Summary
Le but de ce protocole est de génotype de l'anémone de mer Nematostella vectensis pendant la gastrulation sans sacrifier l'embryon.
Abstract
Décrit ici est un protocole PCR-basé pour génotype l'embryon de stade de gastrula du vectensis cnidaire anthozoan nematostella sans sacrifier la vie de l'animal. Après la fécondation in vitro et la dégelée, les zygotes sont autorisés à se développer pendant 24 h à température ambiante pour atteindre le stade précoce à moyen-gastrula. Les embryons de gastrula sont ensuite placés sur un lit de gel d'agarose dans un plat Petri contenant de l'eau de mer. Sous le microscope disséquant, une aiguille de tungstène est utilisée pour séparer chirurgicalement un fragment de tissu aboral de chaque embryon. Les embryons post-chirurgical sont ensuite autorisés à guérir et à poursuivre leur développement. L'ADN génomique est extrait du fragment de tissu isolé et utilisé comme modèle pour le PCR spécifique au locus. Le génotype peut être déterminé en fonction de la taille des produits PCR ou de la présence ou de l'absence de produits PCR spécifiques à l'allèle. Les embryons post-chirurgical sont ensuite triés en fonction du génotype. La durée de l'ensemble du processus de génotypage dépend du nombre d'embryons à dépister, mais il faut au minimum 4 à 5 h. Cette méthode peut être utilisée pour identifier les mutants knock-out d'une population génétiquement hétérogène d'embryons et permet d'analyser les phénotypes au cours du développement.
Introduction
Les Cnidariens représentent un groupe diversifié d'animaux qui comprennent les méduses, les coraux et les anémones de mer. Ce sont des diploblastes, composés d'ectoderm et d'endoderm qui sont séparés par une matrice extracellulaire (mesoglea). Cnidaria est un groupe sœur pour spécifier Bilateria, à laquelle les modèles animaux traditionnels tels que Drosophila et Mus appartiennent1. En outre, on pense que la divergence Cnidaria-Bilateria s'est produite dans la période précambrienne2. En tant que tel, les études comparatives des cnidaires et des bilateriens sont essentielles pour obtenir des perspicacités dans la biologie de leur ancêtre commun le plus récent. Récemment, la génomique comparative a révélé que les cnidaires et les bilateriens partagent de nombreux gènes de boîte à outils de développement tels que l'encoche et la bHLH, ce qui implique que leur ancêtre commun avait déjà ces gènes3. Cependant, le rôle de ces gènes de boîte à outils développementales dans le dernier ancêtre commun de Cnidaria et De Bilateria est comparativement moins bien compris. Pour résoudre ce problème, il est essentiel d'étudier comment ces gènes profondément conservés fonctionnent chez les cnidaires.
L'un des nouveaux modèles génétiques cnidaires est l'anthozoan Nematostella vectensis. Son génome a été séquencé3, et une variété d'outils génétiques, y compris le knockdown de gène morpholino-négocié, la transgenèse meganuclease-négociée, et LES knockins et knockouts de gène CRISPR-Cas9-négociés, sont maintenant disponibles pour l'usage dans cet animal. En outre, le développement de Nematostella est relativement bien compris. Pendant l'embryogenèse, la gastrulation se produit par invagination4, et l'embryon se développe en une larve de planula de nage libre. La planule se transforme ensuite en polype sessile avec une bouche et des tentacules circonraux. Le polype grandit alors et atteint la maturité sexuelle.
CRISPR-Cas9-mediated mutagenesis ciblé est maintenant couramment utilisé pour étudier la fonction génique dans Nematostella vectensis5,6,7,8,9. Pour générer des mutants knock-out dans Nematostella, un cocktail contenant locus-spécifique RNA mono-guide et la protéine Cas9 endodocléuale est d'abord injecté dans les œufs non fécondés ou fécondés pour produire des animaux fondateurs F0 qui montrent généralement mosaïsme. Les animaux F0 sont ensuite élevés à maturité sexuelle et croisés les uns avec les autres pour produire une population de F1, dont un sous-ensemble peut être ko en état de mutation6. Alternativement, les animaux F0 sexuellement matures peuvent être croisés avec des animaux de type sauvage pour générer des animaux hétérozygotes F1, et les hétérozygotes F1 qui portent un allèle knock-out dans le lieu d'intérêt peuvent alors être croisés les uns avec les autres pour produire la progéniture F2, un quart dont on s'attend à ce qu'il s'agit de mutants knock-out5. Les deux approches nécessitent une méthode pour identifier les mutants knock-out d'une population génétiquement hétérogène. Les tentacules de polype peuvent être employéspour extraire l'ADN génomique pour le génotypage 6,7. Cependant, dans les cas où la fonction développementale du gène d'intérêt est étudiée et où les embryons mutants n'atteignent pas le stade du polype (c.-à-d. en raison de la létalité larvaire associée à la mutation), les mutants knock-out doivent être identifiés tôt dans l'ontogéne. Décrit ici est un protocole PCR-basé pour génotyper des animaux individuels au stade de gastrula sans sacrifier l'animal, qui permet d'identifier des mutants knock-out d'une population génétiquement hétérogène d'embryons. La durée de l'ensemble du processus de génotypage dépend du nombre d'embryons à dépister, mais il nécessite un minimum de 4-5 h.
