Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تقييم الاستجابة المناعية الخلوية ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، استخدام "في فيفو البلعمه بالانزيم"

Published: April 10, 2019 doi: 10.3791/59543
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biology, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, 3Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Summary

ويصف هذا البروتوكول مقايسة المجراة في البلعمه في الكبار melanogaster المورفولوجية التحديد الكمي للاعتراف بلعمية وتخليصها من العدوى الميكروبية.

Abstract

ويوفر الحصانة الفطرية في جميع الحيوانات، دفاع فورية وقوية ضد طائفة واسعة من العوامل الممرضة. الاستجابات المناعية خلطيه وخلوية الفروع الرئيسية للحصانة الفطرية، والعديد من العوامل التي تنظم هذه الاستجابات هي تقحم المصانة بين اللافقاريات والثدييات. البلعمه، عنصرا رئيسيا من الحصانة الفطرية الخلوية، قام بها خلايا الدم متخصصة في الجهاز المناعي. ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، برز كنموذج وراثية قوية للتحقيق في الآليات الجزيئية والتأثيرات الفسيولوجية البلعمه في الحيوانات كلها. هنا علينا أن نظهر مقايسة المستندة إلى حقن المجراة في البلعمه قياس امتصاص الجسيمات وتدمير خلايا الدم المورفولوجية ، هيموسيتيس. الإجراء الذي يسمح للباحثين التحكم بدقة في تركيز الجسيمات والجرعة، مما يجعل من الممكن الحصول على نتائج عالية استنساخه في فترة قصيرة من الزمن. التجربة الكمية، من السهل القيام به، ويمكن تطبيقها على الشاشة لعوامل المضيف هذا التأثير الممرض الاعتراف وامتصاص وإزالة الألغام.

Introduction

دفاعات المناعة الفطرية تشكل الخط الأول للدفاع ضد الجراثيم المسببة للأمراض. يمكن تقسيم هذه الردود وظيفيا إلى الحصانة الفطرية خلطيه وخلوية، وكلاهما وساطة من مستقبلات الاعتراف بنمط ترميز الخط (برس) أن الشعور بأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (بامبس)1. هي حفظت العديد من مسارات الإشارات والآليات المستجيب للحصانة الفطرية في الثدييات واللافقريات، مثل ديدان أسطوانية، ايليجانس كاينورهابديتيس، وذبابة الفاكهة، المورفولوجية ميلانوجاستير2. ذبابة الفاكهة برز كنظام قوي لدراسة الدفاع المضيف ضد الكائنات الدقيقة المعدية3. المورفولوجية وراثيا أصعب، بسهولة وبتكلفة زهيدة تربيتها في المختبرات، وله وقت قصير جيل. وعلاوة على ذلك، يسلك ذبابة الفاكهة ذات كفاءة عالية الدفاعات ضد مجموعة ميكروبات، مما يتيح النظر في الحصانة المضيف ضد مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية والفطرية، أو الطفيلية.

تاريخيا استخدمت للذيفان المورفولوجية شاشات الجينية إلى الأمام، على نطاق الجينوم الحمض النووي الريبي بوساطة التدخل ([رني]) فحص خطوط الخلية الحشرات، والقائمة من قبل سلالات ذبابة متحولة دراسة الحصانة الفطرية – مما يؤدي إلى تحديد وتوصيف لعدة مسارات مأمن خلطيه تقحم المصانة4،5،6،،من78. الاستجابة المناعية الفطرية خلطيه، يمكن القول، الأفضل وصف الدفاع المناعي في ذباب الفاكهة. في أعقاب الإصابة، يقود استجابة خلطيه لإنتاج وإطلاق النظمية للميكروبات الببتيد جزيئات (أمبير) في hemolymph، الدم يعادل في الحشرات. الامبير تنتجها حصيلة عالية المصانة و Imd إشارات المسارات. المسار حصيلة مثلى للثدييات TLR/إيل-1R مستقبلات الإشارات، ومسار Imd مثلى لإشارات الثدييات عامل نخر الورم-ألفا. في حصيلة المورفولوجية، مما يشير إلى فعل إيجابية البكتيريا والفطريات فيرو "س المورفولوجية"s6،،من910 وإشارات Imd هو الناجم عن بكتيريا سلبية الغرام11 ،12.

