Summary
Målet med detta protokoll är att genotyp havanemon Nematostella vectensis under gastrulation utan att offra embryot.
Abstract
Beskrivs här är ett PCR-baserat protokoll till genotyp den gastrulastadium skede embryot av Robotskapade stubbar om artikel om Nematostella vectensis utan att offra livet av djuret. Efter in vitro -fertilisering och de-jellying, zygoter får utvecklas för 24 h vid rumstemperatur för att nå början till mitten av gastrula skede. De gastrulastadium embryona placeras sedan på en aguppstod gel säng i en petriskål som innehåller havsvatten. Under dissekera Mikroskop, en Volfram nål används för att kirurgiskt separera ett aboral vävnad fragment från varje embryo. Efter operationen embryon får sedan läka och fortsätta utvecklingen. Genomiskt DNA extraheras från det isolerade vävnads fragmentet och används som mall för Locus-specifik PCR. Genotypen kan bestämmas utifrån storleken på PCR-produkter eller förekomst/frånvaro av allelespecifika PCR-produkter. Efter operationen embryon sorteras sedan efter genotyp. Varaktigheten av hela genotypningen beror på antalet embryon som ska screenas, men det kräver minimalt 4 – 5 timmar. Denna metod kan användas för att identifiera knockout-mutanter från en genetiskt heterogen population av embryon och möjliggör analyser av fenotyper under utvecklingen.
Introduction
Cnidarians representerar en mångsidig grupp av djur som inkluderar maneter, koraller och havsöroner. De är diploblaster, består av ektoderm och endoderm som separeras av en extracellulär matris (mesoglea). Cnidaria är en syster grupp till speciose Bilateria, som traditionella djur modellerar liksom Drosophila och mus hör hemma till1. Dessutom är Cnidaria-Bilateria divergensen tros ha inträffat i pre-kambriska perioden2. Som sådan, jämförande studier av koraller och bilaterians är viktiga för att få insikter i biologi deras senaste gemensamma förfader. Nyligen har komparativ genomik visat att koraller och bilaterians dela många utvecklingsverktyg gener såsom notch och bhlh, vilket innebär att deras gemensamma förfader redan hade dessa gener3. Men den roll som dessa utvecklingsverktyg gener i den sista gemensamma förfader Cnidaria och Bilateria är jämförbart mindre väl förstått. För att lösa detta problem är det viktigt att studera hur dessa djupt bevarade gener fungerar i cnidarians.
En av de framväxande artikel om genetiska modellerna är Robotskapade stubbar om Nematostella vectensis. Dess genom har sekvenserat3, och en mängd olika genetiska verktyg, inklusive morpholino-medierad Gene knockdown, meganuclease-medierad transgenes, och CRISPR-Cas9-medierade genknockins och Knockouts, finns nu tillgängliga för användning i detta djur. Dessutom är Nematostella utveckling relativt väl förstått. Under embryogenes, gastrulation sker genom invagination4, och embryot utvecklas till en fri-simning planula larv. Planula förvandlas därefter till ett oskaftade polyp med en mun och cirkumoral tentakler. Den polyp växer sedan och når sexuell mognad.
CRISPR-Cas9-medierad riktad mutagenes används nu rutinmässigt för att studera genfunktion i Nematostella vectensis5,6,7,8,9. För att generera knockout mutanter i Nematostella, en cocktail som innehåller Locus-specifika Single-guide rnas och Endonuklease Cas9 protein injiceras först i obefruktad eller befruktade ägg för att producera F0 grundare djur som typiskt visar mosaicism. F0 djur höjs därefter till sexuell mognad och korsas med varandra för att producera en F1-population, varav en delmängd kan vara knockout mutanter6. Alternativt kan sexuellt mogna F0 djur korsas med vildtyp djur för att generera F1 heterozygot djur, och F1 heterozygoter som bär en knockout allel i Locus av intresse kan sedan korsas med varandra för att producera F2 avkomma, en fjärdedel som förväntas bli knockout mutanter5. Båda metoderna kräver en metod för att identifiera knockout mutanter från en genetiskt heterogen population. Polyp tentakler kan användas för att extrahera genomiskt DNA för genotypning6,7. Men i de fall där utvecklings funktionen av genen av intresse utreds och mutanta embryon inte når polyp Stadium (dvs. på grund av larv dödlighet i samband med mutationen), knockout mutanter måste identifieras tidigt i Ontogeni. Beskrivs här är ett PCR-baserat protokoll till genotyp enskilda djur på gastrulastadium scenen utan att offra djuret, vilket möjliggör identifiering av knockout mutanter från en genetiskt heterogena population av embryon. Varaktigheten av hela genotypning processen beror på antalet embryon som skall screenas, men det minimalt kräver 4-5 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. induktion av lek, provrörsbefruktning och de-jellying
- Upprätthålla Nematostella vectensis i havsvatten med en salthalt av 12 promille (ppt) i mörker vid 16 ° c, utfodring Artemia dagligen.