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Protocol
1. Induction du frai, de la fécondation in vitro et de la dégelée
- Maintenir Nematostella vectensis dans l'eau de mer avec une salinité de 12 parties par millier (ppt) dans l'obscurité à 16 oC, alimentant Artemia tous les jours.
- La veille de l'induction du frai, placez les animaux dans un incubateur à température et à lumière. Programmez l'incubateur de sorte que les animaux soient exposés à 8 h de lumière à 25 oC. Facultatif : Nourrissez un petit morceaud'huître (1 mm 3) d'huîtres à des animaux individuels avant de les placer dans l'incubateur pour améliorer le frai.
- Laisser les animaux dans l'incubateur pendant 1 h à 16 oC.
- Retirez les animaux de l'incubateur et laissez-les sur un banc avec de la lumière à température ambiante (RT) pour permettre le frai. Le frai se produit habituellement dans les 1,5 à 2 h suivants.
- Si les mâles et les femelles sont dans des contenants séparés, placez les paquets d'œufs du contenant femelle dans un contenant mâle contenant des spermatozoïdes à l'aide d'une pipette de transfert dont la pointe est coupée pour agrandir l'ouverture afin que les œufs ne soient pas endommagés par un stress mécanique pendant transférer. Laisser les œufs être fécondés en les laissant dans le récipient mâle pendant au moins 15 min.
- Dégelée les paquets d'œufs dans l'eau de mer contenant 3% de cystéine (pH 7.4) sur un plat Petri ou dans un tube de 15 ml. Agiter doucement sur un shaker pendant 12 min.
- Utilisez une pipette en plastique pour briser les touffes et continuer à agiter pendant un autre 2-3 min jusqu'à ce que complètement déjellied.
- Enlever la cystéine en remplaçant les médias par de l'eau de mer fraîche pendant au moins 5 x.
- Gardez les œufs fécondés sur un plat Petri en verre à 16 oC ou RT.
2. Enlèvement chirurgical d'un tissu aboral d'un embryon de gastrula
- Préparer un tampon d'extraction d'ADN composé de 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3 % Tween20, 0,3 % NP40 et 1 mg/mL de protéinase K. Utilisez 20 mL de tampon d'extraction par embryon. Bien mélanger en vortexant et aliquot le tampon dans les tubes PCR.
- Dissoudre 1% d'agarose dans l'eau de mer et verser dans un plat Petri pour couvrir le fond. Refroidir sur un banc pour faire un lit en gel. Verser l'eau de mer fraîche pour couvrir le lit de gel dans le plat Petri.
- Transférer 24 h d'embryons post-fertilisation (hpf) (stade précoce à mi-gastrula) dans le plat Petri contenant un lit de gel agarose.
- Insérez une aiguille de tungstène dans un porte-aiguille et stérilisez en trempant la pointe de l'aiguille dans de l'alcool (70 % ou plus) et en la mettant en flammes pour brûler l'alcool.
- Sous un microscope à disséquer (à 20x à 40x grossissement), utiliser l'aiguille de tungstène pour faire une dépression sur le lit agarose en enlevant un morceau d'agarose de surface de la taille d'un embryon à manipuler, et placez l'embryon sur la dépression avec son latéral côté vers le bas afin de restreindre le mouvement de l'embryon pour la microchirurgie.
- Utilisez l'aiguille de tungstène pour exciser chirurgicalement un morceau de tissu aboral situé en face de l'ouverture blastorale orale. Un tiers à un quart du tissu embryonnaire le long de l'axe oral-aboral est généralement suffisant.