الحصانة الخلوية، تتألف من التغليف، وشكل الميلانين والبلعمه من مسببات الأمراض الغازية، التي تقوم بها خلايا الدم متخصصة تسمى هيموسيتيس13. وهناك ثلاث فئات من هيموسيتيس في ذبابة الفاكهة: كريستال الخلايا ولاميلوسيتيس وبلاسماتوسيتيس13. كريستال الخلايا، التي تشكل 5% هيموسيتيس المتداولة في يرقات، الإفراج عن الإنزيمات بروفينولوكسيداسي (قتراح) مما يؤدي إلى شكل الميلانين المسببة للأمراض والأنسجة المضيف في مواقع الجرح. لاميلوسيتيس، التي لا توجد عادة في أجنة صحية أو يرقات، هي ملتصقة الخلايا التي تغلف الكائنات الخارجية. فعل هذه الخلايا عند بوبارييشن، أو عندما يتم إيداع باراسيتيزينج دبور البيض في اليرقات. بلاسماتوسيتيس متجولة، التي تشكل 95% من تعميم هيموسيتيس في اليرقات وجميع هيموسيتيس المتبقية في البالغين، تلعب دوراً في الأنسجة يعيد البناء خلال التنمية، ولا سيما، بمثابة الخلية الرئيسية المستجيب المورفولوجية الخلوية الحصانة.

البلعمه خط فورية وحاسمة للدفاع المناعة الفطرية؛ الميكروبات التي خرق الحاجز الظهارية المضيفة هي غارقة بسرعة والقضاء على خلايا الدم متجولة (لإجراء استعراض شامل لبيولوجيا الخلايا البلعمه راجع مرجع 14). تبدأ هذه العملية عند التعرف على نمط germline ترميز مستقبلات (PRRs) على هيموسيتيس الاعتراف بالعوامل الممرضة المرتبطة أنماط الجزيئية (بامبس) للميكروبات. مرة ملتزمة بأهدافها، بدء برس الشلالات مما يشير إلى أن يؤدي إلى تشكيل بسيودوبودس من خلال إعادة عرض cytoskeleton أكتين. بسيودوبودس تحيط الميكروبات، والتي اجتاحت في وقت لاحق واستيعابه في عضية وليدة، يبلوع. وتدمر الميكروبات كما يبلوع يخضع لعملية نضج يبلوع عند يبلوع يتم الاتجار بهن نحو الداخلية من هيموسيتي وأسيديفيس من خلال سلسلة من التفاعلات مع ليسوسوميس. في المختبر والخلية كانت دراسات علم الأحياء في خلايا الثدييات الأولية دور فعال في تحديد ووصف العوامل التي تنظم البلعمه، مثل مستقبلات Fc-غاما الثدييات ومستقبلات C3b15،16. ومع ذلك، محدودة القدرة على تنفيذ الدراسات المجراة في الشاشات على نطاق واسع أو في نظم الثدييات.

نقدم هنا مقايسة المجراة في البلعمه في ذباب الفاكهة الكبار، الذي يرتكز على إجراء لأول مرة بمختبر ديفيد شنايدر في 200017. مختبر شنايدر أظهرت أن phagocytose لاطئة هيموسيتيس متفاوت المسافات على طول السفينة الظهرية البطن سهولة الخرز البوليسترين والبكتيريا. تصور البلعمه، يتم حقن الذباب بالجسيمات المسمى فلوريسسينتلي (مثل كولاي المسمى مع fluorescein isothiocyanate (كولاي-فيتك))، المحتضنة لمدة 30 دقيقة لإتاحة الوقت هيموسيتيس بابتلاع الجزيئات، ومن ثم حقن تريبان الأزرق، الذي يروي fluorescence الجسيمات لا فاجوسيتوسيد أثناء فترة الحضانة. يتم تصوير الأوعية الظهرية يطير ثم استخدام مجهر فلوري مقلوب. استخدام تجربة بسيطة نسبيا، أثبتت أن هيموسيتيس phagocytose البكتيريا ويمكن أن تحول دون مطاط الخرز، أن البلعمه البكتيريا بالحقن قبل الذباب هذه الورقة المنوي، مع الخرز مطاط، وأن الذباب دون الخلوية وخلطيه الاستجابات المناعية عرضه حتى كولاي. ويستند التحليل الوارد في هذا التقرير عمل المختبر شنايدر كمياً المجراة في البلعمه بقياس كثافة الجسيمات التي عصفت بالسفينة الظهرية المرتبطة هيموسيتيس الأسفار.

