Summary
El objetivo de este protocolo es genotipo la anémona de mar Nematostella vectensis durante la gastrulación sin sacrificar el embrión.
Abstract
Aquí se describe un protocolo basado en PCR para genotipo el embrión de la etapa de gastrula del anthozoiano cnidario Nematostella vectensis sin sacrificar la vida del animal. Después de la fertilización in vitro y la desgelatina, se permite que los cigotos se desarrollen durante 24 horas a temperatura ambiente para llegar a la etapa de gastrula temprana a media. Los embriones de gastrula se colocan en un lecho de gel de agarosa en un plato de Petri que contiene agua de mar. Bajo el microscopio de disección, se utiliza una aguja de tungsteno para separar quirúrgicamente un fragmento de tejido abortivo de cada embrión. Los embriones post-cirugía se les permite sanar y continuar el desarrollo. El ADN genómico se extrae del fragmento de tejido aislado y se utiliza como plantilla para PCR específico del locus. El genotipo se puede determinar en función del tamaño de los productos PCR o de la presencia/ausencia de productos PCR específicos de alelos. Los embriones post-cirugía se clasifican según el genotipo. La duración de todo el proceso de genotipado depende del número de embriones a examinar, pero requiere mínimamente 4-5 h. Este método se puede utilizar para identificar mutantes noqueantes de una población genéticamente heterogénea de embriones y permite analizar fenotipos durante el desarrollo.
Introduction
Los cnidarios representan un grupo diverso de animales que incluyen medusas, corales y anémonas de mar. Son diploblasts, compuestos de ectodermo y endoderm que están separados por una matriz extracelular (mesoglea). Cnidaria es un grupo hermano de la especia bilateria, al que pertenecen1. modelos animales tradicionales como Drosophila y Mus. Además, se cree que la divergencia Cnidaria-Bilateria ocurrió en el período pre-Cambriano2. Como tal, los estudios comparativos de cnidarios y bilaterianes son esenciales para obtener información sobre la biología de su ancestro común más reciente. Recientemente, la genómica comparativa ha revelado que los cnidarios y bilaterianes comparten muchos genes del kit de herramientas del desarrollo como la muesca y la bHLH, lo que implica que su ancestro común ya tenía estos genes3. Sin embargo, el papel de estos genes del conjunto de herramientas de desarrollo en el último ancestro común de Cnidaria y Bilateria es comparativamente menos bien entendido. Para abordar este problema, es fundamental estudiar cómo funcionan estos genes profundamente conservados en los cnidarios.
Uno de los modelos genéticos cnidarios emergentes es el antozoiano Nematostella vectensis. Su genoma hasido secuenciado 3, y una variedad de herramientas genéticas, incluyendo el derribo genético mediado por morpholino, la transgénesis mediada por meganucleasas y los knockins y knockouts de genes mediados por CRISPR-Cas9, ahora están disponibles para su uso en este animal. Además, el desarrollo de Nematostella es relativamente bien entendido. Durante la embriogénesis, la gastrulation se produce por invaginación4,y el embrión se convierte en una larva de planula de natación libre. La planula posteriormente se transforma en un pólipo sésil con boca y tentáculos circunportales. El pólipo entonces crece y alcanza la madurez sexual.
La mutagénesis dirigida mediada por CRISPR-Cas9 se utiliza ahora de forma rutinaria para estudiar la función génica en Nematostella vectensis5,6,7,8,9. Para generar mutantes noqueadores en Nematostella, un cóctel que contiene ARN de una sola guía específicos de locus y la proteína endonuclease Cas9 se inyecta primero en huevos no fertilizados o fertilizados para producir animales fundadores de F0 que normalmente muestran Mosaicism. Los animales F0 son posteriormente elevados a la madurez sexual y cruzados entre sí paraproducir una población de F1, un subconjunto de los cuales pueden ser mutantes nocaut 6. Alternativamente, los animales F0 sexualmente maduros se pueden cruzar con animales de tipo salvaje para generar animales heterocigotos F1, y los heterocigotos F1 que llevan un alelo knockout en el locus de interés se pueden cruzar entre sí para producir descendencia F2, una cuarta parte de los cuales se espera que sean mutantes nocaut5. Ambos enfoques requieren un método para identificar mutantes noqueantes de una población genéticamente heterogénea. Los tentáculos de pólipos se pueden utilizar para extraer ADN genómico para el genotipado6,7. Sin embargo, en los casos en que se está investigando la función de desarrollo del gen de interés y los embriones mutantes no alcanzan la etapa de pólipos (es decir, debido a la letalidad larvaria asociada con la mutación), los mutantes noqueantes deben ser identificados al principio de la ontogenia. Aquí se describe un protocolo basado en PCR para genotipo de animales individuales en la etapa de gastrula sin sacrificar al animal, que permite la identificación de mutantes noqueadores de una población genéticamente heterogénea de embriones. La duración de todo el proceso de genotipado depende del número de embriones a ser examinados, pero requiere mínimamente 4-5 h.
