Summary
O objetivo deste protocolo é genótipo o vectensis do nematostella do Anemone de mar durante o gastrulação sem sacrificar o embrião.
Abstract
Descrito aqui é um protocolo PCR-baseado para genótipo o embrião do estágio do gástrula do vectensis cnidários cnidários do nematostella sem sacrificar a vida do animal. Após a fertilização in vitro e de-jellying, zigítos são autorizados a desenvolver por 24 h à temperatura ambiente para chegar ao estágio inicial-a meados de gastrula. Os embriões do gástrula são coloc então em uma cama do gel do agarose em um prato de Petri que contem o seawater. o microscópio de dissecação, uma agulha de tungstênio é usada para separar cirurgicamente um fragmento de tecido aboral de cada embrião. Os embriões pós-cirúrgicos são então autorizados a curar e continuar o desenvolvimento. O DNA de Genomic é extraído do fragmento isolado do tecido e usado como um molde para o PCR locus-específico. O genótipo pode ser determinado com base no tamanho dos produtos de PCR ou presença/ausência de produtos de PCR alelo-específicos. Os embriões pós-cirúrgicos são então ordenados de acordo com o genótipo. A duração de todo o processo de genotipagem depende do número de embriões a serem rastreados, mas requer minimamente 4 – 5 h. Este método pode ser usado para identificar mutantes Knockout de uma população geneticamente heterogênea de embriões e permite análises de fenótipos durante o desenvolvimento.
Introduction
Os cnidarians representam um grupo diverso de animais que incluem Medusa, corais, e Anemones de mar. São diploblastos, compostos por ectoderma e endoderma que são separados por uma matriz extracelular (mesoglea). Cnidaria é um grupo de irmãs a especiosos Bilateria, a que os modelos animais tradicionais tais como a Drosophila e o Mus pertencem1. Além disso, pensa-se que a divergência Cnidaria-Bilateria ocorreu no período pré-cambriano2. Como tal, estudos comparativos de cnidários e bilaterianos são essenciais para obter insights sobre a biologia de seu ancestral comum mais recente. Recentemente, a genômica comparativa revelou que os cnidários e os bilaterianos compartilham muitos genes de kit de ferramentas de desenvolvimento, como notch e bhlh, implicando que seu ancestral comum já tinha esses genes3. Entretanto, o papel destes genes desenvolventes do Toolkit no último antepassado comum de Cnidaria e de Bilateria é comparàvel menos bem compreendido. Para abordar este problema, é crítico estudar como estes genes profundamente conservados funcionam em cnidarians.
Um dos modelos genéticos cnidários emergentes é o cnidários nematostella vectensis. Seu genoma foi seqüenciado3, e uma variedade de ferramentas genéticas, incluindo o knockdown do gene morpholino-negociado, o transgenesis meganuclease-negociado, e as knockins e os Knockouts do gene de Crispr-Cas9-negociados, estão agora disponíveis para o uso neste animal. Além disso, o desenvolvimento de Nematostella é relativamente bem compreendido. Durante a embriogênese, a gastrulação ocorre pela invaginação4, e o embrião se desenvolve em uma larva de Planula de natação livre. A Planula posteriormente se transforma em um pólipo séptil com uma boca e tentáculos circunorais. O pólipo cresce e atinge a maturidade sexual.
A mutagenese segmentada por crispr-Cas9 é agora rotineiramente utilizada para estudar a função gênica em nematostella vectensis5,6, 7,8,9. Para gerar mutantes Knockout em Nematostella, um coquetel contendo RNAs de guia único Locus-específicos e a proteína de endonuclease Cas9 é injetado pela primeira vez em ovos não fertilizados ou fertilizados para produzir animais fundadores da F0 que tipicamente mostram mosaicism. Os animais F0 são subsequentemente levantados para a maturidade sexual e cruzados uns com os outros para produzir uma população de F1, um subconjunto do que pode ser mutantes Knockout6. Alternativamente, os animais de F0 sexualmente maduros podem ser cruzados com animais do tipo selvagem para gerar animais heterozigotos F1, e os heterozygotes F1 que carregam um alelo de nocaute no locus de interesse podem então ser cruzados uns com os outros para produzir descendentes de F2, um quarto dos quais são esperados para ser mutantes Knockout5. Ambas as abordagens requerem um método para identificar mutantes de nocaute de uma população geneticamente heterogênea. Os tentáculos de pólipo podem ser usados para extrair o DNA genómico para a genotipagem6,7. No entanto, nos casos em que a função de desenvolvimento do gene de interesse está sendo investigada e os embriões mutantes não atingem o estágio pólipo (isto é, devido à letalidade larval associada à mutação), os mutantes Knockout precisam ser identificados precocemente na ontogenia. É descrito aqui um protocolo PCR-baseado para genótipo animais individuais no estágio do gástrula sem sacrificar o animal, que permite a identificação de mutantes do Knockout de uma população genetically heterogênea dos embriões. A duração de todo o processo de genotipagem depende do número de embriões a serem rastreados, mas requer minimamente 4-5 h.