- På dagen före lek induktion, placera djuren i en temperatur-och ljus-kontrollerad inkubator. Program mera inkubatorn så att djuren utsätts för 8 h ljus vid 25 ° c. Tillval: mata en liten bit (< 1 mm3) ostron till enskilda djur innan du placerar dem i inkubatorn för att förbättra lek.
- Lämna djuren i inkubatorn i 1 h vid 16 ° c.
- Ta bort djuren från inkubatorn och lämna dem på en bänkskiva med ljus i rumstemperatur (RT) för att möjliggöra lek. Leken sker vanligtvis inom de närmaste 1,5 – 2 h.
- Om män och kvinnor är i separata behållare, placera äggförpackningar från honbehållaren i en spermie-innehållande manlig behållare med hjälp av en överföringspipett vars spets skärs för att förstora öppningen så att äggen inte skadas av mekanisk påfrestning under Överföra. Låt äggen gödslas genom att lämna dem i den manliga behållaren i minst 15 min.
- De-gelé ägg paketen i havsvatten som innehåller 3% cystein (pH 7,4) på en petriskål eller i en 15 mL tub. Skaka försiktigt på en shaker i 12 minuter.
- Använd en plastpipett för att bryta upp klumpar och fortsätta att agitera för en annan 2-3 min tills helt de-jellied.
- Ta bort cystein genom att ersätta media med färskt havsvatten i minst 5x.
- Förvara de befruktade äggen på ett glas petriskål vid 16 ° c eller RT.
2. kirurgiskt avlägsnande av en aboral vävnad från ett gastrulastadium embryo
- Bered en DNA-extraktionsbuffert bestående av 10 mm Tris-HCl (pH 8), 50 mm KCL, 1 mm EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 och 1 mg/ml proteinas K. Använd 20 ml extraktionsbuffert per embryo. Blanda väl genom vortexa och alikvot bufferten i PCR-rör.
- Lös 1% Agreste i havsvatten och häll den i en petriskål för att täcka botten. Cool på en bänkskiva för att göra en gel säng. Häll färskt havsvatten för att täcka gelbädden i petriskål.
- Överför 24 h postfertilisering (HPF) embryon (tidigt till mitten av gastrula skede) i petriskål som innehåller en agaros gel säng.
- Sätt in en Volfram nål i en nål hållare och sterilisera genom att doppa nålspetsen i alkohol (70% eller högre) och placera den i flamma för att bränna bort alkoholen.
- Under en dissekera Mikroskop (vid 20x till 40x förstoring), Använd volfram nålen för att göra en depression på aguppstod sängen genom att ta bort en bit yta aguppstod om storleken på ett embryo som ska manipuleras, och placera embryot på depression med dess laterala Sidan vänd nedåt för att begränsa rörligheten för embryot för mikrokirurgi.
- Använd volfram nålen till kirurgiskt punktskatter en bit aboral vävnad ligger mittemot den muntliga blastoporal öppningen. Ett aboral en tredjedel till en fjärdedel av den embryonala vävnaden längs oral-aboral axeln är vanligtvis tillräckligt.