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Protocol
1. Inducción de desove, fertilización in vitro y de-jellying
- Mantener nematostella vectensis en el agua de mar con una salinidad de 12 partes por mil (ppt) en la oscuridad a 16 oC, alimentando Artemia diariamente.
- El día antes de la inducción del desove, coloque a los animales en una incubadora controlada por temperatura y luz. Programar la incubadora para que los animales estén expuestos a 8 h de luz a 25oC. Opcional: Alimente una pequeña pieza (<1 mm3) de ostra a animales individuales antes de colocarlos en la incubadora para mejorar el desove.
- Dejar a los animales en la incubadora durante 1 h a 16oC.
- Retire los animales de la incubadora y déjelos en una mesa con luz a temperatura ambiente (RT) para permitir el desove. El desove generalmente ocurre dentro de la siguiente 1.5–2 h.
- Si los machos y las hembras están en recipientes separados, coloque los paquetes de óvulos del recipiente femenino en un recipiente macho que contenga espermatozoides utilizando una pipeta de transferencia cuya punta se corta para agrandar la abertura de modo que los óvulos no se dañen por estrés mecánico durante Transferencia. Deje fertilizar los óvulos dejándolos en el recipiente masculino durante al menos 15 minutos.
- Desgela los paquetes de huevos en agua de mar que contiene 3% de cisteína (pH 7.4) en un plato de Petri o en un tubo de 15 ml. Agitar suavemente en una coctelera durante 12 minutos.
- Utilice una pipeta de plástico para romper los grumos y continúe agitando durante otros 2-3 minutos hasta que se desenjuicie por completo.
- Elimine la cisteína reemplazando los medios por agua de mar fresca durante al menos 5 veces.
- Mantener los huevos fertilizados en un plato de Petri de vidrio a 16 oC o RT.
2. Extirpación quirúrgica de un tejido aboral de un embrión de gastrula
- Preparar un tampón de extracción de ADN que consista en 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40, y 1 mg/ml de proteinasa K. Utilice 20 ml del tampón de extracción por embrión. Mezclar bien mediante el vórtice y alícuota el búfer en tubos PCR.
- Disolver 1% de agarosa en agua de mar y verter la en un plato de Petri para cubrir el fondo. Enfríe en una mesa de trabajo para hacer una cama de gel. Vierta agua de mar fresca para cubrir el lecho de gel en el plato Petri.
- Transfiera embriones de 24 h después de la fertilización (hpf) (etapa de gastrula temprana a media) a la placa Petri que contiene un lecho de gel de agarosa.
- Inserte una aguja de tungsteno en un soporte de aguja y esterilice sumergiendo la punta de la aguja en alcohol (70% o más) y colocándola en llamas para quemar el alcohol.
- Bajo un microscopio de disección (con aumento de 20x a 40x), utilice la aguja de tungsteno para hacer una depresión en el lecho de agarosa quitando un pedazo de agarosa superficial del tamaño de un embrión a manipular, y coloque el embrión en la depresión con su lateral cara hacia abajo con el fin de restringir el movimiento del embrión para la microcirugía.
- Utilice la aguja de tungsteno para extirpar quirúrgicamente un pedazo de tejido abortivo situado frente a la abertura blastoporal oral. Por lo general, es suficiente un aboral de un tercio a una cuarta parte del tejido embrionario a lo largo del eje oral-aboral.
- Utilice una pipeta P20 para transferir el tejido aboral aislado (en <2 ml) a un tubo PCR que contenga 20 ml de tampón de extracción de ADN.