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Protocol
1. indução de desova, fertilização in vitro e de-jellying
- Manter Nematostella vectensis em água do mar com uma salinidade de 12 partes por mil (ppt) na escuridão a 16 ° c, alimentando Artemia diariamente.
- No dia antes da indução de desova, coloque os animais em uma incubadora de temperatura e luz controlada. Programe a incubadora para que os animais sejam expostos a 8 h de luz a 25 ° c. Opcional: alimente uma pequena peça (< 1 mm3) de ostra para animais individuais antes de colocá-los na incubadora para melhorar a desova.
- Deixe os animais na incubadora por 1 h a 16 ° c.
- Retire os animais da incubadora e deixe-os em um de bancada com luz à temperatura ambiente (RT) para permitir a desova. A desova geralmente ocorre dentro dos próximos 1,5 – 2 h.
- Se machos e fêmeas estiverem em recipientes separados, coloque os pacotes de ovos do recipiente fêmea em um recipiente masculino contendo espermatozóides usando uma pipeta de transferência cuja ponta é cortada para ampliar a abertura para que os ovos não sejam danificados pelo estresse mecânico durante Transferência. Permitir que os ovos sejam fertilizados, deixando-os no recipiente macho durante pelo menos 15 min.
- De-Jelly os pacotes de ovos em água do mar contendo 3% de cisteína (pH 7,4) em uma placa de Petri ou em um tubo de 15 mL. Agitar suavemente em uma coqueteleira por 12 min.
- Use uma pipeta plástica para romper aglomerados e continuar a agitar por outro 2-3 min até completamente de-jellied.
- Remover cisteína, substituindo a mídia com água do mar fresco por pelo menos 5x.
- Mantenha os ovos fertilizados em um prato de Petri de vidro a 16 ° c ou RT.
2. remoção cirúrgica de um tecido aboral de um embrião de gástrula
- Prepare um tampão de extração de DNA consistindo de 10 mM de Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 e 1 mg/mL de proteinase K. Use 20 mL do tampão de extração por embrião. Misture bem por vortexing e alíquota o buffer em tubos de PCR.
- Dissolver 1% de agarose na água do mar e despeje-o em uma placa de Petri para cobrir o fundo. Esfrie em um de bancada para fazer uma cama do gel. Despeje a água do mar fresca para cobrir a cama de gel no prato de Petri.
- Transfira os embriões da borne-fecundação de 24 h (HPF) (cedo-à fase meados de-gastrula) no prato de Petri que contem uma cama do gel do agarose.
- Inserir uma agulha de tungstênio em um suporte de agulha e esterilizar por mergulhar a ponta da agulha em álcool (70% ou superior) e colocando-o em chamas para queimar o álcool.
- um microscópio de dissecação (em 20x à ampliação 40x), use a agulha do tungstênio para fazer uma depressão na cama do agarose removendo uma parte de agarose de superfície sobre o tamanho de um embrião a ser manipulado, e coloc o embrião na depressão com seu lateral lado virado para baixo, a fim de restringir o movimento do embrião para a microcirurgia.
- Use a agulha de tungstênio para extirpar cirurgicamente um pedaço de tecido aboral localizado oposto à abertura blastoporal oral. Um aboral um terço a um quarto do tecido embrionário ao longo do eixo oral-aboral é geralmente suficiente.
- Use uma pipeta P20 para transferir o tecido aboral isolado (em < 2 mL) para um tubo de PCR contendo 20 mL de tampão de extração de DNA.
