Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di genottare l'anemone di mare Nematostella vectensis durante la gastrulation senza sacrificare l'embrione.
Abstract
Descritto qui è un protocollo basato su PCR per genotipare l'embrione dello stadio gastrula del cnidariano anthozoano Nematostella vectensis senza sacrificare la vita dell'animale. Dopo la fecondazione in vitro e la de-jellying, gli zigoti sono autorizzati a svilupparsi per 24 h a temperatura ambiente per raggiungere la fase iniziale-medio gastrula. Gli embrioni di gastrula vengono poi posti su un letto di gel di agarose in un piatto Petri contenente acqua di mare. Al microscopio dissezioso, un ago di tungsteno viene utilizzato per separare chirurgicamente un frammento di tessuto aborale da ogni embrione. Gli embrioni post-chirurgia sono poi autorizzati a guarire e continuare lo sviluppo. Il DNA genomico viene estratto dal frammento di tessuto isolato e utilizzato come modello per la PCR specifica per il locus. Il genotipo può essere determinato in base alle dimensioni dei prodotti PCR o alla presenza/assenza di prodotti PCR specifici per alleli. Gli embrioni post-chirurgia vengono poi ordinati in base al genotipo. La durata dell'intero processo di genotipizzazione dipende dal numero di embrioni da vagliare, ma richiede minimamente 4-5 h. Questo metodo può essere utilizzato per identificare i mutanti knockout provenienti da una popolazione geneticamente eterogenea di embrioni e consente l'analisi dei fenotipi durante lo sviluppo.
Introduction
I cnidariani rappresentano un gruppo eterogeneo di animali che includono meduse, coralli e anemoni di mare. Sono diploblasti, composti da ectodermi ed endodermi separati da una matrice extracellulare (mesoglea). Cnidaria è un gruppo gemello per speciosiare Bilateria, a cui i modelli animali tradizionali come Drosophila e Mus appartengono1. Inoltre, si pensa che la divergenza di Cnidaria-Bilateria si sia verificata nel periodo pre-Cambriano2. Come tale, gli studi comparativi di cnidariani e bilateriani sono essenziali per ottenere informazioni sulla biologia del loro antenato comune più recente. Recentemente, la genomica comparativa ha rivelato che i cnidariani e i bilateriani condividono molti geni del toolkit di sviluppo come tacca e bHLH, il che implica che il loro antenato comune aveva già questi geni3. Tuttavia, il ruolo di questi geni del toolkit di sviluppo nell'ultimo antenato comune di Cnidaria e Bilateria è comparabilmente meno ben compreso. Per affrontare questo problema, è fondamentale studiare come funzionano questi geni profondamente conservati nei cnidariani.
Uno dei modelli genetici cnidariani emergenti è l'antozoo Nematostella vectensis. Il suo genoma è stato sequenziato3, e una varietà di strumenti genetici, tra cui il knockdown genico mediato da morfolino, la transgenesi mediata da meganucle e le knockine e knockout genici mediati da CRISPR-Cas9, sono ora disponibili per l'uso in questo animale. Inoltre, lo sviluppo di Nematostella è relativamente ben compreso. Durante l'embriogenesi, la gastrazione si verifica per invaginazione4e l'embrione si sviluppa in una larva di planula che nuota liberamente. La planula successivamente si trasforma in un polipo sessile con bocca e tentacoli circumorali. Il polipo poi cresce e raggiunge la maturità sessuale.
La mutagenesi mirata mediata da CRISPR-Cas9 è ora abitualmente utilizzata per studiare la funzione genica nella vectensis 5 di Nematostella5,6,7,8,9. Per generare mutanti knockout a Nematostella, un cocktail contenente RNA a guida singola specifici di locus e la proteina Cas9 endonuclease viene iniettato per la prima volta in uova non fecondate o fecondate per produrre animali fondatori F0 che in genere mostrano Mosaicism. Gli animali F0 vengono successivamente allevati alla maturità sessuale e incrociati tra loro per produrre una popolazione di F1, un sottoinsieme dei quali può essere mutanti ad eliminazione diretta6. In alternativa, gli animali F0 sessualmente maturi possono essere incrociati con animali di tipo selvatico per generare animali eterozigoti F1, e gli eterozigoti F1 che portano un allele da urlo nel locus di interesse possono quindi essere incrociati tra loro per produrre F2 prole, un quarto di cui dovrebbero essere mutanti ad eliminazione diretta5. Entrambi gli approcci richiedono un metodo per identificare i mutanti knockout provenienti da una popolazione geneticamente eterogenea. I tentacoli polipici possono essere utilizzati per estrarre il DNA genomico per la genotipizzazione6,7. Tuttavia, nei casi in cui si sta studiando la funzione dello sviluppo del gene di interesse e gli embrioni mutanti non raggiungono lo stadio polipo (cioè a causa della letalità larvale associata alla mutazione), i mutanti knockout devono essere identificati precocemente nell'ontogenesi. Descritto qui è un protocollo basato su PCR per genotipare singoli animali allo stadio gastrula senza sacrificare l'animale, che consente l'identificazione di mutanti knockout da una popolazione geneticamente eterogenea di embrioni. La durata dell'intero processo di genotipizzazione dipende dal numero di embrioni da vagliare, ma richiede minimamente 4-5 h.