- Transfiera el embrión post-cirugía a un pozo que contenga al menos 500 ml de agua de mar fresca en una placa de 24 o 96 pocillos.
- Repita los pasos 2.4–2.8 para el número de embriones según sea necesario.
- Coloque la placa de pozo que contiene embriones post-cirugía en una incubadora a 16 oC o RT hasta que se complete el genotipado.
3. Extracción de ADN genómico y genotipado PCR
- Gire brevemente los tubos de PCR que contienen el tampón de extracción de ADN y los tejidos embrionarios aislados utilizando una minicentrífuga (por ejemplo, a 2.680 x g durante 10 s).
- Para extraer ADN genómico de embriones individuales, incubar los tubos de PCR a 55 oC durante 3 h. Vórtice durante 30 s cada 30 min para asegurar la ruptura de los grumos celulares y mejorar la lisis celular.
- Incubar los tubos de PCR a 95 oC durante 5 min para inactivar la proteinasa K.
- Mantener los extractos de ADNG a 4 oC o sobre hielo, y proceder inmediatamente a la PCR.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí colocando extractos de ADNa en un congelador de -20 oC. - Configure una reacción de PCR utilizando gDNA extraído como plantilla para amplificar el locus genómico de interés.
- Si los diferentes alelos en el locus de interés difieren en tamaño para que la diferencia de tamaño se pueda detectar mediante electroforesis de gel de agarosa, diseñe un solo conjunto de imprimaciones para amplificar todo el locus.
- Alternativamente, utilice imprimaciones específicas de alelos que generen productos de PCR sólo en presencia del alelo específico; por ejemplo, diseñando la imprimación que se une a una región que contiene mutaciones de inserción/eliminación.
- Utilice una mezcla de reacción PCR típica de 20 ml de la siguiente manera: 5 ml de extractos de ADNa-G, 8 ml de agua libre de nucleasa, 4 ml de tampón PCR, 0,2 ml de dNTPs de 10 mM, 0,6 ml de DMSO, 1 ml de imprimación directa de 10 ml, 1 ml de imprimación inversa de 10 mM , y 0,2 ml de ADN polimerasa (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Se pueden utilizar varios imprimadores en una reacción de PCR. Por ejemplo, se puede combinar una imprimación delantera universal y dos imprimaciones inversas específicas de alelos, siempre y cuando las dos imprimaciones inversas estén diseñadas para generar productos de PCR de tamaños distintos, de modo que la presencia/ausencia de los dos alelos pueda ser inequívoca electroforesis de gel (ver sección de resultados representativos).
- Ejecute la electroforesis de gel de agarosa para determinar el tamaño y la presencia/ausencia de los productos pcR. Ajuste el estado de la electroforesis del gel de agarosa (por ejemplo, porcentaje de gel de agarosa, V/cm y duración) dependiendo del tamaño esperado de los productos de PCR.
- Utilice los resultados de la PCR con respecto al tamaño y la presencia/ausencia de productos de PCR para asignar un genotipo a cada embrión post-cirugía. Por ejemplo, si se espera que diferentes alelos generen productos de PCR de diferentes tamaños, utilice la información de tamaño para asignar el genotipo para cada embrión. Si se utilizan imprimaciones específicas de alelo, los datos sobre la presencia/ausencia de productos PCR deben utilizarse para asignar un genotipo a cada embrión.
- Ordenar embriones según genotipo.
