Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य भ्रूण का त्याग किए बिना समुद्र एनामोने नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस को गैसट्रेशन के दौरान जीनोटाइप करना है.
Abstract
यहाँ वर्णित एक पीसीआर आधारित प्रोटोकॉल है जो जानवर के जीवन का त्याग किए बिना एंथोजोआन निडरियन नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस के गैस्ट्रुला चरण भ्रूण को जीनोटाइप करने के लिए है। इन विट्रो निषेचन और डी-जेलिंग के बाद, युग्मनज को कमरे के तापमान पर 24 एच के लिए विकसित करने की अनुमति दी जाती है ताकि मध्य-गैस्ट्रुला चरण तक पहुंच सके। गैस्ट्रुला भ्रूण तो समुद्री जल युक्त एक पेट्री डिश में एक agarose जेल बिस्तर पर रखा जाता है. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक टंगस्टन सुई शल्य चिकित्सा प्रत्येक भ्रूण से एक aboral ऊतक टुकड़ा अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सर्जरी के बाद भ्रूण तो चंगा और विकास जारी रखने के लिए अनुमति दी जाती है. जीनोमिक डीएनए अलग ऊतक टुकड़ा से निकाला जाता है और टिड्डी विशेष पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया। जीनोटाइप पीसीआर उत्पादों या उपस्थिति /विशिष्ट पीसीआर उत्पादों की उपस्थिति/अभाव के आकार के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है। सर्जरी के बाद भ्रूण तो जीनोटाइप के अनुसार हल कर रहे हैं. पूरे जीनोटाइपिंग प्रक्रिया की अवधि जांच की जाने वाली भ्रूणों की संख्या पर निर्भर करती है, लेकिन इसके लिए न्यूनतम 4-5 ज की आवश्यकता होती है। इस विधि भ्रूण की एक आनुवंशिक रूप से विषम आबादी से नॉकआउट उत्परिवर्ती की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और विकास के दौरान phenotypes के विश्लेषण में सक्षम बनाता है.
Introduction
Cnidarians जेलीफ़िश, कोरल, और समुद्री anemones शामिल हैं कि जानवरों की एक विविध समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं। वे डिप्लोब्लास्ट, बहिर्चर्म और एंडोडर्म से बना है जो एक extracellular मैट्रिक्स (mesoglea) द्वारा अलग कर रहे हैं। Cnidaria एक बहन समूह के लिए कल्पना Bilateria है, जो इस तरह के Drosophila और Mus के रूप में पारंपरिक पशु मॉडल1से संबंधित है. इसके अतिरिक्त, Cnidaria-Bilateria विचलन पूर्व Cambrian अवधि2में हुई है माना जाता है. इस तरह के रूप में, उनके सबसे हाल ही में आम पूर्वज के जीव विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए nidarians और bilaterians के तुलनात्मक अध्ययन आवश्यक हैं. हाल ही में, तुलनात्मक जीनोमिक्स से पता चला है कि cnidarians और bilaterians पायदान और BHLH जैसे कई विकासात्मक टूलकिट जीन साझा करते हैं, जिसका अर्थ है कि उनके सामान्य पूर्वज में पहले से ही ये जीन3थे। हालांकि, Cnidaria और Bilateria के अंतिम आम पूर्वज में इन विकास Toolkit जीन की भूमिका तुलनात्मक रूप से कम अच्छी तरह से समझा जाता है. इस समस्या का समाधान करने के लिए, यह अध्ययन करना महत्वपूर्ण है कि ये गहराई से संरक्षित जीन कैसे निडरियन्स में कार्य करते हैं।
उभरते निडनेरियन आनुवंशिक मॉडलों में से एक एंथोजोअन नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस है। इसके जीनोम3अनुक्रम किया गया है, और आनुवंशिक उपकरणों की एक किस्म है, morpholino-मध्यस्थ जीन knockdown सहित, meganuclease-मध्यस्थ transgenesis, और CRISPR-Cas9-मध्यस्थ जीन knockins और knockouts, अब इस जानवर में उपयोग के लिए उपलब्ध हैं. इसके अलावा, नेमाटोस्टेला विकास अपेक्षाकृत अच्छी तरह से समझा जाता है। भ्रूणजनन के दौरान, गैस्ट्रेशन 4 के सेवन से होता है, और भ्रूण एक मुक्त-स्वीमिंग प्लैनुला लार्वा में विकसित होता है। planula बाद में एक मुंह और परिमुख जाल के साथ एक सेसाइल पॉलीप में बदल देती है। पॉलीप तो बढ़ता है और यौन परिपक्वता तक पहुँचता है.