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Protocol
1. Induzione della deposizione delle uova, fecondazione in vitro e deduzione
- Mantenere la veturi di Nematostella nell'acqua di mare con una salinità di 12 parti per mille (ppt) al buio a 16 gradi centigradi, alimentando Artemia ogni giorno.
- Il giorno prima dell'induzione della deposizione delle uova, posizionare gli animali in un'incubatrice a temperatura e a luce. Programmare l'incubatrice in modo che gli animali siano esposti a 8 h di luce a 25 gradi centigradi. Facoltativo: alimentare un piccolo pezzo (<1 mm3) di ostrica ai singoli animali prima di inserirli nell'incubatrice per migliorare la deposizione delle uova.
- Lasciare gli animali nell'incubatrice per 1 h a 16 gradi centigradi.
- Togliere gli animali dall'incubatrice e lasciarli su una panchina con luce a temperatura ambiente (RT) per consentire la deposizione delle uova. La riproduzione di solito si verifica entro il prossimo 1,5–2 h.
- Se i maschi e le femmine si trovano in contenitori separati, inserire i pacchetti di uova dal contenitore femminile in un contenitore maschio contenente spermatozoi utilizzando una pipetta di trasferimento la cui punta viene tagliata per ingrandire l'apertura in modo che le uova non siano danneggiate da stress meccanico durante trasferire. Lasciare che le uova siano fecondate lasciandole nel contenitore maschile per almeno 15 min.
- De-jelly i pacchetti di uova in acqua di mare contenenti 3% cisteina (pH 7.4) su un piatto Petri o in un tubo da 15 mL. Agitare delicatamente su uno shaker per 12 min.
- Utilizzare una pipetta di plastica per rompere i grumi e continuare ad agitare per altri 2-3 minuti fino a quando completamente de-jellied.
- Rimuovere la cisteina sostituendo il supporto con acqua di mare fresca per almeno 5x.
- Conservare le uova fecondate su un piatto di Petri di vetro a 16 gradi centigradi o RT.
2. Rimozione chirurgica di un tessuto aborale da un embrione di gastrula
- Preparare un buffer di estrazione del DNA composto da 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 e 1 mg/mL di proteina K. Utilizzare 20 mL del buffer di estrazione per embrione. Mescolare bene vorticee e il tampone in tubi PCR.
- Sciogliere l'1% di agarose nell'acqua di mare e versarla in un piatto Petri per coprire il fondo. Raffreddare su un banco per fare un letto gel. Versare acqua di mare fresca per coprire il letto di gel nel piatto Petri.
- Trasferire nella piastra Petri embrioni da 24 h post-fecondazione (hpf) (stadio da inizio gastrula) contenente un letto di gel di agarose.
- Inserire un ago di tungsteno in un portaa ago e sterilizzare immergendo la punta dell'ago nell'alcool (70% o superiore) e mettendolo in fiamme per bruciare l'alcol.
- Sotto un microscopio dissezioso (a magnifiche da 20x a 40x), utilizzare l'ago di tungsteno per fare una depressione sul letto di agarose rimuovendo un pezzo di superficie agarose circa le dimensioni di un embrione da manipolare, e posizionare l'embrione sulla depressione con la sua laterale verso il basso per limitare il movimento dell'embrione per la microchirurgia.
- Utilizzare l'ago del tungsteno per eccitare chirurgicamente un pezzo di tessuto aborale situato di fronte all'apertura blastoporale orale. Di solito è sufficiente un aboral aboral a un quarto del tessuto embrionale lungo l'asse orale-aborale.