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Representative Results
El genoma de Nematostella tiene un único locus que codifica una proteína precursora para el neuropéptido GLWamida. Tres alelos mutantes noqueados en este locus (glw-a, glw-b, y glw-c) se han reportado previamente5. Cuatro machos heterocigotos que llevaban un alelo de tipo salvaje (+) y un alelo de nocaut enel locus GLWamide (genotipo: +/glw-c)fueron cruzados con una hembra heterocigota que llevaba un alelo de tipo salvaje y un nocaut diferente alelo glw-a en el mismo locus (genotipo: +/glw-a) para generar una progenie. Hay cuatro genotipos posibles en la progenie: glw-a/glw-c, +/glw-c, glw-a/+, y +/+. De toda la progenie, ocho embriones fueron seleccionados al azar para este ensayo representativo de genotipado. Para el genotipado PCR, se diseñó una imprimacióndelantera universal y dos imprimaciones inversas específicas de alelos 5. La imprimación inversa específica de glw-a se une a una región que contiene mutaciones de inserción, y el tamaño esperado del producto PCR es de 151 bp. La imprimación inversa específica de glw-c se une a una región que contiene mutaciones de inserción y eliminación, y el tamaño esperado del producto PCR es de 389 bp. Ninguna de las imprimaciones inversas puede unirse a la secuencia de tipo salvaje, por lo que no se generarán productos de PCR a partir de embriones de tipo salvaje. La Figura 1 muestra un resultado representativo del ensayo de PCR. Embryos 1 y 2 muestran una sola banda de PCR consistente con el tamaño esperado de glw-a. Los embriones 3 y 6 muestran dos bandas de PCR que corresponden a los tamaños esperados para los alelos glw-ay glw-c. Embryos 4, 7 y 8 muestran una sola banda de PCR consistente con el tamaño esperado de glw-c. Embryo 5 no muestra bandas, lo que sugiere la falta de unión de imprimación.
Para descartar la posibilidad de fallo de extracción de ADNG, se ejecutó otro PCR utilizando una imprimación inversa que puede unirse a la secuencia de tipo salvaje, que mostró un producto PCR de un tamaño esperado (1290 bp; Figura 2). Cabe señalar que en la Figura 2, una de las muestras (indicada por *) no mostró productos de PCR, lo que sugiere un fracaso en la extracción de ADNes.
Sobre la base de los resultados anteriores, el genotipo de cada embrión se interpreta como sigue: embrión 1: +/glw-a, embrión 2: +/glw-a, embrión 3: glw-a/glw-c, embrión 4: +/glw-c, Embrión 5: +/+,embrión 6: glw-a/glw-c, embrión 7: +/glw-c, y embrión 8: +/glw-c.
Figura 1: Resultados representativos de un ensayo de PCR de genotipado. 1-8 representan los resultados de LA PCR de genotipado de embriones muestreados aleatoriamente entre la progenie de un cruce mutante heterocigoto F1 entre uno +/glw-una hembra y +/glw-cmachos. gDNA se extrajo de un fragmento de tejido embrionario y se utilizó como una plantilla de PCR. El locus GLWamide estaba dirigido a la amplificación de PCR, y se utilizó una imprimación delantera universal y dos imprimaciones inversas específicas de alelos (Tablade materiales). La imprimación inversa específica de glw-a genera una banda PCR de 151 bp (1, 2, 3, 6), mientras que la imprimación inversa específica de glw-c genera una banda PCR de 389 bp (3, 4, 6, 7, 8). Ninguna de las imprimaciones inversas puede unirse a la secuencia de tipo salvaje, por lo que no se generarán productos de PCR a partir de embriones de tipo salvaje (5). El gel de agarosa del 1,5% se ejecutó a 128 V durante 25 min. Se utilizó una escalera de ADN de 100 bp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos de la PCR específica del locus para confirmar la presencia de ADNg. Diez extractos de ADNados que no generaron productos de PCR en experimentos de PCR específicos de alelos mutantes glw, incluido el embrión 5 de la Figura 1 (en lo sucesivo, «5»), se utilizaron como plantillas de PCR para el experimento de PCR mostrado. Se utilizaron imprimaciones universales específicas de GLWamide-locus hacia adelante y hacia atrás para generar un producto PCR de 1290 bp a partir de un alelo de tipo salvaje. Nueve de cada diez extractos de ADN (excepto el indicado*) mostraron una banda de PCR de tamaño esperado, incluido el embrión 5 de la Figura 1 ('5'). Esto sugiere que la falta de generación de productos de PCR a partir del embrión 5 no se debió a la falta de una plantilla suficiente de ADNr. El gel de agarosa del 1,5% se ejecutó a 128 V durante 25 min. 1 kb se utilizó una escalera de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí se describe un protocolo basado en PCR para genotipo un solo embrión de anémonas de mar sin sacrificar al animal. Después del desove y la desgelatina, los huevos fertilizados se pueden convertir en gastrulas. La región aborta de cada embrión de gastrula se extrae quirúrgicamente, y el tejido aboral aislado se utiliza para la extracción genómica posterior de ADN, mientras que los embriones post-cirugía restantes sanan y continúan el desarrollo. Los extractos de ADNG se utilizan para un ensayo de PCR para determinar el genotipo de cada embrión. Este método aprovecha la capacidad de las mitades orales del embrión de anémona sano para regular y desarrollar10,11, y la mayoría de los embriones (>90%) por lo general sobreviven a la cirugía y se desarrollan normalmente en condiciones de cultivo adecuadas. La cantidad de tejido necesaria para este ensayo de genotipado es menos de la mitad de todo un embrión de gastrula, y los resultados negativos debidos a la falla en la extracción de ADN g son raros (<5%). Dado que sólo se requiere una pequeña cantidad de tejido, es probable que se utilicen embriones de etapa pre-gastrula para este ensayo de genotipado; aunque, esto aún no se ha probado. Este método se puede realizar de manera eficiente siempre y cuando el animal no haya alcanzado una etapa de natación activa (es decir, antes de la etapa de planula de natación libre). Este método de genotipado es particularmente ventajoso en casos que requieren la realización de análisis de fenotipo durante el desarrollo.