على غرار النهج المتبع في أنظمة الثدييات، الصفات المورفولوجية المستخدمة في البداية على نطاق الجينوم شاشات [رني] في المختبر لتحديد الجينات المطلوبة للاستجابة المناعية الخلوية18،19،20 ،21،،من2223. بيد أن وضع مقايسة البلعمه المجراة في الكبار مكن تجارب متابعة سيضطلع سهولة في الحيوانات كلها، مما يسمح للباحثين للتحقق من البيولوجية دور العوامل التي تم تحديدها في الدراسات في المختبر. وهذا هو الحال مع مستقبلات transmembrane أكلي لحوم البشر، التي حددت لأول مرة كمستقبل بكتيرية في شاشة [رني] استخدام S2 الخلايا24 وثم بعد ذلك سيظهر للتوسط في الإشريكيّة القولونية (كولاي)، البرازية فايكاليس، و المكوّرات العنقودية الذهبية (S. aureus) البلعمه في البالغين25.

لدينا مختبر يعمل الإنزيم البلعمه في المجراة في الشاشات الوراثية إلى الأمام والدراسات على نطاق الجينوم الرابطة (باستخدام لوحة إشارة المورفولوجية الوراثية (دجرب)) لتحديد الجينات الجديدة التي تنظم البلعمه في هيموسيتيس الكبار. أدت هذه الدراسات إلى الوصف مستقبلات بجرب-SC1A وبجرب-سا26، حويصلة داخل الخلايا الاتجار بالبروتين Rab1427غلوتامات الناقل بوليفيموس28، والجيش الملكي النيبالي ملزمة البروتين فوكس-129.

ونحن نتوقع أن الشاشات المستقبلية تتضمن البلعمه المجراة في يمكن أن يؤدي إلى تحديد الجينات الإضافية التي تعتبر مهمة للاستجابة المناعية الخلوية في المورفولوجية. شاشات باستخدام خطوط فطري متسلسلة تماما، مثل دجرب أو المورفولوجية الاصطناعية السكان الموارد (دسبر)، يمكن تحديد المتغيرات الطبيعية التي تؤثر على التنمية البلعمه أو هيموسيتي. وعلاوة على ذلك، يمكن اعتماد في الأنواع الأخرى من المورفولوجية التقنية أو المستخدمة في الشاشة الجديدة موارد المجتمع، مثل جمع 250 الأنواع المورفولوجية الاحتفاظ بالأنواع المورفولوجية الوطنية مخزون مركز (ندسك ) في كورنيل. هذه التجارب يمكن القيام بها باستخدام المسمى فلوريسسينتلي البكتيرية أو الفطرية الجدار بيوبارتيكليس متوفرة تجارياً أو يمكن أن يؤديها باستخدام أي عدد من الأنواع البكتيرية أو الفطرية – المقدمة أن الميكروب تعرب عن علامات نيون .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد جسيمات فلوريسسين للحقن

  1. إعادة تشكيل 10 مغ بكتيريا المتاحة تجارياً، قتلت الحرارة الجسيمات المسمى مع فلوريسسين (انظر الجدول للمواد) إلى تركز أسهم من 10 ملغ/مل بإضافة PBS العقيمة x 1 ميليلتر 990 و 10 ميليلتر 50 مم أزيد الصوديوم. دوامة المزيج.
    1. تقسيم إلى مختبرين ميليلتر 8 تستخدم مرة واحدة في أنابيب 0.2 مل وتخزينها في مربع الظلام عند 4 درجة مئوية لتقليل ضوء حساسية المرتبطة بها.
      ملاحظة: أزيد الصوديوم الحافظة هو اختياري ويمكن إهماله إذا تم إجراء مخزون 10 ملغ/مل مع PBS العقيمة 1 x 1 مل، الكوتيد، والمخزنة في-20 درجة مئوية.
  2. جعل حلاً 10 مل من الأغذية 5% التلوين في برنامج تلفزيوني 1 x بخلط 500 ميليلتر محقن تصفية المواد الغذائية الخضراء التلوين ومل 9.5 x 1 العقيمة برنامج تلفزيوني.
  3. أغسل الجسيمات قبل الحقن لإزالة أزيد الصوديوم. 42 مزيج ميليلتر العقيمة 1 x برنامج تلفزيوني وميليلتر 8 من 10 ملغ/مل في أنبوب 1.7 مل. الطرد المركزي في أقصى سرعة ل 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    1. إزالة المادة طافية، إضافة 50 ميليلتر 1 x برنامج تلفزيوني، وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة ل 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. كرر الخطوات من 1-3 و 1.3.1 x 2، ليصبح مجموع يغسل 3.
    3. وبعد الغسيل النهائي، تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق الجسيمات إلى 1.6 ملغ/مل في 50 ميليلتر من الغذاء 5% التلوين في برنامج تلفزيوني 1 x.
    4. لف الأنبوب في رقائق الألومنيوم لحماية من الضوء. تخزين في 4 درجات مئوية، وتجاهل بعد أسبوع واحد.