CRISPR-Cas9-मध्यस्थ लक्षित मटजनन अब नियमित रूप से नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस5,6,7,8,9में जीन फंक्शन का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Nematostellaमें नॉकआउट म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए, एक कॉकटेल जिसमें टिड्डी-विशिष्ट एकल-गाइड आरएनए और एंडोनुकेलेस Cas9 प्रोटीन शामिल हैं, को पहले F0 संस्थापक जानवरों का उत्पादन करने के लिए अनफर्टिलाइज्ड या निषेचित अंडे में इंजेक्ट किया जाता है जो आम तौर पर दिखाते हैं मोज़ेकवाद. F0 जानवरों बाद में यौन परिपक्वता के लिए उठाया और एक दूसरे के साथ पार कर रहे हैं एक F1 जनसंख्या का उत्पादन, जिनमें से एक सबसेट नॉकआउट उत्परिवर्ती6हो सकता है . वैकल्पिक रूप से, यौन परिपक्व F0 जानवरों जंगली प्रकार जानवरों के साथ पार किया जा सकता है F1 विषमयुग्मज जानवरों उत्पन्न करने के लिए, और F1 heterozygotes कि ब्याज की टिड्डी में एक नॉकआउट allele ले तो एक दूसरे के साथ पार किया जा सकता है F2 वंश का उत्पादन करने के लिए, एक चौथाई जिनमें से नॉकआउट म्यूटेंट5होने की संभावना है. दोनों दृष्टिकोण एक आनुवंशिक रूप से विषम आबादी से नॉकआउट उत्परिवर्ती की पहचान करने के लिए एक विधि की आवश्यकता है. पॉलीप स्पर्शक का उपयोग जीनोटाइपिंग6,7के लिए जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए किया जा सकता है . हालांकि, मामलों में जहां ब्याज के जीन के विकास समारोह की जांच की जा रही है और उत्परिवर्ती भ्रूण पॉलीप चरण तक नहीं पहुंचते हैं (यानी, उत्परिवर्तन के साथ जुड़े लार्वा घातकता के कारण), नॉकआउट म्यूटेंट की पहचान जल्दी में करने की आवश्यकता है। यहाँ वर्णित एक पीसीआर आधारित प्रोटोकॉल जानवर का त्याग किए बिना gastrula चरण में जीनोटाइप व्यक्तिगत जानवरों के लिए है, जो भ्रूण की आनुवंशिक रूप से विषम आबादी से नॉकआउट उत्परिवर्ती की पहचान सक्षम बनाता है. पूरे जीनोटाइपिंग प्रक्रिया की अवधि जांच की जाने वाली भ्रूणों की संख्या पर निर्भर करती है, लेकिन इसके लिए न्यूनतम 4-5 ज की आवश्यकता होती है।
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Protocol
1. अंडे देने का प्रेरण, इन विट्रो निषेचन, और डी-जेलिंग
- समुद्र के पानी में नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस बनाए रखें, जिसमें 16 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में प्रति हजार (ppt) 12 भागों की लवणता होती है, जिससे आर्टेमिया दैनिक भोजन होता है।
- आगमन पैदा करने से पहले दिन, एक तापमान और प्रकाश नियंत्रित इनक्यूबेटर में जानवरों जगह है। इनक्यूबेटर को प्रोग्राम करें ताकि जंतुओं को 25 डिग्री सेल्सियस पर 8 ज प्रकाश से अवगत कराया जा सके। वैकल्पिक: अंडे देने को बढ़ाने केलिए उन्हें इनक्यूबेटर में रखने से पहले अलग-अलग जानवरों को सीप का एक छोटा सा टुकड़ा (और 1 मिमी 3) खिलाएं।
- 16 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेटर में जानवरों को छोड़ दें।
- इनक्यूबेटर से जानवरों को निकालें और उन्हें कमरे के तापमान (आरटी) पर प्रकाश के साथ बेंचटॉप पर छोड़ दें ताकि अंडे देने की अनुमति दी जा सके। Spawning आमतौर पर अगले 1.5-2 ज के भीतर होता है.