- Använd en P20-pipett för att överföra den isolerade aboral vävnaden (i < 2 mL) till ett PCR-rör som innehåller 20 mL DNA-extraktionsbuffert.
- Överför efter operationen embryot till en brunn som innehåller minst 500 mL färskt havsvatten i en 24-eller 96-brunn tallrik.
- Upprepa steg 2.4 – 2.8 för antalet embryon efter behov.
- Placera väl plattan som innehåller embryon efter operationen i en inkubator vid 16 ° c eller RT tills genotypning har slutförts.
3. genomisk DNA-extraktion och genotypning PCR
- Snurra snabbt ner PCR-rören som innehåller DNA-extraktionsbufferten och isolerade embryonala vävnader med hjälp av en mini-centrifug (t. ex. vid 2 680 x g för 10 s).
- För att extrahera genomiskt DNA från enstaka embryon, inkubera PCR-rören vid 55 ° c i 3 h. Vortex för 30 s var 30 min för att säkerställa upplösningen av cell klumpar och förbättra cell lysis.
- Inkubera PCR-rören vid 95 ° c i 5 minuter för att inaktivera proteinas K.
- Håll gDNA-extrakt vid 4 ° c eller på is och fortsätt omedelbart till PCR.
Obs: protokollet kan pausas här genom att placera gDNA-extrakt i a-20 ° c frys. - Ställa in en PCR-reaktion med extraherade gDNA som mall för att förstärka den genomiska Locus av intresse.
- Om olika alleler på Locus av intresse skiljer sig i storlek så att storleksskillnaden kan upptäckas av aguppstod gel elektrofores, designa en enda uppsättning primers att förstärka hela Locus.
- Alternativt, Använd allele-specifika primers som genererar PCR-produkter endast i närvaro av den specifika allelen; till exempel genom att designa primer som binder till en region som innehåller införande/radering mutationer.
- Använd en typisk 20 mL PCR-reaktionsblandning enligt följande: 5 mL gDNA-extrakt, 8 mL nukleasfritt vatten, 4 mL PCR-buffert, 0,2 mL 10mM dNTPs, 0,6 mL DMSO, 1 mL 10 mM framåtriktad primer, 1 mL 10 mM omvänd primer och 0,2 mL DNA-polymeras (se tabell över material).
Anmärkning: flera primers kan användas i en PCR-reaktion. Till exempel kan en universell framåtprimer och två allele-specifika omvänd primers kombineras, så länge de två omvänd primers är utformade för att generera PCR-produkter av olika storlekar så att närvaron/frånvaron av de två alleler kan otvetydigt bestäms av gel elektrofores (se representativa resultat avsnitt).
- Kör agaros gel elektrofores för att bestämma storlek och förekomst/frånvaro av PCR-produkter. Justera tillståndet för Agros gel elektrofores (t. ex. Agros gel procent, V/cm och varaktighet) beroende på den förväntade storleken av PCR-produkter.
- Använd resultaten från PCR avseende storlek och förekomst/frånvaro av PCR-produkter för att tilldela en genotyp till varje embryot efter operationen. Om till exempel olika alleler förväntas generera PCR-produkter av olika storlekar använder du storleks informationen för att tilldela genotypen för varje embryo. Om allele-specifika primers används, bör data om förekomst/frånvaro av PCR-produkter användas för att tilldela en genotyp till varje embryo.