- Utilisez une pipette P20 pour transférer le tissu aboral isolé (en lt;2 ml) dans un tube PCR contenant 20 ml de tampon d'extraction d'ADN.
- Transférer l'embryon post-chirurgical dans un puits contenant au moins 500 ml d'eau de mer fraîche dans une assiette de 24 ou 96 puits.
- Répétez les étapes 2.4-2.8 pour le nombre d'embryons au besoin.
- Placez la plaque de puits contenant des embryons post-chirurgical dans un incubateur à 16 oC ou RT jusqu'à ce que le génotypage soit terminé.
3. Extraction et génotypage génomique de l'ADN PCR
- Faites brièvement tourner les tubes PCR contenant le tampon d'extraction d'ADN et les tissus embryonnaires isolés à l'aide d'une mini-centrifugeuse (p. ex. à 2 680 x g pour 10 s).
- Pour extraire l'ADN génomique d'embryons uniques, incubez les tubes PCR à 55 oC pendant 3 h. Vortex pendant 30 s toutes les 30 min afin d'assurer la rupture des amas cellulaires et d'améliorer la lyse cellulaire.
- Incuber les tubes PCR à 95 oC pendant 5 min pour inactiver la protéase K.
- Gardez les extraits d'ADNc à 4 oC ou sur la glace, et passez immédiatement à PCR.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici en plaçant des extraits d'aDNc dans un congélateur de -20 oC. - Configurez une réaction PCR à l'aide de l'ADN g extrait comme modèle pour amplifier le locus génomique d'intérêt.
- Si différents allèles au lieu d'intérêt diffèrent en taille de sorte que la différence de taille peut être détectée par électrophoresis gel agarose, concevoir un seul ensemble d'amorces pour amplifier l'ensemble du locus.
- Alternativement, utilisez des amorces spécifiques à l'allèle qui génèrent des produits PCR uniquement en présence de l'allèle spécifique; par exemple, en concevant l'amorce qui se lie à une région contenant des mutations d'insertion/suppression.
- Utilisez un mélange de réaction PCR typique de 20 mL comme suit : 5 ml d'extraits d'adnas, 8 ml d'eau sans nucléane, 4 ml de tampon PCR, 0,2 mL de 10 mMd, 0,6 mL de DMSO, 1 ml d'apprêt avant de 10 mmm, 1 ml d'amorce inverse de 10 mM , et 0,2 ml de polymérase d'ADN (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE : Plusieurs amorces peuvent être utilisées dans une réaction PCR. Par exemple, une amorce avant universelle et deux amorces inversées spécifiques à l'allèle peuvent être combinées, tant que les deux amorces inversées sont conçues pour générer des produits PCR de tailles distinctes afin que la présence/absence des deux allèles puisse être sans ambiguïté par électrophoresis de gel (voir la section des résultats représentatifs).
- Exécuter l'électrophorèse gel agarose pour déterminer la taille et la présence / absence des produits PCR. Ajuster l'état de l'électrophorèse de gel d'agarose (p. ex., pourcentage de gel d'agarose, V/cm, et durée) selon la taille prévue des produits DE PCR.
- Utilisez les résultats de PCR concernant la taille et la présence/absence des produits PCR pour attribuer un génotype à chaque embryon post-chirurgical. Par exemple, si différents allèles sont censés générer des produits PCR de différentes tailles, utilisez les informations de taille pour attribuer le génotype pour chaque embryon. Si des amorces spécifiques à l'allèle sont utilisées, les données sur la présence ou l'absence de produits PCR devraient être utilisées pour attribuer un génotype à chaque embryon.
- Trier les embryons selon le génotype.