2-إعداد محطة ضخ والذباب

  1. إعداد لوحة المفاتيح الحقن. لحقن تصل إلى لوح الأنماط الجينية 4 من الذباب في الوقت نفسه، استخدام مختبر الشريط لتقسيم ذبابة2 CO مستطيلة إلى أربعة أقسام. على مقاعد البدلاء قرب المجهر، تعين المناطق مكان في القنينات مرة واحدة وقد اصطف الذباب على لوحة المفاتيح (واحد لكل زاوية من لوحة المفاتيح).
  2. إعداد قنينة من العمر-المتطابقة، 4-7 أيام-الذباب القديمة، للحقن. لكل سلالة اختبارها، نقل 5 ذكور و 5 إناث في قنينة جديدة، المسمى من الطعام المعد يطير والإبقاء على 25 درجة مئوية.
  3. إعداد محقن هوائي (انظر الجدول للمواد) بإعداد الصك إلى وضع TIMED (رشقات نارية قصيرة من ضغط الغاز بطرد السائل – السماح بإيصال كميات sub-نانولتر) 100 مللي ثانية.
  4. إعداد شرائح المجهر. قص شرائط 1.5 بوصة من الشريط الكهربائي وإضعاف في حلقة مع الجانب لاصقة بها ومكان إلى شريحة مجهر مسمى.

3-إعداد الزجاج الإبر الشعرية

  1. سحب الزجاج الإبر (رقيقة الجدار الزجاج الشعيرات الدموية) باستخدام ساحبة إبرة.
    1. اضغط الإبرة تحت المجهر مع ميكرومتر وكسر تلميح استخدام #5 نقطة غرامة ملاقط الفولاذ المقاوم للصدأ. 100 ميكرومتر نصائح تكفي بيرس بشرة يطير مع التقليل من إصابة.
    2. قياس حجم السوائل التي سيتم ضخها في كل الطيران. تحميل الإبرة معقمة 5% الغذاء التلوين في برنامج تلفزيوني 1 x وطرد السائل على قطره زيت المعدني في ميكرومتر مرحلة 0.01 مم.
      ملاحظة: إذا الحبرية السائل كروي، يحسب وحدة التخزين في بيكوليتيرس (الحجم)3/1910. 30 سيتم إخراج إبرة قطرها 100 ميكرومتر ~ 2 nL 100 مللي ثانية.

4-حقن الذباب

  1. "الماصة؛" 10 ميليلتر من الجسيمات 1.6 ملغ/مل على مربع صغير من بارافيلم.
    1. سحب السائل في الإبرة وجبل في فوهة حاقن (انظر الجدول للمواد).
    2. تخدير الذباب مع CO2 وخط لهم في منطقتهم المعينة في فليباد، مع الجانب البطني الأعلى والرؤساء الموجهة نحو الجزء الأمامي من لوحة المفاتيح. ضع قارورة في المناطق المقابلة على مقاعد البدلاء.
    3. حقن الذباب في الزاوية العليا من البطن مع 5، 100 مللي مضخات السائل (~ 10 nL المجموع).
    4. نقل الذباب المحقون للقنينات المناسبة، ملاحظة الوقت في القنينة. تبقى عند 25 درجة مئوية.
  2. تحميل إبرة جديدة مع 0.4% "تريبان الأزرق الحل".
  3. تعيين حاقن تعمل بالهواء المضغوط إلى محكمة الإيداع، مما يتيح تدفق مستمر للهواء لدفع السائل من الإبرة.
  4. تخدير الذباب بعد أن كانوا قد استراح لمدة 30 دقيقة وحقن تريبان الأزرق حتى البطن كامل ومنتفخة.
    ملاحظة: عند دراسة النضج يبلوع مع الجسيمات المسمى بصبغة حساسة لدرجة الحموضة، السماح للذباب للراحة ح 1 ولا حقن تريبان الأزرق قبل تصاعد الذباب.
  5. جبل ذباب على شرائح المجهر مع الشريط الكهربائي، الجانب البطني لأسفل. دفع الأجنحة إلى جانب الطاير وتأمينها للشريط. أيضا، دفع بلطف الرأس إلى الشريط للتأكد من أنه لن يتحرك الطاير.
  6. الانتقال مباشرة إلى الخطوة 5.