- Sortera embryon enligt genotyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den Nematostella arvsmassan har en enda Locus som kodar ett prekursor protein för neuropeptid Glwamid. Tre knockout Mutant alleler på denna Locus (GLW-a, GLW-b, och GLW-c) har tidigare rapporterats5. Fyra heterozygot män som bär en vildtyp allel (+) och knockout allel GLW-cvid glwamide Locus (genotyp: +/GLW-c) korsades med en heterozygot hona bär en vild-typ allel och olika knockout allel GLW-a vid samma Locus (genotyp: +/GLW-a) för att generera en avkomma. Det finns fyra möjliga genotyper i avkomman: GLW-a/GLW-c, +/GLW-c, GLW-a/+, och +/+. Av alla avkomman, valdes åtta embryon slumpmässigt för denna representativa genotypning assay. För genotypning PCR utformades en universell framåtriktad primer och två allele-specifika omvänd primers5. Den omvända primer som är specifik för GLW-a binder till en region som innehåller insättande mutationer, och den förväntade storleken på PCR-produkten är 151 BP. Den omvända primer som är specifik för GLW-c binder till en region som innehåller både insättnings-och borttagnings mutationer, och den förväntade storleken på PCR-produkten är 389 BP. Varken omvänd Primer kan binda till Wild-typ sekvens, och därmed inga PCR-produkter kommer att genereras från vildtyp embryon. Figur 1 visar ett representativt resultat av PCR-analysen. Embryona 1 och 2 visar ett enda PCR-band som överensstämmer med den förväntade storleken på GLW-a. Embryona 3 och 6 visar två PCR-band som motsvarar de förväntade storlekarna för alleler GLW-aoch GLW-c. Embryona 4, 7 och 8 visar ett enda PCR-band som överensstämmer med den förväntade storleken på GLW-c. Embryo 5 visar inga band, vilket tyder på avsaknaden av primer bindning.
För att utesluta möjligheten att gDNA extraktionsfel, en annan PCR kördes med hjälp av en omvänd primer som kan binda till Wild-typ sekvens, som visade en PCR-produkt av en förväntad storlek (1290 BP; Figur 2). Det bör noteras att i figur 2visade ett av proverna (indikeras med *) inga PCR-produkter, vilket tyder på ett misslyckande vid gDNA-extraktion.
Baserat på ovanstående resultat tolkas genotypen för varje embryo till följande: embryo 1: +/GLW-a, embryo 2: +/GLW-a, embryo 3: GLW-a/GLW-c, embryo 4: +/GLW-c, embryo 5: +/+, embryo 6: GLW-a/GLW-c, embryo 7: +/GLW-c, och embryo 8: +/GLW-c.
Figur 1: representativa resultat av en genotypning PCR-analys. 1-8 representerar genotypning PCR resultat från slumpmässigt urvalet embryon bland avkomman av en F1 heterozygot Mutant kors mellan en +/GLW-en hona och +/GLW-cmän. gDNA extraherades från ett embryonala vävnads fragment och användes som en PCR-mall. GLWamide Locus var avsedd för PCR-förstärkning, och en universell framåtriktad primer och två allele-specifika omvänd primers användes (tabell över material). Den omvända primer som är specifik för GLW-a genererar ett 151 BP PCR-band (1, 2, 3, 6), medan den omvända primern som är specifik för GLW-c genererar ett 389 BP PCR-band (3, 4, 6, 7, 8). Varken omvänd Primer kan binda till Wild-typ sekvens, och därmed inga PCR-produkter kommer att genereras från vildtyp embryon (5). Den 1,5% aguppstod gel kördes på 128 V för 25 min. En 100 BP DNA-stege användes. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa resultat av Locus-specifik PCR för att bekräfta förekomst av gDNA. Tio gDNA-extrakt som inte genererade PCR-produkter i GLW Mutant allele-specifika PCR-experiment, inklusive embryo 5 från figur 1 (' 5 '), användes som PCR-mallar för det PCR-experiment som visades. En universell framåtriktad och omvänd GLWamide-Locus-specifika primers användes för att generera en 1290 BP PCR-produkt från en vildtyp-allel. Nio av tio DNA-extrakt (med undantag för det som anges *) visade ett PCR-band av förväntad storlek, inklusive embryo 5 från figur 1 (' 5 '). Detta tyder på att underlåtenheten att generera PCR-produkter från embryot 5 inte berodde på avsaknaden av en tillräcklig gDNA-mall. Den 1,5% aguppstod gel kördes på 128 V för 25 min. 1 KB DNA-stege användes. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrivs här ett PCR-baserat protokoll till genotyp ett enda hav Anemon embryo utan att offra djuret. Efter lek och de-jellying, de befruktade äggen får utvecklas till gastrulae. Aboral regionen av varje gastrulastadium embryo avlägsnas kirurgiskt, och den isolerade aboral vävnad används för efterföljande genomisk DNA-extraktion, medan de återstående efter operationen embryon läka och fortsätta utvecklingen. GDNA-extrakt används sedan för en PCR-analys för att bestämma genotypen för varje embryo. Denna metod utnyttjar möjligheten för de muntliga halvorna av havanemon embryo att reglera och utveckla10,11, och majoriteten av embryona (> 90%) normalt överleva operationen och utvecklas normalt under lämpliga odlingsförhållanden. Den vävnad som krävs för denna genotypning analys är mindre än hälften av ett helt gastrulastadium embryo, och negativa resultat på grund av gDNA extraktion misslyckande är sällsynta (< 5%). Med tanke på att endast en liten mängd vävnad är nödvändig, är det sannolikt möjligt att använda pre-gastrula embryon för denna genotypning analys; även om, detta har ännu inte testats. Denna metod kan utföras effektivt så länge djuret inte har nått en etapp av aktiv simning (dvs., innan fri-simning planula skede). Denna genotypning metod är särskilt fördelaktigt i fall som kräver prestanda av fenotyp analyser under utveckling.