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Representative Results
Le génome de Nematostella a un locus unique qui code une protéine précurseur pour le gLWamide neuropeptide. Trois alleles mutants knock-out à ce locus (glw-a, glw-b, et glw-c) ont été précédemment signalés5. Quatre mâles hétérozygotes portant un allèle de type sauvage (en) et allèle à élimination bée-c-cau locus gLWamide (génotype : ' ' ''' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' allele glw-a au même locus (génotype: '/glw-a)pour générer une progéniture. Il y a quatre génotypes possibles dans la progéniture : glw-a/glw-c, '/glw-c, glw-a/', et '/ '. De toute la descendance, huit embryons ont été choisis au hasard pour cet exemple représentatif de génotypage. Pour le génotypage PCR, une amorce avant universelle et deux amorces inversées spécifiques à l'allele ont été conçues5. L'amorce inverse spécifique à l'éblouissement -une se lie à une région contenant des mutations d'insertion, et la taille prévue du produit PCR est de 151 pb. L'amorce inversée spécifique à glw-c se lie à une région contenant à la fois des mutations d'insertion et de suppression, et la taille prévue du produit PCR est de 389 pb. Ni l'amorce inverse ne peut se lier à la séquence de type sauvage, et donc aucun produit PCR ne sera généré à partir d'embryons de type sauvage. La figure 1 montre un résultat représentatif de l'assidupc. Les embryons 1 et 2 montrent une seule bande PCR compatible avec la taille prévue de glw-a . Les embryons 3 et 6 montrent deux bandes PCR qui correspondent aux tailles attendues pour alleles glw-aet glw-c. Les embryons 4, 7 et 8 montrent une seule bande PCR compatible avec la taille prévue de glw-c . L'embryon 5 ne montre aucune bande, suggérant l'absence de liaison d'apprêt.
Pour écarter la possibilité d'une défaillance de l'extraction de l'ADNc, un autre PCR a été exécuté à l'aide d'une amorce inverse qui peut se lier à la séquence de type sauvage, qui a montré un produit PCR d'une taille prévue (1290 bp; Figure 2). Il convient de noter qu'à la figure 2, l'un des échantillons (indiqués par l'apo) ne montrait aucun produit de PCR, ce qui suggère une défaillance de l'extraction de l'ADNc.
Sur la base des résultats ci-dessus, le génotype de chaque embryon est interprété comme suit : embryon 1 : '/glw-a, embryon 2: '/glw-a, embryon 3: glw -a/glw-c, embryo 4: '/glw-c, embryon 5 : ' / ', embryon 6 : glw-a/glw-c, embryon 7 : '/glw-c, et embryon 8: '/glw-c.
Figure 1 : Résultats représentatifs d'un analyse pcR génotypage. 1-8 représentent des résultats de PCR de génotypage d'embryons échantillonnés au hasard parmi la progéniture d'un croisement mutant hétérozygote De F1 entre un mâle femelle et un mâle de glw./glw. gDNA a été extrait d'un fragment de tissu embryonnaire et utilisé comme modèle PCR. Le locus GLWamide a été ciblé pour l'amplification de PCR, et une amorce avant universelle et deux amorces inverses allèle-spécifiques ont été employées (tableau des matériaux). L'amorce inverse spécifique à l'éblouisseur-a génère une bande PCR de 151 pb (1, 2, 3, 6), tandis que l'amorce inverse spécifique à l'éblouisseur -c génère une bande PCR de 389 pb (3, 4, 6, 7, 8). Ni l'amorce inverse ne peut se lier à la séquence de type sauvage, et donc aucun produit PCR ne sera généré à partir d'embryons de type sauvage (5). Le gel agarose de 1,5 % a été exécuté à 128 V pendant 25 min. Une échelle d'ADN de 100 pb a été utilisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Résultats représentatifs de la PCR spécifique au locus pour confirmer la présence d'ADNc. Dix extraits d'ADNc qui n'ont pas réussi à générer des produits PCR dans des expériences PCR spécifiques aux allèles mutants, y compris l'embryon 5 de la figure 1 ('5'), ont été utilisés comme modèles PCR pour l'expérience PCR montrée. Un avant universel et inverse GLWamide-locus-spécifiques amorces ont été utilisés pour générer un produit PCR 1290 bp à partir d'un alléléage de type sauvage. Neuf extraits d'ADN sur dix (à l'exception de celui indiqué) montraient une bande de PCR de taille prévue, y compris l'embryon 5 de la figure 1 (5 '). Ceci suggère que l'échec de produire des produits de PCR à partir de l'embryon 5 n'était pas dû à l'absence d'un modèle suffisant de gDNA. Le gel d'agarose de 1,5 % a été exécuté à 128 V pendant 25 min. 1 échelle d'ADN de kb a été employée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Décrit ici un protocole basé sur PCR pour génotyper un seul embryon d'anémone de mer sans sacrifier l'animal. Après le frai et la dégelée, les œufs fécondés sont autorisés à se développer en gastrulae. La région aboral de chaque embryon de gastrula est enlevée chirurgicalement, et le tissu aboral isolé est employé pour l'extraction génomique suivante d'ADN, tandis que les embryons post-chirurgicaux restants guérissent et continuent le développement. Les extraits de gDNA sont ensuite utilisés pour un test PCR pour déterminer le génotype de chaque embryon. Cette méthode tire parti de la capacité des moitiés orales de l'embryon d'anémone de mer à réguler et à développer10,11, et la majorité des embryons (-gt;90%) survivent généralement à la chirurgie et se développent normalement dans des conditions de culture appropriées. La quantité de tissu requise pour cet analyse de génotypage est inférieure à la moitié d'un embryon entier de gastrula, et les résultats négatifs dus à l'échec d'extraction de gDNA sont rares (lt;5%). Étant donné que seule une petite quantité de tissu est nécessaire, il est probablement possible d'utiliser des embryons pré-gastrula étape pour cette analyse de génotypage; bien que, cela n'a pas encore été testé. Cette méthode peut être effectuée efficacement tant que l'animal n'a pas atteint un stade de natation active (c.-à-d. avant le stade de la planule de nage libre). Cette méthode de génotypage est particulièrement avantageuse dans les cas nécessitant la performance d'analyses de phénotype au cours du développement.