5-تصوير الذباب

  1. صورة الذباب، واحدة في وقت واحد، وفي 25 x أو 32 x التكبير باستخدام مجهر مقلوب الأسفار تعلق على الكاميرا الرقمية والكمبيوتر (انظر الجدول للمواد). وتركز على السفينة الظهرية ذبابة باستخدام برامج الحاسوب للكاميرا الرقمية.
  2. تسجيل وقت التعرض والتكبير بين التجارب.
    ملاحظة: فقدان المسار للأنماط الجينية مصدر محتمل للخطأ عند تصوير سلالات متعددة في جلسة واحدة. لتجنب بكتيريا الذباب، دون ملاحظة عن عدد صورة فوتوغرافية يطير الأول والأخير لكل الوراثي.

6-التحديد الكمي، وتطبيع الأسفار

  1. افتح البرنامج وافتح صورة واحدة في كل مرة.
    1. قياس كثافة السفينة الظهرية الأسفار. رسم مضلع حول السفينة الظهرية. تحديد قياس وتسجيل كثافة الأسفار داخل المضلع.
    2. تحديد كثافة fluorescence الخلفية. نسخ المضلع الأول ونقله إلى منطقة مجاورة للسفينة الظهرية ذبابة. حدد قياس وكثافة fluorescence سجل المنطقة الخلفية.
    3. تطبيع fluorescence السفينة الظهرية بالأسفار الخلفية:
      سفينة الظهرية ÷ الخلفية.
    4. حساب المتوسط تطبيع السفينة الظهرية fluorescence كثافة الذباب جميع في سلالة.
    5. تكرار التجربة 2 مرات أكثر.
    6. استخدام طالب مزاوج تي-اختبار لمقارنة الكثافات fluorescence النسبية يعني الذباب مراقبة واختبار الذباب من التجارب الثلاث. حساب حجم تأثير استخدام الصيغة: كوهين د = (م1-M2) ÷ SDالمجمعة، حيث م1 متوسط التركيب الوراثي 1 وأم2 متوسط التركيب الوراثي 2 &
      التنمية المستدامة المجمعة =Equation
      حيث SD1 هو الانحراف المعياري للنمط الوراثي 1 و SD2 هو الانحراف المعياري للنمط الوراثي 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1Aتخطيطي للمقايسة البلعمه المجراة باستخدام الجسيمات المسمى فلوريسسين. هي الذباب الجانب البطني المحملة إلى أسفل على قطعة من الشريط الكهربائية والجزء الأول والثاني من البطن، حيث يقع السفينة الظهرية، مرئية بوضوح (الشكل 1B). المصادر الرئيسية للخطأ التجريبي تنشأ في الحقن وتصوير خطوات الإجراء (الشكل 1). استخدام نفس الإبرة في حقن الذباب متعددة قد يؤدي إلى انسداد الأنسجة يطير أو جسيمات (اللوحة اليسرى العلوية في الشكل 1). سبب المورفولوجية السيارات-فلوريسسيس تحت ضوء بروتينات فلورية خضراء، سوف فلوريس خافت الذباب حقن بإبرة انسداد لكنها تفتقر إلى الأسفار واضحة، الشروريه الجسيمات استيعابه قبل هيموسيتيس. يمكن أن يحدث مصدرا محتملاً آخر للخطأ التجريبي خلال الحقن تريبان الأزرق. ثلاثين دقيقة بعد حقن الأولى بالجسيمات المسمى فلوريسسينتلي، الذباب تلقي حقنه ثانية مع تريبان الأزرق، الذي يروي fluorescence الجسيمات خارج الخلية، فاجوسيتوسيد الأمم المتحدة. كثافة fluorescence النسبي لكل ذبابة يحسب بقسمة fluorescence السفينة الظهرية من منطقة مجاورة متساوية الحجم في البطن. الذباب الذي لا يحصلون على ما يكفي تريبان الأزرق فلوريس الزاهية في جميع أنحاء البطن كامل (اللوحة اليسرى السفلي من الشكل 1). يمكن أن تقلل هذه الأسفار مشرق نسبة السفينة الظهرية للأسفار الخلفية، وبالتالي خفض نسبة كثافة الأسفار الحقيقية للحيوان. وأخيراً، الذباب ينبغي تصوير بينما المعطل تداولها قبل CO2، تتحرك بنشاط الذباب إنتاج الصور الباهتة التي لا يمكن قياسها كمياً (أعلى وأسفل، حق لوحات من الشكل 1).