- Transfira o embrião da borne-cirurgia em um poço que contem pelo menos 500 mL do seawater fresco em uma placa 24 ou 96-well.
- Repita os passos 2.4 – 2.8 para o número de embriões, conforme necessário.
- Coloque a placa de poço contendo embriões pós-cirurgia em uma incubadora a 16 ° c ou RT até que a genotipagem seja concluída.
3. extração do ADN de Genomic e PCR genotipagem
- Gire momentaneamente para baixo os tubos do PCR que contêm o amortecedor da extração do ADN e os tecidos embrionário isolados usando um mini-centrifugador (por exemplo. em 2.680 x g para 10 s).
- Para extrair o ADN genomic dos únicos embriões, incubar os tubos do PCR em 55 ° c para 3 h. Vortex para 30 s cada 30 minutos para assegurar o rompimento de aglomerações da pilha e para realçar o lysis da pilha.
- Incubar os tubos do PCR em 95 ° c por 5 minutos para inativar o proteinase K.
- Mantenha os extratos de gDNA a 4 ° c ou no gelo e prossiga imediatamente para a PCR.
Nota: o protocolo pode ser pausado aqui colocando extratos de gDNA em um freezer de-20 ° c. - Configurar uma reação de PCR usando gDNA extraído como um modelo para amplificar o locus genómico de interesse.
- Se os alelos diferentes no locus do interesse diferem no tamanho de modo que a diferença do tamanho possa ser detectada pela electroforese do gel do agarose, projete um único jogo dos primers para amplificar o locus inteiro.
- Alternativamente, use os primers alelo-específicos que geram produtos do PCR somente na presença do alelo específico; por exemplo, projetando o primer que se liga a uma região contendo mutações de inserção/deleção.
- Use uma mistura típica da reação do PCR de 20 mL como segue: 5 mL de extratos de gDNA, 8 mL da água nuclease-livre, 4 mL do amortecedor do PCR, 0,2 mL de dNTPs de 10mM, 0,6 mL de DMSO, 1 mL da primeira demão para diante de 10 milímetros, 1 mL da primeira demão reversa de 10 milímetros e 0,2 mL de DNA polimerase (ver tabela de materiais).
Nota: os primers múltiplos podem ser usados em uma reação do PCR. Por exemplo, uma primeira demão para diante universal e dois primers reversos alelo-específicos podem ser combinados, contanto que os dois primers reversos forem projetados gerar produtos do PCR de tamanhos distintos de modo que a presença/ausência dos dois alelos possa ser inequivocamente determinada por electroforese em gel (ver secção de resultados representativos).
- Execute a electroforese do gel do agarose para determinar o tamanho e a presença/ausência de produtos do PCR. Ajuste a condição da electroforese do gel do agarose (por exemplo, porcentagem do gel do agarose, V/cm, e duração) dependendo do tamanho esperado de produtos do PCR.
- Use os resultados do PCR a respeito do tamanho e da presença/ausência de produtos do PCR para atribuir um genótipo a cada embrião da borne-cirurgia. Por exemplo, se os alelos diferentes são esperados gerar produtos do PCR de tamanhos diferentes, use a informação do tamanho para atribuir o genótipo para cada embrião. Se forem utilizados primers alelo-específicos, os dados sobre a presença/ausência de produtos de PCR devem ser utilizados para atribuir um genótipo a cada embrião.
- Ordenar embriões de acordo com o genótipo.