- यदि पुरुषों और महिलाओं को अलग कंटेनरों में हैं, एक शुक्राणु युक्त पुरुष कंटेनर में महिला कंटेनर से अंडे संकुल जगह एक हस्तांतरण pipette जिसका टिप खोलने विस्तार करने के लिए कटौती की है का उपयोग करके इतना है कि अंडे के दौरान यांत्रिक तनाव से क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे हैं स्थानांतरण. कम से कम 15 मिनट के लिए उन्हें पुरुष कंटेनर में छोड़ कर अंडे निषेचित होने की अनुमति दें।
- डी-जेली समुद्री जल में अंडे संकुल जिसमें 3% सिस्टीन (पीएच 7.4) एक पेट्री डिश पर या 15 एमएल ट्यूब में होता है। धीरे से 12 मिनट के लिए एक शेकर पर आंदोलन.
- एक प्लास्टिक pippette का प्रयोग करें clumps को तोड़ने के लिए और एक और 2-3 मिनट के लिए आंदोलन जारी रखने के लिए जब तक पूरी तरह से de-Jellied.
- कम से कम 5x के लिए ताजा समुद्री जल के साथ मीडिया की जगह cysteine निकालें.
- 16 डिग्री सेल्सियस या आरटी पर एक गिलास पेट्री डिश पर निषेचित अंडे रखें।
2. गैस्ट्रुला भ्रूण से एक अपमुख ऊतक का सर्जिकल हटाने
- एक डीएनए निष्कर्षण बफर तैयार करें जिसमें 10 एमएम ट्रास-एचसीएल (पीएच 8), 50 एमएम केसीएल, 1 एमएम ईडीटीए, 0.3% ट्वेन20, 0.3% एनपी 40, और 1 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन्स के 20 एमएल का उपयोग प्रति भ्रूण निष्कर्षण बफर के। पीसीआर ट्यूबों में भंवर और alicot बफर द्वारा अच्छी तरह से मिक्स.
- समुद्री जल में 1% agarose भंग और यह एक पेट्री डिश में डाल करने के लिए नीचे कवर. एक जेल बिस्तर बनाने के लिए एक बेंचटॉप पर शांत। पेट्री डिश में जेल बिस्तर को कवर करने के लिए ताजा समुद्री जल डालो।
- स्थानांतरण 24 एच के बाद निषेचन (hpf) भ्रूण (जल्दी से मध्य gastrula चरण के लिए) एक agarose जेल बिस्तर युक्त पेट्री डिश में.
- एक सुई धारक में एक टंगस्टन सुई डालें और शराब (70% या अधिक) में सुई टिप सूई द्वारा बाँझ और यह लौ में रखने के लिए बंद शराब जला.
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत (20x से 40x आवर्धन) के तहत, टंगस्टन सुई का उपयोग करने के लिए एक भ्रूण के आकार के बारे में सतह agarose के एक टुकड़े को हटाने के द्वारा agarose बिस्तर पर एक अवसाद बनाने के लिए हेरफेर किया जा करने के लिए, और अपने पार्श्व के साथ अवसाद पर भ्रूण जगह माइक्रोसर्जरी के लिए भ्रूण की आवाजाही को प्रतिबंधित करने के लिए साइड फेसिंग डाउन।
- मौखिक blastoporal खोलने के सामने स्थित aboral ऊतक का एक टुकड़ा शल्य चिकित्सा आबकारी करने के लिए टंगस्टन सुई का प्रयोग करें। मुख-अपमुख अक्ष के साथ भ्रूणीय ऊतक का एक-तिहाई से एक-चौथाई भाग आमतौर पर पर्याप्त होता है।
- डीएनए निष्कर्षण बफर के 20 एमएल युक्त एक पीसीआर ट्यूब के लिए अलग aboral ऊतक (में और 2 एमएल) स्थानांतरित करने के लिए एक P20 पिपेट का उपयोग करें।
- सर्जरी के बाद भ्रूण को 24 या 96-वेल प्लेट में कम से कम 500 एमएल मीठे समुद्री जल से युक्त एक कुएं में स्थानांतरित करें।
- आवश्यकतानुसार भ्रूणों की संख्या के लिए चरण 2-4-2-8 दोहराएँ।
- जीनोटाइपिंग पूरा होने तक 16 डिग्री सेल्सियस या आरटी में पोस्ट-सर्जरी भ्रूण युक्त अच्छी तरह से प्लेट रखें।
3. जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण और जीनोटाइपिंग पीसीआर
- एक मिनी-सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके डीएनए निष्कर्षण बफर और पृथक भ्रूण ऊतकों वाले पीसीआर ट्यूबों को संक्षेप में स्पिन करें (उदाहरण के लिए 10 s के लिए 2,680 x g पर)।
- एकल भ्रूण से जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए, पीसीआर ट्यूबों को 55 डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए इनक्यूबेट करें 30 एस हर 30 मिनट के लिए सेल क्लंप्स का ब्रेकअप सुनिश्चित करने और सेल lysis को बढ़ाने के लिए।
- प्रोटीनाज के निष्क्रिय करने के लिए पीसीआर ट्यूबों को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- GDNA अर्क 4 डिग्री सेल्सियस पर या बर्फ पर रखें, और तुरंत पीसीआर के लिए आगे बढ़ें।
नोट: प्रोटोकॉल एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में gDNA अर्क रखकर यहाँ रोका जा सकता है. - ब्याज के जीनोमिक टिड्डी बढ़ाना करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में निकाले gDNA का उपयोग कर एक पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें।
- यदि ब्याज की लोकपथ पर विभिन्न alleles आकार में अलग इतना है कि आकार अंतर agarose जेल electrophoresis द्वारा पता लगाया जा सकता है, प्राइमर का एक सेट डिजाइन करने के लिए पूरे टिड्डी बढ़ाना.
- वैकल्पिक रूप से, केवल विशिष्ट एलीले की उपस्थिति में PCR उत्पाद जनरेट करने वाले allele-विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करें; उदाहरण के लिए, प्राइमर को डिजाइन करके जो सम्मिलन/हटाने वाले उत्परिवर्तनों वाले क्षेत्र से बांधता है।
- एक ठेठ 20 एमएल पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण इस प्रकार का प्रयोग करें: gDNA अर्क के 5 एमएल, nuclease मुक्त पानी के 8 एमएल, पीसीआर बफर के 4 एमएल, 10 mM dNTPs के 0.2 एमएल, DMSO के 0.6 एमएल, 10 एमएल आगे प्राइमर, 10 एमएम रिवर्स प्राइमर के 1 एमएल और 0ण्2 एमएल डी.एन.ए. पॉलिमरेज (सामग्री की सारणीदेखें )
नोट: एकाधिक प्राइमर एक पीसीआर प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक सार्वभौमिक आगे प्राइमर और दो allele-विशिष्ट रिवर्स प्राइमर संयुक्त किया जा सकता है, जब तक दो रिवर्स प्राइमर अलग आकार के पीसीआर उत्पादों को उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं ताकि उपस्थिति / जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा निर्धारित (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें).।
- पीसीआर उत्पादों के आकार और उपस्थिति/अभाव का निर्धारण करने के लिए agaros जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस चलाएँ। पीसीआर उत्पादों के अपेक्षित आकार के आधार पर agarose जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (उदा., agarose जेल प्रतिशत, V/cm, और अवधि) की स्थिति को समायोजित करें।
