrait potentiellement affecter le remodelage veineux à la zone de sténose. En outre, la fistule dans ce modèle est faite entre l'aorte et l'IVC de sorte que tout le flux de fistule est dirigé dans la sténose IVC, tandis que la fistule créée dans l'extrémité supérieure humaine permet souvent aux veines collatérales de se développer, en gardant la sténose asymptomatique. Les signes physiques de sténose veineuse centrale tels que l'œdème distal et la formation collatérale ne sont pas indiqués dans ce modèle.

En résumé, nous introduisons un protocole pour un nouveau modèle de fistule aortocavale murine avec une sténose de sortie ivC qui est facile à exécuter et reproductible. Nous nous attendons à ce que ce modèle soit utile pour étudier les changements hémodynamiques par une sténose veineuse centrale qui pourrait affecter la maturation de l'AVF.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health (NIH) des États-Unis Grant R01-HL128406; le prix I01-BX00236 du Programme d'examen du mérite du Ministère des Anciens Combattants des États-Unis pour la recherche et le développement en laboratoire biomédical; ainsi qu'avec les ressources et l'utilisation des installations au va Connecticut Healthcare System, West Haven, CT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20-60 Mhz scan head VisualSonics Inc. RMV-704
8-0 Sterile Micro Suture, 6mm (140 µ), 3/8 Circle, TAP Point Needle AROSuture T06A08N14-13 polyamide monofilament sutures
Induction Chamber, 2 Liter
3.75"W x 9.00"D x 3.75"H
VetEquip 941444
Isoflo, Isoflurane liquid Zoetis 26675-46-7
Mice, C57BL/6J The Jackson Laboratory 664
Pet Bed Microwave Heating Pad Snuggle Safe 6250
PrecisionGlide Needle 25G BD 305122
Surflo I.V. Catheter 22G Terumo SR-OX2225CA 0.85mm outer diameter
Vascular clamp Roboz Surgical Instrument RS-5424
Vevo770 High Resolution Imaging System VisualSonics Inc. 770

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References

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Médecine Numéro 149 Biologie vasculaire anatomie physiologie chirurgie aorte veau cava inférieur fistule artérioveineuse fistule aortocavale sténose veineuse centrale souris ligature modèle animal
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Isaji, T., Ono, S., Hashimoto, T.,More

Isaji, T., Ono, S., Hashimoto, T., Yamamoto, K., Taniguchi, R., Hu, H., Wang, T., Koizumi, J., Nishibe, T., Hoshina, K., Dardik, A. Murine Model of Central Venous Stenosis using Aortocaval Fistula with an Outflow Stenosis. J. Vis. Exp. (149), e59540, doi:10.3791/59540 (2019).

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