- Utilizzare una pipetta P20 per trasferire il tessuto aborare isolato (in <2 mL) in un tubo PCR contenente 20 mL di buffer di estrazione del DNA.
- Trasferire l'embrione post-chirurgia in un pozzo contenente almeno 500 mL di acqua dolce in una piastra di 24 o 96 pozze.
- Ripetere i passaggi da 2,4 a 2,8 per il numero di embrioni in base alle esigenze.
- Posizionare la piastra del pozzo contenente gli embrioni post-chirurgia in un'incubatrice a 16 gradi centigradi o RT fino al completamento della genotipizzazione.
3. Estrazione del DNA genomico e genotipizzazione PCR
- Far girare brevemente i tubi PCR contenenti il buffer di estrazione del DNA e i tessuti embrionali isolati utilizzando una mini centrifuga (ad esempio a 2.680 x g per 10 s).
- Per estrarre il DNA genomico da singoli embrioni, incubare i tubi PCR a 55 gradi centigradi per 3 h. Vortex per 30 s ogni 30 min per garantire la rottura dei grumi cellulari e migliorare la lisi cellulare.
- Incubare i tubi PCR a 95 gradi centigradi per 5 minuti per inattivare la proteinasi K.
- Conservare gli estratti di gDNA a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio e procedere immediatamente alla PCR.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui inserendo estratti gDNA in un congelatore -20 . - Impostare una reazione PCR utilizzando gDNA estratto come modello per amplificare il locus genomico di interesse.
- Se diversi alleli al luogo di interesse differiscono in termini di dimensioni in modo che la differenza di dimensioni possa essere rilevata dall'elettroforesi gel agarose, progettare un unico set di primer per amplificare l'intero locus.
- In alternativa, utilizzare primer specifici per alleli che generano prodotti PCR solo in presenza dell'allele specifico; ad esempio, progettando l'incarico che si lega a una regione contenente mutazioni di inserimento/eliminazione.
- Utilizzare un tipico mix di reazione PCR da 20 mL come segue: 5 mL di estratti di gDNA, 8 mL di acqua senza nucleato, 4 mL di buffer PCR, 0,2 mL di 10mM dNTP, 0,6 mL di DMSO, 1 mL di 10 mM di primer in avanti di 10 mM, 1 mL di 10 mM in avanti , e 0,2 mL di polimerasi del DNA (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: in una reazione PCR è possibile utilizzare più primer. Ad esempio, è possibile combinare un primer in avanti universale e due primer invertiti specifici per gli alleli, a condizione che i due primer invertiti siano progettati per generare prodotti PCR di dimensioni distinte in modo che la presenza/assenza dei due alleli possa essere inequivocabilmente determinata dall'elettroforesi gel (vedi sezione dei risultati rappresentativi).
- Eseguire l'elettroforesi gel di agarose per determinare le dimensioni e la presenza/assenza di prodotti PCR. Regolare la condizione dell'elettroforesi del gel di agarose (ad esempio, percentuale di gel di agarose, V/cm e durata) a seconda delle dimensioni previste dei prodotti PCR.
- Utilizzare i risultati della PCR per quanto riguarda le dimensioni e la presenza/assenza di prodotti PCR per assegnare un genotipo a ogni embrione post-chirurgico. Ad esempio, se si prevede che diversi alleli generino prodotti PCR di dimensioni diverse, utilizzare le informazioni sulle dimensioni per assegnare il genotipo per ogni embrione. Se si utilizzano primer specifici dell'allele, i dati sulla presenza/assenza di prodotti PCR devono essere utilizzati per assegnare un genotipo a ciascun embrione.
- Ordinare gli embrioni in base al genotipo.
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Representative Results
Il genoma di Nematostella ha un singolo locus che codifica una proteina precursore per il neuropeptide GLWamide. Tre alleli mutanti knockout in questo locus (glw-a, glw-be glw-c) sono stati precedentemente segnalati5. Quattro maschi eterozigoli che trasportavano un allele di tipo selvaggio ( ) e l'allele da urlo glw-cal locus GLWamide (genotipo: / glw-c) sono stati incrociati con una femmina etetozigola che portava un allele di tipo selvaggio e diversi knockout allele glw-a nello stesso locus (genotipo: /glw-a) per generare una progenie. Nella progenie sono presenti quattro possibili genotipi: glw-a/glw-c, /glw-c, glw-a. Di tutta la progenie, otto embrioni sono stati selezionati casualmente per questo saggio di genotipizzazione rappresentativo. Per la genotipizzazione PCR, sono stati progettati5un primer in avanti universale e due primer invertiti specifici per gli alleli. Il primer inverso specifico per glw-a si lega a una regione contenente mutazioni di inserimento e la dimensione prevista del prodotto PCR è 151 bp. L'inversione di tendenza inversa specifica di glw-c si lega a una regione contenente mutazioni di inserimento ed eliminazione e la dimensione prevista del prodotto PCR è 389 bp. Nessuno dei due primer inverso può legarsi alla sequenza di tipo selvaggio, e quindi nessun prodotto PCR sarà generato da embrioni di tipo selvatico. La figura 1 mostra un risultato rappresentativo del saggio PCR. Gli embrioni 1 e 2 mostrano una singola banda PCR coerente con la dimensione prevista di glw-a. Gli embrioni 3 e 6 mostrano due bande PCR che corrispondono alle dimensioni previste per gli alleli glw-ae glw-c. Gli embrioni 4, 7 e 8 mostrano una singola banda PCR coerente con le dimensioni previste di glw-c. L'embrione 5 non mostra bande, suggerendo la mancanza di rilegatura del primer.
Per escludere la possibilità di un guasto dell'estrazione di gDNA, un altro PCR è stato eseguito utilizzando un primer inverso in grado di legarsi alla sequenza wild-type, che ha mostrato un prodotto PCR di una dimensione prevista (1290 bp; figura 2). Va notato che nella Figura 2, uno dei campioni (indicato da ) non ha mostrato alcun prodotto PCR, suggerendo un guasto nell'estrazione gDNA.
Sulla base dei risultati di cui sopra, il genotipo di ogni embrione viene interpretato come segue: embrione 1: "/glw-a, embrione 2: /glw-a, embrione 3: glw-a/glw-c, embrione 4: embrione 5: embrio- , embrione 6: glw-a/glw-c, embrione 7: /glw-c, e l'embrione 8: /glw-c.
Figura 1: Risultati rappresentativi di un saggio PCR genotipi. 1-8 rappresentano i risultati PCR di genotipizzazione da embrioni campionati casualmente tra la progenie di un incrocio mutante eterozigoto di F1 tra un maschio femmina e maschio di z/glw-c. gDNA è stato estratto da un frammento di tessuto embrionale e utilizzato come modello PCR. Il locus GLWamide è stato preso di mira per l'amplificazione PCR, e un primer in avanti universale e due primer inversi allele-specific sono stati utilizzati (Tabella dei materiali). Il primer inverso specifico per glw-a genera una banda PCR 151 bp (1, 2, 3, 6), mentre il primer inverso specifico di glw-c genera una banda PCR 389 bp (3, 4, 6, 7, 8). Nessuno dei due primer inverso può legarsi alla sequenza di tipo selvaggio, e quindi nessun prodotto PCR sarà generato da embrioni di tipo selvatico (5). Il gel di agarose 1.5% è stato eseguito a 128 V per 25 min. È stata utilizzata una scala di DNA di 100 bp. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati rappresentativi della PCR specifica per locus per confermare la presenza di gDNA. Dieci estratti di gDNA che non sono riusciti a generare prodotti PCR in esperimenti PCR mutati glw, tra cui l'embrione 5 della Figura 1 ('5'), sono stati utilizzati come modelli pcR per l'esperimento PCR. Per generare un prodotto PCR da 1290 bp da un allele di tipo selvaggio e inverso sono stati utilizzati dei primer specifici di GLWamide-locus. Nove estratti di DNA su dieci (ad eccezione di quello indicato) hanno mostrato una banda PCR di dimensioni previste, compreso l'embrione 5 della Figura 1 ('5'). Ciò suggerisce che la mancata generazione di prodotti PCR dall'embrione 5 non era dovuta alla mancanza di un modello di gDNA sufficiente. Il gel di agarose dell'1,5% è stato utilizzato a 128 V per 25 min. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Descritto qui un protocollo basato su PCR per genotipare un singolo embrione di anemone di mare senza sacrificare l'animale. Dopo la deposizione delle uova e la de-jellying, le uova fecondate sono autorizzate a svilupparsi in gastrulae. La regione aborale di ogni embrione di gastrula viene rimossa chirurgicamente e il tessuto aborale isolato viene utilizzato per la successiva estrazione genomica del DNA, mentre i restanti embrioni post-chirurgia guariscono e continuano lo sviluppo. Gli estratti di gDNA vengono quindi utilizzati per un saggio PCR per determinare il genotipo di ogni embrione. Questo metodo sfrutta la capacità delle metà orali dell'embrione di anemone di regolare e sviluppare10,11e la maggior parte degli embrioni (>90%) in genere sopravvivono all'intervento chirurgico e si sviluppano normalmente in condizioni di coltura appropriate. La quantità di tessuto necessaria per questo test di genotipizzazione è inferiore alla metà di un intero embrione di gastrula, e i risultati negativi dovuti all'insufficienza di estrazione gDNA sono rari (<5%). Dato che è necessaria solo una piccola quantità di tessuto, è probabile che sia possibile utilizzare embrioni pre-gastrula stadio per questo saggio di genotipizzazione; anche se, questo deve ancora essere testato. Questo metodo può essere eseguito in modo efficiente, purché l'animale non abbia raggiunto una fase di nuoto attivo (cioè prima della fase di planula di nuoto libero). Questo metodo di genotipizzazione è particolarmente vantaggioso nei casi in cui richiedono l'esecuzione delle analisi del fenotipo durante lo sviluppo.
Una limitazione di questo protocollo è che il numero di embrioni in grado di vagliare può essere limitato. In particolare, la rimozione chirurgica di un tessuto aborale può richiedere da uno a due minuti per embrione, soprattutto per i non iniziati. Un ricercatore esperto dovrebbe essere in grado di completare l'intero test di genotipizzazione per almeno 80 embrioni al giorno, ma gli studi che coinvolgono centinaia o migliaia di embrioni sono probabilmente troppo lunghi per essere completati in un giorno.
I ricercatori devono anche essere consapevoli del fatto che il fenotipo osservato nei mutanti post-chirurgia può essere diverso da quello dei mutanti intatti, ad esempio, a causa dell'effetto dell'eliminazione genica sulla guarigione e/o sulla regolazione embrionale nelle gastrule. Questa possibilità dovrebbe essere testata esaminando se il fenotipo trovato nei mutanti post-chirurgia è effettivamente osservabile nei mutanti intatti.
Esistono diversi approcci alternativi al metodo descritto di genotipizzazione. In primo luogo, l'immunostaining con un anticorpo contro una proteina la cui espressione è persa nei mutanti knockout può essere eseguita per identificare gli individui mutanti knockout da una popolazione geneticamente eterogenea di animali in via di sviluppo. In secondo luogo, l'ibridazione in situ può essere utilizzata a questo scopo, se il riboprobe può essere progettato in modo da non ibridarsi amRNA mutanti. Ad esempio, se gli alleli mutanti di un animale knockout portano grandi mutazioni di delezione nella stessa regione del gene, il riboprobe può essere progettato per ibridarsi nella regione del gene eliminato nei mutanti knockout. In entrambi i casi, ci si aspetta che i mutanti knockout non mostrino etichettatura, mentre gli individui eterozigosi e selvatici dovrebbero mostrare l'etichettatura. Tuttavia, gli animali dovranno essere sacrificati a causa della fissazione dei tessuti necessaria per la colorazione. Infine, i mutanti knockout possono essere sollevati alla maturità sessuale e incrociati tra loro per generare una progenie, tutti i quali dovrebbero essere mutanti ad eliminazione diretta, e le analisi del fenotipo dello sviluppo possono essere eseguite utilizzando questa progenie6. Questo metodo richiede che gli animali knockout siano vitali e in grado di riprodotti ed è quindi limitato nella sua applicazione ageni non essenziali.
Sebbene il protocollo di genotipizzazione descritto sia progettato per gli embrioni di anemone marino, è possibile utilizzare questo metodo con altri cnidariani in cui sia le informazioni genomiche che gli embrioni sono accessibili (ad esempio, coralli12 e meduse13), a condizione che gli embrioni sono in grado di guarire e regolamentare al momento della rimozione chirurgica. Negli esperimenti di modificazione genica mediati da CRISPR di successo sono già stati riportati nei coralli14 così come nelle meduse idrozoe15,16. Le future applicazioni di questo protocollo di genotipizzazione agli anemone anemone non marini saranno importanti per gli studi sulla base genetica del loro sviluppo. Questo, a sua volta, sarà fondamentale per ottenere intuizioni meccanicistiche sull'evoluzione di uno sviluppo cnidariano notevolmente diversificato.
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Disclosures
L'autore non ha nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i revisori anonimi per i commenti sulla versione precedente del manoscritto, che ha migliorato il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi dell'Università dell'Arkansas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
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