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Representative Results
O genoma de Nematostella tem um único Locus que codifica uma proteína precursora para o neuropeptídeo GLWamide. Três alelos do mutante do Knockout neste Locus (GLW-a, GLW-b, e GLW-c) foram relatados previamente5. Quatro machos heterozygous que carreg um selvagem-tipo alelo (+) e alelo do Knockout GLW-cno locus do glwamide (genótipo: +/GLW-c) foram cruzados com uma fêmea heterozygous que carreg um selvagem-tipo alelo e nocaute diferente alelo GLW- a no mesmo locus (genótipo: +/GLW-a) para gerar um progeny. Existem quatro genótipos possíveis na progêia: GLW-a/GLW-c, +/GLW-c, GLW-a/+ e +/+. De todas as progêias, oito embriões foram selecionados aleatoriamente para este ensaio de genotipagem representativo. Para a genotipagem de PCR, uma cartilha de avanço universal e dois primers reversos alelo-específicos foram projetados5. O primer reverso específico para GLW-a vincula- se a uma região contendo mutações de inserção, e o tamanho esperado do produto PCR é 151 BP. A cartilha reversa específica para GLW-c vincula- se a uma região contendo mutações de inserção e deleção, e o tamanho esperado do produto PCR é 389 BP. Nem a cartilha reversa pode se vincular à seqüência de tipo selvagem e, portanto, nenhum produto de PCR será gerado a partir de embriões de tipo selvagem. A Figura 1 mostra um resultado representativo do ensaio de PCR. Os embriões 1 e 2 mostram uma única banda de PCR consistente com o tamanho esperado de GLW-a. Os embriões 3 e 6 mostram duas bandas de PCR que correspondem aos tamanhos esperados para alelos GLW-ae GLW-c. Os embriões 4, 7, e 8 mostram uma única faixa do PCR consistente com o tamanho esperado do GLW-c. O embrião 5 não mostra bandas, sugerindo a falta de encadernação de primer.
Para descartar a possibilidade de falha de extração de gDNA, outro PCR foi executado usando uma cartilha reversa que pode se vincular à seqüência do tipo selvagem, que mostrou um produto de PCR de um tamanho esperado (1290 BP; Figura 2). Deve-se notar que na Figura 2, uma das amostras (indicada por *) não mostrou nenhum produto de PCR, sugerindo uma falha na extração de gDNA.
Com base nos resultados acima, o genótipo de cada embrião é interpretado como o seguinte: embrião 1: +/GLW-a, embrião 2: +/GLW-a, embrião 3: GLW-a/GLW-c, embrião 4: +/GLW-c, embrião 5: +/+, embrião 6: GLW-a/GLW-c, embrião 7: +/GLW-c, e embrião 8: +/GLW-c.
Figura 1: resultados representativos de um ensaio de PCR genotipagem. 1-8 representam resultados da PCR de genotipagem dos embriões aleatòria amostrados entre a progêia de uma cruz heterozygous F1 do mutante entre um +/GLW- machos fêmeas e de +/GLW-c. gDNA foi extraído de um fragmento embrionário do tecido e usado como um molde do PCR. O locus de GLWamide foi alvejado para a amplificação do PCR, e um primer dianteiro universal e dois primers reversos alelo-específicos foram usados (tabela dos materiais). O primer reverso específico para GLW-a gera uma banda de PCR 151 BP (1, 2, 3, 6), enquanto o primer reverso específico para GLW-c gera uma banda de PCR 389 BP (3, 4, 6, 7, 8). Nem a cartilha reversa pode se vincular à seqüência do tipo selvagem e, portanto, nenhum produto de PCR será gerado a partir de embriões de tipo selvagem (5). O gel de agarose 1,5% foi executado em 128 V por 25 min. Uma escada do ADN de 100 BP foi usada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: resultados representativos da PCR Locus-específica para confirmar a presença de gDNA. Dez extratos de gDNA que não conseguiram gerar produtos de PCR em experimentos de PCR alelo-específicos de GLW Mutant, incluindo o embrião 5 da Figura 1 (' 5 '), foram utilizados como modelos de PCR para o experimento de PCR mostrado. Um universal dianteiro e reverso GLWamide-locus-específico os primers foram usados para gerar um produto do PCR do 1290 BP de um selvagem-tipo alelo. Nove em cada dez extratos de DNA (exceto o indicado *) mostraram uma banda de PCR de tamanho esperado, incluindo o embrião 5 da Figura 1 (' 5 '). Isto sugere que a falha gerar produtos do PCR do embrião 5 não era devido à falta de um molde suficiente de gDNA. O gel de agarose de 1,5% foi executado em 128 V por 25 min. 1 KB a escada do ADN foi usada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Descrito aqui um protocolo PCR-baseado para genótipo um único embrião do Anemone de mar sem sacrificar o animal. Depois de desova e de-jellying, os ovos fertilizados são autorizados a desenvolver-se em gastrulae. A região aboral de cada embrião do gástrula é removida cirùrgica, e o tecido aboral isolado é usado para a extração genomic subseqüente do ADN, quando os embriões restantes da borne-cirurgia curarem e continuarem o desenvolvimento. Os extratos de gDNA são usados então para um ensaio do PCR para determinar o genótipo de cada embrião. Este método aproveita-se da habilidade das metades orais do embrião do Anemone de mar para regular e desenvolver10,11, e a maioria dos embriões (> 90%) tipicamente sobrevivem à cirurgia e desenvolvem-se normalmente condições apropriadas da cultura. A quantidade de tecido necessária para este ensaio de genotipagem é inferior a metade de um embrião de gástrula inteiro, e os resultados negativos devido à falha de extração de gDNA são raros (< 5%). Dado que apenas uma pequena quantidade de tecido é necessária, é provável que seja possível utilizar embriões de fase pré-gastrula para este ensaio de genotipagem; embora, isso ainda não foi testado. Este método pode ser realizado eficientemente, desde que o animal não tenha atingido um estágio de natação ativa (ou seja, antes da fase de Planula de natação livre). Este método de genotipagem é particularmente vantajoso nos casos que exigem o desempenho de análises do phenotype durante o desenvolvimento.