Una limitación de este protocolo es que el número de embriones capaces de examinar puede ser limitado. En particular, la extirpación quirúrgica de un tejido abortivo puede tardar de uno a dos minutos por embrión, especialmente para los no iniciados. Un investigador experimentado debe ser capaz de completar todo el ensayo de genotipado durante al menos 80 embriones por día, pero los estudios que involucran cientos o miles de embriones probablemente consumen demasiado tiempo para completarse en un día.
Los investigadores también deben ser conscientes de que el fenotipo observado en los mutantes post-cirugía puede ser diferente del de los mutantes intactos, por ejemplo, debido al efecto de la eliminación de genes en la curación y/o regulación embrionaria en las gastrulaes. Esta posibilidad debe ser probada examinando si el fenotipo encontrado en mutantes post-cirugía es de hecho observable en mutantes intactos.
Existen varios enfoques alternativos al método descrito de genotipado. En primer lugar, la inmunomancha con un anticuerpo contra una proteína cuya expresión se pierde en mutantes noqueantes se puede realizar para identificar a los individuos mutantes noqueantes de una población genéticamente heterogénea de animales en desarrollo. En segundo lugar, la hibridación in situ se puede utilizar para este propósito, si el riboscopio se puede diseñar para que no hibrida a ARNm mutantes. Por ejemplo, si los alelos mutantes de un animal noqueador llevan grandes mutaciones de deleción en la misma región del gen, el ribosión puede ser diseñado para hibridar a la región del gen eliminado en los mutantes noqueantes. En ambos casos, se espera que los mutantes noqueantes muestren ningún etiquetado, mientras que los individuos heterocigotos y de tipo salvaje deben mostrar etiquetado. Sin embargo, los animales tendrán que ser sacrificados debido a la fijación de tejido necesaria para la tinción. Finalmente, los mutantes noqueantes pueden ser elevados a la madurez sexual y cruzados entre sí para generar una progenie, todos los cualesdeben ser mutantes noqueantes, y los análisis del fenotipo del desarrollo se pueden realizar usando esta progenie 6. Este método requiere que los animales noqueantes sean viables y capaces de reproducirse y, por lo tanto, está limitado en su aplicación a genes no esenciales.
Aunque el protocolo de genotipado descrito está diseñado para embriones de anémona de mar, es posible utilizar este método con otros cnidarios en los que tanto la información genómica como los embriones son accesibles (por ejemplo, corales12 y medusas13),siempre y cuando los embriones son capaces de sanar y recurar tras la extracción quirúrgica. Ya se han notificado experimentos exitosos de modificación genética mediados por CRISPR en corales14, así como en medusas hidrozoanas15,16. Las futuras aplicaciones de este protocolo de genotipado a los cnidarios de anémonas no marinas serán importantes para los estudios de la base genética de su desarrollo. Esto, a su vez, será clave para obtener conocimientos mecánicos sobre la evolución del desarrollo cnidario notablemente diverso.
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Disclosures
El autor no tiene nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los revisores anónimos por los comentarios sobre la versión anterior del manuscrito, que mejoró el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por fondos de la Universidad de Arkansas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
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