يتم جمع زكير يطير فريق من إيثيل ميثانيسولفوناتي (EMS) تعامل مع طفرات جسمية. 31 أنشئت أصلاً بوصفها موردا مجتمع في عام 2004، وقد استخدمت الخطوط الاضطلاع بها إلى الأمام وعكس شاشات الجينية. لدينا مختبر تحديد خط من مجموعة زكير أنه غير قادر على البلعمه الغرام (كولاي K-12 السلالة) والبكتيريا إيجابية (الخشبالمذهبة س. سلالة دون البروتين A) (الشكل 2). هذا المسخ، دعا ارجوس، يظهر تقريبا لا سفينة الظهرية الأسفار في مقايسة المجراة في البلعمه. عند مقارنة بسلالة اسوي الخلفية زكير، cn bw، ارجوس يبين الإقبال أقل بشكل ملحوظ من كولاي (فالقيمه = 0,019؛ كوهين د = 1.677) و المكوّرات س. (فالقيمه = 0.0083؛ كوهين د = 1.672). ارجوس البلعمه الجرثومي أيضا إلى حد كبير البصر، كولاي (فالقيمه = 0.045؛ كوهين د = 0.850) و المكوّرات س. (فالقيمه = 0.0136؛ كوهين د = 1.422) بالمقارنة مع آخر مشترك مختبر مراقبة السلالة، كانتون-س.

Figure 1
رقم 1: نظرة عامة وصور الممثل للمقايسة المجراة في البلعمه. ألف التخطيطي للمقايسة البلعمه المجراة باستخدام الجسيمات المسمى فلوريسسين. اثنين الحقن، 30 دقيقة عن بعضها البعض، التي تستخدم للتعرف على الجسيمات تصور واستيعاب الظهرية خلايا الدم المرتبطة بالسفينة. الأبيض ب الضوء صورة عرض يطير شنت على الشريط، مع شرائح البطن الأمامية واضحة للعيان. جيم مثلاً في فيفو البلعمه الصور. (أعلى اليسار) وقد يطير حقن بإبرة انسداد لا الجسيمات الفلورية. (أسفل اليسار) يطير مع الأسفار خارج الخلية عالية بسبب عدم كفاية تريبان الأزرق. (أعلى اليمين) الطاير إيموبيليزي مع لا الأسفار خارج الخلية – صورة مثالية. (أسفل اليمين) نقل يطير كما يلبس CO2 التخدير ينشئ صورة ضبابية. مقياس بار، 0.2 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: البلعمه البكتيريا في المسخ ومراقبة الذباب. ألف الصور التمثيلية البلعمه البكتيريا المسماة بصبغ فلوريسسين؛ كولاي (لوحات أعلى) و المذهبة س. (الألواح السفلي). ب نسبة كثافة fluorescence الذباب المحقون معكولاي جسيمات fluorescein. جيم نسبة كثافة fluorescence الذباب المحقونالمكوّرات س. الجسيمات fluorescein. n = 3 تجارب لكل نوع من البكتيريا، مع الذباب 6-8 كل تجربة. أشرطة الخطأ، ± التحليل الإحصائي sem. = ثنائي الطرف تي-الاختبار. مقياس بار، 0.2 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تستخدم الجسيمات المتاحة تجارياً، والمسمى فلوريسسينتلي لتقييم البلعمه في العام (0.2 ميكرون تعديل كاربوكسيلات الجزئي المجالات الخرز الصغير) أو البلعمه للميكروبات (المسمى فلوريسسينتلي الحرارة-أو كيميائيا قتل البكتيريا أو الخميرة). تقييم نضج يبلوع، حدد الباحثون الجسيمات المسمى بصبغة حساسة لدرجة الحموضة فلوريسسيس عند درجة الحموضة يقلل من محايد إلى حمضية، كما هو الحال فاجوليسوسومي. بدلاً من ذلك، ينبغي اختيار الباحثين لدراسة الخطوات الأولية البلعمه، والاعتراف بالعوامل الممرضة وامتصاص، الجسيمات المسمى بواسطة العلامات الفلورية أن فلوريس داخل وخارج الخلايا.