L'une des limites de ce protocole est que le nombre d'embryons pouvant être dépistés peut être limité. En particulier, l'ablation chirurgicale d'un tissu aboral peut prendre une à deux minutes par embryon, en particulier pour les non-initiés. Un chercheur expérimenté devrait être en mesure de compléter l'ensemble de l'examen du génotypage pour au moins 80 embryons par jour, mais les études portant sur des centaines ou des milliers d'embryons sont probablement trop longues pour être terminées en une seule journée.
Les chercheurs doivent également être conscients que le phénotype observé chez les mutants post-chirurgicales peut être différent de celui des mutants intacts, par exemple, en raison de l'effet de l'élimination des gènes sur la guérison et/ou la régulation embryonnaire des gaztrulae. Cette possibilité devrait être testée en examinant si le phénotype trouvé dans les mutants post-chirurgical est en effet observable chez les mutants intacts.
Il existe plusieurs approches alternatives à la méthode décrite de génotypage. Tout d'abord, l'immunostaining avec un anticorps contre une protéine dont l'expression est perdue dans les mutants knock-out peut être effectuée pour identifier les individus mutants knock-out d'une population génétiquement hétérogène d'animaux en développement. Deuxièmement, l'hybridation in situ peut être utilisée à cette fin, si la riboprobe peut être conçue de sorte qu'elle ne s'hybride pas aux ARNm mutants. Par exemple, si les allèles mutants d'un animal knock-out portent de grandes mutations de suppression dans la même région du gène, la riboprobe peut être conçue pour s'hybrider à la région du gène supprimé dans les mutants knock-out. Dans les deux cas, on s'attend à ce que les mutants knock-out ne montrent aucun étiquetage, alors que les individus hétérozygotes et sauvages devraient montrer l'étiquetage. Cependant, les animaux devront être sacrifiés en raison de la fixation des tissus nécessaires à la coloration. Enfin, les mutants knock-out peuvent être élevés à la maturité sexuelle et croisés les uns avec les autres pour générer une progéniture, qui devraient tous être mutants knock-out, et les analyses du phénotype développemental peut être effectuée en utilisant cette progéniture6. Cette méthode exige que les animaux knock-out sont viables et capables de reproduction et est donc limité dans son application aux gènes non essentiels.
Bien que le protocole de génotypage décrit soit conçu pour les embryons d'anémone de mer, il est possible d'utiliser cette méthode avec d'autres cnidaires dans lesquels l'information génomique et les embryons sont accessibles (p. ex. les coraux12 et les méduses13),tant que les embryons sont capables de guérir et de se réparer lors de l'ablation chirurgicale. Des expériences réussies de modification génétique par CRISPR ont déjà été signalées chez les coraux14 ainsi que dans les méduses hydrozoaires15,16. Les applications futures de ce protocole de génotypage aux cnidaires non anémones seront importantes pour l'étude de la base génétique de leur développement. Ceci, à son tour, sera la clé pour obtenir des aperçus mécanistes dans l'évolution du développement cnidaire remarquablement diversifié.
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Disclosures
L'auteur n'a rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions les critiques anonymes pour les commentaires sur la version antérieure du manuscrit, qui a amélioré le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des fonds de l'Université de l'Arkansas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
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