- प्रत्येक पोस्ट-सर्जरी भ्रूण को जीनोटाइप असाइन करने के लिए पीसीआर उत्पादों के आकार और उपस्थिति/अभाव के बारे में पीसीआर के परिणामों का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, यदि विभिन्न एलील्स से विभिन्न आकारों के PCR उत्पाद उत्पन्न करने की अपेक्षा की जाती है, तो प्रत्येक भ्रूण के लिए जीनोटाइप असाइन करने के लिए आकार जानकारी का उपयोग करें. यदि एले-विशिष्ट प्राइमर का उपयोग किया जाता है, तो पीसीआर उत्पादों की उपस्थिति/अभाव पर डेटा का उपयोग प्रत्येक भ्रूण को जीनोटाइप असाइन करने के लिए किया जाना चाहिए।
- जीनोटाइप के अनुसार भ्रूणों को क्रमबद्ध करें।
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Representative Results
नेमाटोस्टेला जीनोम में एक एकल स्थान है जो न्यूरोपेप्टाइड ग्लोवामाइड के लिए एक अग्रदूत प्रोटीन को एन्कोड करता है। इस लोकस (ग्लवा- ए, ग्लवा- बी, और ग्लडब्ल्यू-सी) में तीन नॉकआउट उत्परिवर्ती एलेल्स पहले5सूचित किए जा चुके हैं . चार विषमयुग्मज पुरुष एक जंगली प्रकार के एलील (+) और नॉकआउट एले-गव-सीपर GLWamide लोकस (जीनोटाइप: +/glw-c) को एक विषमयुग्मज महिला के साथ पार कर गया था जो एक जंगली-प्रकार के एलील और अलग-अलग नॉकआउट ले जा रही थी एक संतान उत्पन्न करने के लिए एक ही स्थान पर एलेग्व-a (genotype: +/glw-a) संतान में चार संभावित जीनोटाइप हैं: glw-a/glw-c, +/glw-c, glw-a/+, और +/+. सभी संतान ों में से, आठ भ्रूण बेतरतीब ढंग से इस प्रतिनिधि जीनोटाइपिंग परख के लिए चुना गया. जीनोटाइपिंग पीसीआर के लिए, एक सार्वभौमिक फॉरवर्ड प्राइमर और दो एलील-विशिष्ट रिवर्स प्राइमर को5डिजाइन किए गए थे। glw के लिए विशिष्ट रिवर्स प्राइमर -एक सम्मिलन उत्परिवर्तन युक्त क्षेत्र के लिए बांधता है, और पीसीआर उत्पाद की उम्मीद आकार 151 बीपी है। glw-c के लिए विशिष्ट रिवर्स प्राइमर दोनों प्रविष्टि और विलोपन उत्परिवर्तनयुक्त क्षेत्र के लिए बांधता है, और पीसीआर उत्पाद की उम्मीद आकार 389 बीपी है। न तो रिवर्स प्राइमर जंगली प्रकार अनुक्रम के लिए बाध्य कर सकते हैं, और इस प्रकार कोई पीसीआर उत्पादों जंगली प्रकार भ्रूण से उत्पन्न किया जाएगा। चित्र 1 PCR परख का एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है. भ्रूण 1 और 2 glw-a की उम्मीद आकार के अनुरूप एक एकल पीसीआर बैंड दिखा . भ्रूण 3 और 6 दो पीसीआर बैंड है कि alleles glw-aऔर glw-cके लिए अपेक्षित आकार के अनुरूप दिखाते हैं. भ्रूण 4, 7, और 8 glw-c की उम्मीद आकार के साथ संगत एक एकल पीसीआर बैंड दिखाते हैं। भ्रूण 5 कोई बैंड से पता चलता है, प्राइमर बाध्यकारी की कमी का सुझाव.
gDNA निष्कर्षण विफलता की संभावना से इनकार करने के लिए, एक और PCR जंगली प्रकार अनुक्रम है, जो एक अपेक्षित आकार (1290 bp) की एक पीसीआर उत्पाद दिखाया करने के लिए बाइंड कर सकते हैं कि एक रिवर्स प्राइमर का उपयोग कर चलाया गया था; चित्र 2) यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि चित्र 2में, नमूनों में से एक (*द्वारा इंगित) कोई पीसीआर उत्पादों से पता चला, gDNA निष्कर्षण में विफलता का सुझाव.
उपरोक्त परिणामों के आधार पर, प्रत्येक भ्रूण के जीनोटाइप की व्याख्या इस प्रकार है: भ्रूण 1: +/glw-a, भ्रूण 2: +/glw-a, भ्रूण 3: glw-a/ glw-c, भ्रूण 4: +/glw-c, भ्रूण 5: +/+, भ्रूण 6: glw-a/glw-c, भ्रूण 7: +/glw-c, और भ्रूण 8: +/glw-c.
चित्र 1: एक genotyping पीसीआर परख के प्रतिनिधि परिणाम. 1-8 एक के बीच एक F1 विषमयुग्मज उत्परिवर्ती पार की संतति के बीच बेतरतीब ढंग से नमूना भ्रूण से जीनोटाइपिंग पीसीआर परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं +/glw-एक महिला और +/glw-cपुरुषों. gDNA एक भ्रूण ऊतक टुकड़ा से निकाला गया था और एक पीसीआर टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया. GLWamide टिड्डी पीसीआर प्रवर्धन के लिए लक्षित किया गया था, और एक सार्वभौमिक आगे प्राइमर और दो allele-विशिष्ट रिवर्स प्राइमर इस्तेमाल किया गया (सामग्री कीतालिका). glw के लिए विशिष्ट रिवर्स प्राइमर -a एक 151 बीपी पीसीआर बैंड (1, 2, 3, 6) उत्पन्न करता है, जबकि रिवर्स प्राइमर glw करने के लिए विशिष्ट -c एक 389 बीपी पीसीआर बैंड (3, 4, 6, 7, 8) उत्पन्न करता है। न तो रिवर्स प्राइमर जंगली प्रकार अनुक्रम के लिए बाध्य कर सकते हैं, और इस प्रकार कोई पीसीआर उत्पादों जंगली प्रकार भ्रूण (5) से उत्पन्न किया जाएगा. 1.5% agarose जेल 25 मिनट के लिए 128 वी पर चलाया गया था. एक 100 बीपी डीएनए सीढ़ी इस्तेमाल किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: gDNA की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए टिड्डी-विशिष्ट PCR के प्रतिनिधि परिणाम। दस gDNA अर्क है कि glw उत्परिवर्ती allele-विशिष्ट PCR प्रयोगों में पीसीआर उत्पादों को उत्पन्न करने में विफल रहा, भ्रूण सहित 5 चित्र1 से ('5'), पीसीआर प्रयोग दिखाया के लिए पीसीआर टेम्पलेट्स के रूप में इस्तेमाल किया गया. एक सार्वभौमिक आगे और रिवर्स GLWamide-लोक-विशिष्ट प्राइमर एक जंगली प्रकार allele से एक 1290 बीपी पीसीआर उत्पाद उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया. दस में से नौ डीएनए निष्कर्षों (एक संकेत के लिए छोड़कर *) अपेक्षित आकार की एक पीसीआर बैंड दिखाया, चित्रा 1 से भ्रूण 5 सहित ('5'). यह पता चलता है कि भ्रूण से पीसीआर उत्पादों को उत्पन्न करने में विफलता 5 एक पर्याप्त gDNA टेम्पलेट की कमी के कारण नहीं था. 1.5% agarose जेल 25 मिनट के लिए 128 वी पर चलाया गया था 1 kb डीएनए सीढ़ी इस्तेमाल किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यहाँ एक पीसीआर आधारित प्रोटोकॉल के लिए पशु त्याग के बिना एक एकल समुद्र anemone भ्रूण जीनोटाइप वर्णित. अंडे देने और डी-जेलिंग के बाद, निषेचित अंडे को गैस्ट्रूले में विकसित करने की अनुमति है। प्रत्येक gastrula भ्रूण के aboral क्षेत्र शल्य चिकित्सा से हटा दिया जाता है, और अलग aboral ऊतक बाद जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि शेष पोस्ट सर्जरी भ्रूण चंगा और विकास जारी है. GDNA अर्क तो एक पीसीआर परख के लिए उपयोग किया जाता है प्रत्येक भ्रूण के जीनोटाइप निर्धारित करने के लिए. इस विधि को विनियमित करने और विकसित करने के लिए समुद्र anemone भ्रूण के मौखिक हिस्सों की क्षमता का लाभ लेता है10,11, और भ्रूण के बहुमत (gt; 90%) आम तौर पर सर्जरी जीवित है और उचित संस्कृति की स्थिति के तहत सामान्य रूप से विकसित. इस जीनोटाइपिंग परख के लिए आवश्यक ऊतक राशि एक पूरे गैस्ट्रुला भ्रूण के आधे से भी कम है, और gDNA निष्कर्षण विफलता के कारण नकारात्मक परिणाम दुर्लभ हैं (और lt;5%)। यह देखते हुए कि केवल ऊतक की एक छोटी राशि आवश्यक है, यह इस genotyping परख के लिए पूर्व gastrula चरण भ्रूण का उपयोग करने की संभावना है; हालांकि, यह अभी तक परीक्षण किया जाना है. इस विधि के रूप में लंबे समय के रूप में पशु सक्रिय तैराकी के एक चरण तक नहीं पहुँच गया है कुशलता से किया जा सकता है (यानी, मुक्त swimming planula चरण से पहले). विकास के दौरान फीनोटाइप विश्लेषण के प्रदर्शन की आवश्यकता वाले मामलों में यह जीनोटाइपिंग विधि विशेष रूप से लाभप्रद है।
इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि जांच करने में सक्षम भ्रूणों की संख्या सीमित हो सकती है। विशेष रूप से, एक aboral ऊतक के सर्जिकल हटाने भ्रूण प्रति एक से दो मिनट लग सकते हैं, विशेष रूप से uninitiated के लिए. एक अनुभवी शोधकर्ता प्रति दिन कम से कम 80 भ्रूण के लिए पूरे जीनोटाइपिंग परख को पूरा करने में सक्षम होना चाहिए, लेकिन सैकड़ों या भ्रूण के हजारों शामिल अध्ययन भी समय लेने वाली एक दिन में पूरा करने की संभावना है.
शोधकर्ताओं को यह भी ध्यान में रखना चाहिए कि सर्जरी के बाद म्यूटेंट में मनाया गया फीनोटाइप उस से अलग हो सकता है बरकरार म्यूटेंट में, उदाहरण के लिए, उपचार पर जीन नॉकआउट के प्रभाव के कारण और/ इस संभावना की जांच के द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिए कि क्या phenotype पोस्ट सर्जरी म्यूटेंट में पाया वास्तव में बरकरार म्यूटेंट में नजर है.
जीनोटाइपिंग की वर्णित विधि के लिए कई वैकल्पिक दृष्टिकोण हैं। सबसे पहले, एक प्रोटीन जिसकी अभिव्यक्ति नॉकआउट उत्परिवर्ती में खो दिया है के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेनिंग विकासशील जानवरों की एक आनुवंशिक रूप से विषम आबादी से नॉकआउट उत्परिवर्ती व्यक्तियों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। दूसरा, situ संकरीकरण में इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, अगर riboprobe इतना है कि यह उत्परिवर्ती mRNAs संकर नहीं है डिजाइन किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, यदि एक नॉकआउट जानवर के उत्परिवर्ती alleles जीन के एक ही क्षेत्र में बड़े विलोपन उत्परिवर्तन ले, riboprobe नॉकआउट उत्परिवर्ती में नष्ट जीन के क्षेत्र को संकर करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है. दोनों ही मामलों में, नॉकआउट म्यूटेंट से कोई लेबलिंग नहीं दिखाने की उम्मीद की जाती है, जबकि हेटरोजोजियस और जंगली-प्रकार के व्यक्तियों को लेबलिंग दिखानी चाहिए। हालांकि, जानवरों को धुंधला करने के लिए आवश्यक ऊतक निर्धारण के कारण बलिदान करने की आवश्यकता होगी। अंत में, नॉकआउट उत्परिवर्ती यौन परिपक्वता के लिए उठाया जा सकता है और एक दूसरे के साथ पार करने के लिए एक संतान उत्पन्न, जिनमें से सभी नॉकआउट उत्परिवर्ती होना चाहिए, और विकास phenotype के विश्लेषण इस संतान6का उपयोग कर किया जा सकता है. इस विधि की आवश्यकता है कि नॉकआउट जानवरों व्यवहार्य और प्रजनन करने में सक्षम हैं और इस प्रकार nonessential जीन के लिए अपने आवेदन में सीमित है.
हालांकि वर्णित जीनोटाइपिंग प्रोटोकॉल समुद्र एनमोन भ्रूण के लिए डिज़ाइन किया गया है, यह अन्य निडरियन के साथ इस विधि का उपयोग करना संभव है जिसमें जीनोमिक जानकारी और भ्रूण दोनों सुलभ हैं (जैसे, कोरल12 और जेलीफ़िश13),जब तक भ्रूण शल्य चिकित्सा हटाने पर उपचार और विनियमन करने में सक्षम हैं। सफल CRISPR मध्यस्थता जीन संशोधन प्रयोगों पहले से ही कोरल14 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से hydrozoan जेलीफ़िश15,16में सूचित किया गया है. गैर समुद्र anemone nidarians के लिए इस जीनोटाइपिंग प्रोटोकॉल के भविष्य के आवेदन उनके विकास के आनुवंशिक आधार के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा. यह, बारी में, उल्लेखनीय विविध निडनेरियन विकास के विकास में मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण होगा.
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Disclosures
लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम पांडुलिपि है, जो पांडुलिपि में सुधार के पिछले संस्करण पर टिप्पणी के लिए गुमनाम समीक्षक धन्यवाद. इस काम Arkansas विश्वविद्यालय से धन द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
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