التي تسيطر عليها بعناية الظروف التجريبية هي المفتاح لضمان تنفيذ المقايسة المجراة في البلعمه بطريقة استنساخه. أولاً، يخضع المورفولوجية إيممونوسينيسسينسي الخلوية32، حتى الذباب التي استخدمت في التجربة يجب أن تكون مطابقة مع العمر، على النحو الأمثل في نطاق معين من 4-7 أيام. ثانيا، ينبغي أن تكون الفترة الفاصلة بين حقن متسقة. البلعمه يحدث بسرعة، في غضون دقائق الخلية المضيفة الاستشعار ميكروب14. على مدى ساعة المقبلة، يحدث نضوج يبلوع، مما يؤدي إلى تحمض يبلوع وتدمير ميكروب المدخلة. تعيين فاصل مجموعة الانتظار بين الحقن يقلل تجريبية تقلب ويتيح إجراء مقارنات بين السلالات وتجارب في أيام مختلفة. نحن نوصي بالانتظار مدة ثلاثين دقيقة عند استخدام جسيمات fluorescein وساعة واحدة للمقايسة نضوج يبلوع المجراة باستخدام الجسيمات المسمى بصبغة الفلورسنت حساسة لدرجة الحموضة.

استخدام نفس الإبرة في حقن سلالات متعددة يضمن أن جميع الذباب تلقي جرعة نفس الجسيمات وتقلب التجريبية يمكن أن تنشأ إذا كانت الإبر الزجاج كسر أو انسداد. لذلك، إنشاء محطة ضخ والذباب مسبقاً هو المفتاح لضمان أن تتم مقايسة المجراة في البلعمه بسرعة وكفاءة. قبل البدء التجربة، قياس حجم السائل بالإبر عدة طرد والاحتفاظ بمجموعة من الإبر من نفس الحجم. وهكذا، إذا كانت إبرة واحدة فواصل بين الحقن، يمكن الاستعاضة عنها فورا. وعلاوة على ذلك، انسداد الإبر يمكن أن يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة، مما يجعل من الصعب التمييز بين الذباب الذي هيموسيتيس غير قادرين على البلعمه الميكروبات والذباب الذي لم يتلق الجسيمات الفلورية. صبغ الحلول مع تلوين الأغذية الخضراء، وجعلها أسهل لتعقب الذباب الذي قد تم حقن وتحديد القضايا مع الإبر انسداد. ومن الناحية المثالية، ينبغي إجراء التجربة عدة مرات، مع أقل من الذباب 6-8 كل سلالة في كل تجربة، ومقارنة نتائج التجارب لتحديد القيم المتطرفة. وأخيراً، ينبغي أن تدار كافية تريبان الأزرق لإخماد الأسفار خارج الخلية جزيئات تماما حيث يكون الأسفار الخلفية قابلة للمقارنة بين الذباب (الشكل 1).

عند التصوير الذباب، ينبغي أيضا الحرص على الحصول على صور واضحة ومتسقة للسفينة الظهرية. شريط أسود الكهربائية المستخدمة لإنشاء خلفية داكنة، وينبغي أن يكون الذباب الجانب البطني المحملة إلى الأسفل، مع أجنحة ورؤساء المضمونة إلى جانب الشريط اللاصق. إذا كان ذلك ممكناً، ينبغي أن تظل الذباب المعطل تداولها تحت CO2 في حين يتم أخذ صور. وأخيراً، الحد من إمكانية تحيز التجريبية، نحن نوصي باستخدام إعداد تجريبية أعمى؛ حيث يتم ترميز القنينات وسلالات من أحد الباحثين والتجربة نفذت وكمياً بباحث آخر.