Uma limitação deste protocolo é que o número de embriões capazes de ser rastreados pode ser limitado. Em particular, a remoção cirúrgica de um tecido aboral pode levar um a dois minutos por embrião, especialmente para os não iniciados. Um pesquisador experiente deve ser capaz de completar todo o ensaio de genodigitação para pelo menos 80 embriões por dia, mas estudos envolvendo centenas ou milhares de embriões são provavelmente muito demorados para concluir em um dia.
Os pesquisadores também precisam estar cientes de que o fenótipo observado em mutantes pós-cirurgia pode ser diferente do que em mutantes intactos, por exemplo, devido ao efeito do nocaute genético na cicatrização e/ou na regulação embrionária em gastrulae. Esta possibilidade deve ser testada examinando se o phenotype encontrado em mutantes da borne-cirurgia é certamente observável em mutantes intactos.
Existem várias abordagens alternativas para o método descrito de genotipagem. Em primeiro lugar, a imunocoloração com um anticorpo contra uma proteína cuja expressão é perdida em mutantes Knockout pode ser realizada para identificar indivíduos mutantes Knockout de uma população geneticamente heterogênea de animais em desenvolvimento. Em segundo lugar, a hibridação in situ pode ser usada para esta finalidade, se o riboprobe pode ser projetado de modo que não hibridizam ao mRNAs do mutante. Por exemplo, se os alelos mutantes de um animal Knockout carregam grandes mutações de deleção na mesma região do gene, o riboprobe pode ser projetado para hibridizá-lo para a região do gene excluído nos mutantes knockout. Em ambos os casos, os mutantes do Knockout são esperados mostrar nenhuma rotulagem, quando os indivíduos heterozygous e Wild-Type mostrarem a rotulagem. No entanto, os animais precisarão ser sacrificados devido à fixação tecidual necessária para a coloração. Finalmente, mutantes Knockout podem ser aumentados para a maturidade sexual e cruzados uns com os outros para gerar uma progêia, todos os quais devem ser mutantes knockout, e análises de fenótipo do desenvolvimento pode ser realizada usando esta progêia6. Este método exige que os animais Knockout são viáveis e capazes de reprodução e é, portanto, limitada em sua aplicação a genes não essenciais.
Embora o protocolo de genotipagem descrito seja projetado para embriões de anemona do mar, é possível usar esse método com outros cnidários nos quais a informação genômica e os embriões são acessíveis (por exemplo, corais12 e Medusa13), contanto que os embriões são capazes da cura e da regulação em cima da remoção cirúrgica. Experimentos de modificação de genes mediados por crispr bem sucedidos já foram relatados em corais14 ,bem como água-viva hidrozoana15,16. Futuras aplicações deste protocolo de genotipagem para cnidários não-anéteres-marinhos serão importantes para estudos da base genética do seu desenvolvimento. Isso, por sua vez, será fundamental para obter insights mecanísticos sobre a evolução do desenvolvimento cnidário notavelmente diverso.
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Disclosures
O autor não tem nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos revisores anônimos por comentários sobre a versão anterior do manuscrito, que melhorou o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por fundos da Universidade de Arkansas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
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