En begränsning av detta protokoll är att antalet embryon som kan undersökas kan begränsas. I synnerhet, kirurgiskt avlägsnande av en aboral vävnad kan ta en till två minuter per embryo, särskilt för den oinvigde. En erfaren forskare bör kunna slutföra hela genotypning analysen för minst 80 embryon per dag, men studier med hundratals eller tusentals embryon är sannolikt alltför tidskrävande att slutföra på en dag.
Forskarna måste också vara uppmärksamma på att den fenotyp som observerats i mutanter efter operationen kan skilja sig från den i intakt mutanter, till exempel på grund av effekten av gen knockout på läkning och/eller embryonal reglering i gastrulae. Denna möjlighet bör testas genom att undersöka om den fenotyp som finns i post-kirurgi mutanter är verkligen observerbara i intakt mutanter.
Det finns flera alternativa metoder för den beskrivna metoden för genotypning. För det första kan immunofärgning med en antikropp mot ett protein vars uttryck går förlorad i knockout-mutanter utföras för att identifiera knockout-muterade individer från en genetiskt heterogen population av utvecklings djur. För det andra kan in situ hybridisering användas för detta ändamål, om riboproben kan utformas så att den inte hybridiseras till Mutant mrnas. Till exempel, om Mutant alleler av ett knockout djur bära stora strykningar mutationer i samma område av genen, riboproben kan utformas för att hybridisera till regionen av genen bort i knockout mutanter. I båda fallen, knockout mutanter förväntas visa någon märkning, medan heterozygot och vild-typ individer bör Visa märkning. Emellertid, djuren kommer att behöva offras på grund av vävnadsinfixering krävs för färgning. Slutligen kan knockout mutanter höjas till sexuell mognad och korsas med varandra för att generera en avkomma, som alla bör vara knockout mutanter, och analyser av utvecklingsfenotyp kan utföras med hjälp av denna avkomma6. Denna metod kräver att de knockout djuren är livskraftiga och kan reproduktion och är därmed begränsad i sin ansökan till icke väsentliga gener.
Även om det beskrivna genotypningsprotokollet är utformat för anemonembryon, är det möjligt att använda denna metod med andra cnidarier där både genomisk information och embryon är tillgängliga (t. ex. koraller12 och maneter13), så länge som embryona kan läka och reglering vid kirurgiskt avlägsnande. Framgångsrika CRISPR-medierade experiment med genmodifiering har redan rapporterats i koraller14 och hydrozoan maneter15,16. Framtida tillämpningar av detta genotypning protokoll till icke-havsanemon koraller kommer att vara viktigt för studier av den genetiska grunden för deras utveckling. Detta, i sin tur, kommer att vara nyckeln till att få mekanistiska insikter i utvecklingen av anmärkningsvärt varierande artikel om utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar anonyma granskare för kommentarer om den tidigare versionen av manuskriptet, vilket förbättrade manuskriptet. Detta arbete stöddes av medel från University of Arkansas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