والرزن المجراة في البلعمه أداة مفيدة لتحديد العيوب العالمي في البلعمه. بيد أنها لا تميز بين الكفاءة البلعمه هيموسيتي والاختلافات في عدد هيموسيتي أو الموقع، نظراً لانخفاض المتعلقة بالعمر أو عيوب التنموية. 32 وعلاوة على ذلك، الإجراء لا تقدم معلومات عن الاختلافات في الحجم أو متجولة قدرة هيموسيتيس الفردية. وهكذا، مرة واحدة وقد حددت الذباب مع انخفاض البلعمه باستخدام مقايسة المجراة في البلعمه، الباحثين ينبغي إجراء دراسات المتابعة، ربما باستخدام الجزيئات البديلة، من أجل التمييز بين العيوب المتصلة بجهاز المناعة البلعمه وعيوب متجولة عامة. وفي نهاية المطاف، تحديد الآليات الجزيئية التي تكمن وراء العيوب متجولة في سلالات متحولة يتطلب دراسة البلعمه في هيموسيتيس واحد. وهذا يمكن إنجازه باستخدام، على سبيل المثال، [كنفوكل] الفحص المجهري، والأسفار تنشيط الخلية الفرز أو المغناطيسي حبة العزلة للكبار هيموسيتيس27،،من2829،،من3233 , 34.

وبوجه عام، ثبت المورفولوجية لتكون نموذجا فعالاً لدراسة الحصانة الفطرية في الحيوانات الحية. هنا وقد قدمنا لمحة عامة عن مقايسة المجراة في البلعمه، أسلوب دراسة البلعمه العالمية والاستجابة المناعية الخلوية في الذباب الكبار. يمكن تطبيق هذا الإجراء الشاشة للجينات الجديدة التي قد تكون هامة للدفاع المضيف، التحقق من صحة الجينات التي تم تحديدها في شاشات [رني] في المختبر على نطاق واسع، وكذلك تميز طفرات بعيوب في الاستجابات المناعية خلطيه أو القناة الهضمية أو الأدوية المضادة للفيروسات. فمن السهل للإعداد، ويمكن أن تسفر عن كمية كبيرة من البيانات الموثوقة عن سلالات متعددة من الذباب في فترة قصيرة من الزمن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون غونزاليس بيت الدكتور والدكتور أبراجيتا جارج للدعم في إجراء التجارب المجراة في البلعمه. منحة البذور NSF الخفة مقدما والخفة المعاهد الوطنية للصحة T32 التدريب المنح والخلية و "البيولوجيا الجزيئية" (CMB) والتفاعلات المضيف الممرض (HPI)، بتمويل هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres Invitrogen F8810 Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit World Precision Instruments 5430-10 Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen E13231 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen E23370 Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2861 Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate Invitrogen E2863 Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen P35361 Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis Invitrogen A10010 Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820 World Precision Instruments SYS-PV820 The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen S23371 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen S23372 Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen E2851 Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW100F-3 Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma T8154 Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) Zeiss SteREO Discovery.V8 Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Z23373 Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen Z23374 Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate Invitrogen Z2841 Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red Invitrogen Z2843 Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
  2. Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).
  3. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).
  4. Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).
  5. De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila. EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).
  6. Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).
  7. Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila. Science. 296 (5566), 359-362 (2002).
  8. Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila. Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).
  9. Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 86 (6), 973-983 (1996).
  10. Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).
  11. Lemaitre, B., et al. A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).
  12. Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).
  13. Meister, M., Lagueux, M. Drosophilablood cells. Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).
  14. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).
  15. Anderson, R. A., Sando, G. N. Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases. Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).
  16. Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).
  17. Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10, 781-784 (2000).
  18. Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria. Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).
  19. Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
  20. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309, 1251-1253 (2005).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).
  22. Stuart, L. M., et al. Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain. Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).
  23. Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans. PLoS Biology. 4 (1), e4 (2006).
  24. Kocks, C., et al. Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila. Cell. 123 (2), 335-346 (2005).
  25. Nehme, N. T., et al. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
  26. Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).
  27. Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
  28. Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).
  29. Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).
  30. Guille, M. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , Springer Science & Business Media. (1999).
  31. Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster. Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).
  32. Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
  33. Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body. Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).
  34. Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila. Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).

Tags

الإصابة، العدد 146، البلعمه، والبكتيريا، وعلم المناعة الخلوية الحصانة، melanogaster المورفولوجية، الحصانة الفطرية، الكبار
تقييم الاستجابة المناعية الخلوية ذبابة الفاكهة، <em>melanogaster المورفولوجية</em>، استخدام "في فيفو البلعمه بالانزيم"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P.… More

Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay. J. Vis. Exp. (146), e59543, doi:10.3791/59543 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter